La recherche expérimentale d’aval: Evaluation des antibiotiques
dans les modèles animaux
Bruno FANTIN
Hôpital Beaujon, Service de Médecine Interne.
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux
2. Apport des modèles expérimentaux pour
l’évaluation des antibiotiques
Technical Issues in Animal Models: identification of the critical steps
Animal End Points
Create infection
Start of therapy
End of therapy
Sacrifice
«In vitro» inoculum
«In vivo» inoculum
Infection PK/PD Regrowth Carry-over
• Survival • CFU • R
Lack of Relationship between « in vitro » and « in vivo » Inocula
Murine E. coli pyelonephritis 0 h 48 h
109 ≈105-106
≈ 1000-fold decrease
Rabbit S. aureus endocarditis 0 h 48 h
≈108
≈ 100-fold increase
106
Time Interval between Infection and Treatment
Two major impacts:
• Severity of the systemic infection • Characteristics of the « in vivo » inoculum
• growth phase • inoculum size • risk of emergence of resistance • « phenotypic tolerance »
Bacterial Growth between Inoculation and Treatment in Murine K. pneumoniae Infection
Leggett et al., JID,1989
Influence of Duration of Infection on Antibiotic Activity in S. epidermidis Endocarditis in Rats
Entenza et al., JID, 1994
When to Start Therapy?
What is the question ?
• Efficacy • Killing rate • PK/PD parameters
• Influence of disease state on efficacy • Risk of emergence of resistance
Early phase Exponential growth Standardized inoculum ~ 106 CFU (# MBC inoculum)
Late treatment Stationary phase High inoculum ~ 107-108 CFU
Duration of Therapy
• Rate of killing, efficacy - CFU 0-24 h discriminant parameter correlated with survival • Emergence of resistance - more prolonged duration of treatment required onset of selection depends on mechanism of resistance (mutation or not) growth of R subpopulation under selective antibiotic pressure
Duration of Therapy and Development of Resistance in Endocarditis due to VanB E. faecalis
Aslangul et al., JID, 1997
Rational for Antimicrobial Dosing in Animals
Serum elimination half-lives of selected antibiotics in mice and humans
Half-life in minutes
Drug Mice Humans Amikacin 17 104 Imipenem 8 60 Cefazolin 15 108 Ciprofloxacin 32 240 Minocycline 120 1080
Andes & Craig, IJAA, 2002
Simulation of Human Pharmacokinetics
Andes & Craig, AAC, 1998 Piroth et al., AAC, 1999
Uranyl nitrate-induced renal impairment in mice
Human amoxicillin PK simulation in rabbits
Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (1)
If CFU the end point: not too late (avoid regrowth)
not too soon (avoid carryover)
minimize [antibiotic concentration/MIC] ratio in tissue samples
Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (2)
If sterilization rate or « cure rate » are the end points: delay sacrifice « relapse » study Results of therapy in rabbits with E. coli endocarditis
Regimen Log10 CFU/g of vegetation ± SD on: Day 1 Day 6 Control 8.8 ± 0.5 (0/7) 8.1 ± 1.4 (0/8) Ceftriaxone 6.7 ± 1.1 (0/8) 7.6 ± 1.5 (0/7) Netilmicin 5.7 ± 2.0 (0/7) 8.3 ± 1.1 (0/9) Ceftriaxone + netilmicin 2.6 ± 0.9 (4/8) 3.6 ± 2.3 (3/8) Fantin et al., AAC, 1989
Animal Models: end points
• Efficacy • Qualitative
- Survival rate - Sterilization rate
• Quantitative - CFU - parameters calculated from the Emax model dose to kill x log bacteriostatic dose protective dose • Emergence of resistance
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux
2. Apport des modèles expérimentaux pour
l’évaluation des antibiotiques
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Détermination des paramètres PK/PD prédictifs de l’activité antibactérienne in vivo
• Doses et régimes thérapeutiques multiples • Relation entre données PK/PD observées et activité
in vivo
Andes & Craig, IJAA, 2002
Approche PK/PD
• Approche indispensable parallèlement à la phase I • Permet de définir:
– Le paramètre PK/PD à optimiser chez l’homme – Le mode d’administration optimal chez l’homme
• Modèles utilisés: – Infection de cuisse de souris – Infection pulmonaire de souris
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Relation dose - effet bactéricide de la témocilline dans les reins de souris
0
1
2
3
4
5
6
7
8
fT > CMI (%)
log
CFU/
g
CFT073
CFT073Tc P89
0 34-36 46-48 92-97
Soubirou et al, sous presse
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie : diffusion homogène
Crémieux et al, JID, 1989
Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion avec gradient décroissant
Fantin et al., AAC, 1994
Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion hétérogène
Saleh-Mghir et al, AAC 1999
Types de diffusion des antibiotiques marqués dans la végétation
• Amoxicilline, clavulanate • Péfloxacine, téma, sparflo
• Tobramycine • Spiramycine, quinupristine
• Daptomycine
Non homogène
Gradient de diffusion • Ceftriaxone, pénicilline
• Dalfoprisitine • Tigecycline Périphérique Teicoplanine Hétérogène Oritavancine
Homogène
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Témocilline dans la pyélonéphrite murine à E. coli BLSE
log CFU/g dans les reins de souris ± et (no stérile/no total)
Souches E. coli
Contrôles début de
traitement
Témocilline 200mg/kg
q2h Céfotaxime Imipénème
CFT073 4,23 ± 1,17 (1/18)
2,10 ± 1,70
(9/21) 1,92 ± 1,38
(6/13) 1,98 ± 1,67
(6/14) CFT073 Tc P89
4,86 ± 0,69 (0/20)
1,43 ± 1,52
(14/22) 3,95 ± 1,18
(0/13) 1,34 ± 1,50
(12/15)
Pas de mutants in vivo
Soubirou et al, sous presse
Cions in human with a 6mg/kg dose:
Peak # 88-95 µg/ml
Trough # 10 µg/ml
Chakraborty, JAC 2009
Activity of Daptomycin in VanA E. faecium rabbit endocarditis
Caron et al, AAC 1992
Discrepancy between in vitro and in vivo activity of Daptomycin against E. faecium
Protein binding in human # 90%
Caron et al, AAC 1992
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Gènes qnr et activité des quinolones
Souches de E. coli CMI (mg/L) x CMI Sauvage 0,004 Transconjugant (Tc) qnrA1 0,25 64 Mutant gyrA 0,25 64
Concentration minimale inhibitrice (CMI) de la ciprofloxacine en fonction des mécanismes de résistances
Rodriguez-Martinez et al, AAC 2007
CMI=0,5 mg/L: seuil de sensibilité à la ciprofloxacine (CA-SFM)
Première étape: préparation d’un système isogénique chez Escherichia coli
E. coli CFT073 (référence pour modèle in vivo)
E. coli CFT073-RR (résistante à la rifampicine)
E. coli Hm13 (plasmide pQnrA1) E. coli CFT073 –RR-gyrA
E. coli CFT073-RR Tc (pQnrA1)
E. coli PS105 (plasmide pQnrS1)
E. coli CFT073-RR Tc (pQnrS1)
Souches cliniques donatrices:
Allou et al, AAC 2009
Activité de la ciprofloxacine in vitro
Souches de E. coli CMI CPM CPM/ CMI PMR
CFT703-RR 0,0075 0,06 8 0,8 (± 0,4) x 10-8
CFT073-RR Tc (pQnrA1) 0,5 4 8 0,6 (± 0,7) x 10-8
CFT073-RR Tc (pQnrS1) 0,25 2 8 1,1 (± 1,5) x 10-8
CT073-RR-gyrA 0,25 2 8 0,3 (± 0,4) x 10-8
PMR: proportion de mutants résistants / ciprofloxacine à 4 fois la CMI
Allou et al, AAC 2009
Experimental pyelonephritis in mice
CBA female mice 8-week-old
Intra-urethral injection under general anesthesia of 50 µL from an inoculum of 5 x 1010 bactéries/mL (108).
Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR Tc (pQnrS1)
012345678
Contrôle débuttraitement (n=15)
Contrôle fintraitement (n=15)
Souris traitées(n=16)
log/
ufc g
de
vess
ie
P=0,6
0
1
2
3
4
5
Contrôle débuttraitement (n=15)
Contrôle fintraitement (n=15)
Souris traitées(n=16)
log
ufc/g
de
rein
Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR-gyrA
P=0,9
Paramètres PK/PD de la ciprofloxacine chez la souris
Souches de E. coli CMI
ASC0→24h /CMI
Cmax /CMI
CFT073-RR 0,007 827 147
CFT073-RR Tc(pQnrA1) 0,5 12.4 2.2
CFT073-RR Tc(pQnrS1) 0,25 24.8 4.4
CFT073-RR-gyrA 0,25 24.8 4.4
Cmax: 1,1 +/- 0,2 µg/ml; ASC0→24h : 6.2 +/- 1.2 µg.h/ml
Allou et al, AAC 2009
Apports des modèles expérimentaux à l’évaluation des antibiotiques
1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d’un mécanisme de résistance 6. Intérêt d’associations d’antibiotiques
Etude de l’association levofloxacine-rifampicine dans l’ostéite expérimentale
Muller-Seyries et al, AAC 2009