Download - Kultur Jaringan 2014
INTRODUCTION
Genetic Transformation
Breeding
Mutation
Natural Mutation
Artificial Mutation
Cross Pollination
Genetic resources
Warm season grasses?
2
3
PENGERTIAN PEMULIAAN TANAMANIlmu pemuliaan tanaman atau ilmu seleksi atau ilmu penjenisan merupakan suatu ilmu dan seni dalam memanipulir gen. Ilmu disini berdasarkan pengetahuan genetika. Seni dalam melakukan seleksi dalam usahanya memanipulir keragaman genetik untuk mengembangkan jenis baru yang bersifat unggul.
Tujuan pemuliaan tanaman adalah untuk menciptakan jenis unggul atau jenis superior yang yang sudah ada dan mempunyai sifat-sifat seperti :· Jenisnya murni· Resisten terhadap hama dan penyakit· Respon terhadap pemupukan· Mempunyai sifat-sifat agronomis yang disukai· Daya adaptasi yang besar· Mempunyai daya atau kemampuan menghasilkan yang tinggi
4
Sebagai tujuan akhir dalam pemuliaan tanaman adalah untuk mendapatkan sifat dan hasil yang lebih baik yaitu mempunyai kuantitas baik dan kualitas yang baik.· Kuantitas yang baik artinya yaitu untuk mendapatkan potensi / gen apakah penampilannya / hasilnya bisa tinggi. Gen tersebut akan bekerjasama dengan faktor lingkungan. Gen-gen yang dimanipulir atau dikombinasikan dengan gen lain supaya memberikan potensi atau hasil yang tinggi.Gen tersebut tanggap terhadap faktor lingkungan, kemudian baru mengarah pada produksi yang tinggi.
P = G + E P : Phenotip / PerfomanceG : GenE : Environment (lingkungan)
· KualitasGen-gen diarahkan pada kehendak breederDari rangkaian gen-gen yang dimanipulir dengan gen lain dan bekerjasama dengan faktor lingkungan mengasilkan individu tanaman yang baru, sehingga menghasilkan varietas yang unggul. Dengan adanya gen-gen yang dimanipulir akan menciptakan keragaman baru maka berkembanglah Ilmu pemuliaan tanaman.
5
Peran pemuliaan tanamanIlmu pemuliaan tanaman memiliki peranan yang cukup penting dalam kehidupan sehari-hari yaitu dengan penggunaan berbagai macam jenis unggul dari tanaman, dengan peningkatan produksi yang dirasa semakin meningkat.
Dengan melihat berkembangnya pemuliaan tanaman maka dihasilkan :· Menghasilkan jenis baru yang berproduksi lebih tinggi dari jenis yang sudah ada.· Mendapatkan jenis unggul yang tahan hama, penyakit dan cekaman lingkungan.· Mendapatkan jenis baru yang kualitasnya tinggi sehingga mampu bersaing di pasaran dunia.· Jenis unggul yang masaknya awal atau berumur genjah
6
Ilmu yang terkait dalam pemuliaan tanamanIlmu pemuliaan tanaman sebagai ilmu terapan yang dilandasi oleh ilmu-ilmu yang lain seperti ilmu genetika, ilmu sistimatika tumbuhan / taksonomi, biokimia tumbuhan, kimia, fisiologi tumbuhan, ilmu hama dan penyakit dan lain-lain.Prospek pemuliaan tanamanPemuliaan Konvensional :· Menghasilkan jenis baru dengan persilangan · Dengan memanfaatkan keragaman yang tersedia di alam· Perkawinan antar genera tidak dapat· Perakitan sifat ketahanan sulit· Acak· Waktu lamaBioteknologi / rekayasa genetik :· Menghasilkan jenis baru dengan menggunakan dasar genetik· Perkawinan antar genera bisa dilakukan· Gen dari bacteri dapat ditransfer ke tanaman sehingga menghasilkan tanaman transgenik· Terarah· Cepat
Diversity of reproductive system in plant
Vegetative growthVegetative propagation: clonalpropagation, leaf and stem,micropropagation etc.
Reproductive growth Seed Propagation
Amphimixis
Apomixis(clonal propagation)
Self-pollination
Cross-pollination
7
8
Pollination pattern in plants
1a dan 1b self polination
2. Cross polination / out cross
3. Un polinatied
1a 1b
2
3
Rumput kadang ada yg self polination sehingnga apomiksis (clonal propagation) hanya dr mother female
9
The Growth habit of tropical grasses
Tropical, sub tropical zoneThe growth starts from 10 degree CThe best of growing season is from more than 25 degeree CC4plant, Docarboxylic acid cycle
The Growth habit temperate grasses
Temperate, the frigid zoneThe growth starts from 5CThe best pf growing seasons from 15 C to 21 CSummer depression occurs from more tahn 22 CC3 plant, calvin cycle
10
Perkembangbiakan secara aseksual atau secara alami (Apomiksis) adalah suatu peristiwa dimana dibentuknya biji tanpa adanya peleburan atau perpaduan sel jantan dan sel betina.
Sedangkan mekanismenya bermacam-macam, namun semuanya menggunakan material genetik dari induknya (betina). Karena tidak terjadi peleburan sel jantan dan betina maka tidak mengalami meiosis seperti pada pembentukan gametophyt. Yang dihasilkan dari proses apomiksis dinamakan Apomiktik (Apomict).
Bila suatu tanaman ada embrio yang dibentuk secara apomiksis dan ada pula yang dibentuk secara seksual maka disebut Fakultatif Apomictic, seperti pada poliembrioni biji jeruk, mangga, coklat,manggis dsb.
11
Vegetatif apomiksis ada 2 macam yaitu :1. Vegetatif apomiksis dengan organ tanamanOrgan vegetatif tanaman seperti rhizom, stolon, umbi, bulbus. Bagian tersebut bila ditanaman menjadi tanaman baru.2. Vegetatif apomiksis dengan bijiBiji yang terbentuk secara spontan dari sel telur di luar ovul kemudian berkembang menjadi biji, proses pembentukannya dinamakan Vivipary yaitu pembentukan biji tanpa pembentukan sporophyt. Jadi pada vivipary sporophyt tidak ada tetapi dapat tumbuh menjadi tanaman baru dan pada vivipary tidak otonom diperlukan stimulasi penyerbukan tanpa perkecambahan tepungsari.
12
Reproduction mode in plant
1. Autogamaous (self pollination) plant, homozygote
2. Allogamous (cross polination) plant , heterozigote
3. Apomixis –clonal propagation
Breeding barier no 2 dan 3
Warm Season Grasses Limiting Factor
Apomixis Clonal propagation
No Seed Production
Vegetative propagation
Ploidy level
Breeding barrier Micropropagation13
Tissue CultureBeda sel hewan dan sel tumbuhan
SymplastPlasmodesmata, tidak terisolasi walau ada dinding cell
Totipoten Cell kemampuan sel tumbuhan somatik/ vegetatif dan gametik untuk beregenerasi mjd tanamn utuh
Autonom: mengatur rumah tangga cell
Kultur jaringan; suatu metode untuk mengisolasi bagian bagia tanaman seperti sel, jaringan, organ serta menumbuhkannya secara aseptisndi dalam medium budidaya shg bagian tersebut bereregenerasi kembali
Eksplan: bagian kecil dr suatu tanaman yang digunakan untuk memulai suatu kultur
Primordia: sel-selnya masih aktif bersifat meristematis dan sudah mengalami diferensiasi. Sel mesofil, stomata daun, kambium, korteks
Kalus: massa sel yang tidak terorganisir
Dediferensiasi sel kalus: sel-sel yang tidak tidak ter diferensiasiZat pengatur tumbuh: auksin sintetic
Sub kultur: pemindahan sel, jaringan atau organ ke dalam medium baru
Morfogenesis in vitro: proses terbentuknya organ2 baru yg akan menjadi tanaman utuh
Plantlet: tanaman regenerasi yang dihasilkan dengan teknik kultur jaringan
Organogenesis: diferensiasi meristem unipolar, menghasilkan ujung tunas yang akan menjadi tunas atau ujung akar yang akan menjadi akar.
Embryogenesis somatic: diferensiasi meristem bipolar yang berupa bakal tunas dan akar.
eksplan
dediferensiasi
embryogenik
kalus
embrriogenesis
organogenesis
caulogenesis
rhizogenesis
plantlet
1. Apa kultur jaringan?2. Mengapa sel tumbuhan bersifat totipoten3. Apa yang disebut kalus
biji
Sterilisasi
Perkecambahan
Seedling steril
Bagian tanaman lain
sterilisasi
Induksi kalus
Kultr kalus Dispersi selpada medium cair
Kultursuspensi sel
Perlengkapan kultur jaringan
1.Persiapan2.Inokulasi3.Pemeliharaan4.Aklimatisasi
Medium Kultur
1.Garam-garam anorganik2.Zat-zat organik3.Substansi organk komplek4.Bahan pemadap
AuksinCytokinin
Pembentukan akar pada cuttingEmbryogenesisPembentukan akar adventiv kalusInisiasi kalus pada dikotilPembentukan tunas adventifProliferasi tunas aksiler
LABORATORIUM KULTUR JARINGAN
1. persiapan; meliputi penyiapan tanaman, alat, botolkultur dan pembuatan medium.
2. Inokulasi; sterilisasi, pengirisan bagian tanaman ygakan dijadikan eksplan, penanaman pd medium ygtelah disiapkan. Kondisinya hrs absolut steril.
3. Pemeliharaan; diletakkan di rak di ruanginkubator.suhu 25-28
4. Aklimatisasi; adaptasi planlet dr kondisi heterotrofdlm botol menjadi autotrof yg dpt ditanam pdkondisi alamiah di tanah. Aklimatisasi di green house.
MEDIUM KULTUR JARINGAN
Pemilihan medium disesuaikan dengan jenis tanaman ygdigunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing2 peneliti.
Medium MS atau LS merupakan medium yang sangat banyakdigunakan untuk kultur klaus dan regenerasi berbagai tanaman.
Medium ini mengandung garam2 mineral dengan kosentrasitinggidan senyawa N dlm bentuk ammmonium dan nitrat.
Medium B5 digunakan utk kultur suspensi sel tanamanleguminosae. Nitsch & Nitsch, N6 digunakan utk serealia. Medium WPM utk tanaman berkayu. VW dan C (Vacin, Went, Knudson) utk anggrek, medium Kao dan Michayluk utk kulturprotoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae.
KOMPONEN DASAR DARI MEDIUM KULTUR
1. Garam-garam anorganika. Unsur Makro; C ,H, N, S, P, K, Ca dan Mgb. Unsur Mikro; Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe, Co
2. Zat-zat organikGula, Myo-isonitol, Vitamin, asam-asam amino, Zat
pengatur tumbuh3. Substansi organik komplek
Air kelapa, Ekstrak buah-buahan, ekstrak yeast, pepton, Trpton, Hidrolisat kasein4. Bahan pemadat
agar-agar, Gelrite, Phytagel, Sea Plaque Agarose5. pH6. Bahan2 lain misal arang aktif.
Unsur Makro
Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang sudahmengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas 2 kali.
Kebutuhan garam mineral di dalam jaringan kurang lebih samadengan tanaman utuh. Beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan pada medium kultur jaringan antara lain; KNO3, NH4NO3, Ca(N03).4H2O; NaNO3; CaCl2; 2H2O, MgSO4; 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4; 2H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4Kisaran antara 25-60 mM
Nitrogen
Bentuk2 persenyawaannya; KNO3; NH4NO3, Ca(NO3).4H2O, NaNO3, NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan N itu terbesar utkmenyusun asam-asam nukleat, protein, sebagai koenzym ataupersenyawaan lain yang mengandung N seperti klorofil, alkaloit, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.Kisaran ion ammonium 2-8 mM, nitrat 25-40 mM
Fosfor
Bentuk persenyawaannya antara lain; KH2PO4; k2HPO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. Kisaran yg diberikan 0,5-20 mM/l
Kalium
Bentuknya: KNO3; KH2PO4; k2HPO4, KCl dan K2SO4. Kisaran yg diberikan 1,837-25,18 mM/l. fungsinya utk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan proten, pembuatan klorofil.
Sulfur
Bentuknya MgSo4; 7H2O; (NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4; 7H2O; MnSO4; 4H2O; ZnSO4; 7H2O; CuSO4; 5H2O.Kisaran pemberian0,75-3 mM/l. Fungsinya utk memacu perkembangan akar sertaketahanan tumbuhan.
Calsium
Bentuknya Ca(NO3); 4H2O; CaCl2. 2H2O; Ca3(PO4)2. pemberian kisaran 1-3 mM/l. digunakan utk pembentukan dinding primitive, sbg Ca-pectat yaitu bagian integral dr dinding sel, sbg kation selular dan kofaktor enzym.
Magnesium
Bentuknya MgSO4; 7H2O. Diperlukan sbg elemen utama dalam pembentukanklorofil, aktifator ensim terutama dalam proses fosforilasi dan sintesis protein dg cara mebentuk komplek enzim-substrat.
Unsur Mikro
Fungsinya tidak diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat2 ini mengakibatkankelainan pertumbuhan.Bentunya; MnSO4.4H2O; ZnSO4; 7H2O; H3BO3; Kl; CuSO4; 5H2O; NaMoO4; 2H2O; CoCl2; 6H2O; FeCl3; 6H2O; Fe III citrate; FeSO4; 7H2O; NaFeEDTA; 2H2O; Fe(SO4)3, Fe III tartrate.
BesiBerperan penting dalam sintesis klorofil, konfersi energi pd fotosintesis danrespitasi dg melakukanreduksi oksidasi. Bentuknya; FeCl3; 6H2O; Fe III citrate; FeSO4; 7H2O; NaFeEDTA; 2H2O; fe(SO4)3; Fe III tartrate.
BoronSebagai asam borak H3BO3, berperan dalam translokasi karbohidrat, diferensiasiseluler dan perkembangan.
Molybdenum
Sebagai sodium molybdat (Na2MoO4; 2H2O). Berfungsi pd konfersinitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen.
Manganese
Berperan sebagai aktifator enzim dengan bertindak sebagaiperantara pada proses fosforilasi. Bentuknya MnSO4
Cobalt
Esensial untuk fiksasi nitrogen, bentuknya Cobalt Chloride (CoCl2).
Zincum
Sebagai aktifator enzim, penyusun klorofil, pemacu pembentukan zatpengatur tumbuh terutama IAA. Bentuknya ZnSO4.
Cuprum
Berfungsi dlm proses fotosintesis dan reduksi nitrit. Bentuknya CuSO4.5H2O
Chlorine
Memacu proses fotosintesis. Bentuknya CaCl2
KEBUTUHAN ZAT-ZAT ORGANIK
zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon. Diberikandalam bentuk gula, myo-isonitol, vitamin, asam amino dan zat pengatur tumbuh.
Gula
Diperlukan dalam proses fotosintesa. Sukrosa dlm medium kultur ditambahkansebanyak 30 gr/l. glukosa pada kisaran 20-30 gr/l
Myo-inositol
Untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan jaringan. Myo-isonitol ini adalahzat perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagaiprazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.
Vitamin
Ditambahkan untuk mempercepat pertumbuhan, diferensiasi kalus. Berfungsisebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor dari reaksi-reaksi enszimatispenting. Bentuknya antara lain; Thiamin-HCl; Nicotinic acid; Pyridoxin-HCl; Ca D-panthothenate, Folic acid, Choline chloride; Robiflavin;
Asam-asam Amino
Merupakan sumber N organik, penyusun protein dan asam nukleat. Bentknya ; Glutamine; Glycine; L-Cyteine; L-Arginine; L-Aspartic Acid; L-Methionine
Zat pengatur tumbuh
Diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan, perkembangan dandiferensiasi. Bentuknya Auksin, Sitokinin, Gibberellin; Abscisic acid, Ethylene.
AuksinIAA sbg auksi alamiah berperan dalam mempengaruhi pemsnjsngsn sel, pembelahan sel, diferensiasi jaringan faskuler, inisiasi pembentukan akar, mempengaruhi dominasi aplikal, zona absisi pada daun dan buah, pembungaan, dan pemasakan buah.
Auksin sintetik yg sering dipakai ; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); I-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA)
Sitokinin
Sitokinin alami berupa kinetindan zeatin. Sitokini hanya aktif jika ada auksin, pemberiannya bersama auksin membantu memacu pembelahan sel danmorfogenesiaSitokinin sintesis seperti N6-benzylaminopurine (BAP)
Biji
Sterilisasi
Perkecambahan
Seedling steril
Induksi kalus
Pemindahan kalus
Dispersi sel pada medium cair
Suspensi sel
Baguan tanaman lain
Sterilisasi
CONTOH KASUS
Dwarf Cogongrass(Imperata cylindrica L.)
Dwarf Napiergrass(Pennisetum purpureum Schumach.)
36
Dwarf Plant Characteristics
Easy Maintenance Leafier More Clump and Cluster More TillersGood for grazing areaGood nutrient content
DeMerit:
Lower Yield ProductionDifficult for propagationNo Seed Production
Merit:
37
EXAMPLE Case
I. Efficient nursery plant production of dwarf cogongrass(Imperata cylindrica L.) through mass propagation inliquid culture.
I. Efficient nursery production and multiple-shoot clumpsformation from shoot tiller-derived shoot apices ofdwarf napiergrass (Pennisetum purpureum Schumach.).
I. Efficient of Embryogenic Callus Induction Derived FromApical Meristem and The Examination Of The GeneticTransformation Condition By Particle Bombardment inDwarf Napiergrass
38
Stage of Research Activity
I. Efficient nursery plant production of dwarfcogongrass (Imperata cylindrica L.) throughmass propagation in liquid culture.
39
COGONGRASS (Imperata cylindrica L.)
Spread over wide area.Perennial grass reproduces
vegetatively by rhizomes.Used as thatch, mulching
material, ground cover plant.Addapt well in any
environtment and soil type.
40
Establishment of tissue culture method(Akashi and Adachi 1989).
In 2005, dwarf cogongrass was found as a mutant of cogongrass radiated by ion beams. (Shigeki et al, 2009).
Dwarf Mutant- Dwarf Cogongrass
41
Characteristics of dwarf cogongrass
Dwarf mutant Wild type
The height is 15-20 cm. No need for cutting. Low maintenance. Ground cover grass. Leafier. Cluster.
42
Propagation of dwarf cogongrass
Dwarf cogongrass No Seed production
Vegetative propagation
Limiting factors• Long time to prepare nursery• Intensive labor• Need space• Dependent on field condition
Propagation Using In vitro Tissue Culture Method Enables rapid multiplication Not depending on the season Healthy plant production Not labour
43
Material and Method
o Explant : Shoot Apical Meristem
Cutting Apical Meristem
MSCs Induction MS solid medium 0.1 mg L–1 2,4-D and 2 mg L–
1 BAP.
Mass Propagation in liquid mediumMS liquid culture (2,4-D; 0, 0.05, 1.0 mg L–1) and BAP ; 0, 1.0, 2.0 mg L–1) .
Plant regeneration Transfer to MS solid media with 0.5 mg L–1
BAP+ 0.05 mg L–1 2,4-D; 2 mg L–1 BAP+0.01 mg L–1 2,4-D; 1 GA+1mg L–1
KIn; free hormon media.
Aclimatization Jiffy-7 peat pellets, soil, soil + vermiculite (30d).
Genetic analysisAFLP analysis
44
RESULT
Induction of MSCs in Dwarf Cogongrass
Figure 1. Induction of MSCs of dwarf cogongrass in MS solid medium
45
Figure 2. Effect of hormone concentrations on proliferation of multiple-shoot clumps in dwarf cogongrass.
Mass Propagation of MSCs in Liquid Culture
46
Evaluation of Plant Regeneration Media in dwarf cogongrass
Medium Composition No of inoculated MSCs
No of regenerated MScs (%)
Total No of regenerated plants
No. of plants/ regenerated MSc
Rooting
Basal Medium
Hormone concentration (mg/L)
MS BAP (0.5) ± 2.4-D (0.05)
74 0.0 0.0 0.0 -
BAP (2.0) ± 2,4-D (0.01)
74 0.0 0.0 0.0 -
GA3 (1.0)± kinetin (1.0)
74 0.0 0.0 0.0 -
- 74 46.3 (62.5±2.1)b
90.0± 4.9b 2.0 ± 0.2b +
½ MS - 74 52.5 (70.9±4.9)a
145.5± 5.6a 2.8± 0.2a +++
The values are means ± standard deviations of 3 replications, and rooting was evaluated objectively. Letters indicate a significant difference by Tukey’s test (P< 0.05).† Root rating: – none, + poor, ++ moderate, and +++ good .
Table 1. Effect of medium composition on plant regeneration and rooting
47
Size of MSC
Experiment
No. of Inoculated MSCs
No. of regenerated MSCs (%)
Total No. of Regenerated plants
No. of plants/ regenerated MSC
Rooting
< 2mm 1 60 56 341 6.1 +++
2 56 330 5.9 +++
3 56 367 6.6 +++
Mean 56.0(93.3±0.0)a
346.0± 9.0a 6.2± 0.3a +++
2-5mm
1 80 28 78 2.8 +
2 31 57 1.8 +
3 30 84 2.8 +
Mean 29.7(49.4±2.5)b
73.0± 14.2b 2.5± 0.6b +
Effect of MSC Size on Plant Regeneration and Rooting
Mean values are indicated mean ± standard deviations of 3 replications, and rooting was evaluated objectively. Letters indicate a significant difference by Tukey’s test (P< 0.05).† Root rating: – none, + poor, ++ moderate, and +++ good .
Table 2.Effect of MSC size on plant regeneration and rooting in dwarf cogongrass
48
Acclimatization medium
Pla
nt
heig
ht
(cm
)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
Jiffy-7 Soil Soil + Vermiculite
a
b
b
Figure 3 Effect of acclimatization medium on nursery plant growth of dwarfcogongrass. Values are the means of 30 replications, standard deviations arerepresented by vertical bars. Letters indicate a significant difference by Tukey’stest (P < 0.05).
Aclimatization in Several Media
49
b c d
e f g
I j
1 mm 5 mm 5 mm
Figure 4 Mass propagation and nursery plant production of dwarf cogongrass.
Culture of MSCs on solid medium
Mass propagation in liquid culture
Plant Regeneration and Rooting Aclimatization
50
Primer Combination
Total fragments
Fragments details Polymorphic bands Original
plant
Regenerated
plant
X-CTA/M-CTG
X-CAG/M-CAA X-CTG/M-CAT
X-CGA/M-CGC
P-GTA/M-CGT
P-GCA/M-CAC
P-GCG/M-CGA P-GAC/M-CCG
P-GTG/M-CAG
P-GTT/M-CTC
Total
15
13 15
5
9
8
7 10
10
9
101
15
13 15
4
9
8
7 10
10
9
100
15
13 15
5
9
8
7 10
10
9
101
0
0 0
1
0
0
0 0
0
0
1
Table 3. AFLP analysis of original dwarf plants and regenerated dwarf plants of cogongrass
51
Figure 5. AFLP profiles ofthe original dwarfnapiergrass plants (O1-3)and regenerated plants(1-24) as revealed byAFLP primer combinationXba I+CTA/ Mse I+CTG.(M= DNA marker 1 kbpladder).
Genetic variations of regenerated plants through micropropagations were assessed by amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis using 3 primer combinations. 43 scorable fragments were amplified, all regenerants showed same band pattern with original dwarf cogongrass and no major genetic variations.
AFLP Analysis
52
1.Mass propagation of dwarf cogongrass conditions were established from
multiple-shoot clump cultured in MS liquid medium containing 0.05 mg L–1 2,4-D
and 0.5 mg L–1 BAP.
2.The small clump size is more effective to proliferate than the large one. On
regeneration medium, the small clumps have higher regeneration rate and higher
rooting on the similar medium than the large clumps.
3.Regenerated clumps of the small size can grow normally in aclimatization media
and can grow well on soil media.
4.Genetic uniformity of the regenerants in the present study adds to the
significance of this establishment method as supply nursery plant production
system of dwarf cogongrass .
Conclusions
53
II. Efficient Nursery Production and Multiple-ShootClumps Formation from Shoot Tiller-Derived ShootApices of Dwarf Napiergrass (Pennisetumpurpureum Schumach)
Stage of Research Activity
54
DWARF NAPIERGRASS (Pennisetum purpureum Schumach)
LeafierCan be grown in a wide
variety of soil typeForage for grazingHigh nutrient contains
No Seed Production
Vegetative Propagation
In Vitro Propagation 55
Using convensional vegetative propagationAdvantage: Simple method/ every farmer in smalholder farm
can apply the system Gives good result
Disadvantage; Demand suplly problem (quantity and time) Labour intensive
56
Research on micropropagation of monocotyl plants using multiple-shoot clumps:
• Sugarcane (Sacharum officinarum) (Khan et al. 1996).
• Pineapple( Ananas comosus) (Gutterson, 2003).
• Lemongrass (Cymbopogan citratus) (Mizukami et al. 1989)
• Vetiveria grass (Vetiveria zizoinoides) ( Vanbe et al., 2003)
57
MATERIAL AND METHOD
• Induction of MSCs (2,4-D and BAP)(0.0, 0.01, 0.1, 0.5 mg L–1 2.4-D and 0.0, 2.0 mg L–1 BAP)
• Proliferation of MSCsD0.1B2 : 0.1mg L–1 2,4-D + 2.0 mg L–1 BAP;D0.1B2CL : 0.1 mg L–1 2,4-D +2.0 mg L–1 BAP + 5.0 µM CuSO4;D0.1B2CH : 0.1 mg L–1 2,4-D + 2.0 mg L–1 BAP + 50 µM CuSO4).
• Regeneration of MSCs (NAA and BAP)(0.0, 0.01, 0.1 mg L–1 NAA and 0.0, 0.2 mg L–1 BAP)
• Morphological Characteristics and Flow Cytometry (FCM) Analysis
58
Sterilization Of Explants
59
RESULT
Induction of MSCs of dwarf napiergrass
2,4-D mg/L 0 0.01 0.1 0.5
BAP (mg/L) 2 2 2 2
Figure 6. Induction of MSCs of dwarf cogongrass in MS solid medium60
Table 4. Effect of hormone concentration on the formation ofMSC derived from shoot apices in tiller of dwarf napiergrass
Hormone
concentration (mg L–1)
No. of
inoculated
shoot apices
No. of multiple-shoot
clumps formed (%)
2,4-D BAP
0 0 60 0 (0) a
0 2 60 0 (0)a
0.01 2 60 0 (0) a
0.1 2 60 17 (29) b
0.5 2 60 8 (14) c
abc Different letters following each value within a column indicated a significant difference by Tukey’s Test (P< 0.05) on experiment of MSCs formation.
Effect of Hormone Concentration on MSC Formation
61
Clump Proliferation Capacity
Clumps proliferatiin capacity (%)= (number of cluster proliferated) (number of cluster on the subculture medium ) –1X100.
Figure 7. Clumps proliferation capacity in proliferation media.
62
Table 5. Effect of hormone concentration on plant regeneration fromMSC derived from shoot apices in tiller of dwarf napiergrass
Hormone
concentration
(mg L–1)
No. of
inoculated
clumps
No. of
regenerated
clumps(%)
No. of total
regenerated
shoots
No. of
shoot/c
lumps
NAA BAP
0 0 63 27 (47.8) a 49 ab 1.5
0 2 63 14 (22.2) b 31 a 2.5
0.01 2 63 33 (52.3) ab 99 b 3.0
0.1 2 63 53 (84.1) b 158 c 3.0
ab Different letters following each value within a column indicated significant difference by Tukey’s Test (P < 0.05).†Clumps derived from one original shoot apex.
Effect of hormone concentration on plant regeneration
63
Figure 8 Plant regenerationvia MSCs in dwarf napiergrass.(a) Excised shoot apex fromshoot tiller as initial explant.(b) Inducted of shoot apex inMS medium containing 2 mgL–1 BAP and 0.1 mg L–1 2,4-Dafter 10 days of culture. (c)Primary MSCs after 30 days.(d) MSCs after 40 days in thetube culture. (e) Proliferatedclump in MS inductionmedium with 50 µM CuSO4.(f) Germinated clump in MSmedium containing 0.1 mg L–1
NAA and 2.0 mg L–1 BAP. (g)Numerous green regeneratedplants in MS mediumcontaining 0.1 mg L–1 NAA and2.0 mg L–1 BAP. (h) Rootingregenerants in half strenghhormone-free MS medium. (i)Regenerants from MSCs infield experiment. 64
a
cFigure 9. Regenerated plants from multiple-shoot clumps of dwarf napiergrass growth in the field. 65
100
Nu
mb
er o
f n
ucl
ei
(a)
(b)
Dwarf napiergrass (control)O. sativa
100
Nu
mb
er o
f n
ucl
ei
Fluorescence intensity
Regenerant dwarf napiergrass from multiple-shoot clumpO. sativa
DNA Content Analysis Using Flowcytometry
Figure 10. DNA content of regenerants from multiple-shoot clump and control plant.
66
Control: 128.6 cmReg 1: 115.2 cmReg 2: 145.2 cm
Control: 134.04 cmReg 1: 116.3Reg 5: 148.1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
12 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021
Plan
tleng
th(cm)
PlantNumber
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021
Leafblade
leng
th(cm)
PlantNumber
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021
LeafBlade
Width(cm)
PlantNumber
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1 3 5 7 9 111315171921
Plan
tHeigh
t(cm)
PlantNumber
Control: 77.4Reg 17: 83.3Reg 19: 62
Control: 2.9Reg 17: 3.4Reg 2: 2.44
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021
FreshYield(g/pot)
PlantNumber
Control: 21.6Reg 15: 32Reg 15: 561
Control 731.6Reg 16 : 876Reg 15: 561
Figure 11. Morphological characteristics and fresh yield of regenerants from multiple-shoot clumps and control plants of dwarf napiergrass.
Morphological Characteristics
67
1. The most effective plant growth hormone treatment for multiple-shoot
clumps induction was 0.1 mg L–1 2,4-D plus 2.0 mg L–1 BAP in MS solid
medium.
2. The addition of 50 µM CuSO4 could increase the percentage of multiple-
shoot clumps proliferation. Plant regeneration frequency was achieved up
to 84% by culturing the multiple-shoot clumps on solid MS medium
containing 0.1 mg L–1 NAA and 2.0 mg L–1 BAP.
3. All regenerants were successfully grown up in the soil. Compared to control
plants, in vitro regenerated plants did not reveal any significant difference
on morphological characteristics and DNA content.
Conclusions
68
III. Efficient of Embryogenic Callus InductionDerived From Apical Meristem and TheExamination Of the Genetic TransformationCondition by Particle Bombardment in DwarfNapiergrass
Stage of Research Activity
69
Breeding Of Dwarf Napiergrass
Agronomic important genes
New CultivarMass Propagation
Nursery
70
Transformation of Graminae
Species
Barley(Cho et al 1998)Wheat(Cho et al 2000)Pearl Millet (Gildman et al 2003Bahiagrass (Gondo et al 2003)Ruzigrass (Ishigaki et al 2012)
Embryogenic Calli for Material Genetic Transformation
Materials
Embryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calliEmbryogenic calli and Multiple-shoot clumps
71
Materials and Methods
Induction of EC (2.0 mg L–12.4-D & 0, 0.01, 0.1, 0.5 mg L–1BAP), 30-40d
Proliferation of EC•D2B0.5 : 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP; •D2B0.5CL : 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP + 5.0 µM CuSO4;• D2B0.5CH: 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.5 mg L–1 BAP + 50 µM CuSO4).
Regeneration of MSC and EC (NAA&BAP)
Shoot apices
Data were analysed by Tukey’s Test with SPPS 10 software
72
RESULT
2,4-D mg/L 2 2 2 2
BAP (mg/L) 0 0.01 0.1 0.5
Induction of Embryogenic Callus
Figure 12. Induction of embryogenic callus of dwarf napiergrass onseveral media. 73
Table 6. Effect of hormone concentration on the formation of EC derivedfrom shoot apices in tiller of dwarf napiergrass
Hormone
concentration
(mg L–1)
No. of
inoculated
shoot apices
No. of calli
formed (%)
No. of
embryogenic
calli formed (30
days) (%)
No. of
embryogenic
calli formed (60
days) (%)2,4-D BAP
0 0 60 0 ( 0.0) 0 (0.0) a 0 (0.0)
2 0 60 49 (81.7) 0 (0.0) a 22 (36.7)
2 0.01 60 56 (93.3) 5 (8.3) a 27 (45.0)
2 0.1 60 52 (86.6) 12 (20.0) b 37 (56.7)
2 0.5 60 54 (90.0) 15 (25.0) b 48 (80.0)
Embryogenic Calli Formation
abdifferent letters following each value within a column indicate significant difference by Tukey’s Test (P<0.05). 74
0 day 10 day 20 day 30 day
D2B0
D2B0.5
e
Figure 13. Developmental stage of embryogenic calli of dwarf napiergrass.
Developmental Stage of Embryogenic Calli
75
Callus Proliferation Capacity
Figure 14. Callus proliferation capacity of dwarf napiergrass in proliferation media.
76
Figure 15. Developmental stage of embryogenic calli of dwarf napiergrass on different media.
0 day 3 days 7 days 21 days
D2B0.5
D2B0.5CH
Developmental Stage
77
Table 7. Effect of hormone concentration on plantregeneration from EC derived from shoot apices in tillerof dwarf napiergrass
Hormone
concentration
(mg L–1)
No. of
inoculated
calli
No. of
regenerated
calli (%)
No. of total
regenerated
shoots
No. of
shoot/c
alli
NAA BAP
0 0 63 20 (31.7) a 39a 1.9
0 2 63 29(46.0) a 50a 2.0
0.01 2 63 32(50.8) a 62a 1.9
0.1 2 63 43(68.2) b 87a 2.0
ab: different letters following each value within a column indicate significant difference by Tukey’s Test (P<0.05).
78
Regeneration, Rooting and Aclimatization
Figure 16. Regenerating and Rooting Stage ofdwarf Napieragrass.
79
Genetic Transformation of Dwarf Napiergrass
Target Tissue : Embryogenic calli of dwarf napiergrass.
Vector DNA pAHC25 containing uidA gene controlled by maize ubiquitin 1 (UBI1)promoter, which was used to drive GUS reporter gene and selective marker bar (Christensen et al. 1992).
Osmotic treatment : Mannitol and Sorbitol (0-1.2M).
80
Callus
Gold(xμm)
Target gene
Helium gus pressure
Transgenic plant
High digestibilityResistant to droughtResistant to virus
・・・・
etc
Transformation System Using Particle inflow gun
Selectionand
Regeneration
Rooting
Donor plant
81
Promoter
pAHC25
NOS 3’
GUS
Exon
9706 bp
PromoterExon
BAR
NOS 3’
HindIII
SphI
PstI
Sal I
PstI
Sal I
XbaI
BamHI
SmaI
Bgl II
Eco RI
Sac I
Hind III
SphI
PstI
Eco RIBamHI
XbaI
Sal I
PstI
PstI
Sal I
Bgl II
SphI
Eco RI
Sal I
Eco RI
SphI
Bgl IISal I
pUC8
bla
Figure 17. Schematic diagrams of plasmid used for transformation.
pAHC25
Reporter gene,GUS
Selection marker gene, BAR
82
1 2 3 4 5
Concentration ofMannitol&Sorbitol
0 0.3 0.6 0.9 1.2
Number of GUS Spot 609 1189 2804 2739 1894
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Nu
mb
er
of
GU
S Sp
ot
Comparison of transient GUS expression in MS-D2B0.5CH with mannitol and sorbitol
83
GUS Expression on Embryogenic Callus of Dwarf Napiergrass
84
1. Embryogenic calli of dwarf napiergarss could produce regenerated plants on
MS medium containing 2 mg L-1 2,4-D and 0.5 mg L-1 BAP, which was found as
a suitable induction medium of dwarf napiergrass.
2. MS medium containing same hormon on induction medium and addition by
50 μM CuSO4 was the best condition for proliferation.
3. The best osmoticum for embryogenic callus was found at 0.3M mannitol and
0.3M sorbitol. With this concentration give result in improving number of
GUS expression and there was no browning expression in the calli.
4. This embryogenic calli can be used as target tissues for genetic
transformation using particle bombardmet of napiergrass.
Conclusions
85
Cogongrass Napiergrass
Dwarf Type Artificial Mutation Natural Mutation
Propagation Clonal/ No Seed Clonal/ No Seed
Merit Covergrass, cluster grass, Easy to maintenance
Forage for grazing area, Good Quality forage
Demerit Difficult to propagate Need alternativemethods and breeding
SUMMARY
86
The Total Composition of Artificialdifficult