©2016 Waters Corporation 1
沃特世科技(上海)有限公司
手性分离的最佳解决方案 —超临界流体色谱(SFC)
Ultra Performance Convergence Chromatography
©2016 Waters Corporation 2
手性化合物分离-联萘酚对映异构体
HPLC正相分离结果
时间长、峰形差
20min
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0
Rs=1.67NPLC
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0
Rs=2.61UPC2
©2016 Waters Corporation 3
手性化合物分离-联萘酚对映异构体
UPC2分离结果
3min
©2016 Waters Corporation 4
UPC2和正相分析的成本对比
成本计算
Waters UPC2 &
正相分离结果对比
系统名称 Waters UPC2 正相HPLC
单个样品的分析时间 5分钟 20分钟
仪器流速 1.6ml/min 2ml/min
流动相组成 CO2:正己烷/ 85:
15 几乎100%正己烷
一天可以分析样品的个数 180个 48个
分析每个样品的溶剂成本 (正己烷 125元/升,CO2 5元/升
) 0.30元 7.5元
分析180个样品的人工成本 (以100元/8小时计算)
100元 375元
每年分析样品的任务是65700个需要的仪器数量 1台 4台
每年溶剂的成本 19,710.00
元 492,750.00元
每年的人力成本 36,500.00
元 136,875.00元
每年实验室溶剂和人力成本将节省 573,415.00元
©2016 Waters Corporation 5
事件:海正药业采用UPCC对某仿制药原料药进行分析方法验证,新药申报资料已提交到国家新药审评中心,通过审批后UPCC将做为海正药业对于该仿制药原料药GMP放行方法
用户挑战:仿制药为典型的手性药物,用户在研发初期采用LC的分析方法,峰拖尾严重、分离度差、塔板数低、重现性差
沃特世方案:UPCC相对LC方法峰形尖锐,分离度和塔板数显著提高,重现性优异,分离时间和成本低五倍
2015UPCC在国内制药领域的突破
©2016 Waters Corporation 6
样品信息
A1
A2
©2016 Waters Corporation 7
色谱柱:SUPELCO CYCLOBOND I 2000 RSP,250*4.6 mm, 5 μm;
缓冲液:50 mM甲酸铵水溶液,氨水调节pH=7.5;
波长:225 nm;流速: 0.8ml/min; 柱温: 25℃;进样量: 5 μL;
稀释液:60%甲醇-水(先用1mlTHF溶解)
样品浓度: 0.4mg/ml;
•缓冲液:甲醇=45:55
min0 5 10 15 20 25
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
VWD1 A, Wavelength=225 nm (D:\DATA\BDKL-YGT-20140731 2014-07-31 15-08-21\201407310000002.D)
7.519
8.604
存在问题: 分离度1.88,较小,理论塔板数均在3000以下,拖尾严重
客户采用条件
©2016 Waters Corporation 8
UPCC实验条件
检测器:ACQ-PDA
扫描波长范围:210 - 450nm
检测波长:225nm
色谱柱: Daicel-IC 手性柱(4.6*150mm, 3um)
柱温:35℃
Back pressure:2000psi
流动相:A:CO2,B:IPA/ACN=3:1+0.2%NH3.H2O ; 流速:2.5mL/min
梯度条件:
©2016 Waters Corporation 9
UPCC结果谱图
©2016 Waters Corporation 10
样品6针重现性谱图和结果
©2016 Waters Corporation 11
©2016 Waters Corporation 12
案例二: 默沙东将UPCC用于GMP的QC方法
©2016 Waters Corporation 13
©2016 Waters Corporation 14
©2016 Waters Corporation 15
©2016 Waters Corporation 16
©2016 Waters Corporation 17
©2016 Waters Corporation 18
维生素异构体分析
维生素E主要有四种衍生物,按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。
维生素E结构:
UPC2
流速 (mL/min) 2.5
流动相A/B CO2/甲醇(98:2至95:5,1.5min)
背压(psi) 1885
温度 (oC) 50
色谱柱 ACQUITY UPC2 BEH,3.0 x 100mm,1.7μm
前处理 异辛烷溶解过滤直接进样
监测器 PDA
©2016 Waters Corporation 19
UPC2分析维生素E四种异构体
©2016 Waters Corporation 20
叶黄素(Xanthophyll )
β-胡萝卜素( β-Carotene)
玉米黄质(Zeaxanthin)
辣椒红素(Capsanthin)
隐黄质( β-Cryptoxanthin)
五种结构类似色素的分析
挑战1:LC分析需要60分钟
挑战2:结构非常相似很难获得好的分离度
©2016 Waters Corporation 21
UPC2分析结果
β-胡萝卜素
隐黄质
叶黄素
玉米黄质
辣椒红素
5 min
©2016 Waters Corporation 22
维生素D代谢产物分析
©2016 Waters Corporation 23
LC-MS/MS分析
WAA05203:22:01
30-Jan-2012
Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50
%
0
100
Jan 28 DEQAS 405 2 Sm (Mn, 3x8) 2: MRM of 2 Channels ES+ 383.35 > 257.25 (25-OH-D3)
4.99e5Area
3.7346015
3.5439207
6.5
1. 异构体分离度不佳
2. 分析时间6.5分钟
©2016 Waters Corporation 24
UPC2 Xevo TQD分析
25 d3 0.5ng/ul in Waters Hexane MRM of 3epi25D3 in in 1min 2min run 100uL M/U CSH FP column
Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25
%
0
100
27July2012_069 Sm (Mn, 2x3) 1: MRM of 3 Channels ES+ 383.35 > 257.32 (25 D3 15v)
1.97e51.38
1.26 2.5
1. 异构体基线分离
2. 分析时间2.5分钟
©2016 Waters Corporation 25
手性农药残留分析
采用传统的正相条件分析手性化合物,面临以下挑战:
1、农残分析MRM质谱定量,正相溶剂的质谱兼容性差
2、正相分析方法的局限性:等度分析时间长、分离度不佳、方法重现性差
分析成本高,对环境和人体有害
三唑醇
﹡ ﹡
©2016 Waters Corporation 26
UPC2 MS MS分析结果
UPC2
流速
(mL/min) 2.5
流动相 CO2 : 甲醇
95:5\80:20(2min)
背压 2000psi
温度 (oC) 30
色谱柱 Chiralpak IC-3 4.6x150mm
进样体积 (µL) 2
电离模式: ESI+
MRM 296-〉70
三唑醇 UPC2-MS\MS 仪器方法
SZC_HG_1ppm
Time1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
%
0
100
SZC-N18 MRM of 1 Channel ES+ 296 > 70 (SZC)
7.95e5
1.22296.0
1.80296.0
0.001ppb
0.03ppb
0.1ppb
3分钟完成定量分析
黄瓜基质加标样品分析结果
©2016 Waters Corporation 27
听沃特世讲过去的事情
什么是超临界流体
超临界流体是指物质在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态,它既不是气体也不是液体
©2016 Waters Corporation 28
超临界流体具有接近气体的低黏度、类似液体的溶解性、接近于气体的高扩散性
超临界流体的性质
©2016 Waters Corporation 29
超临界流体色谱
超临界流体色谱理论由Klesper等在1961年首次提出
商品化仪器于上世纪80年代用于分析领域
超临界流体色谱: 超临界流体做流动相,依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。
分离机理: 吸附和解吸附,利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。
主要流动相: 超临界CO2(化学惰性、温和临界状态、绿色环保、低成本、易获得)
改变选择性、溶解性, 改善峰形,可以适当加入一定量的不同极性的有机溶剂和缓冲盐。
辅助溶剂:
固定相: 非极性和极性填料
©2016 Waters Corporation 30
正相色谱应用优缺点 : 选择性好(更多流动相和固定相供选择),有机溶剂直接进样工作流程简单;分离度、方法耐用性不佳,流动相价格昂贵毒性大,仅限于不挥发化合物,质谱兼容性有限
反相色谱应用优缺点: 方法耐用性好,溶剂价格相对便宜毒性较小,质谱兼容性好;仅限于不挥发化合物,对脂溶性化合物、结构类似物分离有挑战
GC应用优缺点 : 气体流动相黏度低、扩散性好、分离效率高,可以利用长色谱柱;仅限于挥发性化合物,低挥发性化合物需要衍生,很难用于制备
SFC结合LC、GC优点
突破瓶颈的部分:
正相和反相流动相和固定相都可用选择性好(水为辅助溶剂比例通常要低于5%);有机溶剂直接进样简化工作流程;流动相成本低、没有毒性;方法耐用性好,与各种质谱兼容;CO2的低黏度和高扩散性可获得分离的高效率;非挥发、挥发性化合物都适合
超临界流体色谱特点
©2016 Waters Corporation 31
SFC的瓶颈:
SFC技术对温度、压力稳定性控制要求很高,传统的SFC仪稳定性达不到,分离重现性和稳定性很差。
SFC技术对CO2泵和辅助溶剂泵的稳定性和精度要求高,传统的SFC仪的精度和稳定性不好,导致分离的重现性、稳定性和分离度不佳。
©2016 Waters Corporation 32
UPC2的突破 :
UPC2继承了传统SFC的原理和所有优势。
UPC2采用沃特世成熟而稳定的硬件设计,保证了对温度和压力的精确而稳定的控制,以及CO2和辅助溶剂泵的精度,从而使色谱分离的重现性和稳定性达到最佳状态。
UPC2结合了UPLC技术,采用1.7um小颗粒技术,可以获得更高的分离度、灵敏度,更短的分离时间。
©2016 Waters Corporation 33
近距离走进UPC2
二元泵
样品管理器
UPC2
管理器
色谱柱管理器
监测器
©2016 Waters Corporation 34
Peak1 -
4.4
41
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
Injection RT 1 4.432 2 4.441 3 4.428 4 4.434 5 4.431 6 4.433 Mean 4.433 Std. Dev. 0.0044 % RSD 0.098
Isocratic 99.0% CO2 : 1.0% Methanol
Peak1 -
2.5
39
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
0.30
0.32
0.34
0.36
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
Isocratic 98.5% CO2 : 1.5% Methanol
Injection RT 1 2.534 2 2.539 3 2.535 4 2.543 5 2.532 6 2.541 Mean 2.537 Std. Dev. 0.0043 % RSD 0.170
Peak1 -
1.8
06
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
0.30
0.32
0.34
0.36
0.38
0.40
0.42
0.44
0.46
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
Injection RT 1 1.806 2 1.806 3 1.813 4 1.810 5 1.809 6 1.811 Mean 1.809 Std. Dev. 0.0028 % RSD 0.154
Isocratic 98.0% CO2 : 2.0% Methanol
Peak1 -
1.4
46
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
Injection RT 1 1.446 2 1.444 3 1.443 4 1.435 5 1.435 6 1.442 Mean 1.441 Std. Dev. 0.0047 % RSD 0.327
Isocratic 97.5% CO2 : 2.5% Methanol
2.1X150 mm UPC2 Hybrid @ 1 mL/min
UPC2优秀的精密度、重现性
©2016 Waters Corporation 35
1-Coum
arin - 0
.840
2-Flav
one - 1
.116
3-Caffe
ine - 1
.247
4-Thym
ine - 1
.584 5-P
apaver
ine - 1
.664
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
Minutes
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00
1-Coum
arin - 0
.788
2-Flavo
ne - 1.
072
3-Caffe
ine - 1.
209
4-Thym
ine - 1.
559
5-Papa
verine
- 1.641
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
Minutes
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00
RT %RSD: <0.15 Area %RSD: <0.67
1-20% B back to 1% B
RT %RSD: <0.34 Area %RSD: <0.69
1.5-20% B back to 1.5% B
Viridis® BEH 2-Ethylpyridine, 3 x 100 mm, 1.7 µm 2.00 mL/min, 55 °C, 1958 psi (135 Bar)
Injection Volume = 3 µL, 10 repeated injections PDA 280 nm compensated (500-600 nm) 20 Hz, TC = 0.2 sec
UPC2优秀的精密度、重现性
©2016 Waters Corporation 36
八角茴香油的分析
30min
反式茴脑
GC分析
挑战1:分析时间太长
挑战2:蒸馏法不能获得期望的纯度,气相不能制备
©2016 Waters Corporation 37
UPC2分析
反式茴脑
分析时间2.5分钟
UPC2分析
©2016 Waters Corporation 38
UPC2分析结果放大到制备型SFC
循环进样模式,半天时间制备2.5克目标物
反式茴脑
©2016 Waters Corporation 39
纯化后的反式茴脑分析
反式茴脑
©2016 Waters Corporation 40
SFC 100 MS or UV Directed
Investigator
完备的SFC制备系统
Investigator
Prep 100 SFC
SFC 80
SFC 200
SFC 350
Scale mgs to grams to Kilo Grams
©2016 Waters Corporation 41
UPC² 简易性 的工作流程: –缩短样品前处理和分析时间 o 有机溶剂/提取物可直接进样分析
UPC² 分离“相似”的化合物 –手性, 位置异构, 结构相似,共轭化合物
UPC² 的正交性 –实验室其他分析手段的补充 –更为全面的样品表征
如果您拥有了UPC²,您将得到…
©2016 Waters Corporation 42
UPC² 简易性 的工作流程: –缩短样品前处理和分析时间 o 有机溶剂/提取物可直接进样分析
UPC² 分离“相似”的化合物 –手性, 位置异构, 结构相似,共轭化合物
UPC² 的正交性 –实验室其他分析手段的补充 –更为全面的样品表征
如果您拥有了UPC²,您将得到…