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ANALISI ENZIMATICAANALISI ENZIMATICA
L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni:
• determinazione dell’ attività cataliticaattività catalitica di enzimi
• determinazione della concentrazioneconcentrazione di sostanze per mezzo di enzimi
• determinazione della concentrazioneconcentrazione di sostanze mediante reattivi
marcati con enzimi
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• Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con
gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di
sostanze
• Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le
reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non
avrebbero luogo
• Sono caratterizzati da:
- elevato potere cataliticopotere catalitico
- altissima specificitàspecificità
ENZIMIENZIMI
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ENZIMI
X
G
G Y
Reazione non catalizzata
G*
G*
Reazione catalizzata
• Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per:
–Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate.
–Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche
–Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti.
–L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.
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COFATTORI ENZIMATICICOFATTORI ENZIMATICI
- OloproteineOloproteine
• l’attività dipende soltanto dalla struttura proteica
- Eteroproteine:Eteroproteine:
• l’attività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori
• Il cofattore può essere:- un coenzima (NAD+, NADP+, ADP, ATP)- un gruppo prostetico (FMN, FAD)- uno ione metallico (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+)
APOENZIMA (Parte proteica)
OLOENZIMA
coenzima
ione metallico
gruppo prostetico (legato covalentemente)
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VITAMINE: precursori di coenzimi
COFATTORI
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CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMICLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI
1. ossidoreduttasi
2. transferasi
3. idrolasi
4. liasi
5. isomerasi
6. ligasi
•Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura
generale delle reazioni catalizzate:
Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta
comprendono delle sotto-sottoclassi
•Un enzima ha generalmente:
-un nome comune
-un nome sistematico
-un numero di classificazione
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NOMENCLATURANOMENCLATURA
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UNITÀ DI MISURAUNITÀ DI MISURA
• Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come
qualunque altra proteina
• Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività attività
cataliticacatalitica (o attività enzimatica)
• L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.)(U.I.)
Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in
grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al
minuto in condizioni standardizzate
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G6125 Glucose Oxidase Aspergillus niger Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen)
Synonyms -D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase
GOx
G.Od.
CAS Number 9001-37-0
Enzyme Commission (EC) Number
1.1.3.4
EG/EC Number EINECS
MDL number MFCD00131182
Analysis Note Protein determined by Biuret method.
Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice.
Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate.
Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of -D-glucose to D-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%.
Propertiesstorage temp. 20°Cforeign activity Catalase2 Sigma units/mg solidforeign activity amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 %
ReferencesMerck Merck13, 4473
Safety Information
Hazard Codes XnRisk Statements 42Safety Statements 22-45RTECS RQ8452000
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P6782 Peroxidase horseradish Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder
Synonyms Horseradish peroxidase
Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase
CAS Number 9003-99-0
Enzyme Commission (EC) Number
1.11.1.7
EG/EC Number 2326686
MDL number MFCD00071339
Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid
Linkage Similar to P8375
Packaging Packaged in mg solid
Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0
Analysis Note Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed.
Analysis Note The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity.
Unit Definition One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C.
Description
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C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp. buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret)
Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase
CAS Number 9028-76-6
Enzyme Commission (EC) Number
1.1.3.6
MDL number MFCD00130783
Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization.
Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0
storage temp. 20°C
Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977)
Identifiers
Description
Properties
References
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Glucose Dehydrogenase Bacillus megaterium BioChemika ~33 units/mg
Identifiers
Synonyms -D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase
CAS Number 9028-53-9
Enzyme Commission (EC) Number
1.1.1.47
EG/EC Number 2328369
MDL number MFCD00131181
Description
Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate
Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmol-D-glucose to D-glucono--lactone per minute at pH 7.6 and 25°C
Properties
mol wt Mr~120000
storage temp. 20°C
References
Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990)
49165
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ISOENZIMI
• Gli enzimi non hanno una struttura omogenea
Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica,
diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverseproprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale,
affinità per substrato e coenzima…..
Es.Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone)
LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)
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METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI
•Metodi elettroforetici
•Metodi cromatografici
•Metodi di elettrofocalizzazione
METODI NON SELETTIVI
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METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI
METODI SELETTIVI
•Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,…
•Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi
•Inibizione immunologica Anticorpi
•Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH1
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Infarto miocardico
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Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta
ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI
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ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONEENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE
• L’energia libera di attivazione G è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione
stato iniziale
stato finale
statodi transizione
energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata)
energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata)
energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata)
energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata)
cambiamento totale di energia libera durante la reazione
direzione della reazione
ener
gia
liber
a
• Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione
• Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione
• La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione
• Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità aumentando la velocità delle reazioni chimichedelle reazioni chimiche
E + S ES E + P
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ATTIVITÀ ENZIMATICAATTIVITÀ ENZIMATICA
• L’attività di un enzima’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione
da esso catalizzata
• La velocità di reazionevelocità di reazione viene misurata in termini di quantità di
substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo
• La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche
ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità
diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in
relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti
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CINETICA CHIMICACINETICA CHIMICA
• Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti
• Reazioni di 1° ordine1° ordine]A[K
dt
]A[dv
A P
A + B P
2 A P
• Reazioni di 2° ordine2° ordine
]B][A[Kdt
]A[dv
2]A[Kdt
]A[dv
• Reazioni di ordine 0ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti
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• In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta
A P
EA P
• In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso
• Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo
dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili,
mentre V e Km sono due costanti
[substrato]
ve
loc
ità
][
][
sK
sVv
m
CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA
vmax
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EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
• L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione
di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten
• Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad
alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES]
• Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui
Vmax = k2[E]
• L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza
della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di
enzima
]s[K
]s[Vv
m
max
]s[K
]s[]E[kv
m2
k1 k2
E + S ES E + P k-1
k1 k2
E + S ES E + P k-1
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• Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato
• Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni
][s Km>>
1° ordine
Regione 1
La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]
Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato
][][2
KsE
kvm
][max
KsV
m
1
2
3
CINETICA ENZIMATICA
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Regione 2
Regione non utile dal punto di vista analitico
][s intermedie ordine misto
v maxVmax
2V
][s Km>> ordine 0
Regione 3
][2 Ekv maxV
Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica
1
2
3
CINETICA ENZIMATICA
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DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
tempo
[P]
• La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ inizialevelocita’ iniziale della reazione (v0) o (vi)
Vantaggi:
Si misura sicuramente la Vmax
L’enzima è in buone condizioni
Non ci sono problemi di inibizione da prodotto
Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse
Metodi analitici rapidi
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(s/T) Approccio dispendioso in termini di tempo
Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipuntometodi ad un punto, a due punti, multipunto
tempo
Seg
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alit
ico
s
t
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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• Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica
anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla
• Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il
plateau
• Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario
per raggiungerlo
• Inconvenienti:
– difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato
errore sulla misura)
– tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la
misura di attività enzimatiche basse
tempo
[P]
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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METODI AD UN PUNTOMETODI AD UN PUNTO
• Affinchè la misura sia accurata:
– il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo
– ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura
• Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione
• Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione
tempo
seg
na
le
tx
Sx
• La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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METODI AD UN PUNTOMETODI AD UN PUNTO
Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto
• Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti analizzatori discreti automatici
- Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore)
• Metodi automatizzati basati su analizzatori a flussoanalizzatori a flusso continuo automatici
- Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema
Approccio tecnico
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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METODI A DUE PUNTIMETODI A DUE PUNTI
Affinchè la misura sia accurata:
• ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la
misura
Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione
Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema
Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come S / t
tempo
seg
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let1
S1
t2
S2
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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METODI A DUE PUNTIMETODI A DUE PUNTI
Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti
• Metodi automatizzati basati su analizzatori discretianalizzatori discreti automatici
- Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura
- A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale
• Metodi automatizzati basati su analizzatori a flussoanalizzatori a flusso continuo automatici
- La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa
- Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure
Approccio tecnico
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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ENZIMI IN DIAGNOSTICA
Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma–Aumento del turnover cellulare–Proliferazione cellulare (neoplasia)–Aumento di sintesi enzimatica (induzione)–Lesione di un tessuto–Ostruzione della secrezione–Diminuzione della eliminazione (clearance)
Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da:-sintesi dell’enzima-stato d’integrità delle membrane cellulari-fenomeni di distribuzione-velocità di eliminazione
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Alcuni enzimi del plasmaEnzima Organo Cause di aumento Note
Fosfatasi alcalina (ALP)
Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale
Gravidanza, infanzia
Osteomalacia, cirrosi epatica,
Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale
Isoenzimi identificabili per elettroforesi
Fosfatasi acida
Prostata Tumore prostatico Enzima labile
Aspartato transami-nasi (AST o GOT)
Fegato e miocardio
Epatite/necrosi epatica,
Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica
Fisiologico in neonati
Normale: ALT<AST
Epatite: ALT>AST
Gamma glutamil transferasi (GGT)
Fegato, rene, pancreas
Colestasi epatica
Epatite, cirrosi, pancreatite
Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca
Marker di sindromi epatobiliari
Creatin chinasi (CK)
Distrofia muscolare, infarto del miocardio BB cervello
MB cuore
MM muscolo
Amilasi Ghiandole salivari, pancreas
Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari
Lattato
Deidrogenasi
(LDH)
Isoenzimi danno indicazioni più
specifiche
Alanina Transaminasi
(ALT o GPT)
Fegato Aumenta in epatiti e cirrosi
Colineste-rasi Fegato Livello basso indica disfunzione epatica
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EFFETTO DEL pHEFFETTO DEL pH
Il profilo a campana è il più comune
6 8 10
tripsina
6 8 10
colinesterasi
4 6 8
papaina
2 4 6
pepsina
pH
attiv
ità e
nzim
atic
a re
lativ
a
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EFFETTO DELLA TEMPERATURAEFFETTO DELLA TEMPERATURA
• Gli enzimi hanno diversa stabilità termica
• La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica
T (°C)
attiv
ità e
nzim
atic
a re
lativ
a
20 40 60
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MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICAMISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Reazioni enzimatiche semplici
Condizioni sperimentali
– Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso
– pH e Temperatura controllati rigorosamente
– Attenzione alla inibizione da substrato
SE
P
DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE
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MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICAMISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Reazioni enzimatiche accoppiate
Altre condizioni peculiari
– La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante– Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione
primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente– può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria– può seguire una via metabolica diversa
• Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1 ≥ 100
SEprim.
P1
Eind.
P3
Eaus.
P2
SEprim.
P1
Eind.
P2k1 k2
Condizioni sperimentali
– Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso
– pH e Temperatura controllati rigorosamente
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DETERMINAZIONEDETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
• Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come
“strumenti” analitici“strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di
interesse con i seguenti vantaggi:
– L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi
diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione
e purificazione
– L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano
caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto
piccoli di campione
Maggiore rapidità Maggiore accuratezza
Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici
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• Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato
• Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni
][s Km>>
1° ordine
Regione 1
La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]
Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato
][][2
KsE
kvm
][max
KsV
m
1
2
3
CINETICA ENZIMATICA
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METODI A PUNTO FINALE SEMPLICIMETODI A PUNTO FINALE SEMPLICI
• Esempio: acido lattico
• Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano
– Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica
– Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina)
Acido latticoAcido lattico + NAD+ Acido piruvico + NADH + H+
LDH
SEind.
P– Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T
ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente
DETERMINAZIONEDETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
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METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATIMETODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI
– La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere
continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano,
garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il
consumo completo del substrato
Condizioni sperimentali
– Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso
– pH e Temperatura ottimali
SEaus.
P1
Eind.
P2
DETERMINAZIONEDETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
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METODI DI MISURAMETODI DI MISURA
• La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse
• Tali proprietà devono poter essere misurabili
• I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono:
– spettrofotometrici
– luminometrici
• Altri metodi sono:
– potenziometrici, conduttometrici, polarografici
• Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati
e si basano su:
I. Misura diretta
II. Misura mediante derivati chimici
III. Misura mediante derivati generati enzimaticamente
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
• Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici)
– Esempio:
p-nitrofenilfosfato +H2O p-nitrofenolo + fosfato
fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo)
• Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami)
– Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina
• Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV:– lampada a idrogeno per generare 200-300 nm
– cuvette di quarzo costose
– proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV
I. Misura diretta
AP
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
• L’attività enzimatica delle
ossidoreduttasi che utilizzano
(consumano o producono) NAD(P)H
come cofattore può essere determinata
direttamente perché il NAD(P)H ha un
massimo di assorbimento caratteristico
a 340 nm che non si trova nel cofattore
in forma ossidata NAD(P)+
• Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di
eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm
– Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico
– Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo
Lunghezza d’onda (nm)
Ass
orb
anz
a
I. Misura diretta
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
• Sali di tetrazolio
Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare
II. Misura mediante derivati chimici
N
R3C
NR2
N+R1
N
Cl-
N
CR3
R2N
+ N
N
N
R3C
NR2
N+
N
Rx Ry2Cl-
Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico
R = gruppi aromatici
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
• Sali di tetrazolio
Esempio: alcol deidrogenasi
• Il valore di dei formazani (m2/mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H
(m2/mol) , perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = bc)
Etanolo
Acetaldeide
NAD+
NADH + H+ PMS
PMSH
Prodotto di riduzione (formazano)
Sale di tetrazolio
PMS = fenazina metasolfato
Alcol deidrogenasiAlcol deidrogenasi
II. Misura mediante derivati chimici
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
III. Misura mediante derivati generati enzimaticamente
•Accoppiamento con ossidoreduttasi
YH2 + NAD(P)+ Y + NAD(P)H + H+
X + NAD(P)H + H+ XH2 + NAD(P)+
Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH)
2-Oxoglutarato
Glutammato
Alanina
Piruvato Piruvato
Lattato
NADH + H+
NAD+
ALTALT LDH
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
•Accoppiamento con perossidasi
Esempio: glucosio ossidasi
Glucosio
Acido gluconico
H2O + O2
H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico
Prodotto colorato o fotoni
Glucosio Glucosio ossidasiossidasi
Perossidasi
III. Misura mediante derivati generati enzimaticamente
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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI
Esempio: fosfolipasi
Fosfatidilcolina + 2H2O Acido fosfatidico + ColinaFosfolipasi
Colina + 2O2 Betaina + 2H2O2
Colina ossidasi
2H2O2 + Accettore Prodotto colorato + 2H2O + O2
Perossidasi
•Accoppiamento con perossidasi
III. Misura mediante derivati generati enzimaticamente
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ASPETTI QUANTITATIVIASPETTI QUANTITATIVI
• interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione
costruita con degli standard a concentrazione nota di analita
• confronto con un’unico standard, attraverso la relazione
derivante dalla legge di Lambert-BeerCsAs
AcCc
b
AcCc
b
AsCs
Cs
Asb Cs
As
AcCc
Nel caso della concentrazione dell’analitaconcentrazione dell’analita nel campione tramite
enzimi, nei metodi spettrofotometrici questa viene determinata
mediante:
• Quando non si dispone di uno standard puro, la
concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente
di estinzione molare del prodotto colorato, sfruttando la legge di
Lambert-Beer
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ASPETTI QUANTITATIVIASPETTI QUANTITATIVI
Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione
e del volume v del campione:
v
V
b
A)L/mmol(C
v
V
10b
.m.pA)dL/mg(C
Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da
applicare funzioni che tengono conto di questi fattori
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METODI NON SPETTROFOTOMETRICIMETODI NON SPETTROFOTOMETRICI
•Misure conduttimetriche
CO(NH2)2 + H2O 2NH4+ + CO3
2-UreasiUreasi
Esempio
Utilizzo di elettrodo specifico per NH4+
•Misure polarografiche
glucosio + O2 acido gluconico + H2O2
Glucosio ossidasiGlucosio ossidasiEsempio
Utilizzo di elettrodo selettivo per O2
È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio
perossidasiperossidasi
accettore prodotto colorato
derivatizzazionechimica
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METODI NON SPETTROFOTOMETRICIMETODI NON SPETTROFOTOMETRICI
•Misure potenziometriche
triacilgliceroli + H2O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi- + H+
LipasiLipasi
Esempio
Utilizzo di elettrodo per H+ (misura di pH)
•Misure microcalorimetriche
Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche
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ENZIMI IMMOBILIZZATIENZIMI IMMOBILIZZATI
Vantaggi
• Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi)
• Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili)
• Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne
• Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari
Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici
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ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODIENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI
• Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi
• L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio
Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico
CO(NHCO(NH22))22 + 2H2O + H+ 2NH4+ + HCO3
-Ureasi
Esempio
• In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea
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PRINCIPI DI RIVELAZIONEPRINCIPI DI RIVELAZIONE
• Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali:
– spettrofotometria
– spettrofluorimetria
• un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore
dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi):
– chemiluminescenza
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BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZABIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA
• La luminescenzaluminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica
nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della
transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello
energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale
• La chemiluminescenza (CL)chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui
l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una
reazione chimica
• La bioluminescenza (BL)bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel
visibile che si verifica in organismi viventi
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SISTEMI CHEMILUMINESCENTISISTEMI CHEMILUMINESCENTI
• Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette
• Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia
Prodotto + [Accettore]*
Substrato CL
[Prodotto]*
Prodotto + h Accettore + h
+ Accettore
Diretta Indiretta
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SISTEMI CHEMILUMINESCENTISISTEMI CHEMILUMINESCENTI
luminolo
NHNH
NH2 O
O
aminoftalato
+ N2 + H2O + hperossidasi
H2O2/OH-
COO-
NH2
COO-
Luminolo/H2O2/Perossidasi
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SISTEMI CHEMILUMINESCENTISISTEMI CHEMILUMINESCENTI
1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina
HPO42-
O
+
O-OOCH3
*+ F F + h
O OOCH3
OPO32-
AMPPD
O-OOCH3 *
+ F
fosfatasi alcalina
OCH3
O-AMP-D
O O
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SISTEMI CHEMILUMINESCENTISISTEMI CHEMILUMINESCENTI
1,2-Diossietani-fenil--D-galattopiranoside/-Galattosidasi
O O OCH3
O O
OH
HO OH OH
O
O O OCH3
o-
OOCH3
o-
Oh+
-galattosidasi
+
OCH3
o-
O*
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SISTEMI BIOLUMINESCENTISISTEMI BIOLUMINESCENTI
• Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis
(lucciola nord-americana)
• L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1
luciferina + ATP + O2 ossiluciferina + CO2 + AMP + P~P + luceluciferasi
Mg2+
+ AMP + + luceN
S
S
NHO COOHH
N
S
S
NHO O
+ ATP
O2, Mg2+
luciferina
luciferasipirofosfato
BL/CL =n. fotoni emessi
n. molecole reagenti
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SISTEMI BIOLUMINESCENTISISTEMI BIOLUMINESCENTI
• Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio
fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum
• Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una
ossidoreduttasi che produce FMNH2
O2
NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2
FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + luce
ossidoreduttasi
luciferasi
CH3(CH2)12CHO + FMNH2 CH3(CH2)12COOH + FMN +
luciferina batterica
luciferasi batterica
luce
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ASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHEASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHE
Aspetti quantitativi:
• La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi
• In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è
proporzionale all’attività enzimatica
• Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione
luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato
• La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione
adatto all’analisi quantitativa
Caratteristiche analitiche:
• Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a
quella dei radioisotopi
• Minimo segnale di fondo dovuto alla matrice biologica rispetto alla
fluorescenza
• Ampio intervallo dinamico
• Rapidità di risposta
• Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi
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APPLICAZIONI ANALITICHEAPPLICAZIONI ANALITICHE
• Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in
fluidi biologici, omogenati di tessuto, ..
• Determinazione della concentrazione di metaboliti o
dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche
accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H2O2/H2O
Luminolo/H2O2/Perossidasi
colesterolo ossidasicolesterolo colesterolo H2O2
fosfolipasi D colina ossidasi
fosfolipidifosfolipidi colina H2O2
perossidasiluminolo aminoftalato + N2 + H2O + h H2O2/OH-
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APPLICAZIONI ANALITICHEAPPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi da lucciola
• Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi
adeninici in campioni biologici
• Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di
enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono
chinasi e la formazione o degradazione di ATP
creatininacreatinina creatina
creatina + ATP creatina-fosfato + ADP
ATP + luciferina + O2 AMP + P~P + CO2 + ossiluciferina + h
creatinina ammide idrolasi
creatina chinasicreatina chinasi
luciferasi
Mg++
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APPLICAZIONI ANALITICHEAPPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi batterica
• Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con
maggiore sensibilità per il NADH (fmoli)
• Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di
enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono
deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H
R-OHR-OH + NAD+ R=O + NADH
NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2
FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + h
7-idrossisteroide-deidrogenasi
ossidoreduttasi
luciferasi
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APPLICAZIONI COMMERCIALIAPPLICAZIONI COMMERCIALI
Rapid Enzymatic Tests for Glucose Introduction:Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below.Step 1:Glucose -----------Glucose Oxidase --------Glucose ----------------------- > Gluconic Acid + H2O2Step 2: Clinistix and Dextrostix: ----------H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase --------H2O2 + chromogen orthotolidine ------------- > oxidized orhotolidine--------Diastix: --------H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase --------H2O2 + Potassium iodide ------------------ > iodine complex The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples.
Materials: Please refer to class notes and p. 82-82b of the Laboratory Manual .
Bottles of Reagent Strips
Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be usedProcedure:Clinistix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart providedDextrostix:
· Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediatelyDiastix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart