Download - Karakterisasi Enzim Nitril Hidratase dan Amidase dari

173

Karakterisasi Enzim Nitril Hidratase dan Amidase dari Pseudomonas sp

Karakterisasi Enzim Nitril Hidratase dan Amidase dari Pseudomonas sp.BP3 dalam Biokonversi Adiponitril menjadi Asam Adipat

Bambang Sunarko & Nunik SulistinahBidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Jl Raya Bogor Jakarta Km 46, Cibinong

Email: [email protected]

ABSTRACT

Characterization of Nitrile Hydratase and Amidase of Pseudomonas sp BP3 in Bioconversionof Adiponitrile to Adipic Acid. Adipic acid is a commercially important compound, primarilyused as precursor for the production of nylon 6.6. It is also used for plasticizer, fibers, and foodadditive. Synthesis of adipic acid by chemical means requires large amount of energy andconcentrated acid. It also produces N2O as by product, which is very toxic and suspectedcauses depletion of the ozone layer. The purpose of this research was to study thebioconversion of adiponitrile by Pseudomonas sp. BP3 and to characterize the involved enzymesin the whole cell. Pseudomonas sp. BP3 was able to utilize adiponitrile as the sole source ofcarbon and nitrogen. It’s doubling time (td) and growth rate constant (µ) during the growth inadiponitrile were 2 hours and 0.346/h, respectively. The optimum pH and temperature of nitrile-hydratase were pH 7.0 and 30°C, respectively, while those of amidase were pH 6 and 50°C.Vmax and Ks of nitrile hydratase were 8.3 nM/ml.min. and 55.56 mM, respectively, and ofamidase were 5,9 nM/ml.min and 50 mM. The rate of adiponitrile consumption was 0.245 mM/h and of adipic acid formation was 0.181 mM/h. The yield of bioconversion of adiponitrile andadipamide were about 50 % and 25%, respectively.

Key words: Bioconversion, adiponitrile, adipic acid, Pseudomonas sp. BP3, nitrile hydratase,amidase

PENDAHULUAN

Asam adipat, HOOC(CH2)4COOH,merupakan senyawa penting secarakomersial. Dalam industri, asam adipatdigunakan terutama sebagai bahan bakuuntuk produksi nilon 6,6. Selain itu,senyawa tersebut juga digunakan sebagaiplasticizers, serat, dan aditif makanan.Selama ini, asam adipat diproduksi secarakimiawi, terutama melalui oksidasisikloheksana. Namun proses ini, selain

memerlukan konsentrasi asam danenergi yang tinggi, juga menghasilkanproduk samping N2O, yang dicurigaibertanggung-jawab atas kerusakanlapisan ozon dan pemanasan global(ICCP 2001).

Sebagai alternatif, asam adipatsecara prinsip dapat juga dihasilkanmelalui proses biokonversi, yangmelibatkan mikrob penghasil enzimsebagai biokatalis. Hal ini dilandaskanpada banyak laporan yang menunjukkan

174

Sunarko & Sulistinah

asam adipat. Dengan demikian, penelitianuntuk mengungkap kemungkinan adanyamikrob lain yang mampu mendegradasiadiponitril masih layak untuk dilakukan.

Dari hasil penelitian sebelumnya,Pseudomonas sp. BP3 terbukti mampumendegradasi asetonitril, denganmenghasilkan asetamida dan asam asetatsebagai produk degradasinya (Sunarkoet al. 2005). Ini mengindikasikan, bahwaPseudomonas sp. BP3 mampumensintesis enzim nitril-hidratase danamidase, yang kemungkinan dapat jugamenghidrolisis adiponitril. Penelitian inibertujuan untuk menguji lebih lanjuthipotesis ini. Penelitian mencakuppengujian kemampuan tumbuhPseudomonas sp. BP3 dalam adiponitril,penentuan pola degradasi dan biosintesisenzim yang terlibat didalamnya (nitrilhidratase, amidase) serta menentukanbeberapa karakteristik enzim-enzimtersebut. Hasil yang diperoleh diharapkandapat digunakan sebagai landasan untukproduksi asam adipat dalam skala yanglebih besar.

BAHAN DAN CARA KERJA

Mikroorganisme.Pseudomonas sp BP3, yang

digunakan dalam penelitian ini, diisolasidari limbah pabrik cat dan saat inidisimpan di koleksi kultur BidangMikrobiologi, Puslit Biologi-LIPI.

Media kultivasi Pseudomonas sp.BP3

Media yang digunakan untukmenumbuhkan Pseudomonas sp BP3adalah media mineral (Meyer & Schlegel

bahwa beberapa mikrob mampumenghidrolisis senyawa nitril menjadiasam karboksilat. Mycobacteriumimperiale CBS-74, misalnya, dilaporkanmampu memproduksi asam nikotinat,senyawa pemula Vitamin B3 (Cantarellaet al. 2008). Asam-asam amino jugadapat diproduksi melalui hidrolisisberagam senyawa nitril oleh Rhodoc-coccus sp. AJ270 (Wang et al. 2005)Demikian pula, asam akrilat dapatdiproduksi melalui hidrolisis akrilonitriloleh Rhodoccoccus spp. (Hughes et al.1998).

Sampai saat ini, dikenal dua macamlintasan reaksi hidrolisis senyawa nitrilsecara enzimatis. Lintasan reaksipertama melibatkan dua ensim, yaitunitril-hidratase (E.C.4.3.2.84) danamidase (E.C.3.5.1.4). Enzim nitril-hidratase menghidrolisis nitril menjadiamida, sedangkan amidase menghidrolisisamida menjadi asam karboksilat (Drauz& Waldmann 1995). Lintasan reaksikedua melibatkan hanya satu macamensim, yaitu nitrilase (E.C.3.5.5.1), yangmenghidrolisis nitril menjadi asamkarboksilat, tanpa menghasilkan amidasebagai produk antara (Drauz &Waldmann 1995).

Sampai saat ini, masih sangat sedikitpenelitian yang mengungkap kemampuanmikrob penghidrolisis adiponitril danpemanfaatannya untuk memproduksiasam adipat. Hanya Bengis-Garber &Arie (1989), Moreau et al. (1993ab) danDhillon & Shivaraman (1999) yangpernah melaporkan bahwa Rhodococ-cus rhodochrous N.C.I.B. 11216 danBrevibacterium sp. mampu menghidro-lisis adiponitril dengan menghasilkan

175


1983; Pfennig 1974) yang ditambahdengan 40 mM adiponitril, sebagai satu-satunya sumber karbon, energi dannitrogen.

Kultivasi Pseudomonas sp. BP3Kultivasi Pseudomonas sp. BP3

dilakukan dalam bejana Erlenmeyer (2liter) berisi 800 ml media tumbuh. Kulturdiinkubasi di atas mesin pengocok(shaker) pada suhu kamar (+ 28oC).Dalam interval waktu 3 jam, contohdiambil untuk penentuan pola pertum-buhan, perubahan pH, aktivitas enzim,kadar protein, konsumsi adiponitril,konsentrasi NH4

+, dan asam adipat.

Produksi biomassa sel Pseudomonassp. BP3

Biomassa diproduksi dalam bejanaErlenmeyer (3 liter) berisi 1,5 liter mediatumbuh yang mengandung 40 mMadiponitril. Kultur diinkubasi pada suhukamar (+ 28oC). Sel dipanen dengansentrifuse (10.000 rpm) pada suhu 4oC,selama 15 menit. Pelet yang diperolehdicuci 2 kali dengan bufer fosfat (50 mMKH2PO4, pH 7,2). Pelet digunakan untukpenentuan aktivitas dan karakteristikenzim dalam sel utuh (whole cells).

Aktivitas enzim nitrilhi-dratase danamidase (Sunarko 1995)

Aktivitas nitril-hidratase dalam selutuh ditentukan dengan menambahkan1,5% (b/v) sel ke dalam bufer fosfat,berisi 100 mM adiponitril. Campuranreaksi kemudian diinkubasi selama 15menit pada suhu kamar (+ 28oC).Aktivitas enzim dihentikan denganpenambahan 0,20 ml 4N HCl, disentrifuse

dan kemudian kadar NH4+ dalam

supernatan ditentukan. Aktivitas amidaseditentukan dengan cara yang sama,namun dengan mengganti substratdengan 100 mM adipamida. Satu unitaktivitas enzim (U) setara dengan 1 mmoladiponitril atau adipamida yangterhidrolisis dalam waktu satu menit permg sel. Aktivitas total merupakanaktivitas enzim per satuan volume,sedangkan aktivitas spesifik merupakanaktivitas enzim per satuan bobot protein(Thontowi et al. 2004)

Suhu dan pH optimum aktivitas enzimnitril hidratase dan amidase

Pengaruh suhu terhadap aktivitasnitril-hidratase dan amidase ditentukandengan menambahkan 1,5% (b/v) sel kedalam 10 ml bufer fosfat yangmengandung substrat (100 mM adiponitrilatau 100 mM adipamida). Larutankemudian diinkubasi pada kisaran suhu5oC - 60oC dalam bejana tertutup.Aktivitas enzim ditentukan dengan caraseperti yang telah diuraikan sebelumnya.Pengaruh pH terhadap aktivitas enzimditentukan dengan cara yang samaseperti pada penentuan suhu, namunlarutan reaksi diinkubasi pada kisaran pH4-10 pada suhu optimum.

Vmaks dan Ks enzim nitril-hidratasedan amidase

Sebanyak 1,5% sel b/v ditambahkanke dalam bufer fosfat pada suhu kamar(+ 28oC). Substrat (adiponitril atauadipamida) kemudian ditambahkandengan konsentrasi 0-120 mM. Aktivitasenzim ditentukan dengan cara yang telahdisebutkan.

176


Biokonversi adiponitril dengan selPseudomonas sp. BP3

Sebanyak 1,5% (b/v) sel ditambah-kan ke dalam bufer fosfat, berisi 100 mMadiponitril. Larutan kemudian diinkubasidi atas mesin pengocok, pada suhu kamar(+ 28oC). Dalam interval waktu tertentu,contoh diambil dan kandungan NH4

+

ditentukan.

Konsentrasi adiponitril dan asamadipat

Konsentrasi adiponitril, dan asamadipat ditentukan dengan kromatograficair kinerja tinggi (KCKT) (Thontowi etal. 2004), dengan kondisi: fase gerakmetanol 80%, fase diam kolom organikC18 10µ, detektor UV (λ 354). Sebelumdiinjeksikan ke dalam KCKT, supernatan(hasil fermentasi dan biotransformasi)dilarutkan dalam metanol. Konsentrasiadiponitril dan asam adipat ditentukandengan membandingkan kurva yangdidapat dengan kurva dari larutan standaradiponitril atau asam adipat.

Konsentrasi amoniumKonsentrasi amonium ditentukan

secara kolorimetris dengan menggunakanmetode Nessler (Gerhardt et al. 1994).Supernatan sampel (0,1 ml) ditambahkanke dalam 9,9 ml 0,1 N NaOH. Kemudianke dalam larutan tersebut ditambahkan0,2 ml pereaksi Nessler yangdihomogenkan dan diinkubasi selama 20menit. Selanjutnya campuran diukur padapanjang gelombang 400 nm. Konsentrasiamonium dalam sampel dihitungberdasarkan kurva standar.

HASIL

Pertumbuhan Pseudomonas danbiosintesis enzim nitril hidratase danamidase

Pola pertumbuhan Pseudomonassp. BP3, perubahan pH, konsentrasisubstrat (adiponitril) dan produk degradasi(asam adipat dan amonia) selamapertumbuhan dalam 10 mM adiponitrilditampilkan pada Gambar 1. Sedangkan,aktivitas enzim nitril hidratase danamidase selama pertumbuhan Pseudo-monas sp. BP3 ditampilkan pada Gambar2. Pseudomonas sp. BP3 mamputumbuh dengan fase lag ± 6 jam. Darihasil perhitungan, waktu penggandaan(td) dan laju pertumbuhan spesifik (µ)bakteri tersebut masing-masing sebesar2 jam dan 0,346/jam.

Selama pertumbuhan, konsentrasisubstrat (adiponitril) terus menurun,sedangkan konsentrasi asam adipat danamonia cenderung meningkat. Dari hasilperhitungan, laju rata-rata penurunansubstrat (adiponitril) sebesar 0,245 mM/jam, sedangkan laju rata-rata kenaikanasam adipat dan amonia masing-masingsebesar 0,181 mM/jam dan 0,676 mM/jam. Konsentrasi tertinggi asam adipat(9,49 mM) dan NH4

+ (34,26 mM) dicapaipada akhir fase logaritmik. Selain itu, pHmedium juga cenderung meningkatselama pertumbuhan, dengan kisaranantara pH 7,8 -8,3.

Dari Gambar 2A tampak, aktivitastotal enzim nitril hidratase dan amidasejuga cenderung meningkat selamapertumbuhan. Aktivitas tertinggi keduaenzim dicapai pada akhir fase logpertumbuhan, yaitu masing-masing

177


sebesar 1,19 U dan 4,23 U. Sedangkandari Gambar 2B tampak bahwa aktivitasspesifik nitril hidratase dan amidasemempunyai pola yang berbeda. Aktivitasamidase tertinggi dicapai pada 20 jampertama kemudian menurun secara tajam,sedangkan aktivitas nitril hidratasecenderung stabil selama pertumbuhan.

Pengaruh pH dan suhu terhadapaktivitas enzim nitril hidratase danamidase dalam sel utuh

Pengaruh pH terhadap aktivitasenzim nitril hidratase dan amidase dalamsel utuh ditampilkan pada Gambar 3A,sedangan pengaruh suhu ditampilkan padaGambar 3B. Terlihat bahwa aktivitastertinggi enzim nitril hidratase terlihat padapH 7 dan amidase pada pH 6. Sedangkan,suhu optimum untuk nitril hidratase beradapada kisaran suhu 25oC-30oC, dan untukamidase pada 50oC.

Gambar 1: Pola pertumbuhan Pseudomonas sp. BP3 dalam 100 mM adiponitril.

KS dan Vmaks nitril hidratase danamidase

Gambar 4A dan 4B menunjukkanbahwa aktivitas enzim nitril hidratase danamidase (dalam sel utuh) mengikuti polaMichaelis-Menten. Dengan menggu-nakan persamaan Line-Weaver Burk(Gambar 4C dan 4D), nilai Vmaks dan KSenzim nitril hidratase dapat ditentukanmasing masing sebesar 8,3 nM/min.mldan 55,56 mM, sedangkan untuk enzimamidase masing masing sebesar 5,9 nM/ml.min dan 50 mM.

Biokonversi adiponitril danadipamida dengan sel utuh.

Pola pembentukan produk degradasi(NH4

+) dari proses biokonversi adiponitrildan adipamida ditampilkan dalamGambar 5A, sedangkan laju dari prosesbiokonversi tersebut pada Gambar 5B.Seperti terlihat dalam gambar, Selama180 menit, biokonversi adiponitril

178


Gambar 2. Aktivitas enzim nitril hidratase dan amidase dari sel Pseudomonas sp. BP3

selama pertumbuhan. Aktivitas total (A) dan aktivitas spesifik (B).

menghasilkan 108 mM NH4+ dengan laju

tertinggi sebesar 2,21 mM/ml.min.,sedangkan biokonversi adipamidamenghasilkan 26,64 mM NH4

+ denganlaju sebesar 4,05 mM/ml.min.

PEMBAHASAN

Sampai saat ini, telah banyaklaporan tentang kemampuan bakteridalam mendegradasi senyawa nitril, baikalifatik maupun aromatik (Layh et al.1997; Sugai et al. 1997; Johnson et al.2000; Mart´ýnkov´a & Mylerov´a2003), namun belum banyak laporantentang kemampuan bakteri dalammendegradasi adiponitril, yaitu senyawanitril dengan dinitril, sebagai gugusfungsionalnya (Moreau et al. 1993ab;Munandar 2002; Fitri 2005; Thontowi etal. 2004).

Dalam penelitian ini dapat dibuktikanbahwa Pseudomonas sp. BP3 mamputumbuh pada adiponitril dengan laju

pertumbuhan spesifik (µ) 0,346/jam danwaktu penggandaan (td) 2 jam (Gambar1). Ini berarti, isolat tersebut dapatmemanfaatkan adiponitril sebagai satu-satunya sumber karbon, energi, dannitrogen untuk tumbuhnya. Isolat bakteriNUB1 dilaporkan juga mampu tumbuhpada adiponitril (Munandar 2002).Namun, Pseudomonas sp. BP3tampaknya lebih mampu beradaptasiterhadap adiponitril dibandingkan isolatNUB1. Dalam substrat yang sama,Pseudomonas sp. BP3 tumbuh denganfase lag + 6 jam, sedangkan isolat NUB1selama + 200 jam.

Kemampuan tumbuh Pseudomonassp. BP3 pada adiponitril, secara tidaklangsung, juga mengindikasikan bahwaisolat tersebut mampu mensintesis enzimpendegradasi adiponitril. Penurunansubstrat (adiponitril), dan terjadinyaakumulasi asam adipat dan amonia(NH4

+) selama pertumbuhan (Gambar 1),memperkuat dugaan adanya proses

179


Gambar 3. Pengaruh pH (A) dan suhu (B) terhadap aktivitas nitril hidratase dan amidase

dari sel Pseudomonas sp. BP3

degradasi adiponitril oleh aktivitas enzimtersebut. Secara umum, biokonversisenyawa nitril dilaporkan melibatkandua alur reaksi yang menghasilkanasam-karboksilat dan NH4

+, sebagaiproduk akhirnya (Nagasawa et al.1987; Wyatt & Linton 1988; Sander1991; Sunarko 1995). Alur reaksipertama melibatkan enzim nitrilhidratase (E.C. 4.3.2.84) dan amidase(E.C. 3.5.1.4), sedangkan alur reaksikedua kedua melibatkan enzim nitrilase(E.C.3.5.5.1).

Degradasi adiponitril olehPseudomonas sp. BP3 selamapertumbuhan tampaknya melewati aluryang melibatkan nitril hidratase danamidase, dan bukan melalui alur yangmelibatkan nitrilase. Ini terbukti darikeberadaan enzim nitril hidaratase danamidase selama pertumbuhan (Gambar2). Banyak laporan menunjukkan,bahwa degradasi senyawa nitril alifatik

cenderung melibatkan nitril-hidratase danamidase, sedangkan degradasi nitrilaromatik cenderung hanya melibatkanenzim nitrilase saja (Kobayashi et al.1997; Nagasawa et al. 1988; DiGeronimo&Antoine 1976; Asano et al. 1980; Brigliaet al. 1996).

Biosintesis enzim nitril hidratase danamidase dalam sel Pseudomonas sp. BP3terjadi dalam fase eksponensialpertumbuhan. Ini diindikasikan olehaktivitas total kedua enzim tersebut, yangmencapai puncaknya di awal fasestasioner (Gambar 2). Kecenderungan inibisa dipahami, karena kedua enzimtermasuk dalam kelompok enzimmetabolik, yang berperan sebagaipemasok sumber energi dan karbon untukpertumbuhan. Hasil ini memperkuatpengamatan Wu & Li (2002) yangmenunjukkan bahwa enzimpentransformasi senyawa nitril biasanyaterbentuk secara optimum pada fase log.

180


Gambar 5: Pola (A) dan laju (B) pembentukan produk (NH4+) biotransformasi adiponitril

dan adipamida dengan sel Pseudomonas sp. BP3

Gambar 4: Kurva Michaelis Menten dan Line-Weaver Burk dari aktivitas nitril- hidratase (A,C) dan amidase (B, D).

181


Selama pertumbuhan, Pseudomo-nas sp. BP3 mensintesis enzim amidasejauh lebih tinggi (+ 4 kali) dibandingkandengan nitril hidratase (Gambar 2).Kecenderungan ini juga terlihat pada lajutransformasi substrat yang dihasilkan selPseudomonas sp. BP3 (Gambar 5A &5B). Laju transformasi maksimumdengan substrat adipamida (amidase)sekitar dua kali lebih tinggi dibandingkandengan substrat adiponitril (nitrilhidratase). Sejauh ini belum adapenjelasan yang cukup memuaskanterkait dengan fenomena tersebut, namunbanyak laporan yang menunjukkankecenderungan yang sama (DiGeronimoet al. 1976; Asano et al. 1980; Nagasa-wa et al. 1988; Briglia et al. 1996).

Sebaliknya, aktivitas nitril hidratase,yang terbentuk selama pertumbuhan,tampak relatif lebih stabil dibandingkandengan aktivitas amidase. Inidiindikasikan oleh pola aktivitas spesifikkedua enzim tersebut (Gambar 2). Polalaju transformasi yang ditampilkan padaGambar 5A dan 5B juga memperkuathasil pengamatan ini. Laju transformasiadiponitril (aktivitas nitril-hidratase) relatifstabil selama inkubasi, sedangkan lajutransformasi adipamida (amidase)tertinggi hanya terjadi di awal reaksi,kemudian menurun secara drastis.Ketidakstabilan aktivitas amidase adakemungkinan terkait dengan perubahankondisi media pertumbuhan, terutamapenurunan konsentrasi substrat(adiponitril), akumulasi produk degradasi(asam adipat dan amonia), dan jugaperubahan pH. Namun sejauh ini belumdiketahui secara pasti peranan ketigafaktor tersebut sebagai aktivator atau

inhibitor terhadap aktivitas enzimamidase.

pH optimum aktivitas enzim nitrilhidratase dan amidase dari Pseudomo-nas sp. BP3 diketahui berada pada pHnetral, yaitu masing-masing pada pH 7dan pH 6 (Gambar 3A). Aktivitas nitrilhidaratase dari beberapa mikrobdilaporkan juga mempunyai pH optimumdalam kisaran pH 6.0 - pH 7.0, antaralain Agrobacterium tumefaciens d3(Bauer et al. 1994) dan Bacillus sp.(Pereira et al. 1998). Sedangkan, pHoptimum amidase pada kisaran yangsama, antara lain ditunjukkan olehArthrobacter sp. J1 (Asano et al. 1982);Klebsiella pneumoniae NCTR1(Nawaz et al. 1994; Bacillus stearother-mophilus BR388 (Cheong & Oriel 2000);Rhodococcus rhodochrous M8(Kotlova et al. 1999).

Suhu optimum nitril hidratase danamidase dari Pseudomonas sp. BP3menunjukkan perbedaan yang cukupmencolok (Gambar 3B). Nitril hidratasepaling aktif pada suhu 25°C-30°C,sedangkan amidase cenderung bersifatmesofilik, aktivitas tertinggi terjadi padasuhu 50°C. Enzim nitril hidratase dariRhodococcus sp. N 771 (Yamada &Kobayashi 1996); dan Brevibacteriumsp. R 312 (Nagasawa et al. 1986)dilaporkan juga mempunyai suhu optimum25°C - 30°C. Disamping itu, dilaporkanbanyak mikrob yang menghasilkan enzimamidase yang mempunyai suhu optimumyang tinggi, antara lain Klebsiellapneumoniae NCTR1 (65°C) (Nawaz etal. 1994; Pseudomonas chlororaphisB23 (50°C) (Ciskainik et al. 1995);Ochrobactrum anthropi SV3 (45°C)

182


(Komeda & Asano 2000); Bacillusstearothermophilus BR388 (55°C)(Cheong & Oriel 2000); Rhodococcussp. (40°C) (Nawaz et al. 1994);Rhodococcus erythropolis MP50(55°C) (Hirrlinger et al. 1996);Rhodococcus rhodochrous M8 (55°C-60°C) (Kotlova et al.1999)

Ks enzim nitril hidratase danamidase dalam sel Pseudomonas sp.BP3 tidak terlalu jauh berbeda, yaitumasing-masing sebesar 55,56 mM dan 50mM (Gambar 4). Sedangkan Vmaksnitril-hidratase (8,3 nM/ml.min) relatiflebih tinggi dibandingkan dengan amidase(5,9 nM/ml.min). Sebagai pembanding,amidase murni dari sel Pseudomonaschlororaphis B23 memiliki Km 0,25 mMdan Vmaks 11,7 µmol/min/mg denganmenggunakan substrat propionamida(Ciskanic et al. 1995), sedangkan Km danVmaks amidase dari strain mutanBrevibacterium sp masing-masingsebesar 11 mM dan 7,5 U/mg proteindengan substrat adipamida (Moreau etal. 1993ab).

Selama 180 menit, biokonversi 100mM adiponitril menghasilkan 108 mMNH4

+, sedangkan biokonversi 100 mMadipamida menghasilkan 26,64 mM NH4

+

(Gambar 5) Secara stoikiometris,degradasi adiponitril (1) dan adipamida(2) dapat dipaparkan sebagai berikut:

rendemennya hanya sebesar + 25 %.Walaupun demikian, rendemen yangdiperoleh jauh lebih tinggi, biladibandingkan dengan proses biokonversimenggunakan isolat bakteri BA2.Dengan substrat dan waktu inkubasi yangsama dihasilkan 4,44 mM NH4

+, yangberarti setara dengan rendemen sebesar< 2,5 %.

KESIMPULAN

Pseudomonas sp. BP3 mamputumbuh dan memanfaatkan adiponitrilsebagai satu-satunya sumber karbon,energi dan nitrogen dengan waktupenggandaan (td) selama 2 jam dankonstanta laju pertumbuhan (µ) sebesar0,316 jam-1. Proses degradasi adiponitrilmelibatkan enzim nitril-hidratase danamidase, dengan produk asam adipat danamonia. Laju konsumsi adiponitril danpembentukan asam adipat masing-masing sebesar 0,245 mM/jam dan 0,181mM/jam. Nilai pH optimum untuknitril hidratase dan amidase masing-masing adalah pH 7 dan 6, dan suhuoptimum masing-masing adalah 27 0Cdan 50 0C. Nilai KS dan Vmaks nitrilhidratase berturut-turut sebesar 55,56mM dan 8,3 nM/ml.min, sedangkan KSdan Vmaks amidase masing-masingsebesar 50 mM dan 5,9 nM/ml.min.

UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terimakasih disampaikankepada sdri. Eva Yuliana Fitri atasketerlibatannya dalam pelaksanaaneksperimen. Penelitian ini memperolehdukungan biaya dari APBN tahunanggaran 2006.

(1) (CH2) 4(CN) 2 + 4 H2O ———————→ (CH2) 4(COOH) 2 + 2 NH3

(2) (CH2) 4(CONH 2) 2 + 2 H2O ——————→ (CH2) 4(COOH) 2 + 2 NH3

Ini berarti, efisiensi (rendemen) dariproses biokonversi adiponitril dengan selPseudomonas sp. BP3 adalah sebesar+ 50%, sedangkan bila adipamidadigunakan sebagai substrat,

183


DAFTAR PUSTAKA

Asano, Y., Y. Tani & H. Yamada. 1980.A new enzyme “nitrile hydratase”which degrades acetonitrile incombination with amidase. Agric.Biol Chem 44(9): 2251-2252.

Asano, Y., M. Tashibana, Y. Tani & H.Yamada.1982. Aliphatic nitrilehydratase from Arthrobacter sp. J1:purification and characterization.Agric Biol Chem 46:1165–1174

Banerjee, A., R. Sharma & UC.Banerjee. 2002. The nitr ile-degrading enzymes: current statusand future prospects. ApplMicrobiol Biotechnol 60:33-44

Bauer, R., B. Hirrlinger, N. Layh, A.Stolz & HJ. Knackmuss.1994.Enantioselective hydrolysis ofracemic 2-phenylpropionitrile andother (R, S)-2-arylpropionitriles bya new bacter ial isolate,Agrobacterium tumefaciens straind3. Appl Microbiol Biotechnol42:1–7

Bengis-Garber, C. & LG. Arie. 1989.Selective hydrolysis of dinitriles intocyano-carboxylic acids byRhodococcus rhodochrous NCIB11216. Appl Microbiol Biotechnol32 : 11-16

Briglia, M., Y. Nakatsuka, T. Sugai & H.Ohta. 1996. Action of nitrilehydratase from Rhodococcusrhodochrous IFO 15564 onderivates of 2,5-anhydro-D-allonitrile. Biosci BiotechnolBiochem. 60(9):1540-1542.

Cantarella, M. , L. Cantarella, A.Gallifuoco, R. Intellini, O. Kaplan,A. Spera & L. Mart´ýnkov´a. 2008.Amidase-catalyzed production ofnicotinic acid in batch andcontinuous stirred membranereactors. Enzyme Microb. Technol42: 222–229

Cheong, T. & P. Oriel. 2000. Cloning ofa wide spectrum amidase fromBacillus stearothermophilus BR388 in E. coli and markedenhancement of amidase expressionusing directed evolution. EnzymeMicrob Technol 26:152–158

Ciskanik, LM. , MW. Jolanta & DF.Robert. 1995. Purification andcharacterization of anenantioselective amidase fromPseudomonas chlororaphis B23.Appl Environ Microbiol 61 : 998-1003

Dhillon, JK. & N. Shivaraman. 1999.Biodegradation of cyanidecompounds by a Pseudomonasspecies (S1). Can J. Microbiol 45:201–8.

DiGeronimo, MJ. & AD. Antoine. 1976.Metabolism of acetonitrile andpropionitrile by Nocardiarhodochrous LL100-21. ApplEnviron Microbiol 31(6): 900-906.

Drauz, K. & H. Waldmann. 1995.Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis : A ComprehensiveHandbook. VCH, Weinheim : 365-367.

Fitri, EY. 2005. Kinetika fermentasi dankarakteristik enzim yang terlibatdalam proses produksi asam adipatoleh Pseudomonas sp [Skripsi].

184


Bogor, Fakultas Matematika danIlmu Pengetahuan Alam, IPB

Gerhardt, P., RGE. Murray, WA. Wood& NR. Krieg. 1994. Methods forGeneral and Molecular Bacterio-logy. ASM, Washington, D.C.

Hirrlinger, B., A. Stolz & H. Knackmuss.1996. Purification andcharacterization of an amidase fromRhodococcus erythropolis MP 50which enantioselectively hydrolyzes2-arylpropionamides. J Bacteriol178:3501–3507

Hughes, J., YC. Armitage & KC. Symes.1998. Application of whole cellrhodococcal biocatalysts in acrylicpolymer manufacture. Antonie VanLeeuwenhoek 74:107-18.

ICCP. 2001. Climate Change 2001:Synthesis Report. A Contribution ofWorking Groups I, II, and III to theThird Assessment Report of theIntegovernmental Panel on ClimateChange [Watson, R.T. and the CoreWriting Team (eds.)]. CambridgeUniversity Press, Cambridge, UnitedKingdom, and New York, NY, USA,398 pp.

Johnson, DV., AA. Zabelinskaja-Mackova & H. Griengl. 2000.Oxynitrilases for asymmetric C–Cbond formation. Curr Opin ChemBiol 4: 103–109.

Kaplan, O., V. Vejvoda, AC. Pisvejcova& L. Martinkova. 2006.Hyperinduction of nitrilases infilamentous fungi. J. Ind MicrobiolBiotechnol 33:891-896

Kobayashi, M., T. Fujiyama & S.Shimizu. 1996. Hyperinduction ofnitrile hydratase acting on indole-3-

acetonitrile in Agrobacteriumtumefaciens. Appl. MicrobiolBiotechnol. 45:176-181.

Kobayashi, M., F. Yoshie, G. Masahiko,K. Hidenobu & S. Sakayu. 1997.Identification of active sites inamidase : Evolutionary relationshipbetween amidase bond and peptidebond-cleaving enzymes. Proc NatlAcad Sci 94: 11986-11991

Komeda, H. & Y. Asano.2000. Genecloning, nucleotide sequencing, andpurification and characterization ofthe D-stereospecific amino acidamidase from Ochrobactrumanthropi SV3. Eur J Biochem267:2028–2035

Kotlova, E., G. Chestukhina, O.Astaurova, T. Leonova, A. Yanenko& V. Debabov.1999. Isolation andprimary characterization of anamidase from Rhodococcusrhodochrous M8. Biochemistry64:384–389

Layh, N., B. Hirrlinger, A. Stolz & HJ.Knackmuss.1997. Enrichmentstrategies for nitrile-hydrolyzingbacter ia. Appl MicrobiolBiotechnol 47: 668–674.

Mart´ýnkov´a, L. & V. Mylerov´a. 2003.Synthetic applications of nitrile-converting enzymes. Curr OrgChem 7: 1279–1295.

Meyer, O. & HG. Schlegel. 1983. Biologyof aerobic carbon monoxideoxidizing bacteria. Ann RevMicrobiol. 37: 277-310.

Moreau, JL., A. Said, A. Alain & G.Pierre. 1993a. Purification andcharacterization of an adipamidasefrom a mutant strain of

185


Brevibacterium sp. involved indinitrile degradation. Biosci BiotechBiochem 57: 294-296

Moreau, JL., N. Bernet, A. Arnaud & P.Galzy. 1993b. Islation ofBrevibacterium sp. R312 mutantspotentially useful for the enzymaticproduction of adipic acid. Can. J.Microbiol 39 (2): 207-212

Munandar, H. 2002. Biokonversiadiponitril menjadi asam adipatsecara mikrobiologi [Skripsi]. Bogor,Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam, IPB

Nagasawa, T., K. Ryuno & H.Yamada.1986. Nitrile hydratase ofBrevibacterium R312: purificationand characterization. BiochemBiophys Res Commun 139:1305–1312

Nagasawa, T., H. Nanaba, K. Ryuno, K.Takeuchi & H. Yamada.1987. Nitrilehydratase of Pseudomonaschlororaphis B23. Eur. J.Biochem. 162: 691-698.

Nagasawa, T., M. Kobayashi & H.Yamada. 1988. Optimum cultureconditions for the production ofbenzonitrilase by Rhodococcusrhodochrous J1. Arch. Microbiol.150: 89-94.

Nawaz, MS., TM. Heinze & CECerniglia. 1992. Metabolism ofbenzonitrile and butyronitrile byKlebsiella pneumoniae. Appliedand Environmental Microbiology,58: 27-31.

Nawaz, M., A. Khan, D. Bhattachaarya,P. Sittoneu & C. Cerniglia.1994.Purification and characterization ofan amidase from an acrylamide-

degrading Rhodococcus sp. J ApplMicrobiol Biotechnol 60:3343–3348

Pereira, R., D. Graham, F. Rainey & D.Cowan.1998. A novel thermostablenitrile hydratase. Extremophiles2:347–357

Pfennig, N. 1974. Rhodopseudomonasglobiformis sp., a new species ofthe Rhodospirillaceae. ArchMicrobiol 100: 197–206.

Sander, A. 1991. CharakterisierungTaxonomisch Diverser Nitril-Abbauender Bakterien undUntersuchung der Am NitrilabbauBeteilegten Enzyme. Doktorarbeit,Universität Bayreuth, Jerman.

Sugai, T., T. Yamazaki, M. Yokoyama &H. Ohta. 1997. Biocatalysis inorganic synthesis: the use of nitrile-and amide-hydrolyzingmicroorganism. Biosci. Biotechnol.Biochem 61: 1419–1427

Sunarko, B. 1995. Mikrobieller Abau vonAcetonitril und Vinylacetat undCharacterisierung vonVinylacetatesterase. Dissertation.Universität Bayreuth, Bayreuth

Sunarko, B., T U. Harwati, N. Sulistinah,A. Thontowi, AT. Utari, D.Setianingrum & L. Nurbayani.2005.Pengembangan dan AplikasiMetode Penapisan MikrobaPotensial untuk Biokatalis Produksisenyawa Obat Antiinflamasi Non-Steroid (AINS). Laporan TeknisProyek Penelitian Bioteknologi,Puslit Bioteknlogi-LIPI

Thontowi, A., EW. Pamuji & B. Sunarko.2004. Biotransformasi Adiponitril

186


oleh Bacillus licheniformis BA2.Berk. Penel. Hayati: 10 (25–30).

Wang, MX., J. Liu, DX. Wang & QY.Zheng. 2005. Synthesis of opticallyactive a-methylamino acids andamides through biocatalytic kineticresolution of amides. Tetrahedron:Asymmetry 16: 2409–2416

Wu, ZL. and ZY. Li. 2002. Enhancementof enzyme activity andenantioselectivity via. Cultivation innitrile metabolism by Rhodococcussp. CGMCC 0497. Biotechnol.Appl. Biochem 35:61-67

Wyatt, JM. & EA. Linton. 1988. Theindustrial potensial of microbial nitrilebiochemistry. Dalam Mehnert, J.,L. Br imer (eds.), CyanideCompounds in Biology, John Wiley& Sons, Chichester, 32-42

Yamada, H. & M. Kobayashi.1996.Nitrile hydratase and its applicationto industr ial production ofacrylamide. Biosci. Biotech.Biochem. 60 : 1391-1400

Download - Karakterisasi Enzim Nitril Hidratase dan Amidase dari

Top Related