![Page 1: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/1.jpg)
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
A Genética Molecular em Análises Clínicas
![Page 2: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/2.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 3: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/3.jpg)
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-LambertC=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente)
![Page 4: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/4.jpg)
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente)
![Page 5: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/5.jpg)
Espectofotometria
![Page 6: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/6.jpg)
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente) AA(contaminantes)(contaminantes)
![Page 7: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/7.jpg)
maxmax=260 nm=260 nm max(proteínas) max(proteínas) =280 nm=280 nm ref ref =320 nm=320 nm Concentração = f(ODConcentração = f(OD260260). Se L=1cm:). Se L=1cm:
dsDNA 1OD=50µg/mldsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/mlssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/mlssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)
..
Quantificação de DNA
)280(
)260(
fPureza
![Page 8: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/8.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 9: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/9.jpg)
Fazer um gel de agarose
![Page 10: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/10.jpg)
Electroforese
![Page 11: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/12.jpg)
ELECTROFORESE
V=IR V=IR P=IP=I22RR A resistência é inversamente proporcional á secção e á A resistência é inversamente proporcional á secção e á
força iónica da soluçãoforça iónica da solução
![Page 13: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/13.jpg)
TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE)Agarose (TAE e TBE)
SeakamSeakam NusieveNusieve Nusieve 3:1Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc)outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturanteformamida como desnaturante
Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida Acrilamida/bisacrilamida
/TEMED /peróxido de amónio/TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturanteSDS como desnaturante
HorizontaisHorizontais VerticaisVerticais
![Page 14: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/14.jpg)
Electroforese em campo pulsado (PFGE)
![Page 15: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/15.jpg)
Electroforese Capilar
Electroforese em capilares de pequeno Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno)interno)
Utiliza campos eléctricos muito elevados Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiênciacalor com muita eficiência
Separações muito boas, num período de Separações muito boas, num período de tempo inferior. tempo inferior.
![Page 16: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/16.jpg)
Electroforese Capilar (II)
Fluxo Electro-osmótico (FEO):Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos
funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. negativo, carregando consigo moléculas do solvente.
Moléculas neutras viajam á velocidade do FEOMoléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEOMoléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEOMoléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com todas as moléculas migram para o pólo negativo (com
velocidade que depende da sua carga e do seu peso velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.aparelhagem utilizado em HPLC.
![Page 17: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/17.jpg)
Electroforese capilar (III)
![Page 18: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/18.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 19: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/19.jpg)
REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Brometo de etidio e análogosBrometo de etidio e análogos RadioactividadeRadioactividade
3232P e P e 3333PP 3535SS 125125II 1414CC 33HH Tempos de exposiçãoTempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidorCassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geisNecessidade de secagem dos geis
Nitrato de prataNitrato de prata
![Page 20: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/20.jpg)
Marcação de sondas
Radio-isótoposRadio-isótopos 3232PP 3333PP 3535SS 33HH 1414CC 125125II
![Page 21: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/21.jpg)
DigoxigeninaDigoxigenina BiotinaBiotina
detecção directa da cadeia dupladetecção directa da cadeia dupla
Marcação de sondas
![Page 22: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/22.jpg)
Enzimas para a marcação de sondas PolimerasesPolimerases
Actividade exonucleoliticaActividade exonucleolitica Temp. optimaTemp. optima estabilidade térmicaestabilidade térmica
TdTTdT
![Page 23: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/23.jpg)
Tipos de sondas
OligonucleótidosOligonucleótidos inserts de plasmideosinserts de plasmideos prod. de PCRprod. de PCR
![Page 24: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/24.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 25: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/25.jpg)
Fotografia
![Page 26: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/26.jpg)
FOTOGRAFIA
Abertura do diafragmaAbertura do diafragma Tempo de exposiçãoTempo de exposição Focagem e profundidade de focoFocagem e profundidade de foco Filtros necessáriosFiltros necessários Tipos de fotos PolaroidTipos de fotos Polaroid Sistemas alternativosSistemas alternativos
![Page 27: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/27.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 28: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/29.jpg)
Aquisição computorizada de imagens de geis
![Page 30: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/30.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 31: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/32.jpg)
Integração de histogramas
![Page 33: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/33.jpg)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
![Page 34: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/34.jpg)
Reacção de restrição
![Page 35: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/35.jpg)
SISTEMAS R-M
Protecção contra DNA estranhoProtecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%)TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas)TIPO II: (93% das enzimas)
reconhecem sequencias simétricas cortando reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequenciasentre as sequencias
As endonucleases requerem MgAs endonucleases requerem Mg2+ 2+ e as e as metiltransferases requerem s-adenosylmetioninametiltransferases requerem s-adenosylmetionina
endonucleases compostas por um homodimeroendonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomerometiltransferases compostas por monomero
![Page 36: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/36.jpg)
SISTEMAS R-M
TIPO IIs:TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de como as Iis, mas com sequencias de
reconhecimento assimétricas e interrompidasreconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência local de corte a até 20 nucleótidos da sequência
reconhecidareconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para Metilação efectuada po 2 metilases (uma para
cada cadeia, podendo ser metiladas bases cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia)diferentes em cada cadeia)
TIPO III: pouco frequentes (<1%)TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantesTIPO IV: as restantes
![Page 37: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/37.jpg)
MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO
Instabilidade térmicaInstabilidade térmica Concentração de glicerolConcentração de glicerol Tampão de reacçãoTampão de reacção Actividade enzimática:Actividade enzimática:
1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNAconformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzimautilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µlvolume total > 50µl Homogeneizar por pipetagemHomogeneizar por pipetagem Verificar a temperatura de reacçãoVerificar a temperatura de reacção
![Page 38: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/38.jpg)
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
Genética Molecular em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações Técnicas de estudo de mutações desconhecidasdesconhecidas
![Page 39: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/39.jpg)
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas
Métodos Baseados No TmMétodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clampsMelting Profiles and GC clamps DGGEDGGE
• PerpendicularPerpendicular• ParaleloParalelo
CDGECDGE TTGETTGE
Métodos Baseados na conformaçãoMétodos Baseados na conformação SSCPSSCP HAHA CSGECSGE
![Page 40: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/40.jpg)
“Melting Profiles”
Vários domínios de fusãoVários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapasAs moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gelMoléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu PmMoléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão totalPodem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
![Page 41: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/41.jpg)
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gradiente de desnaturaçãoGradiente de desnaturação QuímicoQuímico TemperaturaTemperatura
O gradiente pode ser:O gradiente pode ser: Perpendicular ao Perpendicular ao
campo eléctricocampo eléctrico Paralelo ao campo Paralelo ao campo
eléctricoeléctrico
![Page 42: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/42.jpg)
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
![Page 43: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/43.jpg)
Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)
![Page 44: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/44.jpg)
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Não existe um gradiente no gel, Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corridaem cada momento da corrida
Existe uma temperatura Existe uma temperatura crescente ao longo da corridacrescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração Em cada momento, a migração em cada molécula depende de em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não esta já ter atingido ou não algum domínio de fusãoalgum domínio de fusão
![Page 45: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/45.jpg)
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
VantagensVantagens
Mais fácil de fazer os Mais fácil de fazer os geisgeis
Mais reprodutível de Mais reprodutível de gel para gelgel para gel
DesvantagensDesvantagens
Mais difícil de acertar Mais difícil de acertar a gama de Tma gama de Tm
![Page 46: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/46.jpg)
Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA
não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA
depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)
![Page 47: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/47.jpg)
Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-
desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas
Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de desnaturanteConcentração de desnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos
(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)
WT1
WT2
mutantes
![Page 48: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/48.jpg)
Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M
![Page 49: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/49.jpg)
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA
![Page 50: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/50.jpg)
Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio:Principio:
Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais.conformacionais.
Método:Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus porosaumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bpUtilizar fragmentos com 300-800 bp
![Page 51: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/51.jpg)
Hibridização
desnaturar
![Page 52: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/52.jpg)
Hibridização
Adicionar sonda
![Page 53: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/53.jpg)
Hibridização
![Page 54: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/54.jpg)
Hibridização
Adicionar substracto
![Page 55: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/55.jpg)
Dot-Blot
![Page 56: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/56.jpg)
Variações
Hibridização em microplacaHibridização em microplaca hibridização reversahibridização reversa
![Page 57: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/57.jpg)
DEIA(hibridização reversa em microplaca)(detecção com anti-dsDNA)
![Page 58: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/58.jpg)
Inno-Lippa
Hibridização em filtroHibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)(tipo código de barras) Hibridização reversaHibridização reversa Marcação no produto do PCRMarcação no produto do PCR
![Page 59: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/59.jpg)
![Page 60: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/60.jpg)
Resultados do INNO-LIPA
![Page 61: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/61.jpg)
MEIA
![Page 62: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/62.jpg)
![Page 63: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/63.jpg)
Southern Blot
![Page 64: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/64.jpg)
![Page 65: Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081721/552fc101497959413d8bd72d/html5/thumbnails/65.jpg)
Northern Blot
Semelhante ao SouthernSemelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNAUtiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restriçãoNão utiliza reacções de restrição