![Page 1: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/1.jpg)
Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA
Northern blotRT-PCR e Real Time RT-PCRTécnicas de estudo da regulação da expressão gênica
DNA footprintingBand shiftTransfecção com gene reporterDuplo-híbridoCHIP (chromatin immunoprecipitation
Técnicas de estudo de expressão gênica em escala genômica
DNA MicroarrayAnálise de EST (expressed sequence tags) SAGE (serial analysis of gene expression)
![Page 2: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/2.jpg)
Etapas na expressão de genes nas células
![Page 3: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/3.jpg)
RNA
A B C
![Page 4: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/4.jpg)
Filme raio X ou Phosphoimager
![Page 5: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/5.jpg)
In Situ Hybridization
In situ hybridization of a Drosophila embryo with probes for even-skipped (red) and hunchback (green).
![Page 6: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/6.jpg)
Run on
Núcleo dehepatócito
Núcleo decel de rim
Transcrição constitutivaTranscrição específica em hepatócitos
F E D C B AK J I H G LR S T V X Z
DNA imobilizado em filtros
![Page 7: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/7.jpg)
Northern blot e nuclear run on indicam regulação pós-transcricional
A7 A7 A7
Núcleos isolados de: epimastigotas
amastigotas
mRNA levels
1
1 3
68
Epi Ama
Amastin
Tuzin
![Page 8: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/8.jpg)
Determinação da vida média de mRNAs de amastina
Tratamento com ActD Extração de RNA Northern blot
em amastigotas: 74 min em epimastigotas: 11 min
![Page 9: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/9.jpg)
Quantificação da expressão de um mRNA
- Northern blot
- Proteção à RNAse
- Primer extension
- RT-PCR (?)
- Real Time PCR
![Page 10: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/10.jpg)
RT-PCR
- R
T+
RT
![Page 11: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/11.jpg)
Determinação do limiar de detecção Ct
![Page 12: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/12.jpg)
O valor de Ct é correlacionado com a quantidade inicial de DNA amplificado
![Page 13: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/13.jpg)
Quantificação de RNA
por Real-Time PCR
Detecção de fluorescência gerada em cada ciclo de amplificação:
- SYBR green- Primers fluorescentes
![Page 14: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/14.jpg)
Quantificação de RNA
por Real-Time PCR:o método TaqMan
![Page 15: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/15.jpg)
Estudo de promotores: transfecção c/ gene repórter
Luciferase assay
Genes repórteres- CAT- Luciferase- -gal
![Page 16: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/16.jpg)
Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting
![Page 17: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/17.jpg)
Estudo de promotores: a técnica de band-shiftEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSAEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSA
DNA + proteína
gel não desnaturante
![Page 18: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/18.jpg)
Estudos de expressão de mRNA em escala genômica:
High throughput analysis
– Microarrays• cDNAs• Oligos• Gene chips (Affymetrix)
– ESTs
– SAGE
![Page 19: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/19.jpg)
Estudos de expressão de mRNA em escala genômica: DNA Microarray
![Page 20: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/20.jpg)
• Single-pass sequencing of “random” cDNAs– Somente sequencias do 5’ ou 3’ – Sequências de baixa qualidade
• ESTs são cDNAs – Representam mRNAs– Correspondem a regiões transcritas do
genoma– Uso de bibliotecas normalizadas e não-
normalizadas
Análises de EST
![Page 21: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/21.jpg)
SAGE: Serial Analysis of Gene Expression
Schematic illustration of the SAGE process. (A) Poly(A +)RNA is extracted and transcribed into double-stranded cDNA, primed by biotinylated oligo (dT) (black circles), and digested with the Anchoring Enzyme. (B) The 3-most fragments are isolated by binding them to streptavidin beads (gray ellipses). (C) The fragments are divided and ligated to different linkers (L1, L2). (D) The isolated linker-tags are blunt-ended. (E) The linker-tagsare ligated to linker-ditag-linker constructs and amplified by PCR (E). (F) The ditags are isolated, ligated to concatamers, cloned, and sequenced.
![Page 22: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/22.jpg)
CHIP: Imunoprecipitação da cromatina
![Page 23: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/23.jpg)
Duplo-híbrido em levedura
GENE REPORTER
GENE REPORTER -Gal
![Page 24: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/24.jpg)
Duplo-híbrido em levedura
- Detecção de colônias azuis- Crescimento em meio sem his
Co-transformação
de leveduras his-
Transformação com bibliotecade expressão
![Page 25: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/26.jpg)
Yeast genome/proteome database: 12Mb ~6000 genes (50% with assigned function)
10% involved in transcription141 with their activity tested:
myc-tagging
Anti-Myc Hybridize to DNA chip with6361 spots, representing allthe known intergenic regions in the yeast genome. Average size of the spotted PCR = 480 bp
![Page 27: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/27.jpg)
CHIP e Microarraypodem identificar todos os genes regulados por um mesmo fator de transcrição
6361 spots, representing all of the known intergenic regions in the yeast genome. (average size = 480 bp)
![Page 28: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/28.jpg)
Identificação de sequencias regulatórias
reconhecidas por uma RBP
![Page 29: Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061521/552fc0f9497959413d8b6a46/html5/thumbnails/29.jpg)
Estudo da regulação
da tradução
Monossomose subunidadesribossomais
Polissomos
Frações contendo mRNA associadoa polissomos cada vez maiores
Marcação de cDNA e hibridização
Uso de Microarray para identificação de genes associadosa polissomos