(Hibiscus sabdariffa L.)

Hibiscus sabdariffa L.

LISA SOEGIANTO1,2*, TRIANA HERTIANI2,3, SUWIJIYO PRAMONO2,3

1

3

Vol. 14, No. 2JURNAL ILMU KEFARMASIAN INDONESIA, September 2016, hlm. 212-218ISSN 1693-1831

* Penulis korespondensi, Hp. 08123208814e-mail: lisa.soegianto@yahoo.com

This research was dried powder of Rosela calyx macerated with ethanol 70%-HCl (99:1)and then fractionated using n-hexane, ethyl acetate, n-butanol and water. All fraction was tested for

S. aureus and E. coli.Quorum sensing inhibition was tested against Pseudomonas aeruginosa. Further fractionation was

performed by analysing 1H-NMR, 13

S. aureus showed by growth inhibition zone ,15.89 ± 0.37 mm(concentration of 10%) and 15.93 ± 0.72 mm (concentration of 20%), while against E . coli, 17.25 mm(concentration of 10%) and 17.35 mm (concentration of 20%). Formation inhibition of S. aureus

E.coli

Pada penelitian ini, kelopak rosela dikeringkan kemudian dimaserasi dengan etanol 70% -HCl (99:1) kemudian difraksinasi berturut-turut menggunakan n-heksana, etil asetat, n-butanol dan

S. aureus dan E.coli dengan menggunakan metodePseudomonas aeruginosa.

Fraksi etil asetat adalah fraksi yang paling aktif terhadap S. aureus menghasilkan daerah hambatanpertumbuhan pada konsentrasi 10% dan 20% sebesar 15,89 ± 0,37 mm dan 15,93 ± 0,72 mm, sedangkanterhadap E. coli sebesar 17,25 ± 0,86 mm dan 17,35 ± 0,48 mm pada konsentrasi 10% dan 20%. Pada

S. aureus sebesar 62,05% ± 17,83 dan padaE.coli19,23 ± 1,52 mm dan 20,89 ± 2,35 mm pada konsentrasi 10% dan 20%. Fraksi etil asetat dilakukanisolasi terhadap satu senyawa aktif dengan menggunakan metode VLC dan KLT preparatif kemudian

1H-NMR, 13C-NMR, COSY-NMR,

benzofuran.

213 SOEGIANTO ET AL. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

perforator, jangka sorong, mikropipet, microplate 96well, inkubator.

. Kelopak rosela (Hibiscus sabdariffa Linn)yang digunakan dalam penelitian ini diambil segardari Kebun Pendidikan, Penelitian dan Pengembangan

Kelopak Rosela kemudian dikeringkan dan diserbuk,dilakukan maserasi selama 24 jam dengan etanol

dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator padasuhu 50 °C.

Ekstrakkental dilarutkan dalam metanol-air (9:1) sebanyak100 mL, kemudian dimasukkan ke dalam corongpisah. Pelarut heksan ditambahkan dalam labupisah dan dikocok secara perlahan-lahan kemudiandidiamkan sehingga terjadi pemisahan antarafraksi heksan dan fraksi metanol-air. Fraksi heksandipisahkan sedangkan fraksi metanol-air dipanaskansehingga metanol menguap sampai habis danyang tertinggal adalah fraksi air. Pelarut etil asetatditambahkan kedalam fraksi air kemudian dilanjutkandengan n-butanol, fraksi n-butanol dipisahkan darifraksi air sehingga didapat 4 fraksi yaitu: fraksiheksana, fraksi etil asetat, fraksi n-butanol dan fraksiair. Fraksi heksana dan fraksi etil asetat diuapkandengan vacuum rotary evaporator pada suhu 50 °Cdan fraksi air diuapkan dengan waterbath suhu 60-80°C sampai kering.

(7).menginokulasikan bakteri uji S. aureus/ E. coli yangkekeruhannya setara dengan larutan ½ Mc FarlandI. Masing-masing fraksi yang didapat disuspensikandalam air dengan bantuan DMSO dibuat konsentrasi10% dan 20%. Media agar overlay yang memadatdibuat sumuran dengan bantuan perforator diameter6 mm. Masing-masing sumuran diisi dengan suspensifraksi sebanyak 20 µL kemudian media agar overlaydiinkubasi pada suhu 37 °C. Pengamatan daerahhambatan pertumbuhannya (DHP) dilakukan setelahinkubasi 24 jam dan dianalisis fraksi dengan DHPyang terbesar.

. Microplate U-bottom96 wellfraksi kelopak rosela sebanyak 100 µL (konsentrasi1 mg/ml), suspensi bakteri (setara dengan ½ McFarland I) sebanyak 10 µL pada masing-masingsumuran kemudian ditutup dengan parafilm dandiinkubasi pada suhu 37 °C, 48 jam. Kelembabandijaga dengan cara sebelum dimasukkan inkubator,

SEIRING dengan semakin meluasnya penyakitinfeksi, resistensi mikroba terhadap antibiotikamenjadi salah satu masalah kesehatan yang perluditangani secara serius. Selama ini pengobatanterhadap resistensi antibiotika lebih ditujukan pada seldalam bentuk planktonik atau bentuk sel bebas yangberperan penting dalam proliferasi sel dan penyebaran

ekstraseluler pelindung dari pengaruh luar sertametabolisme sel mikroba yang lebih lambat merupakanfaktor yang mendukung terjadinya resistensi mikroba

(1). Salah satu pemicu terbentuknya

sel untuk memastikan jumlah sel mencukupi sebelumsuatu spesies melakukan respon biologi khusus,atau yang dikenal dengan sistem kuorum sensing(2).Senyawa antikuorum sensing dapat mencegahkomunikasi antar sel bakteri melalui molekulsignal tetapi tidak membunuh bakteri (3).Dengandemikian, penghambatan komunikasi antar sel tersebutdiharapkan dapat menjadi salah satu strategi eradikasipenyakit infeksi, dikarenakan dapat mencegah

Kelopak Rosela (Hibiscus sabdariffa L.) telahdilaporkan mengandung asam organik (asamsitrat, asam hidroksisitrat lakton), senyawa fenol(protocatechuic acid gossypetin-3-glucoside, gossypetin-8-glucoside) dan antosianin(delphinidine, sabdaretin)(4)

menyebutkan manfaat antimikroba dari kelopak roselaantara lain: bersifat letal terhadap Mycobacteriumtuberculosis(5)

terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcuspyogenes(6). Oleh karena itu dalam penelitian iniakan ditentukan fraksi yang aktif sebagai antibakteri

S. aureus dan E. coli, danantikuorum sensing pada strain reporter Pseudomonasaeruginosasenyawa aktifnya.

. Kelopak rosela, kultur murni Escherichiacoli 24 jam, kultur murni Staphylococcus aureus24 jam, kultur murni Pseudomonas aeruginosa 24jam, aquadest, media Mueller Hinton Agar, mediaTryptic Soy Broth, media Cetrimide, NaCl 0,9 %,crystal violet, alkohol 96%. Seperangkat alat untukmembuat ekstrak, alat untuk uji antibakteri danantikuorum sensing : cawan petri, beaker glass, pinset,

Vol 14, 2016 Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 214

microplate diletakkan pada kotak tertutup yang diberikertas saring basah. Setelah inkubasi, isi sumurandibuang dan dibilas tiga kali dengan air mengalir dandikeringkan.

Masing-masing sumuran diberi 200 µL kristal

dengan air mengalir sebanyak tiga kali. Masing-masing sumuran diberi alkohol 96% teknis (untuk

selama 15 menit. Masing-masing isi sumurandipindahkan sebanyak 150 µl ke dalam microplate 96well yang baru dan dibaca densitas optiknya denganmicroplate readerPenghambatan berdasarkan rumus(8):

Dimana:OD

terbentukODtest

ekstrak/fraksiODblangkoOD

pembawa

(9). Media agaroverlay dibuat dengan menginokulasikan bakteri ujiPseudomonas aeruginosa yang kekeruhannya setaradengan larutan ½ Mc Farland I. Masing-masingfraksi yang diperoleh disuspensikan dalam air denganbantuan DMSO. Media agar overlay yang memadatdibuat sumuran dengan bantuan perforator diameter6 mm. Masing-masing sumuran diisi dengan suspensifraksi masing-masing 20 µL (konsentrasi 8%, 4%,2%) Media Agar overlay diinkubasi pada suhu 30°C

dapat diamati berupa zona yang buram (opaque)

berupa zona jernih (transparan). Senyawa

aktif diisolasi menggunakan Vaccuum LiquidChromatography (VLC

antibakteri. Pemeriksaan kemurnian dilakukandengan metode kromatografi lapis tipis denganfase diam silika gel dan 3 macam fase gerak yangkepolarannya berbeda yaitu n-heksan-etil asetat (9:1),kloroform-karbon tetraklorida (7:1) dan kloroform100% dan dengan LC-MS (Chromatography-Mass

Spectrometrydilakukan dengan menggunakan spektroskopi IR danNMR dengan data spektra 1H-NMR, 13C-NMR, COSY

data LC-MS.

Ekstrak kental etanol-HCl yang diperoleh adalahsebanyak 314,3 g (32,07%), fraksi n-heksana 7,98g (2,66%), fraksi etil asetat 118,92 g (39,64%),fraksi n-butanol 103,95 g (34,65%) dan fraksi air51,81 g (17,27%). Fraksinasi yang dilakukan dapatmemisahkan senyawa berdasarkan sifat kepolarannyasebagaimana ditunjukkan pada hasil KLT fraksi yangdibandingkan dengan ekstrak asalnya (Gambar 1).

Keterangan gambar :

difusi terhadap bakteri Gram positif (S. aureus) danbakteri Gram negatif (E.coli) (Gambar 2 dan Tabel1) menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai

terhadap S. aureus dan E. coli.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia215 SOEGIANTO ET AL.

berdasarkan Acylated Homoserine Lactone (AHL)-mediated density-dependent signaling atau kuorumsensing yang terjadi ketika batas konsentrasi AHLsterakumulasi ke tingkat yang cukup untuk berinteraksidengan reseptor protein. P. aeruginosa adalah salahsatu bakteri patogen yang sangat poten karena

elastase,pyocyanin, rhamnolipids, protease alkalin, daneksotoksin A). Faktor-faktor tersebut diatur oleh jalurAHL kuorum sensing sehingga P. aeruginosa dapatdijadikan model untuk regulasi gen yang diperantaraiAHL(10)

ekspresi gen yang densitasnya dikontrol oleh sinyalantar sel atau kuorum sensing. Dengan menghambatsinyal atau komunikasi antar sel maka pembentukan

sensing bakteri P. aeruginosa dan diketahui bahwa

sensing terbesar dibanding fraksi lain. Dengan adanya

maka fraksi etil asetat kelopak rosela potensial untukdifraksinasi lebih lanjut untuk mengisolasi senyawaaktif.

no detected activity

Proses fraksinasi lebih lanjut dilakukanmenggunakan Vaccuum Liquid Chromatography

tipis preparatif. Hasil uji bioautografi digunakansebagai penuntun dimana gabungan fraksi yang aktifdipisahkan menjadi 2 fase yaitu fase yang larut CHCl3dan fase yang larut air (Gambar 3).

3

6 cfu/ml

Keterangan gambar :

nodetected activity paper disk: 6 mm.

Tabel 2. menunjukkan bahwa ekstrak kasarkelopak rosela mempunyai persentase penghambatan

S. aureus dan E.coli dibandingkan fraksi-fraksinya, hal ini disebabkankarena ekstrak kasar mengandung lebih banyak

dapat melalui antara lain mekanisme penghambatankuorum sensing dan penghambatan enzim yang

S. aureus dan E. coli dengan

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 216Vol 14, 2016

preparatif mendapatkan isolat yang mempunyai

tipis pada fase diam silika gel dan 3 macam fasegerak yang kepolarannya berbeda yaitu n-heksan-etilasetat (9:1), kloroform-karbon tetraklorida (7:1) dankloroform 100%.

Isolat diuji kemurnian lebih lanjut dengan metodeKLT dua dimensi (fase diam silika gel 60 F254 dan

hasil scanning panjang gelombang bercak tersebut

max 221

sistem terkonjugasi (karakteristik pita konjugasi) danmerupakan ciri khas dari ester atau lakton tak jenuh

max 278 nm mengindikasikan

pita benzenoid) dan ciri khas untuk spektra molekularomatik dan heteroaromatik(11). Hal ini menunjukkanbahwa senyawa hasil isolasi yang didapat mengandunggugus ester/lakton tak jenuh dan gugus aromatis

menunjukkan informasi sebagai berikut:

tidak menunjukkan adanya warna, UV 254 pada

UV 366 noda isolat berwarna biru hitam halini mengindikasikan adanya ikatan rangkapterkonjugasi dalam isolat.Dengan anisaldehida asam sulfat menghasilkanwarna merah yang menunjukkan kemungkinansenyawa golongan terpenoid/steroid.Dengan AlCl3 menghasilkan noda berwarna putih

mengindikasikan tidak adanya senyawa golongan

Dengan FeCl3 menghasilkan noda yang berwarnaputih dengan latar belakang kekuningan, ini

Dengan Dragendorff menghasilkan warna kuningpucat dengan latar belakang kuning tua yangmengindikasikan tidak adanya senyawa alkaloid.

Spektra IR menunjukkan informasi adanya gugushidroksil (-OH), C-H, C-O dan cincin aromatik(Gambar 4).

Data ini didukung oleh hasil spektra 1H-NMR,13

ditunjukkan pada gambar 5 dan tabel 4.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia217 SOEGIANTO ET AL.

Penggabungan data yang diperoleh menunjukkan

Hasil LC-MS menunjukkan bahwa senyawamempunyai ion pseudomolekular [M+H+

dengan kemungkinan kehilangan fragmen [C3H7+H+]+

merupakan turunan benzofuran dengan gugushidroksil dan alifatik (Gambar 7).

dapat disimpulkan bahwa, fraksi etil asetat kelopak

S. aureusdan E.coli P.aeruginosa

fraksi etil asetat kelopak bunga rosela merupakansenyawa turunan benzofuran yang memiliki gugushidroksil dan alifatik.

Fakultas Farmasi UGM) yang telah melakukanidentifikasi taksonomi tumbuhan uji Hibiscussabdariffa Linn.

1 13

1 13 1 1

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 218Vol 14, 2016

1.MJ, Kong KF, Queck SY, and Otto M. Staphylococcusepidermidis surfactant peptides promote biofilm

2.infection and antimicrobial therapy. Taylor and

3.

4. Odigie IP,Ettarh RR, Adigun SA. Chronicadministration of aqueous extract of Hibiscus

Ethnopharmacol. 2003. 86 (2-3) : 181-1855.5. Morton JF. Roselle in: fruits of warm climate. C.F. Dowling

(ed). Media, Inc. Greensboro, NCP. 1987. pp. 281-86.6.

ekstrak kelopak rosela (Hibiscus sabdariffa L.)terhadap staphylococcus aureus dan streptococcuspyogenes. PPOT Research Project, LPPM, UnikaWidya Mandala Surabaya. Surabaya. 2008.

7.man ua l in g ene ra l m ic rob io lo gy. E ig h thEdition.The McGraw Hill companies. 2001.

8.Effects of extracts from italian medicinal plants on

of methicillin-resistant staphylococcus aures .Journal of Ethnopharmacology: 2008. 118. 418–28.

9.

10.S. Detection and inhibition of bacterial cell–cellcommunication in Deleo, F.R. dan Otto, M. Methods

and Protocols, Humana Press., 2008, pp 55-68.11. Supratman, U. Elusidasi struktur senyawa organik.