Porovnanie molekulového mechanizmu N-salicylidénglutamátomeďnatých

komplexov na ľudskú nádorovú líniu hrubého čreva

Katarína Koňariková

Plzeň 2013

Univerzita KomenskéhoLekárska fakulta

Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie

Význam medi a meďnatých komplexov

• 2400 p.n.l. – sterilizačný prostriedok

• 1500 p.n.l. – pri bolestiach hlavy, popáleninách

• 400 p.n.l. – liečba vredov, kŕčových žíl

• 25 – 50 n.l. – syntetizované prvé deriváty medi

• 23 – 79 n.l. – lieky obsahujúce meď

• 1867 – prvé záznamy o význame medi pre imunitný systém

• 1885 – použitie acetátu medi

• 1895 - organické komplexy medi vyvinuté firmou Bayer

• 20. stor. » protinádorové účinky » ochorenia srdca» artritída» žalúdočné vredy» protizápalové účinky

Molekulový mechanizmus bunkovej smrti

Ciele

Vplyv meďnatých komplexov na nádorovú líniuhrubého čreva HT-29:

1. Cytotoxický účinok

2. Spôsob bunkovej smrti

3. Molekulový mechanizmus bunkovej smrti

Materiál a metódy

Názov Vzorec MR

(g/mol)

ZK1 monohydrát diakva-(N-salicylidén-L-glutamáto) meďnatého komplexu

[Cu(N-sal-L-glu)(H20)2].H20

366,82

MK0 etanolát bis

[izochinolín-(N-

salicylidén-

D,L-glutamáto]

dimeďnatý komplex

[Cu2 (N-sal-D,L-glu)2(izochinolín)2]. H20

975,98

MK1 monohydrát akva-(N-

salicylidénmetylester-

L-glutamáto)

meďnatého komplexu

[Cu(N-sal-5-met-L-

glu)(H20)].H20

262,82

Meďnaté komplexy

Použitý bunkový model

• Ľudské nádorové bunky hrubého čreva HT-29

Použité metódyPoužité metódy

• Určenie cytotoxického účinku– MTT test

• Určenie typu bunkovej smrti– Gélová elektroforéza

• Molekulový mechanizmus bunkovej smrti– Stanovenie aktivity kaspáz 8, 9 luminometricky

Výsledky1. Cytotoxický účinok

Cytotoxický účinok ZK1 na HT-29

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 24 48 72

Čas (h)

P o

č e

t

b u

n i

e k

/ m

l K

0,001 µmol/L

0,01 µmol/L

0,1 µmol/L

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

Cytotoxický účinok MK0 na HT-29

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 24 48 72

čas (h)

po

čet

bu

nie

k/m

l

K0,0010,010,111050100

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 24 48 72

K

0,001 µmol/L

0,01 µmol/L

0,1 µmol/L

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

Cytotoxický účinok MK1 na HT-29

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 24 48 72

čas (h)

po

če

t b

un

iek

/ml

K0.0010.010.111050100

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 24 48 72

K

0,001 µmol/L

0,01 µmol/L

0,1 µmol/L

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

  IC50 (µmol/L)

24h 48h 72h

ZK1 42 21 6

MK0 10 4 1

MK1 31 25 6

Názov Vzorec MR

(g/mol)

ZK1 monohydrát diakva-(N-salicylidén-L-glutamáto) meďnatého komplexu

[Cu(N-sal-L-glu)(H20)2].H20 366,82

MK0 etanolát bis

[izochinolín-(N-

salicylidén-

D,L-glutamáto]

dimeďnatý komplex

[Cu2 (N-sal-D,L-glu)2(izochinolín)2]. H20

975,98

MK1 monohydrát akva-(N-

salicylidénmetylester-

L-glutamáto)

meďnatého komplexu

[Cu(N-sal-5-met-L-

glu)(H20)].H20

262,82

Výsledky2. Typ bunkovej smrti

–––––––24h–––––– –––––––48h––––– –––––––72h–––––– PK K  1 10 50  100 1 10 50  100 1 10 50 100 µmol/L

Určenie typu bunkovej smrti ZK1

–––––––24h–––––– –––––––48h––––– –––––––72h–––––– PK K  1 10 50  100 1 10 50  100 1 10 50 100 µmol/L

Určenie typu bunkovej smrtiMK0, MK1

Výsledky3. Molekulový mechanizmus

bunkovej smrti

Aktivity kaspázy 8 a 9ZK1

HT-29, Kaspáza-8

0200000400000600000800000

1000000

12000001400000160000018000002000000

0 10 20 30 40

čas (min)

RLU

C

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

HT-29, Kaspáza 9

0

200000

400000600000

800000

1000000

1200000

14000001600000

1800000

2000000

0 10 20 30 40

Čas (min)

RLU

PK

K

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

Aktivity kaspázy 8 a 9MK0

HT-29, Kaspáza 8

010000002000000300000040000005000000600000070000008000000

0 10 20 30 40 50 60

Čas (min)

RLU

K

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

HT-29, Kaspáza 9

010000002000000300000040000005000000600000070000008000000

0 10 20 30 40 50 60

Čas (min)RL

U

PK

K

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

Aktivity kaspázy 8 a 9MK1

HT-29, Kaspáza 8

02000000400000060000008000000

100000001200000014000000

0 10 20 30 40 50 60

Čas (min)

RLU

K

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

HT-29, Kaspáza 9

02000000400000060000008000000

100000001200000014000000

0 10 20 30 40 50 60

Čas (min)RL

U

PK

K

1 µmol/L

10 µmol/L

50 µmol/L

100 µmol/L

Meďnaté komplexy ZK1, MK0 a MK1 vykazovali na ľudskú

nádorovú líniu hrubého čreva HT-29:

1) Cytotoxický účinok

• závislý od použitej koncentrácie a času

pôsobenia

• najvyšší cytotoxický účinok – komplex MK0 s

izochinolínovým ligandom po 72 h pôsobenia

Záver

2. Apoptotickú smrť HT-29 buniek pri koncentráciách

komplexu 1-100 µmol/L:

• ZK1 po 48h pôsobenia

• MK0 a MK 1 po 72h pôsobenia

Záver

3. Komplex ZK1 - [Cu(N-sal-L-glu)(H20)2].H20

Záver

4. Komplex MK0 - [Cu2 (N-sal-D,L-glu)2(izochinolín)2]. H20

Záver

5. Komplex MK1 - [Cu(N-sal-5-met-L- glu)(H20)].H20

Záver

Poďakovanie

• Doc. Ing. Ingrid Žitňanová, PhD.• Prof. Ing. Zdeňka Ďuračková, PhD.• RNDr. Lucia Andrezálová, PhD.• MSc. Georgios Perdikaris

• Kolektív Ústavu lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie

• Vega grant 1/0752/13

Ďakujem za pozornosť