Download - Klinická cytogenetika - metody
Klinická cytogenetika - metody
OLG FN Brno
Cytogenetické barvící metody
Bandy=pruhy-části chromozomů, které jsou zřetelně odlišeny od sousedních segmentů za použití více metod
Metody diferencující po celé délce:
Q-pruhy: fluorescenční barvení, jasné pruhy=oblasti s DNA bohatou na AT,
AT oblasti zvyšují fluorescenci, GC ji potlačují, nevýhoda metody-rychlé blednutí preperátů, foto
G-pruhy: mechanismus nejasný, důl. role Giems. barviva, enzymat. působení trypsinu, afinita u histonů bohatých na arginin, DNA ani proteiny nemizí při působení trypsinu, trvalé preparáty
R-pruhy: reverzní ke G, princip-vysoká teplota (85C), denaturace proteinů a DNA bohaté na AT, GC oblasti zůstávají v nativní konfiruraci (delece koncových úseků)
Metody selektivní
C-pruhy: barvení konstitutivního heterochromatinu, denaturace NaOH,
vyplavení fragmentů DNA z chromozomu do roztoku 2xSSC
NOR: barvení oblastí, které v interfázi tvoří jadérko (nukleolární organizátor jadérka)-mnohonásobné kopie genů pro rRNA, akrocentr. chr., AgNo3
SCE: výměny sesterských chromatid, reciproké výměny, nemění morfologii Ch.
výměny v homologních místech, mechanismus neznámý, vznik během replik. DNA, vztah k reparaci DNA, nesouvisí se vznikem strukturních aberací
inkukce: alkylačními činidly, UV zářením
použití: citlivý indikátor mutagenů
výskyt: Bloomův sy.
princip metody: inkorporace BrdU 2x buněčný cyklus, afinita fluorescenčního barviva Hoechst 33258
FISH - fluorescenční in situ hybridizace
Použití sondy komplementární ke sledovanému úseku DNA, denaturace, hybridizace
Sondy značené: radioaktivně ( zač. 70. let )
fluorescenčně 1990
Typy sond: centromerické, telomerické , celochromozomové (malovací), genově specifické, multisondy, genomové
Hodnocení: fluorescenční mikroskop
počítačová analýza obrazu
Princip FISH
Typy sond
Satelitní-hybridizace se satelitními sondami - centromerické
satelitní: centromery, tandemově se opakující monomer 171 bp (numerické
aberace, interfázní jádra)
satelitní: pericentrické oblasti akrocentr. , tandemově se opakující monomer 68 bp (13,14,15,21,22,9)
telomerické: specifické sekvence TTAGGG (telomer. delece PMR)
Celochromozomové: hybridizují po celé délce chromoz. (translokace)
Genově specifické: hybridizují jedinečné sekcence (mikrodelece, onko)
Genomové: tvořeny celkovou DNA (CGH), detekce jen delecí a amplifikací, klon v 50%zastoupení, k upřesnění cílená FISH celochrom.
Modifikace metody FISH
Sekvenční FISH: po sobě se opakující hybridizace na stejném preparátu (PGD)
Multisondový systém: podložní sklo s 24 sondami ve 24 polích-mitozy
Multicolor: vizualizace jednotlivých párů v oblišných barvách (24 specifických celochromozomových sond- obrazová analýza, pseudobarvy
princip: kombinace 5 sond spektrálně se nepřekrývajících, postupné snímání obrazů a jejich syntéza
požadavek: spec. software (pseudobarvy), komplexní hodnocení chromos. Aberací
nevýhoda: sada úzkopásmových filtrů
Spektrální karyotypování SKY: současná vizualizace všech chr. , emisní spektrum (Furierova transformace)
výhoda: získání obrazu v 1 kroku, ekonomická úspora
mFISH: -X,+del(1p),t(2;15),+8,+8,-9,t(9;15),-10,- 11,+del(13q),+20,-22
t(2;13), t(4;8), t(6;16), t(8;11)
Nejnovější metody
cenM-FISH: identifikace všech centromer současněcentromerické sondy značené 5 různými fluorochromy
použití: malé marker chromozomy
MCB (multicolor banding): chromoz. charakterizovány barevnými pruhy po celé délce