FT-Infrarot-SpektroskopieFT-Infrarot-SpektroskopieStefan Zorn, Fajun Zhang, Alexander Gerlach

Institut für angewandte Physik Tübingen

Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie

-- Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) eignet sich hervorragend zum Nachweis von chemischen Substanzen und der Bestimmung ihrer chemische Umgebung und Konformation-- sie spielt eine wichtige Rolle bei der Analyse von Oberflächen und-Substanzen

-Ziele diese Praktikumsversuches:- - Verständnis des Messprinzips von FT-IR - - Erlernen grundlegender Labortechniken- - Umgang und Experimentieren mit biologischen - Präparaten- - Analyse von Spektren und Auflösungs-- verbesserung mit Hilfe mathematischer Methoden und Programme

FT-IR Spektrometer als Interferometer

2

nd

Verschiebung der Absorptionsbanden durch Tausch H2O D2O

Amid I Absorptionsbande von Papain

Myoglobin- Sauerstofftransportim Muskel- vorwiegend α-Helix

BSA-Aufrechterhaltung osmotischer Druck- vorwiegend α -Helix

Papain-Verdauungsenzym- α-Helix- β-Faltblatt- Schleife

α -Helix

Schleife

β-Faltblatt

Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen

Sekundärstrukturanalyse- der planaren Peptidgruppe können 9 Schwingungsmoden zugeordnet werden (Amid A, Amid B und Amid I – VII)- insbesondere in der Amid I Bande (Hauptanteil C-O-Streckschwingung) lassen sich die verschiedenen Sekundärstrukturelemente gut unterscheiden- mit mathematischen Methoden (höhere Ableitungen, Fourier-Selbstdekonvolution,…) ist es möglich die sich überlappenden Absorptionsbanden zu trennen und ihre Positionen zu bestimmen- durch Fitten und Integration von Gaußkurven an diesen Positionen wird der Anteil der einzelnen Strukturmerkmale ermittelt

μ

Wahrscheinlichkeit der Absorption:

2

Er

I el

1

Interferenz an zwei parallelen Platten im Abstand d

Probenhalter für IRTransmissionsmessungen

IR-Transmissionsspektrum der leeren Zelle bei verschiedenen Abständen der beiden BaF2-Platten

Mit Hilfe der Messung der leeren Zelle kann die tatsächliche Dicke desAbstandshalters zwischen den Kristallplatten, der die Dicke der Schichtder Proteinlösung bestimmt, genau vermessen werden.

H2O

D2O

Vor allem aufgrund der verschiedenen Masse von Deuterium- bzw. Wasserstoffatomen liegen die Absorptionsbanden von Wasser (blau) und Deuteriumoxid (rot) in verschiedenen Bereichen. Dies macht man sich zunutze um die Absorption von Proteinen in Lösung (Deuteriumoxid) beobachten zu können und auch die Reinheit des Deuteriumoxids festzustellen.

Absorptionsspektren von Wasser (blau), Deuteriumoxid (rot) und einer Mischung beider (grün)

Fourier Transformations Infrarot Spektrometer (FTIR) Vertex70 mit Transmissionseinheit

Schematischer Aufbau eines FTIR-Spektrometers

Im Versuchsaufbau wird ein FT-IR Spektrometer verwendet, es bietet durch seine Fähigkeit die Frequenz der IR-Strahlung auf den Wegunterschied in einem MichelsonInterferometer umzusetzen die Möglichkeit alle Frequenzen auf einmal zu messen undarbeitet somit schneller, genauer und vor allem mit einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis als Spektrometer mit dispersiven Elementen

Versuchsaufbau

Physikalische Grundlagen der IR-Spektroskopie

Je höher der Anregungszustand desto stärkerWeicht das tatsächliche Potential von derharmonischen Näherung ab

Jedes Molekül hat eine bestimmte Anzahl von Normal-Moden – voneinander unabhängige Schwingungen.Man unterscheidet Streck- (Schwingung in Richtungder Bindung) und Deformationsschwingungen.Ändert sich bei der Schwingung das Dipolmoment desMoleküls so ist diese IR-aktiv und kann angeregt werden.Hier sind die Normalmoden von Wasser und Kohlen-dioxid dargestellt.

Proteinpuder und Laborwaage zur Herstellungder Proteinlösungen