GLYCOBIOLOGIEET
MYOGENESE :
UTILISATION DES SOURIS GDF8 -/-
Véronique BLANQUETFabrice DUPUYLionel FORESTIERLaëtitia MAGNOLEmilie PINAULTKarine VUILLIER
Séminaire du 13 juin 2008
Unité de Génétique Moléculaire AnimaleUMR 1061
Quels sont les acteurs, associés à la glycobiologie, qui interviennent dans le développement musculaire ?
PROBLÉMATIQUE :
« La glycobiologie est une nouvelle discipline scientifique qui allie les fondements de la biochimie et de la biologie moléculaire des glucides, pour étudier et comprendre la structure , la biosynthèse et la biologie des glycanes ».
DÉFINITION :
Comparaison entre : souris « sauvage » et souris GDF8 -/-
Echantillons biologiques : 20 souris sauvages (Orléans) et 20 souris GDF8 -/- (Limoges) :
(Fond génétique Fvb)
- 5 individus ♂ âgés de 3 sem - 5 individus ♂ âgés de 12 sem- 5 individus ♀ âgés de 3 sem - 5 individus ♀ âgés de 12 sem
muscle squelettique – foie – cœur – cerveau
APPROCHE SCIENTIFIQUE :
Etude Transcriptomique (Glyco-TLDA)
Etude Protéomique (2D-DIGE)
Droit fémoral
DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE :
Broyat musculaire
Broyage dans l’azote liquide
ARN totaux
ADNc
Données PCR-q
20 mgRNA easy kit
AgilentcDNA Archive Kit
TLDA
Transcriptomique Protéomique
Protéines totales
Protéines microsomales
Données protéomiques
Electrophorèse 2DDIGE
Approche Transcriptomique
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Marqueurs myogéniques
Pax3 Pax7 Tropomyosine
GDF8+/+ 3 sem
GDF8+/+ 12 sem
GDF8-/- 3 sem
GDF8-/- 12 sem
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Analyse de l’expression du Glycogénome par TLDA
Gene function Number of known genes1
Number of analyzed genes2
Glycosyltransferase 192 148 (77%)
Glycosidase 74 53 (72%)
Sugar carrier 33 26 (79%)
Translocase 2 2 (100%)
Sugar metabolism 26 23 (88%)
Lectin 165 101 (61%)
Sulfotransferase 50 22 (44%)
Total 542 375 (69%)
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Expression du Glycogénome :Nombre de gènes exprimés différentiellement
EchantillonsGDF8 +/+
12 semainesGDF8 -/-
3 semaines
GDF8 +/+
3 semaines79 51
GDF8 -/-
12 semaines8 42
- Individus ♂- T-test ≤ 5 %- RQ ≥ ± 1,5
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEExpression du Glycogénome :
In Vivo vs. In Vitro
79 gènes chez la souris GDF8+/+ 54 gènes dans les C2C12
20 gènes communs (12 gènes varient différemment)
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Expression du Glycogénome :
Gènes d’intérêt
Gene symbolGDF+/+
3sem/12semGDF-/-
3sem/12sem
3 sem GDF+/+/GDF-
/-
12 sem GDF+/+/GDF-/-
4732435N03Rik x (↘)Amy1 x (↗) x (↗)Art1 x (↗) x (↘)Art4 x (↘)Athl1 x (↘) x (↘)B3galnt1 x (↘)B3galt1 x (↘)B3gat1 x (↘) x (↘) x (↗)B3gnt2 x (↘)B4galnt1 x (↗)B4galt2 x (↘)B4galt4 x (↘)B4galt6 x (↘) x (↘)…
64 gènes d’intérêt
RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEFonctions Biologiques des 64 gènes
(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)
9 gènes
12 gènes
5 gènes
Approche protéomique
���� Etude des protéines microsomales
���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia54 mâles âgés de 3 semaines
18 GDF8-/- et 36 FVB = 4 pools �4 portées différentes
(autres tissus prélevés : foie et cœur)
���� Technologie 2D-DIGE/SM
���� Extraction : “fractionnement ” appliqué à une analyse protéomique
Selon Maribel E. Bruno et al. Archives of Biochemis try and Biophysics. Sept. 2002
Comparaison différentielle d’enzymes de la glycosylation dans le muscle de souris :
lignées GDF8-/- et FVB
microsomes
• Broyage du muscle dans un mortier avec azote• Reprise de la poudre dans Tampon (8 vol muscle/ poids poudre)
� 50mM Hepes, 1 mM EDTA, 0.25M Sucrose, 1mM DTT, inhibiteurs de protéases• Homogénéisation par sonication
• Centrifugation n°1 10 000 g 20 min à 4°Cculot = débris, membranes, noyaux et mitochondries
• Centrifugation n°2 10 000 g 20 min à 4°Cculot = reste mitochondries
• Centrifugation n°3 100 000 g 60 min à 4°C (X 2)culot = fraction microsomale surnageant : fraction soluble cytosolique
• Purification et concentration de l’échantillon
• Fraction « microsomale » tampon adapté pour gel 2D
• Dosage protéique
���� Rendement : 150 mg de tissu musculaire pour ~ 150 µg de fraction microsomale extraite
microsomesFractionnement simple
Glucose regulated protein : GRP78 ���� Marqueur spécifique des microsomesFamille des HSP 70 - Localisation dans RE
Western Blot sur marqueur biochimique
microsomes
Quantification de la protéine GRP78 après révélation par Western Blot
1
0,5
0 00
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Microsomemuscle
Soluble muscle TS3 TS12µ: microsomes
FS : fraction soluble
M : marqueurs
TS3 : fraction totale muscle 3 semaines
TS12 : fraction totale muscle 12 semaines
Enrichissement en protéines
« microsomales»
10% SDS-PAGE, 20µg/puits NC - HRP
Logiciel Image Quant TL
Suivi du fractionnement
µ FS M TS3 TS12
72 kDa
SDS-PAGE 10% 0.75 mm 10*10.5 cm 20 µg de protéines/puitscoloration bleu colloïdal
(1) Microsomes Foie (2) Microsomes Muscle(3) Fraction soluble Foie(4) Fraction soluble Muscle(5) Fraction totale Muscle
1 2 3 4 5
Fraction microsomale du muscle (2) 9 bandes = 115 protéines
Fraction soluble du muscle (4) 5 bandes = 40 protéines
Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM
microsomes
Fraction microsomale du muscle (2)
� Plus grande proportion de protéines microsomales dans la fraction microsomale par rapport à la fraction solubl e
� Présence de protéines cytoplasmiques et mitochondrial es dans la fraction microsomale
Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM
Fraction soluble du muscle (4)
microsomes
Suivi du fractionnementDéveloppement de la technologie MRM
Objectif : détecter de façon spécifique la GRP78 dans la fraction microsomale (mélange complexe de protéines)
Principe :
Séquence protéique
Peptides trypsiques + masse
DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKLVNELTEFAKQEPERNECFLSHK ...
597.3625.3582.3539.6...
Fragment le plus probable ���� masse
496.3859.4708.4734.4...
Couple de masses pour chaque peptide trypsique
Analyse par MS/MS uniquement de ces peptides là
microsomes
8 pools d’animaux 3 semaines : 4 « Sauvages » et 4 « Hy permusclés »4 gels marqués : IEF pH4 - 7 18 cm/SDS-PAGE 10% (150 µ g/gel)
Gels Cy3 Cy5 Cy2 Decyder
N°1 S1 H1 SIN°2 H2 S2 SIN°3 S3 H3 SIN°4 H4 S4 SI
2 gels préparatifs : comparaison cartes protéiques fluorescentesN°5: 450 µg � pool HypermuscléN°6 : 450 µg � pool Sauvage
� Piquage des spots variants et analyse par SM (Emilie)
Approche 2D-DIGE
12 images analysées
Normalisation : référens
Analyse statistique
microsomes
Mise en évidence des protéines différentiellement exprimées dans le muscle de souris hypermusclépar rapport au sauvage ( lignées GDF8 -/- et FVB)
���� Etude du protéome total
���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia
16 mâles âgés de 3 et 12 semaines8 animaux GDF8-/- et 8 animaux FVB
(autres tissus prélevés : foie, cœur et cerveau)
���� Technologie 2D-DIGE/SM
protéome total
• Analyses des 12 semaines :� 47 spots variants , 34 spots piqués
� 24 protéines identifiées en SM
� 50% ~ des protéines contractiles
Résultats préliminairesprotéome total
Gel fluorescent Cy2 Gel coloré au bleu colloïdal - sa uvage
Résultats préliminaires
• Analyses des 3 semaines :
� en cours
• Comparaison 12 et 3 semaines
protéome total
Merci…