Download - Fundamentos de Extração de DNA e RNA
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MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Extração de DNA e RNA
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Importância
Uso de DNA para estudos de natureza variada:
• diagnóstico (sensível e específico);
• medicina (estudo do câncer; identificação doenças);
• processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);
• genoma
• investigações de perícia, paternidade...
Uso de RNA para estudos de natureza variada:
• Transcrição Reversa do RNA (cDNA);
• Análises de expressão gênica
• Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA
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Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
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A extração e a purificação de ácidos nucléicos é uma etapa fundamental para
se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em
cadeia da polimerase (PCR).
Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
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Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
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Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
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Tipos de DNA
Procariontes (sem núcleo)
• DNA circular;
• DNA plasmidial;
Fator adicional: parede celular
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Extração de DNA/RNA
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
• degradação proteínas;
• purificação do DNA/RNA.
Para cada tipo de amostra, vários protocolospodem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
micelas
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album;
É capaz de digerir a queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”.
Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentesDigestão em banho-maria com
temperatura próxima a 50°C Proteinase k
O tempo de incubação pode variar. Importante é que a amostra se apresente totalmente digerida
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Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas Aviso: O fenol é um produto altamente tóxico, irritante para a pele e
mucosas
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa.
Clorofórmio: retira resíduos de fenol
Extração de DNA/RNA
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Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• purificação do DNA/RNA (eliminação de resíduos orgânicos)
A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico.
Uso de álcool para a precipitação
formação do Pellet
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• A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.);
• DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes;
• Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas...
Notas - Extração de RNA
• Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos;
• DNAse;
• O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas.
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Quantificação DNA/RNA
Espectrofotômetro
• Qualidade da extração
• Determinação da quantidade de
DNA/RNA extraído
260 e 280 nm
razão 260/280 =
nucleotídeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm
280 nm para estimar a contaminação com proteínas
1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada
Um valor inferior indica contaminação com proteínas e um valor superior indica contaminação com RNA.
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Conservação da amostra
• Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em álcool
absoluto imediatamente após a coleta, e trocado após 24h.
• Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com sílica.
• Para todas amostras congeladas em estoque, é preferível o fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofradescongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA.
• O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados
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Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório
tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos
procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte:
a) Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos
b) Capelas de exaustão.
c) Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura.
d) Microtubos de polipropileno.
e) Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras).
Material Necessário
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MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Eletroforese Agarose (AGE) e
Poliacrilamida (PAGE)
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• É um método simples e muito eficiente para separar, para identificar e
para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas.
• Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua
carga elétrica e seu peso molecular.
• Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e
moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo).
Eletroforese
A migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é chamada de eletroforese.
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Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Eletroforese
AGE
+-
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Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-AGE
+-
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Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-AGE
+-
Fonte
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Eletroforese
Pólo +
Pólo -
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Equipamento - Agarose
• Ágar-ágar (ágar ou agarose)
• É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta;
• insolúvel em água fria
• dissolve em água quente (absorve uma quantidade de água de cerca de vinte vezes o seu próprio peso) formando um gel não-absorvível, não-fermentável e com importante característica de ser atóxico.
• Concentrações de 0,5 – 2,5% Diluídos no tampão TBE ou TAE.(Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)
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Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
•Tamanho do DNADiferentes tamanhos de moléculas, diferentes taxasde migração no gel de agarose
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
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•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
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•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNAem ≠ formas ou conformação do DNA,a migração ≠ velocidades
DNA superenrolado mais lentoDNA linear mais rápida
Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
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Equipamento - Agarose
Agarose tampão aquece
Despeja na formacom o pente
Cuba com Tampão TBE ou TAE
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Equipamento
DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)
marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra
High...)
(+)
DNA com fragmentos de tamanho conhecido
aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida
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Equipamento
DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)
Coloração com brometo de Etídio (EtBr) (0,0001%).
marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra High...)
(+)
Depois de migrar o suficiente.....
Transiluminador (caixa de luz UV)
aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida
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Brometo de Etídio
AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório.
Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos
Fluorescente na luz ultravioleta
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Equipamento - Poliacrilamida
Utilizado tanto para Proteínas quanto para DNA/RNA
Composto por Acrilamida e Bis-AcrilamidaAVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou
absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.
Concentrações diferentes – quanto mais acrilamida, menores os poros
Proteínas: a carga e a forma devem ser excluídas, com adição de SDS (dodecilssulfato de sódio) que possui carga negativa
– converte proteínas em estrutura linear
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Equipamento - Poliacrilamida
Coloração com:
Brometo de Etídio (EtBr),
prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e
análise de amostra diluída)
SYBR Green (menos mutagênico)
Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. É menos sensível que corar com a pratamas efetivo também, além de ser fácil de corar
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Fotodocumentação
Transluminador
Caixa acoplada máquina fotográfica
Computador
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AGE X PAGE
É mais difícil de ser preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução.
menor capacidade de resolução, porém apresenta maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)
Fácil preparo, não-tóxico.
tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base).
podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.
também usados para separação de proteínas