MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA
Identificação das Vias de Sinalização Anti-apoptóticas
em Células Estaminais Cancerígenas de Osteossarcoma
Cláudia Borges Gonçalves
2012
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, realizada sob a orientação da Doutora Célia Maria Freitas Gomes do Instituto Biomédico de Investigação de Luz e Imagem (IBILI)
Esta cópia da tese é fornecida na condição de que quem a consulta reconhece que os direitos de
autor são pertença do autor da tese e que nenhuma citação ou informação obtida a partir dela
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Aos meus pais
Aos meus irmãos
Este projecto foi desenvolvido na seguinte instituição:
Farmacologia e Terapêutica Experimental, Instituto Biomédico de Investigação de Luz e
Imagem (IBILI), Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Coimbra
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”
Leonardo da Vinci
Aos meus pais
Aos meus irmãos
vii
Agradecimentos
À Doutora Célia Gomes, orientadora deste projecto, e mais que isso, a minha Professora, os
meus sinceros agradecimentos por todo o conhecimento transmitido, pelo apoio, pela confiança,
pela imensa paciência e pelo incentivo demonstrados ao longo deste ano, e especialmente um
grande obrigada pelos “puxões de orelhas” que me fizeram crescer, ir mais além e me tornar mais
perspicaz neste mundo que é a investigação.
Ao Professor Doutor Miguel Morgado, coordenador da disciplina de Projecto de Mestrado, e
coordenador do curso de Engenharia Biomédica, os meus sinceros agradecimentos pelo interesse
apresentado durante este projecto, pela disponibilidade sempre demonstrada e pelo envolvimento
no percurso académico de todos os alunos de Engenharia Biomédica.
Ao Engenheiro Francisco Caramelo, pela disponibilidade, pela atenção e pelas sugestões na
análise estatística.
Ao Professor Doutor Carlos Alberto Fontes Ribeiro, do serviço de Farmacologia e Terapêutica
Experimental, os meus agradecimentos pelo recebimento nestas instalações. E a todo o staff deste
serviço um muito obrigada pelo carinho e simpatia demonstrados.
À Patrícia, minha companheira da “salinha” e dos cafés, por toda a paciência e incentivo,
pelo carinho e pela amizade, e por todos os momentos que vivemos juntas no decorrer deste
projecto que sem dúvida me foram essenciais. À Magui por toda a alegria e entusiasmo, por toda a
ajuda e opiniões, e por me ter salvado tantas vezes ao deixar-me “raptar-lhe” o cartão.
Aos meus amigos de curso, em especial à Licas, à Mónica, à Raquel, à Daniela, à Carla, à
Vanessa e à Cíntia, que sempre estiveram lá quando precisei, e que me deram todo o carinho,
amizade, compreensão e apoio neste percurso feito por todas nós. Ao meu afilhado, Hugo, pelos
lanches e pelo incentivo, e mais importante que isso pela amizade. À minha afilhada, Telma, com a
qual iniciei esta jornada pelo IBILI, pela amizade e pelo apoio.
Aos amigos que fiz ao longo deste percurso académico, em especial à Carla, pelo apoio, pelas
conversas, pela amizade, pelos conselhos, e por todos os sorrisos contagiantes.
Aos meus amigos de infância, em especial à Liliana, à Sofia, ao Pedro, à Fernanda, à Ticha, ao
Júlio, e à Joana, que por mais que a Faculdade nos tenha afastado sempre estiveram lá para me
apoiar, para me dar um ombro amigo e para cultivar esta amizade que sei que vai ser para a vida, um
grande obrigada pela força e pelo carinho.
À minha família, em especial aos meus Pais e aos meus Irmãos, por todos os sacrifícios, pelo
apoio, pelo amor e pelo porto de abrigo. Sem vocês não teria chegado tão longe! Um muito obrigada
por sempre acreditarem no meu potencial!
Ao Diogo que me aturou nos piores momentos, mas que sempre teve uma palavra
animadora para me consolar. Obrigada por todo o amor, pela paciência e pelo apoio incondicional ao
longo deste percurso tão importante da minha vida.
ix
Índice
Agradecimentos ........................................................................................................................vii
Lista de Figuras .......................................................................................................................... xi
Lista de Tabelas ......................................................................................................................... xii
Lista de Abreviaturas ............................................................................................................... xiii
Resumo ..................................................................................................................................... xv
Abstract ................................................................................................................................... xvii
1. Introdução ........................................................................................................................... 1
1.1 Osteossarcoma .............................................................................................................. 1
1.1.1 Etiologia e Factores de Risco ......................................................................... 1
1.1.2 Células de origem do OS ................................................................................ 2
1.1.3 Tratamento do OS .......................................................................................... 4
1.2 Teoria das Células Estaminais Cancerígenas ................................................................ 5
1.2.1 Identificação de CSCs ..................................................................................... 7
1.3 Implicações Terapêuticas das CSCs ............................................................................... 9
1.3.1 Apoptose ...................................................................................................... 12
1.3.1.1. Apoptose e cancro ...................................................................... 15
1.4 Objectivos .................................................................................................................... 16
2. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 17
2.1 Cultura Celular ............................................................................................................. 17
2.1.1 Ensaios de Viabilidade Celular ..................................................................... 17
2.2 Método de formação de esferas ................................................................................. 17
2.3 Estudos de Citotoxicidade com DOX ........................................................................... 18
2.3.1 Preparação das células MNNG/HOS e das CSCs para os estudos de
citotoxicidade com DOX........................................................................................ 19
2.3.2 Estudos de Viabilidade Celular – Ensaio colorimétrico de MTT .................. 19
2.3.3 Estudos de Proliferação Celular – Ensaio colorimétrico de BrdU ................ 20
2.3.4 Ensaio de TUNEL para medição da apoptose .............................................. 21
2.4 Análise da expressão de proteínas por Western blot ................................................. 22
2.4.1 Expressão de proteínas anti- e pró-apoptóticas da família da Bcl-2 e da
caspase- 3 ............................................................................................................. 22
2.4.1.1 Preparação de extractos celulares ............................................... 22
x
2.4.1.2 Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE) e Electrotransferência ........................................................... 23
2.4.1.3 Immunoblotting e Quantificação ................................................. 23
2.5 Análise Estatística ......................................................................................................... 24
3. Resultados .......................................................................................................................... 25
3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS ................... 25
3.2 Sensibilidade das células MNNG/HOS e das CSCs à DOX ............................................. 26
3.2.1 Efeito da DOX na Viabilidade e na Proliferação Celulares ........................... 26
3.2.2 Detecção da apoptose .................................................................................. 29
3.3 Expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas .......................................................... 31
3.3.1 Análise da razão entre as proteínas anti- e pró-apoptóticas ....................... 34
3.4 Expressão da caspase-3 ................................................................................................ 35
4. Discussão ............................................................................................................................ 37
5. Conclusão ........................................................................................................................... 45
6. Trabalhos Futuros .............................................................................................................. 47
7. Referências Bibliográficas .................................................................................................. 49
xi
Lista de Figuras
Figura 1.1 Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens e alterações na diferenciação
osteogénica ................................................................................................................................ 3
Figura 1.2 Modelos de heterogeneidade tumoral ..................................................................... 7
Figura 1.3 Impacto do modelo das CSCs nos tratamentos anti-tumorais ............................... 12
Figura 1.4 Vias intrínseca e extrínseca da apoptose ............................................................... 14
Figura 3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo
método de formação de esferas .............................................................................................. 25
Figura 3.2 Efeito da DOX na viabilidade das células MNNG/HOS e das CSCs .......................... 27
Figura 3.3 Percentagens de células viáveis após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs
a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM) ..................................................................... 27
Figura 3.4 Efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs ........................ 28
Figura 3.5 Percentagens de células MNNG/HOS e de CSCs em proliferação após exposição a
diferentes concentrações de DOX (0-100 µM) ........................................................................ 28
Figura 3.6 Imagens de fluorescência representativas de células MNNG/HOS e de CSCs em
apoptose pelo ensaio de TUNEL após incubação com diferentes concentrações de DOX
durante 48h ............................................................................................................................. 30
Figura 3.7 Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a
diferentes concentrações de DOX durante 48h ...................................................................... 31
Figura 3.8 Imagens representativas da expressão das proteínas Bak e Bax por Western blot
após exposição à DOX .............................................................................................................. 32
Figura 3.9 Imagens representativas da expressão das proteínas Bcl-XL e Bcl-2 por Western
blot após exposição à DOX ....................................................................................................... 33
Figura 3.10 Representação gráfica da razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e
pró-apoptóticas às 48h de incubação com DOX ..................................................................... 34
Figura 3.11 Imagens representativas da expressão da proteína caspase-3 por Western blot
após exposição à DOX .............................................................................................................. 35
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e
respectivas diluições................................................................................................................. 24
Tabela 2. Valores de IC50 obtidos através dos ensaios de MTT e de incorporação com BrdU,
após exposição das células parentais MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de
DOX ........................................................................................................................................... 29
Tabela 3. Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a
diferentes concentrações de DOX durante 48h ....................................................................... 31
xiii
Lista de Abreviaturas:
ABC
Akt
ALDH1
APAF-1
ATP
Bak
Bax
BCA
Bcl-2
Bcl-XL
BCRP
bFGF
BrdU
CIS
CoCl2
CSC
DISC
DMEM/F12
DNA
DOX
DTT
ECF
EDTA
EGF
ELISA
EpCAM
Erk (1/2)
EURAMOS-1
FADD
FBS
ATP-binding cassette
Protein kinase B
Aldeído-Desidrogenase 1
Apoptotic Protease Activating Factor-1
Adenosina Trifosfato
Bcl-2 antagonist killer 1
Bcl-2 associated X protein
Ácido Bicinconínico
B-cell lymphoma protein 2
Bcl-2 related protein, long isoform
Breast Cancer Resistance Protein
Factor básico de crescimento de fibroblastos
5-bromo-2’-deoxiuridina
Cisplatina
Cloreto de Cobalto
Célula Estaminal Cancerígena (Cancer Stem Cell)
Complexo de sinalização indutor de morte
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham
Ácido Desoxirribonucleico
Doxorrubicina
Ditiotreitol
Enhanced Chemifluorescence Substrate
Ácido Etilenodiaminotetracético
Factor de Crescimento Epidérmico (Epidermal Growth Factor)
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Molécula de Adesão Celular Epitelial
Extracellular signal-Regulated Kinases (1 and 2)
European and American Osteosarcoma Study Group
Fas-associated death domain protein
Soro fetal bovino
xiv
HCl
IC50
LMA
MAPK
Mcl-1
MSC
MTT
MTX
NaOH
Oct4
OS
p53
pAkt
PBS
pErk1/2
Pgp
PI3K
pRb
PVDF
RB1
RIPA
RPMI
SD
SDS
SEM
SP
TBS-T
TdT
TIC
TNF
TUNEL
Ácido Clorídrico
Concentração de fármaco que inibe a viabilidade celular em 50%
Leucemia Mielóide Aguda
Mitogen-Activated Protein Kinases
Induced myeloid leukemia cell differentiation protein
Célula Estaminal Mesenquimal (Mesenchymal Stem Cell)
Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
Metotrexato
Hidróxido de Sódio
Octamer-binding Transcription Factor 4
Osteossarcoma
Proteína supressora tumoral p53
Phosphorylated Akt
Tampão Salino de Fosfato
Phosphorylated Erk1/2
Glicoproteína-P
Phosphatidylinositol 3-kinase
Proteína de Retinoblastoma
Difluoreto de Polivinildieno
Gene supressor tumoral de retinoblastoma 1
Radioimmuneprecipitation Assay Lysis Buffer
Roswell Park Memorial Institute (Medium)
Desvio-padrão
Dodecil Sulfato de Sódio
Erro-padrão na média
Side Population
Tampão Salino de Tris – Tween 20
Transferase de desoxinucleotidil terminal
Célula iniciadora de tumores (Tumor Initiating Cell)
Factor de Necrose Tumoral
Terminal dUTP Nick-End Labeling
xv
Resumo
Introdução: O osteossarcoma é o cancro ósseo maligno primário mais frequente em crianças e
adolescentes. Este tumor resulta da ocorrência de mutações genéticas e epigenéticas em células
estaminais mesenquimais durante o processo de diferenciação osteoblática. Estudos recentes
demonstraram que o osteossarcoma contém uma subpopulação de células com características
de células estaminais cancerígenas (CSCs) e que são elas as responsáveis pela iniciação e
progressão do tumor, bem como pela resistência às terapias convencionais incluindo a
quimioterapia e radioterapia. Este trabalho teve por objectivo explorar o papel da via intrínseca
ou mitocondrial da apoptose na resposta das CSCs aos efeitos citotóxicos da doxorubicina (DOX).
Métodos: As CSCs foram isoladas a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo
método de formação de esferas e incubadas com diferentes concentrações de DOX durante 48h.
A citotoxicidade da DOX foi avaliada com base em vários parâmetros: efeitos sobre a viabilidade
celular (método colorimétrico de MTT); proliferação celular (método de incorporação com BrdU)
e indução de apoptose (ensaio de TUNEL). Os níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas
Bcl-2 e Bcl-XL, pró-apoptóticas Bak e Bax, e da caspase-3 foram analisados pela técnica de
Western blot após incubação com DOX.
Resultados: A cultura das células aderentes MNNG/HOS em condições de baixa aderência e na
ausência de soro permitiu fazer o isolamento das CSCs sob a forma de colónias esféricas com
elevada capacidade de auto-renovação. Os estudos de citotoxicidade mostraram que as CSCs
são mais resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS. A concentração de DOX
necessária para reduzir a viabilidade celular das CSCs em 50% foi de 2,21±0,50 µM,
significativamente (p<0,05) superior à obtida para as células parentais MNNG/HOS (0,67±0,17
µM). Pelo contrário, a concentração de DOX que reduziu a proliferação celular em 50% foi de
0,03±0,01 µM para as CSCs, significativamente inferior (p<0,05) ao valor observado nas células
parentais MNNG/HOS (0,19±0,06 µM). Nas células parentais MNNG/HOS observou-se um
aumento na percentagem de células em apoptose dependente da dose de DOX variando de 1%
a 21%, enquanto nas CSCs, a percentagem foi aproximadamente constante, nunca
ultrapassando os 3% para o mesmo intervalo de concentrações. A exposição das CSCs à DOX
induziu um aumento significativo nos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e
Bcl-XL e uma concomitante diminuição na expressão da proteína pró-apoptótica Bak e da
caspase-3.
Conclusões: A linha celular humana de OS MNNG/HOS contém uma subpopulação de células
com propriedades de células estaminais que são relativamente mais resistentes à DOX do que as
células parentais. A sobreexpressão da Bcl-2 e da Bcl-XL em simultâneo com a diminuição da Bak
xvi
parecem contribuir para a maior resistência destas células à apoptose induzida pela DOX. A
capacidade que as CSCs têm em reduzirem a sua taxa de proliferação quando expostas a
concentrações não tóxicas de DOX, permite-lhes evadirem efeitos citotóxicos da DOX que tem
como alvo preferencial células com elevada actividade proliferativa.
Palavras-chave: osteossarcoma; células estaminais cancerígenas; doxorrubicina; proteínas
anti- e pró-apoptóticas, apoptose
xvii
Abstract
Background: Osteosarcoma is the most common primary malignant bone cancer in children
and adolescents. This tumor results from the occurrence of genetic and epigenetic mutations
in mesenchymal stem cells during the osteoblastic differentiation process. Recent studies
demonstrated that osteosarcoma contains a subset of cells with stem cell characteristics
(CSCs), which are the responsible for the initiation and progression of the tumor, as well as for
the resistance to conventional therapies including chemotherapy and radiotherapy. In this
study we purpose to explore the role of the intrinsic or mitochondrial apoptotic pathway in the
response of CSCs to the cytotoxic effects of doxorubicin (DOX).
Methods: CSCs were isolated from the human OS cell line MNNG/HOS using the sphere
formation assay and then incubated with different concentrations of DOX for 48h. The
cytotoxicity of DOX was evaluated considering several parameters: effects on cell viability
(MTT colorimetric assay), cellular proliferation (BrdU Cell Proliferation Assay) and apoptosis
(TUNEL assay). The expression levels of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-XL, pro-
apoptotic proteins Bax and Bak, and caspase-3 was analyzed by Western blot after incubation
with DOX.
Results: The culture of adherent MNNG/HOS cells in serum-free medium under non-adherent
conditions allowed isolating CSCs as spherical colonies with higher self-renewal ability. CSCs
were relatively more resistant to DOX than their parental cells MNNG/HOS. The concentration
of DOX required to inhibit cell viability by 50% was of 2.21±0.50 µM for CSCS, significantly
higher (p<0,05) to the one obtained for parental MNNG/HOS cells (0.67±0.17 µM). In opposite,
the drug concentration that inhibited cellular proliferation by 50% was of 0.03±0.01 µM for
CSCs, significantly lower (p<0.05) than that observed for MNNG/HOS cells (0.19±0.06µM). For
MNNG/HOS cells it was observed a dose-dependent increase in the percentage of apoptotic
cells ranging from 1% to 21%, while for CSCs the percentage of apoptotic cells was
approximately constant, never exceeding the 3% for the same range of DOX concentrations.
Exposure of CSCs to DOX induced a significant increase in the expression levels of the anti-
apoptotic proteins Bcl-2 and a Bcl-XL and a concomitant decrease in the expression of the pro-
apoptotic protein Bak and caspase 3.
Conclusions: The human OS cell line MNNG/HOS contains a subpopulation of cells with stem
cell properties which are relatively more resistant to DOX than their parental cells.
Overexpression of Bcl-2 and Bcl-XL simultaneously with the reduction of Bak appears to
contribute to the higher resistance of these cells to apoptosis induced by DOX. The ability of
CSCs to enter in a low proliferation rate when exposed to non-toxic concentrations of DOX
xviii
allows them to evade the cytotoxic effects of DOX that targets preferentially cells with high
proliferative activity.
Keywords: osteosarcoma; cancer stem cells; doxorubicin; anti- and pro-apoptotic proteins,
apoptosis
1
1. Introdução
1.1 Osteossarcoma
O osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo maligno primário mais comum em crianças e
jovens adolescentes e é o sexto tipo de cancro que mais afecta as crianças com menos de 15
anos de idade. Apesar disso é considerado uma neoplasia relativamente rara com cerca de 400
novos casos a cada ano nos Estados Unidos da América. Este tumor afecta maioritariamente
indivíduos do sexo masculino do que feminino, numa proporção de 1,6:1. No entanto,
manifesta-se mais cedo nos indivíduos do sexo feminino pelo facto de a puberdade, onde ocorre
o surto de crescimento, ser mais precoce. Este cancro apresenta uma distribuição etária
bimodal, em que o primeiro pico de incidência ocorre entre os 10 e os 14 anos, e o segundo pico
ocorre em adultos idosos, com idades acima dos 65 anos. Nestes últimos casos, o aparecimento
da doença está frequentemente relacionada com a doença de Paget do osso (1-3).
O OS pode ocorrer em qualquer tipo de osso, mas é mais frequente na metáfise dos
ossos longos, nomeadamente no fémur distal (40%), tíbia proximal (20%), e úmero proximal
(10%). No entanto, também pode afectar o esqueleto axial, embora tal ocorra em menos de 10%
dos doentes pediátricos, sendo os ossos pélvicos os mais afectados. O OS tem origem na
cavidade medular, invadindo posteriormente o córtex (zona mais periférica do osso) causando
destruição cortical com envolvimento dos tecidos moles adjacentes, músculos, tendões e vasos
sanguíneos (1-2, 4-5).
1.1.1 Etiologia e Factores de Risco
A origem do OS ainda não está completamente esclarecida, no entanto, várias alterações
genéticas já lhe foram associadas. Mutações no gene supressor tumoral de retinoblastoma
(RB1), localizado no cromossoma 13, parecem estar envolvidas na patogénese do OS, uma vez
que nos doentes com retinoblastoma o risco de desenvolver OS, como tumor secundário, é
cerca de 500 vezes superior ao dos indivíduos saudáveis (6). A análise genética de um elevado
número de amostras de doentes com OS identificou alterações genéticas no gene RB1 em cerca
de 70% dos casos, incluindo a perda homozigótica do gene e/ou alterações na expressão da
proteína (7). O produto do gene RB1 é uma proteína fosforilada (pRb) que interage com o factor
de transição celular E2F na fase G1 do ciclo celular, inibindo a transcrição de genes envolvidos na
proliferação e replicação do DNA (6, 8).
1. Introdução
2
Também mutações no gene supressor tumoral p53 parecem estar associadas ao
desenvolvimento do OS. Tal como o RB1, o gene p53 desempenha funções importantes na
regulação do ciclo celular, pelo que a perda da sua função implica a desregulação de
mecanismos de controlo da proliferação celular, estimulando a proliferação de forma
descontrolada e a incapacidade de activação da apoptose. Este gene codifica uma fosfoproteína
nuclear – p53 – que actua como gene supressor tumoral que previne a replicação de células
sempre que o seu DNA esteja danificado por interrupção do ciclo celular, activação das vias de
reparação de DNA ou por indução da apoptose (6-10).
Também a amplificação ou a sobre-expressão dos genes MDM2 (do inglês, murine
double minute 2) e CDK4 (quinase dependente de ciclina) têm sido observadas no OS, o que
sugere o seu envolvimento na patogénese desta doença. O gene MDM2 codifica a proteína que
se liga e inactiva a fosfoproteína nuclear p53, enquanto o produto do gene CDK4 fosforila e
inactiva a pRb, perturbando desta forma a regulação do ciclo celular. O C-Myc e o C-fos, dois
oncogenes que codificam factores de transcrição que controlam a progressão do ciclo celular e a
diferenciação em osteoblastos e condroblastos, também aparecem regularmente sobre-
expressos em células de OS (6).
Um dos factores exógenos associados ao aparecimento do OS é a exposição a radiação
ionizante, sendo a responsável por 2% dos casos. Mas como a doença só se manifesta após um
longo período de exposição à radiação, está mais associada ao aparecimento do OS em pessoas
na idade adulta (2).
1.1.2 Células de origem do OS
Apesar da origem do OS ainda não estar completamente esclarecida, existem evidências
crescentes de que este tumor resulta da ocorrência de mutações genéticas e epigenéticas em
células estaminais mesenquimais (MSCs, do inglês mesenchymal stem cells) durante o processo
de diferenciação osteoblástica. As MSCs são células indiferenciadas multipotentes de origem
não hematopoiética e com elevada capacidade de auto-renovação (11, 12). Estas células foram
primeiro identificadas na medula óssea (13), embora existam também no sangue do cordão
umbilical (14) e em diversos tecidos do corpo humano, e são também as precursoras das células
do tecido ósseo (osteócitos), do tecido adiposo (adipócitos) e da cartilagem (condroblastos)
(Figura 1.1 A) (7, 14, 15).
As células de OS apresentam algumas semelhanças com os osteoblastos, uma vez que
produzem matriz osteóide, sendo esta a base para o diagnóstico histológico que distingue o OS
de outros tumores ósseos. O OS apresenta uma diversidade de padrões histológicos, cuja
1. Introdução
3
classificação é feita com base no tipo e quantidade de matriz extracelular produzida e no tipo e
características das células: osteoblástico, condroblástico, fibroblástico, pouco diferenciado,
telangiectásico e de células gigantes, o que indica que as células de origem do OS são
multipotentes (1, 7). Por esta razão o OS é considerado uma doença de diferenciação resultante
de mutações que ocorrem em diferentes fases do processo de diferenciação osteogénica a partir
das MSCs, como ilustrado na Figura 1.1 B. Acredita-se que quanto maior for o estado de
indiferenciação das células em que ocorrem as mutações mais indiferenciado e agressivo será o
tumor daí resultante (7).
MSC
pluripotente
Osteoprogenitora OS pouco diferenciado
OS moderadamente diferenciado
OS mais diferenciado Osteoprogenitora
Osteoprogenitora Pré-osteoblasto
Pré-osteoblasto Osteoblasto
imaturo
MSC
pluripotente
MSC
pluripotente
B.
Figura 1.1 Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens e alterações na diferenciação osteogénica. (A)
Diferenciação osteoblástica. As MSCs podem dar origem a múltiplas linhagens, tais como miócitos, adipócitos,
condrócitos e osteócitos. (B) Alterações na diferenciação osteogénica podem levar ao desenvolvimento do OS.
Os defeitos causados por alterações genéticas (por exemplo, a activação de oncogenes ou a inactivação da p53
e do gene supressor tumoral RB) e epigenéticas podem ocorrer em diferentes fases da diferenciação
osteogénica. Defeitos em fases iniciais da diferenciação dão origem a OS mais agressivos e indiferenciados. As
células a preto indicam TICs. (Adaptado de (7)).
Crescimento e
Diferenciação
Miócitos
Adipócitos
Condrócitos
Pré-osteoblasto Osteoblasto
imaturo Osteoblasto
maduro Osteócito
Proliferação Diferenciação
Osteoprogenitor
comprometido
MSC
pluripotente
Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens
1. Introdução
4
1.1.3 Tratamento do OS
Antes da década de 70, o prognóstico dos doentes com OS era devastador, sendo a taxa
de sobrevida dos doentes tratados com cirurgias agressivas de apenas 10-20%. Ao longo dos
últimos anos, com a introdução da quimioterapia sistémica neoadjuvante e adjuvante e com os
avanços nas técnicas cirúrgicas, a taxa de sobrevida melhorou consideravelmente para cerca de
65-75% para os doentes sem evidências clínicas de doença metastática na altura do diagnóstico
(1, 16).
O tratamento do OS não-metastático inclui a quimioterapia pré- e pós-operatória. A
quimioterapia pré-operatória ou neoadjuvante induz necrose no tumor primário, o que facilita a
excisão cirúrgica e a eliminação de possíveis micrometastases. Os doentes com uma boa
resposta histológica à quimioterapia pré-operatória, o que corresponde a uma percentagem de
necrose superior a 90%, têm à partida um bom prognóstico, com uma taxa de sobrevida aos 5
anos superior a 65-75%, enquanto que nos doentes com uma resposta histológica de necrose
tumoral inferior a 90%, a taxa de sobrevida é inferior a 15% (2, 17). Contudo, mesmo nos
doentes com doença localizada, aquando do diagnóstico, e com uma resposta histológica
favorável, cerca de 40% acabam por desenvolver doença metastática e morrer da doença, pelo
facto de desenvolverem resistência à terapêutica (2, 6). Vários estudos retrospectivos têm vindo
a demonstrar que a intensificação dos regimes de quimioterapia melhora a resposta histológica
dos doentes, mas não a sua taxa de sobrevida, o que sugere a existência de uma subpopulação
celular capaz de evadir os efeitos citotóxicos das terapêuticas actuais e de dar origem ao
aparecimento de recidivas (17, 18).
Actualmente, de acordo com o European and American Osteosarcoma Study Group
(EURAMOS-1), os protocolos de quimioterapia consistem na administração de doxorrubicina
(DOX), cisplatina (CIS) e de altas doses de metotrexato (MTX) (6, 19-21).
A DOX, também designada por Adriamicina®, é um importante fármaco anticancerígeno
com uma vasta gama de usos terapêuticos, tais como, no tratamento de cancro da mama,
cancro da bexiga e linfomas Hodgkin (22). Este fármaco pertence à classe das antraciclinas e é
normalmente utilizado em conjunto com outros fármacos. A DOX inibe a acção da
topoisomerase II, interferindo com a formação do complexo topoisomerase II-DNA, levando a
quebras na cadeia dupla de DNA ou intercalando-se directamente com a cadeia de DNA, o que
por sua vez inibe a duplicação do DNA e a transcrição do mRNA, levando à morte celular por
apoptose. A produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) também pode ser um efeito
citotóxico da DOX nas células cancerígenas (23).
1. Introdução
5
A CIS ou cis-diaminodicloroplatina II, é utilizada no tratamento de vários tipos de cancro,
entre os quais, o cancro do ovário (24), do testículo (25), e OS (26), embora o seu mecanismo de
acção ainda não esteja completamente esclarecido. Existem evidências de que o principal
mecanismo de acção da CIS é de que esta se liga de forma covalente ao DNA levando à formação
de aductos, originando ligações intra- e intercadeias causando alterações estruturais na cadeia
de DNA, incluindo o seu desenrolamento e torção culminando com a morte celular por apoptose
(27).
O MTX é um antimetabolito análogo do ácido fólico que inibe de modo competitivo a
actividade da enzima di-hidrofolato redutase (DHFR) que é a responsável pela conversão do
ácido fólico em tetra-hidrofolato (THF) que é um co-factor necessário à transferência de
unidades de carbonos em várias reacções metabólicas, como é o caso da síntese de purinas e
timidinas, percursoras de nucleótidos que integram o DNA e o RNA. A inibição da síntese destas
bases azotadas leva ao bloqueio da replicação do DNA (28), sendo a sua acção mais marcante
em células com maior taxa de divisão celular como as células tumorais.
Apesar dos inquestionáveis avanços alcançados nos últimos anos com as novas
abordagens terapêuticas, o tempo de sobrevida dos doentes com OS estagnou nos 70%, e em
cerca de 40% volta a haver uma recidiva do cancro, o que significa que esta terapêutica nem
sempre é eficaz na remissão completa das células tumorais e que são necessárias novas opções
terapêuticas mais eficazes, que permitam melhorar o prognóstico e a sobrevida destes doentes
(17, 29).
1.2 Teoria das Células Estaminais Cancerígenas
Os sarcomas ósseos, incluindo o OS, estão inseridos num grupo de doenças malignas de
origem mesenquimal que apresentam heterogeneidade clínica, histológica e molecular (30).
À luz da teoria das células estaminais cancerígenas (CSCs, do inglês Cancer Stem Cells),
esta heterogeneidade fenotípica e funcional é explicada pela existência de uma subpopulação
celular com características de células estaminais que têm a capacidade de se auto-renovar e de
se diferenciar (ainda que de forma aberrante), sendo elas as responsáveis pela iniciação e
progressão dos tumores e por estabelecer a heterogeneidade celular típica dos tumores (31-33).
Dois modelos têm sido propostos para explicar esta heterogeneidade nos tumores: o
modelo de evolução clonal (também designado de modelo estocástico) e o modelo das CSCs
(também designado de modelo hierárquico). Ambos os modelos propõem que apenas um
pequeno número de células dentro de um tumor tem a capacidade de iniciar e suster o
crescimento do tumor. No entanto, o modelo de evolução clonal é um modelo não-hierárquico
1. Introdução
6
que propõe que todas as células dentro de uma população clonal dominante são biologicamente
homogéneas e, como tal, todas elas possuem um potencial tumorigénico semelhante. Mutações
que possam surgir nas células tumorais desta população conferem-lhes uma vantagem selectiva
de crescimento. Assim sendo, uma série de mutações que possam ocorrer numa única célula
podem torná-la num clone dominante que após sucessivas divisões dá lugar a várias células-
filhas com capacidade tumorigénica semelhante, as restantes células do tumor podem ser não-
tumorigénicas devido a eventos estocásticos. A heterogeneidade tumoral resulta da diversidade
de células presentes no tumor (Figura 1.2) (30-32, 34-36).
Em contraste, o modelo das CSCs sugere que as células estão organizadas
hierarquicamente, em que apenas uma pequena subpopulação das células que constituem a
população tumoral, são as responsáveis pela iniciação e progressão dos tumores e por
estabelecer a heterogeneidade celular típica dos tumores. Essas células também designadas por
células iniciadoras de tumores, do inglês Tumor Initiating Cells – TICs, à semelhança das células
estaminais normais têm capacidade de auto-renovação e de se diferenciar gerando as
populações de células heterogéneas já mais diferenciadas e com um potencial de divisão mais
limitado, razão pela qual se pensa que só as CSCs são tumorigénicas e podem levar ao
aparecimento de tumores (Figura 1.2) (30-32, 34-36).
Ainda está por esclarecer se as mutações ocorrem em células estaminais adultas que
existem nos tecidos normais ou se em células mais diferenciadas que após sofrerem a mutação
adquirem propriedades de células estaminais incluindo a capacidade de auto-renovação e de
diferenciação. No entanto, sabe-se que as células estaminais se podem dividir de forma
simétrica dando origem a duas células-filhas com as mesmas propriedades da célula estaminal
original, mas também de forma assimétrica, dando origem a uma nova célula estaminal e a uma
célula progenitora que pelo processo de diferenciação (altamente regulado), dá origem a uma
célula madura especializada (37).
Dado o paralelismo com as células estaminais normais, e de acordo com a teoria das
CSCs, apenas as CSCs são as células progenitoras dos tumores e as responsáveis pela sua
progressão extensa e heterogeneidade celular, estando na base da hierarquia (30-32, 34-36).
1. Introdução
7
1.2.1 Identificação de CSCs
As primeiras evidências da existência de CSCs surgiram de estudos em amostras de
Leucemia Mielóide Aguda (LMA) (39, 40), nos quais se verificou que apenas uma pequena
subpopulação das células do tumor, cerca de 0,01-1% da população total, tinha propriedades
tumorigénicas (33). Esta pequena subpopulação de células foi capaz de iniciar e manter o
crescimento do tumor in vivo, o que se comprovou pelo transplante de células primárias de LMA
em ratinhos imunodeprimidos (40). Estas células além de terem a capacidade de se
diferenciarem e de proliferarem também apresentaram uma elevada capacidade de auto-
renovação, como demonstrado in vivo pela sua capacidade de formarem novos tumores quando
foram realizados xenotransplantes sucessivos em ratinhos imunodeprimidos (39, 41).
Estes estudos demonstram que na LMA, tal como no sistema normal hematopoiético, as
células estão organizadas hierarquicamente, e que o tumor é iniciado e mantido por uma
pequena subpopulação de células estaminais leucémicas (39, 41).
Figura 1.2 Modelos de heterogeneidade tumoral. Os tumores são compostos por células funcional e
fenotipicamente heterogéneas. Existem dois modelos que explicam esta heterogeneidade tumoral: o modelo
de evolução clonal e o modelo das CSCs. De acordo com o modelo de evolução clonal, as células tumorais são
biologicamente equivalentes, mas o seu comportamento é influenciado por factores intrínsecos e extrínsecos,
ambos variáveis e imprevisíveis. Em contraste, o modelo das CSCs propõe a existência de classes de células
biologicamente distintas e com capacidades funcionais e comportamentos diferentes. Este modelo pressupõe
que apenas uma pequena subpopulação de células tem a capacidade de iniciar e suster o crescimento do tumor
(as CSCs). Estas células possuem a capacidade de se dividirem assimetricamente, dando origem a uma CSC
idêntica (capacidade de auto-renovação) e a uma outra célula mais diferenciada, o que contribui para a
heterogeneidade do tumor (Adaptado de (38)).
Modelo de
Evolução Clonal
Modelo das
CSCs
Os modelos são
funcionalmente
heterogéneos
Factores
intrínsecos
Factores
extrínsecos
Célula iniciadora de
tumores
Células sem
capacidade de iniciar
tumores
X
X
X
X
X
X
1. Introdução
8
Desde então, as CSCs têm sido identificadas em diversos tumores, incluindo tumores da
mama (42), cérebro (43), próstata (44), pâncreas (45, 46), ovário (47), e OS (29, 48).
Nesse sentido, um longo painel de marcadores de superfície tem sido avaliado no
sentido de isolar e caracterizar as CSCs. Este painel inclui, entre outros, o CD133, o CD44, o
CD24, o CD20, a molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), o transportador ABCG2, e a
aldeído-desidrogenase 1 (ALDH1) (49), esta última pertence ao grupo de enzimas citosólicas que
oxidam aldeídos intracelulares em ácidos carboxílicos (ALDHs) (1, 33, 35, 50). No entanto, e
apesar do largo painel de marcadores utilizados para detectar as CSCs permitirem obter
populações enriquecidas em células com características de células estaminais, ainda não foram
estabelecidos marcadores específicos que permitam identificar inequivocamente as CSCs (1).
O CD133/AC133 foi identificado como um marcador das células estaminais
hematopoiéticas normais e mais tarde verificou-se que também está expresso em células
estaminais de um conjunto variado de tecidos tumorais (51, 52). Este marcador foi usado para
isolar CSCs em glioblastomas (53), em cancros do cólon (54), da próstata (55), entre outros. Nos
tumores do cérebro, verificou-se que as células CD133+, mas não as CD133-, expressam vários
marcadores de células estaminais neuronais, e são altamente tumorigénicas e resistentes à
radiação (56, 57). O CD44 e o CD24 foram propostos como marcadores para as células
estaminais em vários tipos de tumor (58, 59), no entanto, enquanto existem dados na literatura
que indicam a existência de células estaminais CD44+/CD24- em cancro da mama (42), outros
estudos demonstram que a falta de expressão do CD24 não é uma característica essencial das
CSCs. De facto, uma subpopulação de células CD24+ possui características de células estaminais
em cancros do cólon (60) e pancreático (61). O CD20 foi identificado em melanomas (62), e a
ALDH1 foi identificada em cancros da mama (63) e do ovário (64). O transportador ABCG2,
pertencente à família ABC (do inglês, ATP-binding cassette superfamily), que funciona como
bomba de efluxo de uma variedade de compostos endógenos e exógenos, é reconhecido como
um marcador de CSCs e desempenha um papel importante na promoção da proliferação e na
manutenção do fenótipo das células estaminais (65).
Alguns estudos mostraram que as células estaminais tumorais podem ser identificadas
por citometria de fluxo através da identificação de uma side-population (SP) utilizando a sonda
fluorescente Hoechst 33342. A identificação da SP, primeiramente descrita por Goodell et al.
(66), é baseada na capacidade das células em fazerem a exclusão do corante Hoechst 33342,
fenótipo este que está associado à sobre-expressão do transportador BCRP (do inglês, breast
cancer resistance protein) ou ABCG2 que reconhece a sonda como substrato impedindo a sua
acumulação no interior da célula, e que como já descrito anteriormente está sobre-expresso em
1. Introdução
9
células estaminais (67). Estudos distintos mostraram a presença de SP em amostras de tumores
humanos de diferentes origens, incluindo LMA (68, 69), neuroblastoma (70), glioma (71) e
cancro do pulmão (72), o que sugere que a SP é enriquecida em CSCs.
Outra técnica muito utilizada no isolamento de CSCs é o ensaio de formação de esferas.
Esta técnica baseia-se na capacidade das células indiferenciadas crescerem sob a forma de
colónias esféricas quando cultivadas na ausência de soro e em condições de baixa aderência.
Nestas condições as células mais diferenciadas são incapazes de proliferar acabando por morrer,
o que permite fazer a selecção de populações celulares enriquecidas em células estaminais. Esta
técnica inicialmente desenvolvida para fazer o isolamento de células estaminais neuronais, tem
sido muito utilizada no isolamento de CSCs em diversos tumores incluindo cerebrais, da mama e
também em tumores ósseos (73).
Gibbs et al. foram os primeiros a demonstrar a existência de CSCs em OS pelo método de
formação de esferas (30). Os autores observaram a formação de colónias esféricas, às quais
chamaram sarcosferas, após cultivarem uma linha celular de OS (MG-63) em meio semi-sólido,
na ausência de soro e na presença de factores de crescimento em condições de baixa aderência.
Essas células apresentavam marcadores de pluripotência que apenas estão expressos em células
estaminais embrionárias o que reforça a validade do método no isolamento de células
indiferenciadas.
Estudos realizados por Martins-Neves et al. (29) utilizando a mesma metodologia com
pequenas modificações, isolaram também com sucesso sarcosferas a partir de outra linha celular
humana de OS – MNNG/HOS. Essas células, para além de expressarem marcadores de
pluripotência, diferenciaram-se em adipócitos, osteoblastos e condroblastos que são os tipos
celulares da linhagem mesenquimal da qual estes tumores derivam, o que demonstra que são
multipotentes, o que é outra característica de células estaminais. Além disso verificaram que as
sarcosferas eram mais resistentes tanto à quimioterapia como à radioterapia o que está de
acordo com a teoria de que as CSCs são resistentes às terapias convencionais.
1.3 Implicações Terapêuticas das CSCs
As CSCs possuem determinadas características que as tornam mais resistentes às
terapias convencionais, quando comparadas com as suas células homólogas mais diferenciadas,
o que significa que a sua existência tenha implicações significativas na resposta à terapia e no
tratamento do cancro. As estratégias terapêuticas convencionais partem do princípio de que a
maioria das células num tumor têm uma elevada actividade proliferativa, e utilizam uma
variedade de fármacos que interferem com a maquinaria celular básica como, por exemplo, a
1. Introdução
10
síntese e replicação de DNA, o ciclo celular e a estrutura do citoesqueleto, causando danos
irreparáveis que levam à morte celular (36). No entanto, apesar da elevada citotoxicidade destes
fármacos, nem todas as células presentes num tumor são sensíveis a estes agentes, o que faz
com que a quimioterapia não seja, muitas das vezes, eficaz na erradicação das células tumorais e
na cura do cancro (74).
Existem evidências que sugerem que as CSCs são de facto as responsáveis pela
propagação do cancro, e como tal devem ser alvo de intensa investigação para o
desenvolvimento de novas terapias que levem à sua erradicação, uma vez que as terapias
actuais são direccionadas às células cancerígenas não estaminais. De facto, já foram
identificados vários mecanismos celulares que estão associados a uma maior resistência das
CSCs, tanto à quimioterapia convencional como à radioterapia. Alguns deles estão relacionados
com propriedades intrínsecas que as CSCs partilham com as suas congéneres estaminais não
tumorais. Uma delas é a sua capacidade de entrar num estado de quiescência durante os
tratamentos, sem no entanto perderem a sua capacidade proliferativa, protegendo-as dos
efeitos citotóxicos dos agentes de quimioterapia que têm como alvo preferencial células com
elevada taxa de proliferação. Uma vez que estas células não perdem a sua capacidade
proliferativa, elas podem voltar a re-entrar no ciclo celular e a iniciar o seu processo de divisão
celular dando origem à formação de novas lesões, uma vez que contêm o programa genético
completo para iniciar e manter o crescimento dos tumores (31, 74). Estudos realizados em CSCs
de LMA comprovam o que foi dito anteriormente (75, 76).
Outra característica destas células, e que lhes confere resistência à quimioterapia, é o
aumento da expressão e da actividade de transportadores membranares pertencentes à
superfamília ABC, que funcionam como bombas de efluxo da maioria dos agentes de
quimioterapia utilizados no tratamento do cancro, impedindo a sua acumulação intracelular.
Dentre estes destacam-se a BCRP e a glicoproteína-P (Pgp), cuja sobre-expressão em células
tumorais conduz ao chamado fenótipo de multi-resistência (74, 77-79). Por exemplo, a DOX e o
MTX, que são dois dos principais agentes de quimioterapia utilizados no tratamento do OS, são
substratos de transporte da BCRP e da Pgp (80). Como já referido anteriormente, a sobre-
expressão da BCRP até é utilizada para pesquisar a existência de CSCs por citometria de fluxo
através da identificação de uma SP que se caracteriza por uma baixa incorporação da sonda
fluorescente Hoechst 33342, facto esse que é atribuído à actividade da BCRP (81, 82).
Além disso, as CSCs parecem ter alterações nas vias que regulam a resposta celular aos
agentes de quimioterapia como por exemplo a activação de mecanismos de reparação de DNA
mais eficientes comparativamente aos das suas células homólogas mais diferenciadas (83, 84).
1. Introdução
11
As vias de reparação do DNA são necessárias para manter a estabilidade genómica e
cromossómica, bem como as funções normais das células. Nas células normais, danos no DNA
podem levar a duas reacções diferentes: à sua reparação, ou à iniciação de uma cascata de
sinalização que resulta na eliminação das células (cujo DNA não foi reparado) por apoptose.
Estudos recentes demonstraram que CSCs isoladas de gliomas malignos possuem mecanismos
de reparação do DNA capazes de contornar os danos causados no DNA pelos agentes de
quimioterapia (85).
A indução da morte celular por apoptose é um dos principais mecanismos pelo qual a
maioria dos agentes de quimioterapia exerce o seu efeito citotóxico sobre as células tumorais.
Esta via de morte celular é altamente regulada e encontra-se frequentemente alterada em
células tumorais, o que torna possível a sobrevivência e a proliferação de células com DNA
danificado. Inúmeras proteínas reguladoras da apoptose têm a sua expressão alterada em
células tumorais, o que resulta na desregulação do controlo da apoptose, desenvolvimento de
resistência à terapia e progressão do cancro (79, 86, 87). Nas CSCs esta via de sobrevivência
ainda não está completamente caracterizada. No entanto, num estudo recente em células de
glioma foram identificados níveis aumentados de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL numa
fracção de células CD133+ em relação aos níveis de expressão na fracção celular CD133- (88).
Além disso verificou-se que os níveis elevados da expressão da Bcl-2 e Mcl-1 (do inglês, induced
myeloid leukemia cell differentiation protein) estavam associados à resistência das células de
glioma CD133+ ao tratamento com um inibidor da Bcl-2, ABT-737 (89-92). Estas observações
sugerem que as CSCs têm mecanismos que lhes conferem maior capacidade de evadir a
apoptose e sobreviver à terapia e que merecem ser explorados no sentido de contribuir para o
desenvolvimento de novas terapias que sejam eficazes na sua eliminação (85).
Assim, apesar de inicialmente os tumores até responderem favoravelmente às terapias actuais
com reduções significativas na massa tumoral, se a pequena fracção de CSCs não for eliminada
os tumores voltam a recidivar devido à sua capacidade de auto-renovação e elevado potencial
tumorigénico (Figura 1.3 a). Terapias direccionadas às CSCs podem não ser eficazes na rápida
indução da redução da massa tumoral, mas ao limitarem a capacidade de auto-renovação das
CSCs, que está na base da proliferação do tumor, podem tornar-se eficazes a longo prazo (Figura
1.3 b) (1, 59).
1. Introdução
12
1.3.1 Apoptose
O termo apoptose ou morte celular programada foi proposto em 1972 por Kerr, Wyllie
and Currie (93) para descrever uma forma distinta da morte celular que ocorre de forma
programada. Esta forma de morte celular ocorre normalmente em diversas situações, como por
exemplo, durante o desenvolvimento, na organogénese e hematopoiese normal e patológica, no
envelhecimento, na resposta inflamatória e na eliminação de células após um dano celular,
assumindo uma importância fundamental na homeostasia dos tecidos. Os mecanismos de
apoptose são extremamente complexos e sofisticados, envolvendo uma cascata de
acontecimentos moleculares dependentes de energia (94).
A apoptose pode ser desencadeada por vários estímulos e condições e é activada por
duas vias principais: a via extrínseca ou via do receptor de morte, e a via intrínseca ou via
mitocondrial que convergem mutuamente através da cascata de reacções proteolíticas que
envolvem a activação das caspases que são as executoras centrais da apoptose (94, 95).
O tumor é reduzido em tamanho, mas
eventualmente ocorre uma recidiva devido à
presença das CSCs
Figura 1.3 Impacto do modelo das CSCs nos tratamentos anti-tumorais. a) Os tratamentos anti-tumorais desenvolvidos para uma ampla actividade citotóxica podem eliminar a maior parte das células cancerígenas de um tecido tumoral específico e induzir uma grande, ou mesmo completa, regressão da massa tumoral. No entanto, se algumas CSCs conseguirem sobreviver, estas são capazes de voltar a proliferar e dar lugar a uma recorrência do tumor. b) Em contraste, os tratamentos anti-tumorais que têm por alvo específico as CSCs, embora teoricamente incapazes de levar a uma rápida redução do tumor, a longo prazo podem levar à erradicação do tumor por reduzirem a capacidade de auto-renovação e o potencial de crescimento das CSCs. (Adaptado de (59)).
Tratamento que não tem
por alvo específico as CSCs
Curto prazo Longo prazo
Tratamento que tem por
alvo específico as CSCs O tumor pode não reduzir de tamanho
rapidamente, no entanto, o seu potencial de
crescimento diminui progressivamente
Curto prazo Longo prazo
1. Introdução
13
A via extrínseca (Figura 1.4) é mediada pela ligação de ligandos a certos receptores
existentes na superfície celular – os receptores de morte (94), pertencentes à família dos
factores de necrose tumoral (TNF). Estes receptores de morte incluem uma subfamília que é
caracterizada por terem domínios extracelulares ricos em cisteína e um domínio intracelular – o
domínio de morte – que é essencial para a transdução do sinal apoptótico (95-97).
Quando estes ligandos se ligam aos receptores de morte, como por exemplo, o CD95, o
TRAIL-R1 (do inglês, TNF-related apoptosis-inducing ligand-R1) ou o TRAIL-R2 (do inglês, TNF-
related apoptosis-inducing ligand-R2), então os domínios de morte recrutam a proteína
adaptadora intracelular FADD (do inglês, Fas-associated death domain protein), formando-se um
complexo de sinalização indutor de morte (DISC), que por sua vez, vai recrutar as formas
inactivas de certos membros da família das caspases, promovendo a sua activação. Quando as
caspase 8 e 10, que são caspases iniciadoras, são activadas vão posteriormente promover o sinal
de morte através da activação das caspases executoras a jusante que vai desencadear o
processo de morte celular (95).
A via intrínseca ou mitocondrial (Figura 1.4) é desencadeada por estímulos que têm
origem no interior da célula: stresse intracelular, lesões no DNA, privação de factores de
crescimento, hipoxia ou activação de oncogenes. Estes insultos convergem normalmente ao
nível da mitocôndria, levando a alterações na permeabilidade da membrana externa permitindo
a libertação de moléculas apoptogénicas, normalmente sequestradas do espaço
intermembranar, para o citoplasma (94, 98). Entre essas proteínas encontra-se o citocromo c,
que é então responsável pela activação desta via de sinalização apoptótica transduzida pela
mitocôndria. No citosol, o citocromo c, na presença de ATP liga-se e activa o complexo APAF-1
(do inglês, Apoptotic Protease Activating Factor-1), que por sua vez recruta uma pró-caspase
iniciadora, a pró-caspase 9, formando-se o complexo molecular denominado de apoptossoma,
que uma vez activado leva à activação da caspase-9 que por sua vez cliva e activa as pró-
caspases efectoras 3, 6 e 7, que podem ainda clivar a activar a pró-caspase 9 num processo de
feed-back positivo. Uma vez activadas, as caspases efectoras clivam uma variedade de
substratos celulares contribuindo para as alterações morfológicas observadas nas células em
apoptose como a fragmentação do núcleo, condensação da cromatina e clivagem do DNA e
ondulação da membrana plasmática (94, 95). Estas caspases clivam também enzimas envolvidas
nos mecanismos de resposta a danos no DNA como a PARP (poly-ADP-ribose polimerase) e
outras, impedindo dessa forma a sua reparação e tornando irreversível o processo apoptótico
(94).
1. Introdução
14
A regulação destes eventos apoptóticos mitocondriais é efectuada pelos membros da
família Bcl-2, com membros pró- e anti-apóptoticos (94, 100) que controlam directamente a
permeabilidade da membrana externa mitocondrial, e deste modo, regulam a libertação dos
factores apoptogénicos (tais como o citocromo c) para o citoplasma (101, 102). A regulação da
permeabilidade membranar pela família Bcl-2 pode ser pró-apoptótica ou anti-apoptótica. Os
membros anti-apoptóticos desta família inibem a libertação dos factores apoptogénicos,
enquanto os membros pró-apoptóticos promovem a sua libertação (101). Entre as proteínas
pró-apoptóticas destacam-se a Bax (do inglês, Bcl-2 associated X protein), e a Bak (do inglês, Bcl-
2 antagonist killer 1), que sob estímulos apoptóticos induzem a formação de um poro que
medeia a libertação de proteínas apoptogénicas, e entre as proteínas anti-apoptóticas
destacam-se a Bcl-2 (do inglês, B-celllymphomaprotein 2) e a Bcl-XL (do inglês, Bcl-2 related
protein, long isoform) que têm uma acção anti-apoptótica que pode ocorrer através da
Bax/Bak
Bcl-2/Bcl-XL
Bid
t-Bid
Stresse Mitocondrial
Mitocôndria
Citocromo c
APAF-1
Apoptossoma
Pró-caspase 9
Caspase-9
activa
Caspase-3
activa
Cascata das
Caspases
Pró-caspase 3
Caspase-8
activa
Pró-caspase 8
Complexo
DISC
FADD
Via Intrínseca Via Extrínseca
CD95, TRAIL
Ligação
Apoptose
Pró-caspase 3
Figura 1.4 Vias intrínseca e extrínseca da apoptose. Na via extrínseca, os receptores de morte (tal como, o CD95,
o TRAIL-R1 e o TRAIL-R2) são activados pelos receptores da família TNF, o que leva à activação da caspase-8,
logo após a sua ligação ao complexo DISC, a partir da molécula FADD. Na via intrínseca, certos estímulos causam
uma perturbação na mitocôndria que leva à libertação de certas proteínas, tais como, o citocromo c. Esta
libertação de citocromo c é regulada pelos membros da família da Bcl-2, sendo que os membros anti-
apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-XL) inibem a libertação e os membros pró-apoptóticos (Bax e Bak) promovem a
libertação. Uma vez libertado, o citocromo c liga-se ao APAF-1 e à pró-caspase 9, formando o apoptossoma, e
levando à activação da caspase-9. Por sua vez, as caspases iniciadoras 8 e 9 activam a caspase efectora 3, o que
leva à activação da cascata das caspases, que culmina com a apoptose (adaptado de (99)).
1. Introdução
15
interacção com a Bax ou Bak sequestrando-as na mitocôndria ou com proteínas que impeçam a
sua activação. A razão entre os níveis de expressão destas proteínas é de extrema importância
na indução da morte celular por apoptose ou na reversão deste processo (94).
1.3.1.1 Apoptose e cancro
Defeitos a nível da regulação da morte celular podem estar na base do aparecimento de
várias doenças, entre as quais, o cancro e doenças neurodegenerativas, tais como, a doença de
Parkinson, e a doença de Alzheimer (94).
O cancro é um exemplo onde a regulação dos mecanismos normais do ciclo celular está
desregulada, e isso pode ocorrer tanto por um excesso de proliferação como por uma
diminuição da eliminação de células disfuncionais. Aliás, a supressão da apoptose durante a
carcinogénese parece desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão de
determinados cancros. As células tumorais são capazes de suprimir a apoptose a partir de uma
variedade de mecanismos moleculares. No caso do cancro, o crescimento celular resulta não só
de uma proliferação descontrolada mas também de uma morte celular reduzida (94).
As células tumorais podem adquirir resistência à apoptose tanto pela sobre-expressão
de proteínas anti-apoptóticas, tal como a Bcl-2, como pela diminuição da expressão de proteínas
pró-apoptóticas, tal como a Bax. Tanto a expressão da Bcl-2 como da Bax são reguladas pelo
gene p53 (94). Certas formas de linfoma de células B humanas apresentam uma sobre-expressão
de Bcl-2, sendo esta uma das mais fortes evidências de que defeitos a nível da apoptose
contribuem para o aparecimento do cancro (103).
Além disso, essa desregulação do processo apoptótico tem também implicações na
resposta à terapia uma vez que os tratamentos do cancro se baseiam na aplicação combinada de
estratégias terapêuticas (quimioterapia e radioterapia) que culminam em morte celular por
apoptose (95).
1. Introdução
16
1.4 Objectivos
O principal objectivo deste trabalho foi explorar o papel da via intrínseca ou
mitocondrial da apoptose na sensibilidade das células estaminais cancerígenas e na sua resposta
aos efeitos citotóxicos da DOX. Com esse objectivo, propusemo-nos:
Isolar uma subpopulação de células estaminais cancerígenas (CSCs) a partir da
linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo método de formação de esferas;
Avaliar o efeito da DOX na viabilidade, proliferação celular e indução de
apoptose nas CSCs e nas células parentais MNNG/HOS;
Analisar os níveis de expressão de proteínas envolvidas na activação da via
intrínseca da apoptose após exposição à DOX.
17
2. Materiais e Métodos
2.1 Cultura Celular
A linha celular humana aderente de OS MNNG/HOS foi adquirida da
AmericanTypeCultureCollection (ATCC, Rockville, MD). As células cresceram em monocamada,
em frascos aderentes T75 (Orange Scientific, Belgium), em meio de cultura RPMI-1640 (R4130,
Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS, 10270-
106, Gibco® Invitrogen Life Technologies), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (15070-063,
Gibco® Invitrogen Life Technologies), e 0,1% (v/v) de anfotericina B (5290-018, Gibco® Invitrogen
Life Technologies), a 37°C numa atmosfera humedecida com 5% de CO2 e 95% de ar. As células
foram divididas duas vezes por semana, em condições estéreis, numa câmara de fluxo laminar
sempre que atingiam uma confluência de cerca de 80%. Estas células não receberam qualquer
tipo de tratamento prévio com agentes de quimioterapia.
2.1.1 Ensaios de Viabilidade Celular
Antes de serem realizadas quaisquer experiências, a viabilidade celular foi determinada
pelo método de exclusão com azul de tripano. Este método é baseado no princípio de que as
células viáveis com membranas celulares intactas não coram de azul, surgindo brilhantes quando
observadas ao microscópio, enquanto as células mortas ou danificadas surgem coradas de azul.
Para este procedimento adicionaram-se iguais volumes (20 µl) de suspensão celular e de 0,4% de
azul de tripano, e transferiu-se essa mistura para um hematocitómetro (câmara de Neubauer;
Marienfeld, Germany), sendo as células posteriormente contadas num microscópio invertido
(Nikon, Eclipse TS 100). A viabilidade celular foi calculada como a percentagem de células viáveis
relativa ao número total de células. Apenas células com uma viabilidade superior a 90% foram
utilizadas nos ensaios subsequentes.
As CSCs foram isoladas a partir da linha celular parental MNNG/HOS pelo método de formação
de esferas em superfícies não aderentes descrito por Martins-Neves et al. (29). As células
MNNG/HOS com uma confluência de 70-80% foram destacadas do frasco de cultura com 1 mL
de tripsina-EDTA (T4049, Sigma-Aldrich®), e seguidamente plaqueadas com uma densidade de
60.000 células/poço em placas de cultura de 6 poços (Orange Scientific, Belgium), previamente
revestidas com 0,8 mg/cm2 (0,4 mL/poço) de poly-HEMA (P3932, Sigma-Aldrich®), em meio N2
2. Materiais e Métodos
18
com 1% de metilcelulose (M0387, Sigma-Aldrich®), sem soro. O meio N2 consiste em meio
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12-Ham, D2906, Sigma-Aldrich®)
suplementado com 1,2 g/L de bicarbonato de sódio (S6297, Sigma-Aldrich®), progesterona 20
nM (P7556, Sigma-Aldrich®), putrescina 100 µM (P5780, Sigma-Aldrich®), 1% (v/v) de
suplemento insulina (20µg/mL)-transferrina(25µg/mL)-selenite(30nM) (Gibco® Invitrogen Life
Technologies), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina e 0,1% (v/v) de anfotericina B. De dois em
dois dias foram adicionadas alíquotas de factor de crescimento epidermal humano (EGF, Sigma-
Aldrich®) e de factor de crescimento fibroblástico básico humano (bFGF, Peprotech EC, London,
UK), numa concentração final de 10 ng/mL. As células foram mantidas a 37°C numa atmosfera
humedecida com 5% de CO2 e 95% de ar.
Após um período de 7-10 dias, as esferas em suspensão, também denominadas de
sarcosferas, foram recolhidas e transferidas para superfícies aderentes (frascos T25, Orange
Scientific, Belgium) e mantidas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, como referido
anteriormente para as células MNNG/HOS. Após atingirem uma confluência de cerca de 70-80%,
as células foram dissociadas e re-plaqueadas em meio N2 em placas não aderentes, como
descrito anteriormente, para isolamento de esferas de 2ª geração. Este procedimento foi
repetido 5-6 vezes para avaliar a capacidade de auto-renovação destas esferas. As sarcosferas
obtidas a partir da 3ª geração foram utilizadas nos estudos subsequentes e foram designadas de
CSCs. A eficiência de formação de esferas foi calculada como percentagem do número de esferas
formado em relação ao número total de células plaqueado.
Antes da sua utilização nos ensaios de citotoxicidade, as CSCs foram expandidas em
frascos aderentes em meio de cultura apropriado para MSCs que consiste em DMEM de baixa
glicose suplementado com 10% de soro específico para células mesenquimais (MSC-qualified
serum), glutamina 2 mM (59202C, Sigma-Aldrich®), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina e 0,1%
(v/v) de anfotericina B.
2.3 Estudos de Citotoxicidade com DOX
Sendo a DOX o principal agente de quimioterapia utilizado no tratamento do OS
avaliámos a sensibilidade das células parentais MNNG/HOS e das CSCs a este fármaco. Os efeitos
citotóxicos da DOX foram avaliados ao nível da actividade da enzima mitocondrial succinato
desidrogenase utilizando o método colorimétrico de MTT, e da proliferação celular utilizando o
método de incorporação com BrdU. Avaliámos também a morte celular por apoptose utilizando
o ensaio de TUNEL.
2. Materiais e Métodos
19
2.3.1 Preparação das células MNNG/HOS e das CSCs para os estudos de
citotoxicidade com DOX
As células MNNG/HOS e as CSCs, previamente expandidas com uma confluência de 70%,
foram destacadas com tripsina, contadas e plaqueadas em placas de 96 poços (Orange Scientific,
Belgium) numa densidade de 7500 células/poço nos respectivos meios de cultura. As placas
foram colocadas na incubadora a 37°C durante 24h para as células aderirem à superfície da
placa.
Após este período, as células foram incubadas com diferentes concentrações de DOX
desde 0,001 µM até 100 µM e colocadas novamente na incubadora a 37°C durante um período
de 48h. A DOX foi preparada a partir de uma solução stock (DOXO-cell®, 2 mg/mL) fazendo
diluições apropriadas em PBS de modo a que o volume de DOX adicionado não ultrapassasse os
10% do volume de suspensão celular.
2.3.2 Estudos de Viabilidade Celular – Ensaio colorimétrico de MTT
O efeito da DOX na viabilidade celular foi avaliado pelo método colorimétrico de
brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Este método é baseado na
actividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase que se encontra activa apenas em
células viáveis metabolicamente activas. Esta enzima reduz o sal de tetrazólio solúvel e de cor
amarela e converte-o num produto insolúvel de cor violeta (cristais de formazan), cuja
quantidade pode ser determinada por espectrofotometria, onde a intensidade da cor resultante
da dissolução dos cristais de formazan é proporcional à actividade da enzima e por conseguinte
ao número de células viáveis.
Após um período de incubação de 48h das células com a DOX, removeu-se o meio de
cultura e adicionaram-se 50 µl/poço de uma solução de 0,5 mg/mL de MTT (M2128, Sigma-
Aldrich®). As células foram mantidas a 37°C na incubadora durante um período de 4h, que é o
tempo necessário para ocorrer a redução do MTT e levar à formação dos cristais de formazan.
Depois adicionaram-se 50 µl/poço de isopropanol ácido (HCl 0,04M) para dissolver os cristais de
formazan. Por fim, mediram-se as absorvâncias num leitor de microplacas ELISA com filtro de
referência a 620 nm e filtro de leitura a 570 nm.
A percentagem de células viáveis em relação aos respectivos controlos (células sem tratamento
com DOX) foi calculada a partir da seguinte fórmula (1):
( ) ( )
( ) (1)
2. Materiais e Métodos
20
Com os valores obtidos foram traçadas curvas de dose-resposta numa escala semi-
logarítmica (% da viabilidade celular em função do logaritmo da concentração de DOX). As
curvas foram depois ajustadas a uma função sigmoidal (equação 2) e determinados os valores da
concentração de fármaco necessária para inibir a viabilidade celular em 50% (IC50).
( ) (2)
em que A1 e A2 são os valores mínimo e máximo de y, respectivamente, x0 é o valor do IC50 e p
é o declive da recta. A curva foi ajustada usando o programa OriginPro8 (OriginLab Corporation,
versão 8).
2.3.3 Estudos de Proliferação Celular – Ensaio colorimétrico de BrdU
O efeito da DOX na proliferação celular das células parentais MNNG/HOS e das
sarcosferas foi avaliado utilizando o ensaio de incorporação de 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU),
que ocorre durante a síntese de DNA em células que estão em proliferação. O BrdU é um
nucleósido sintético análogo da timidina, que após ser metabolizado origina o BrdU-trifosfato, o
qual é incorporado em vez da timidina no DNA de células que estão na fase S do ciclo celular.
Neste estudo foi utilizado o kit comercial CellProliferation ELISA, BrdU(Roche®, Germany)
de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, após um período de incubação de 48h
das células com DOX, como descrito na secção 2.3.1, foram adicionados a cada poço 10 µl de
solução de BrdU (100 µM) e colocaram-se na incubadora de CO2 a 37°C durante 3h. Terminado o
período de incubação, removeu-se o meio de cultura contendo o BrdU, e adicionaram-se 200
µl/poço de solução fixadora (FixDenat), e incubaram-se durante 30 min à temperatura ambiente
para desnaturar o DNA e facilitar o acesso do anticorpo primário ao BrdU previamente
incorporado. De seguida removeu-se o fixador, e incubaram-se as células com 100 µl/poço de
solução anti-BrdU-POD, durante 90 min à temperatura ambiente. Terminado este período,
removeu-se a solução e lavaram-se os poços 3 vezes com 200 µl/poço de solução de lavagem.
Por fim foram adicionados 100 µl/poço de solução de substrato e aguardaram-se 20 min à
temperatura ambiente até à leitura das aborvâncias, num leitor de ELISA com filtro de referência
a 492 nm e filtro de leitura a 370 nm.
Com os valores de absorvância determinou-se a percentagem de células em proliferação
em relação aos respectivos controlos (células sem tratamento com DOX), de acordo com a
equação (1). Com esses valores foram traçadas curvas de dose-resposta, tal como descrito na
secção 2.3.2.As curvas obtidas foram ajustadas a uma função sigmoidal de acordo com a
2. Materiais e Métodos
21
equação (2) e calculados os valores da concentração de DOX que inibem a proliferação celular
em 50% (IC50).
2.3.4 Ensaio de TUNEL para medição da apoptose
A fragmentação do DNA representa uma característica essencial da morte celular por
apoptose. O ensaio de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling) permite identificar células em
apoptose através da detecção de fragmentos de DNA por microscopia de fluorescência. Os
fragmentos de DNA resultantes da quebra do DNA genómico podem ser identificados por
marcação de terminações 3’-OH livres, através de uma reacção enzimática que catalisa a
incorporação de nucleótidos marcados com fluoresceína. Este ensaio foi realizado nas células
MNNG/HOS e nas sarcosferas após exposição a diferentes concentrações de DOX (1 µM; 2 µM; 5
µM, 10 µM e 25 µM) durante 48h. Como controlo negativo foram utilizadas células em meio de
cultura sem exposição à DOX.
Fixação Celular
Após as 48h de incubação com DOX, recolheu-se o meio de cultura para tubos de
recolha, lavaram-se os poços com PBS e destacaram-se as células com tripsina. Os tubos
contendo as células e o meio de cultura foram depois centrifugados a 1500 rpm durante 10 min.
Depois de removido o sobrenadante, adicionaram-se 500 µl de uma solução de paraformaldeído
4% (P6148, Sigma-Aldrich®), durante 20 min à temperatura ambiente para a fixação das células.
De seguida adicionaram-se 1000 µl de PBS à suspensão celular, centrifugaram-se a 1500 rpm
durante 10 min e removeram-se 1000 µl do sobrenadante. Os restantes 500 µl de suspensão
celular foram depois centrifugados a 1000 rpm durante 5 min numa centrífuga de Cytospin
(Cellspin I, Tharmac GmbH, Waldsolms, Germany) para a deposição das células em lâminas de
vidro.
Ensaio de TUNEL
As células foram seguidamente permeabilizadas com Triton 0,25%. Depois de lavadas
com PBS depositaram-se sobre as células 30 µl de uma solução contendo Tris-Cacodilato 30 mM
contendo a enzima transferase desoxinucleotidil terminal (TdT, 03333574001, Roche®,
Germany), o nucleótido (dUTP, 11093070910, Roche®, Germany) e cloreto de cobalto (CoCl2,
11243306001, Roche®, Germany), e incubaram-se 1h a 37°C numa câmara humedecida.
Terminada a reacção, as lâminas foram lavadas com tampão TB (citrato de sódio 30 mM e NaCl
300 mM), e com PBS, e depois incubadas com fluoresceína (numa diluição de 1:100) (Vector
Laboratories Inc.), durante 1h à temperatura ambiente e protegidas da luz. Por fim, lavaram-se
2. Materiais e Métodos
22
as células com PBS e incubaram-se com uma solução de 5 µg/mL de Hoechst (Hoechst 33258,
861405, Sigma-Aldrich®) para a marcação dos núcleos durante 5 min, seguida de 2 lavagens com
PBS. As células foram depois cobertas com uma lamela com o meio de montagem (Vectashield
Mounting Medium for fluorescence, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA). As lâminas foram
observadas ao microscópio de fluorescência (Leica DFC350 FX, Leica Microsystems,
Bannockburn, IL, EUA). A percentagem de células apoptóticas foi determinada como
percentagem de células TUNEL-positivas em relação ao número total de células.
2.4 Análise da expressão de proteínas por Western blot
2.4.1 Expressão de proteínas anti- e pró-apoptóticas da família Bcl-2 e da
caspase- 3
A análise dos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL, das
proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak, e de uma caspase executora (caspase-3) foi determinada
por Western blot após exposição das células a 0,7 µM de DOX a diferentes intervalos de tempo
(6h, 24h e 48h). Esta concentração de DOX corresponde ao valor do IC50 das células parentais
MNNG/HOS, obtido a partir dos estudos de viabilidade celular com MTT.
2.4.1.1 Preparação de extractos celulares
Foram preparados extractos totais a partir das células parentais MNNG/HOS e das CSCs
na situação de controlo e após exposição à DOX nos intervalos de tempo acima referidos.
Depois de recolhidas as células e lavadas com PBS, os pellets celulares obtidos foram
incubados com tampão de lise - RIPA (50mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,
0,5% deoxicolato de sódio e 0,1% de dodecil sulfato de sódio), suplementado com uma mistura
de inibidores de proteases (Roche®) e inibidores de fosfatases (Roche®), e 1mM ditiotreitol
(DTT). As amostras foram mantidas a 4°C durante 30 min com agitação regular e depois
sonicadas num aparelho de ultra-sons (Vibra cell Sonics and Materials Inc. Danbury, CT USA) a 40
MHz, com 3-5 pulsos durante 5 segundos.
A quantificação da proteína dos lisados celulares foi realizada a partir do método do
ácido bicinconínico (BCA, B9643, Sigma-Aldrich®) que permite fazer a detecção colorimétrica e a
quantificação da proteína. Este procedimento é baseado na formação de complexos
proteína/Cu2+, em condições alcalinas, seguido da redução de Cu2+ a Cu1+. Esta redução é
proporcional à quantidade de proteína existente na amostra. Em condições alcalinas, a quelação
2. Materiais e Métodos
23
de BCA com o Cu1+ forma um complexo azul/roxo que pode ser medido no medidor automático
de ELISA num comprimento de onda de 562 nm.
As amostras foram depois diluídas com igual volume de solução desnaturante 2 vezes
concentrada [Tris-HCl 0,25 M (pH 6,8), DTT 200 mM, glicerol 20% (m/v) (G5516, Sigma-Aldrich®),
SDS 4% (m/v) e de azul de bromofenol 0,05% (m/v)], e foram desnaturadas a 95°C durante 5
min. As amostras foram guardadas a -20°C até à sua utilização.
2.4.1.2 Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-
PAGE) e Electrotransferência
As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em géis de acrilamida (161-0148, Bio-Rad
Laboratories, Inc.) numa concentração de 12% (w/v) durante 60 min a 110V em solução tampão
de electroforese [Tris-HCl 50 mM (pH 8,0-8,5) contendo bicina 50 mM (B3876, Sigma-Aldrich®) e
0,1% (m/v) de SDS].
Para a análise por imunodetecção foram utilizados 20-40 µg de proteína total. Em todas
as eletroforeses foi utilizado um marcador de proteínas com peso molecular conhecido –
Precision Plus ProteinTM Standards (161-0373, Bio-RadTM).
Depois de terminada a electroforese, as proteínas foram transferidas do gel de
electroforese para membranas hidrofóbicas de difluoreto de polivinildieno (PVDF, Boehringer
Mannheim, Alemanha), previamente activadas com metanol (Merck, Germany). A
electrotransferência foi realizada em tampão de electrotransferência [Tris-HCl 12,5mM (pH 8,0-
8,5) contendo glicina 96 mM (G8898, Sigma-Aldrich®) e 20 % (v/v) de metanol], a 110V durante
90 min, a 4°C.
2.4.1.3 Immunoblotting e Quantificação
Uma vez terminada a electrotransferência, as membranas foram bloqueadas com uma
solução de 5% (m/v) de leite magro em tampão salino de Tris (TBS: Tris 20 mM, pH 7,6;NaCl 137
mM) contendo 0,1% (v/v) de Tween20 (437082, VWR®) (TBS-T), durante 1h à temperatura
ambiente com agitação suave de modo a evitar a ligação inespecífica aos locais livres na
membrana. De seguida, as membranas foram incubadas overnight, a 4°C, com o anticorpo
primário na diluição desejada (Tabela 1) em TBS-T com 1% (m/v) de leite magro, contendo 0,02%
(v/v) de azida de sódio. Terminada a incubação, as membranas foram lavadas com TBS-T 5 vezes
durante 5 min cada lavagem, e em seguida foram incubadas com o respectivo anticorpo
secundário conjugado com a fosfatase alcalina [anti-mouse ou anti-rabbit] durante 1h à
temperatura ambiente, e com agitação. Por fim, as membranas foram novamente lavadas com
2. Materiais e Métodos
24
TBS-T (5 vezes, 5 min), e depois reveladas com o reagente ECF (Enhanced Chemifluorescence,
Western blotting Reagent Pack, GE Lifesciences, Pittsburg, PA).
As bandas reactivas foram visualizadas no Typhoon FLA 9000 (GE Healthcare Bioscience
AB, Uppsala, Sweden) e foram quantificadas utilizando o programa ImageJ (Research Service
Branch).
As membranas foram depois utilizadas para marcação posterior com o anticorpo contra
uma proteína constitutiva (β-actina). Para isso procedeu-se ao stripping das membranas durante
5 min com NaOH 0,2M. Depois de lavadas com TBS-T procedeu-se à incubação das membranas
com o anticorpo contra actina, seguido de incubação com o anticorpo secundário e revelação,
tal como descrito anteriormente para as proteínas de interesse.
Os níveis de expressão das proteínas de interesse foram normalizados para a expressão
da β-actina. Com os valores normalizados calculou-se a razão entre os níveis de expressão da
proteína de interesse obtida após a exposição à DOX para os diferentes intervalos de tempo, em
relação à situação de controlo.
Tabela 1. Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e respectivas diluições.
Anticorpo
Primário
Peso Molecular Diluição Marca Anticorpo
Secundário
Diluição
Bcl-2 26 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Mouse 1:20000
Bcl-XL 30 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Mouse 1:20000
Bak 30 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Rabbit 1:20000
Bax 23 kDa 1:100 Santa Cruz Biotechnology Anti-Rabbit 1:20000
Caspase 3 35 kDa 1:1000 Cell Signaling Technology® Anti-Rabbit 1:20000
β-actina 43 kDa 1:10000 MiliporeTM
Anti-Mouse 1:20000
2.5 Análise Estatística
Todos os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD) ou como média ±
erro padrão na média (SEM), com n a indicar o número de experiências realizadas. O teste não-
paramétrico Mann-Whitney foi utilizado para comparações entre duas populações celulares
diferentes sob a mesma condição. O mesmo teste foi utilizado para comparações na mesma
população celular sob diferentes condições. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente
significativo. Os resultados obtidos foram estatisticamente tratados utilizando o software
GraphPad Prism, Version 5.0.
25
3. Resultados
3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS
A existência de uma subpopulação de células com propriedades de células estaminais na
linha celular humana aderente de OS MNNG/HOS foi demonstrada pelo método de formação de
esferas. As células parentais aderentes MNNG/HOS com uma confluência de cerca de 70%
(Figura 3.1 A) foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 1% de metilcelulose, sem soro, e em
superfícies não aderentes. Nestas condições, e após um período de cerca de 7 dias, as células
começaram a crescer em suspensão formando colónias esféricas com cerca de 50-100 µm de
diâmetro, as quais foram designadas de sarcosferas ou esferas de 1ª geração (Figura 3.1 B). A
eficiência de formação de esferas foi de aproximadamente 5,0 ± 0,2% (n=3). A presença da
metilcelulose no meio, tornando-o viscoso, previne a reagregação celular pelo que cada colónia
esférica deriva em princípio de uma única célula.
E.
Esferas de 2ª geração Esferas de 6ª geração
Meio sem soro com
metilcelulose
7 dias em superfícies
não aderentes
MNNG/HOS Esferas de 1ª geração
2-3 dias em condições
de cultura standard
Condições de
cultura Standard
Figura 3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo método de formação de
esferas. A. Linha celular parental aderente MNNG/HOS. B. Esferas derivadas da linha celular parental
MNNG/HOS após 7 dias em meio sem soro e em superfícies não aderentes. C. CSCs removidas da cultura em
suspensão, colocadas em superfícies aderentes e cultivadas em meio RPMI contendo soro. As células aderentes
começaram a expandir a partir de cada colónia esférica. D. Formação de esferas de 2ª geração a partir das
células aderentes isoladas em meio sem soro e com metilcelulose, em superfícies não aderentes. E. Formação
de esferas de 6ª geração, a partir do mesmo protocolo usado para formar esferas de 2ª geração. (Ampliação
original: 200x).
Meio sem soro com
metilcelulose
7 dias em
superfícies não
aderentes
3. Resultados
26
As esferas de 1ª geração foram posteriormente recolhidas e transferidas para frascos de
cultura aderentes com meio de cultura RPMI suplementado com 10% de FBS. As células
provenientes destas esferas começaram a migrar e a aderir à superfície do frasco, adquirindo
uma morfologia semelhante à das células parentais MNNG/HOS (Figura 3.1 C). Assim que
atingiram uma confluência de cerca de 70%, estas células foram novamente isoladas em meio de
cultura DMEM/F12 sem soro e com 1% de metilcelulose, como descrito anteriormente, dando
então origem às esferas de 2ª geração (Figura 3.1 D), com uma eficiência de formação
semelhante à da formação de esferas de 1ª geração. Este processo de formação de esferas,
passando de células aderentes a esferas em suspensão, foi repetido várias vezes tendo-se
observado a formação de esferas pelo menos até à 6ª geração (Figura 3.1 E), o que demonstra a
capacidade de auto-renovação destas células, que é uma característica de células estaminais. As
sarcosferas a partir da 3ª geração foram usadas em estudos subsequentes, e foram
denominadas de células estaminais cancerígenas (CSCs).
3.2 Sensibilidade das células MNNG/HOS e das CSCs à DOX
3.2.1 Efeito da DOX na Viabilidade e na Proliferação Celulares
Avaliou-se o efeito da citotoxicidade da DOX na viabilidade e na proliferação celulares
das células parentais MNNG/HOS e das CSCs, utilizando o método colorimétrico de MTT e de
incorporação com BrdU, respectivamente. Para tal, ambas as populações celulares foram
incubadas durante um período de 48h com diferentes concentrações de DOX (0-100 µM), que é
o fármaco principal utilizado no tratamento do OS.
As curvas de dose-resposta obtidas após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs à
DOX foram ajustadas a uma função sigmoidal para se calcular o valor do IC50, que corresponde à
concentração de fármaco que inibe a viabilidade/proliferação celular em 50% e estão
representadas nas Figuras 3.6 e 3.7, respectivamente. Os respectivos valores de IC50 estão
descritos na Tabela 2.
O tratamento com DOX induziu uma diminuição na viabilidade celular, dependente da
dose, tanto nas células MNNG/HOS como nas CSCs. No entanto, esse efeito foi menos
acentuado para as CSCs do que para as MNNG/HOS, como demonstrado pela curva de dose-
resposta que está mais deslocada para a direita (Figura 3.2) e pelo gráfico de barras apresentado
na Figura 3.3. Para concentrações de DOX superiores a 0,5 µM, a percentagem de CSCs viáveis é
significativamente superior (p<0,05) à percentagem de células parentais MNNG/HOS. O valor
médio de IC50 obtido, após o ajuste exponencial das curvas de dose-resposta, para as CSCs foi de
3. Resultados
27
2,21 ± 0,50 µM, significativamente superior (p<0,001), cerca de 3 vezes, ao valor calculado para
as células parentais MNNG/HOS que foi de 0,67 ± 0,17 µM (Tabela 2), o que demonstra que as
CSCs são mais resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS.
0
50
100
150
MNNG/HOS
CSC
CTR 50 M0,5 M0,25 M 5 M1 M
**
*
*Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
O efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs está ilustrado na
Figura 3.4. À semelhança dos resultados obtidos com o teste de MTT, observou-se uma
diminuição da proliferação celular com o aumento da concentração da DOX em ambas as
populações celulares. No entanto, essa diminuição foi mais acentuada para as CSCs do que para
Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
Log [DOX, µM]
Figura 3.2 Efeito da DOX na viabilidade das células MNNG/HOS e das CSCs. Os valores correspondem à média
± desvio-padrão (SD) de 5 experiências independentes realizadas em triplicado.
Figura 3.3 Percentagens de células viáveis após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM). Os resultados foram apresentados como média ± desvio-padrão (SD) de 5 ensaios independentes (n=5) realizados em triplicado. *p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX
3. Resultados
28
as células parentais MNNG/HOS, contrariamente ao observado com o ensaio de MTT, como
evidenciado pela curva de dose-resposta das CSCs que neste caso está mais deslocada para a
esquerda.
De facto, a exposição a 0,1 µM de DOX resultou numa diminuição de aproximadamente
80% da taxa de proliferação celular das CSCs em relação à situação de controlo, enquanto que
nas células MNNG/HOS essa diminuição foi de apenas 20% (Figura 3.5).
0
50
100
150
**
* *
MNNG/HOS
CSC
CTR 0,1 M0,01 M 1 M0,5 M
Pro
lifer
ação
Ce
lula
r (%
)
Pro
lifer
ação
Cel
ula
r (%
)
Log [DOX, µM]
Figura 3.4 Efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs. Os valores correspondem à média
± desvio-padrão (SD) de 5 experiências independentes realizadas em triplicado no caso das células parentais
MNNG/HOS, e de 3 experiências independentes realizadas em triplicado no caso das CSCs.
Figura 3.5 Percentagens de células MNNG/HOS e de CSCs em proliferação após exposição a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM). Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão (SD) de 5 ensaios independentes (n=5) realizados em triplicado no caso das MNNG/HOS e 3 ensaios independentes (n=3) realizados em triplicado no caso das CSCs. *p<0,05, **p<0,001 quando comparadas com as MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX
3. Resultados
29
O valor médio do IC50 obtido através do ensaio de incorporação com BrdU para as CSCs
foi de 0,03 ± 0,01 µM, significativamente inferior (p<0,001), aproximadamente 6 vezes, ao
calculado para as células MNNG/HOS, que foi de 0,19 ± 0,06 µM (Tabela 2), o que sugere que
para concentrações não tóxicas (0,03 ± 0,01 µM), a DOX reduz de forma significativa a taxa de
proliferação das CSCs, mas não das células parentais MNNG/HOS.
Tabela 2. Valores de IC50 obtidos através dos ensaios de MTT e de incorporação com BrdU, após exposição das células
parentais MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de DOX.
**p<0,001 quando comparadas com as células parentais MNNG/HOS.
Abreviaturas: IC50, concentração de fármaco que inibe a viabilidade/proliferação celular em 50%; DOX, doxorrubicina.
As células foram incubadas com concentrações crescentes de DOX (0-100µM) durante 48h. A citotoxicidade da DOX
na viabilidade e proliferação celulares foi avaliada utilizando o método colorimétrico de MTT e de incorporação com
BrdU, respectivamente. Os valores do IC50 foram obtidos a partir do ajuste das curvas dose-resposta a uma função do
tipo sigmoidal. Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão (SD) do número indicado de experiências
realizadas em triplicado.
3.2.2 Detecção da apoptose
A morte celular programada por apoptose foi medida pelo ensaio de TUNEL que permite
identificar, por microscopia de fluorescência, as células que estão em apoptose, baseado na
marcação fluorescente de fragmentos de DNA obtidos especificamente pela acção de
endonucleases que são activadas durante o processo de apoptose. Este ensaio foi realizado nas
duas populações celulares MNNG/HOS e CSCs após exposição a diferentes concentrações de
DOX (1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM e 25 µM) durante um período de 48h. Os resultados revelaram
diferenças significativas entre as células parentais MNNG/HOS e as CSCs, à excepção da situação
em que foram expostas a 1 µM de DOX, onde a percentagem de células mortas foi equivalente
nas duas populações celulares ( 1%). Para as restantes concentrações de DOX, a percentagem
de células em apoptose foi significativamente superior (p<0,05) nas células parentais
MNNG/HOS em relação aos valores observados para as CSCs, como evidenciado nas Figuras 3.7
e 3.8. A partir dos 2 µM e até aos 25 µM, a análise microscópica revelou um aumento
IC50 (µM)
DOX MNNG/HOS CSC
MTT 0,67 ± 0,17 (n=5) 2,21 ± 0,50** (n=5)
BrdU 0,19 ± 0,06 (n=5) 0,03 ± 0,01** (n=3)
3. Resultados
30
progressivo na percentagem de células parentais em apoptose como indicado pelo crescente
número de núcleos fluorescentes visualizados na Figura 3.6 A. A percentagem média de células
mortas aumentou para aproximadamente 9% após exposição a 2 µM de DOX, chegando a atingir
os 21% para uma concentração de DOX de 25 µM (Tabela 3).
No caso das CSCs, a percentagem de células mortas foi significativamente inferior
(p<0,05) ao observado nas células parentais, no intervalo de concentrações de DOX testadas, à
excepção da concentração de 1 µM, nunca chegando a ultrapassar os 3% mesmo para uma
concentração de 25 µM de DOX (Figura 3.7). De realçar que para esta concentração a
percentagem de CSCs em apoptose foi de apenas 1,5%, cerca de 14 vezes inferior à percentagem
observada nas células parentais MNNG/HOS que foi de 21%. Estes resultados sugerem que as
CSCs possuem mecanismos que as tornam mais resistentes à indução de morte por apoptose do
que as células parentais a partir das quais foram derivadas.
Controlo 1 µM
2 µM 5 µM
10 µM 25 µM
Controlo 1 µM
2 µM 5 µM
10 µM 25 µM
1. 2.
3. 4.
5. 6.
1. 2.
3. 4.
5. 6.
MNNG/HOS CSC A. B.
Figura 3.6 Imagens de fluorescência representativas de células MNNG/HOS (A) e de CSCs (B) em apoptose
pelo ensaio de TUNEL após incubação com diferentes concentrações de DOX durante 48h: 0 µM (1.), 1 µM
(2.), 2 µM (3.), 5 µM (4.), 10 µM (5.) e 25 µM (6.).
3. Resultados
31
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
* ** *
MNNG/HOS
CSC
2 M1 M 10 M5 M 25 M
% d
e cé
lula
s m
ort
as
Tabela 3. Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a diferentes concentrações de
DOX durante 48h.
3.3 Expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas
Na tentativa de explicar os resultados apresentados na secção anterior, nomeadamente
a maior resistência das CSCs à morte celular por apoptose após exposição à DOX, analisámos os
níveis de expressão de alguns membros da família Bcl-2 com participação activa na regulação da
apoptose. Avaliámos a expressão de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-XL) e pró-apoptóticas
(Bax e Bak) por Western blot nas células parentais MNNG/HOS e nas CSCs, às 6h, 24h, e 48h após
incubação com 0,7 µM de DOX, que corresponde à concentração de DOX que reduz a viabilidade
celular das células parentais em 50%. A expressão das proteínas depois de normalizadas pela
expressão da β-actina foi apresentada em relação aos níveis de expressão obtidos nas
respectivas amostras de controlo que não foram expostas à DOX.
Células em apoptose (%)
Concentração de DOX (µM) MNNG/HOS CSC
1 µM 1,21 ± 0,15 1,25 ± 0,07
2 µM 8,61 ± 0,76 2,76 ± 0,79
5 µM 9,70 ± 0,45 3,01 ± 0,97
10 µM 14,7 ± 0,55 1,48 ± 0,12
25 µM 20,9 ± 1,09 1,72 ± 0,12
Figura 3.7 Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a diferentes concentrações de DOX durante 48h. Os resultados foram apresentados como média ± desvio-padrão (SD). *p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX
3. Resultados
32
Os nossos resultados mostraram alterações nos níveis de expressão da proteína pró-
apoptótica Bak nas duas amostras celulares, embora discordantes. Enquanto que nas células
parentais MNNG/HOS se observou um aumento significativo (p<0,05) nos níveis de expressão da
Bak em relação à situação de controlo para as 24h e 48h de exposição à DOX, nas CSCs verificou-
se uma diminuição significativa (p<0,05) nos níveis de expressão desta mesma proteína para os
mesmos períodos de exposição, com indicado na Figura 3.8 A.
Em relação à Bax não foram observadas alterações significativas nos níveis de expressão
desta proteína para nenhum dos períodos de exposição à DOX em relação à situação de
controlo, quer para as células MNNG/HOS como para as CSCs (Figura 3.8 B).
Bak
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5*
0,7 M
**
*
CTR 48h24h6h
Exp
ress
ão r
elat
iva
da
Bak
Bax
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Exp
ress
ão r
elat
iva
da
Bax
0,7 M
CTR 48h24h6h
CSC
Bak
β-Actina
30 kDa
43 kDa
CTR 24h 48h 6h
CSC
Bax
β-Actina
23 kDa
43 kDa
CTR 24h 48h 6h
A.
.
B.
Bak
β-Actina
MNNG/HOS
30 kDa
43 kDa
CTR 24h 48h
6h
Bax
β-Actina
MNNG/HOS
23 kDa
43 kDa
CTR 24h 48h 6h
Figura 3.8 Imagens representativas da expressão das proteínas Bak (A) e Bax (B) por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7µM de DOX. A expressão das proteínas foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos
3. Resultados
33
Os resultados da análise da expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL e Bcl-2, estão
representados na Figura 3.9. Os níveis de expressão da Bcl-XL aumentaram de forma significativa
(p<0,05) nas CSCs às 24h e 48h de exposição com DOX em relação à situação de controlo,
enquanto nas células parentais MNNG/HOS se observou uma diminuição (p<0,05) na expressão
desta proteína, que apenas foi significativa para as 48h (Figura 3.9 A).
Resultados semelhantes foram observados em relação à expressão da Bcl-2. Os níveis de
expressão desta proteína anti-apoptótica aumentaram de forma significativa (p<0,05) nas CSCs
às 24h e às 48h. Contrariamente, nas células MNNG/HOS observou-se uma diminuição
significativa nos níveis de expressão desta proteína (p<0,05) para os mesmos períodos de
incubação com DOX (Figura 3.9 B).
Bcl-XL
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
0,7 M
CTR 48h24h6h
**
Exp
ress
ão r
elat
iva
da
Bcl
-XL
Bcl-2
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
**
0,7 M
CTR 48h24h6h
*
*
Exp
ress
ão r
elat
iva
da
Bcl
-2
Bcl-XL
β Actina
MNNG/HOS
30 kDa
43 kDa
CTR 6h 24h 48h
Bcl-XL
β Actina
CSC
CTR 6h 24h 48h
30 kDa
43 kDa
Bcl-2
β Actina
MNNG/HOS
26 kDa
43 kDa
CTR 6h 24h 48h
CSC
Bcl-2
β Actina
26 kDa
43 kDa
CTR 6h 24h 48h
A. B.
Figura 3.9 Imagens representativas da expressão das proteínas Bcl-XL (A) e Bcl-2 (B) por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7µM de DOX. A expressão das proteínas foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos
3. Resultados
34
3.3.1 Análise da razão entre as proteínas anti- e pró-apoptóticas
Uma vez que a razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e pró-apoptóticas
determina a resposta a um sinal de morte celular, sendo considerado um indicador da
susceptibilidade celular a um estímulo apoptótico (104), determinámos a razão entre os níveis
de expressão relativos das proteínas anti- e das pró-apoptóticas tanto para as células parentais
MNNG/HOS como para as CSCs após 48h de incubação com DOX. Uma vez que esta razão
determina a sobrevivência versus morte celular, um aumento desta indica uma menor
susceptibilidade para a morte celular por apoptose. Os resultados mostraram que a razão entre
a expressão anti-/pró-apóptoticas é significativamente superior (p<0,05) nas CSCs quando
comparada com as células parentais. No entanto, essa diferença é maior quando se considera a
razão entre as duas proteínas anti-apóptoticas Bcl-2 ou Bcl-XL e a pró-apoptótica Bak (Figura 3.10
A e B), pois a razão é cerca de 11 vezes maior nas CSCs do que nas células MNNG/HOS, do que
quando se considera a razão entre as duas proteínas anti-apoptóticas e a pró-apoptótica Bax
(Figura 3.10 C e D), que foi cerca de 3 vezes superior nas CSCs, o que sugere que a maior
resistência exibida pelas CSCs é resultante de um aumento significativo (p<0,05) da proteína Bcl-
2 ou da Bcl-XL acompanhado de uma diminuição significativa (p<0,05) da proteína pró-
apoptótica Bak.
A. B.
C. D.
Figura 3.10 Representação gráfica da razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e pró-apoptóticas às 48h de incubação com DOX. A. Razão entre a Bcl-2 e a Bak. B. Razão entre a Bcl-XL e a Bak. C. Razão entre a Bcl-2 e a Bax. D. Razão entre a Bcl-XL e a Bax. Os valores estão apresentados como média ± desvio-padrão (SD) de três experiências independentes (n=3). p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS
Bcl-2/Bak
MNNG/HOS CSC0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
*
Bcl-XL/Bak
MNNG/HOS CSC0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
*
Bcl-2/Bax
MNNG/HOS CSC0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
*
Bcl-XL/Bax
MNNG/HOS CSC0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
*
3. Resultados
35
3.4 Expressão da caspase-3
Além da expressão das proteínas pró- e anti-apoptóticas analisámos também os níveis
de expressão da caspase-3 activa que é a principal caspase executora da apoptose. Esta enzima é
activada na fase final do processo apoptótico e a responsável pelos eventos proteolíticos
associados à morte celular por apoptose. A caspase-3 activa corresponde ao fragmento 17 kDa
resultante da clivagem da pró-caspase 3 pela caspase-9 activa (105).
Os resultados de Western blot nas CSCs mostraram uma diminuição significativa (p<0,05)
nos níveis de expressão da caspase-3 às 48h após tratamento com DOX em relação à situação de
controlo (Figura 3.11). Já nas células parentais MNNG/HOS observou-se um aumento
significativo (p<0,05) nos níveis de expressão desta proteína para o mesmo período de
incubação (Figura 3.11).
Caspase-3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
0,7 M
CTR 48h24h6h
*
Exp
ress
ão r
elat
iva
da
Cas
pas
e-3
CSC
43 kDa
17 kDa Caspase 3
β Actina
CTR 6h 24h 48h
17 kDa
MNNG/HOS
43 kDa
Caspase 3
β Actina
CTR 6h 24h 48h
Figura 3.11 Imagens representativas da expressão da proteína caspase-3 por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7 µM de DOX. A expressão da proteína foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos
37
4. Discussão
Este trabalho teve como principal objectivo explorar o papel da via intrínseca da
apoptose na resistência evidenciada pelas CSCs isoladas de uma linha celular humana de OS
(MNNG/HOS) ao tratamento com DOX. Estudos anteriores mostraram a existência de CSCs nesta
mesma linha celular utilizando o método de formação de esferas. Essas células apresentaram
características de células estaminais, incluindo a sobre-expressão de marcadores de
pluripotência Oct-4 e Nanog e a capacidade de diferenciação em linhagens mesenquimais
(osteoblástica, condroblástica e adipogénica) quando cultivadas em condições apropriadas (29).
Além disso, revelaram ser mais resistentes às terapias convencionais, quimioterapia e radiação
ionizante, do que as células parentais das quais foram derivadas. Estes resultados estão de
acordo com a teoria das CSCs que defende que os tumores contêm uma subpopulação de células
com características de células estaminais, e que são elas as células iniciadoras deste tumor e as
responsáveis pelo desenvolvimento de resistência à terapia e ao aparecimento de recidivas. Esta
constatação, frequentemente observada noutros tumores tanto sólidos como hematológicos,
tem vindo a alterar o paradigma sobre a origem do cancro e sugere a necessidade de
desenvolver novas abordagens terapêuticas que tenham em conta a existência das CSCs. Nesse
sentido um conhecimento mais aprofundado sobre estas células, em particular sobre os
mecanismos que elas têm em desenvolver resistência à terapia é de extrema importância para o
desenvolvimento e planeamento de novos regimes terapêuticos.
Depois da cirurgia, a quimioterapia é a principal abordagem terapêutica utilizada no
tratamento do OS, dependendo o sucesso dos tratamentos da resposta tumoral aos fármacos
utilizados. A DOX, um potente agente citotóxico, é um dos principais agentes de quimioterapia
utilizado no tratamento do OS, sendo o seu principal efeito anti-tumoral a indução da morte
celular por apoptose. Estudos anteriores mostraram que as CSCs no OS possuem mecanismos
que lhes conferem vantagens de sobrevivência sobre as células parentais mais diferenciadas,
permitindo-lhes evadir os efeitos citotóxicos da DOX (29, 106). No seguimento deste trabalho,
propusemo-nos investigar a expressão das proteínas envolvidas na via apoptótica intrínseca nas
CSCs e a sua relação com a menor sensibilidade dessas células aos efeitos citotóxicos da DOX.
Com esse objectivo começámos por isolar as CSCs a partir da linha celular humana de OS
MNNG/HOS, utilizando o método de formação de esferas e analisar a sua sensibilidade à DOX. A
citotoxicidade da DOX tanto nas CSCs como nas células parentais foi avaliado considerando os
seus efeitos sobre a viabilidade e proliferação celulares e indução da apoptose.
4. Discussão
38
Como já demonstrado por Martins-Neves et al. (29), a cultura das células MNNG/HOS
em condições de baixa aderência, com privação de soro e na presença de factores de
crescimento, permitiu fazer o isolamento das CSCs sob a forma de colónias esféricas
(sarcosferas). Nestas condições de cultura, apenas células com propriedades de células
estaminais têm a capacidade de proliferar e de se auto-renovarem enquanto que células mais
diferenciadas são incapazes de proliferar, acabando por morrer. Esta capacidade de formação de
esferas foi observada durante pelo menos 6 gerações consecutivas, o que demonstra a sua
capacidade de auto-renovação que é uma propriedade fundamental das células estaminais.
Além disso, quando transferidas para superfícies aderentes e cultivadas em meio de cultura
contendo soro, as células começaram a expandir em monocamada e a adquirir uma morfologia
semelhante à das células parentais, o que mostra a sua capacidade de diferenciação que é outra
característica de células indiferenciadas.
A citotoxicidade da DOX nas células parentais MNNG/HOS e nas CSCs foi avaliada
considerando o seu efeito na viabilidade celular, na proliferação celular e na indução da
apoptose. A viabilidade celular, que é um dos parâmetros mais usados na avaliação da
citotoxicidade, foi avaliada utilizando o método colorimétrico de MTT que dá indicação da
quantidade de células viáveis com base na actividade da enzima mitocondrial succinato
desidrogenase que apenas está activa em células metabolicamente activas com cadeia
respiratória intacta. Os resultados apresentados na Figura 3.2 mostraram que as CSCs são mais
resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS. A concentração de fármaco
necessária para inibir a viabilidade celular em 50% nas CSCs (IC50= 2,21 ± 0,50 µM) foi cerca de 3
vezes superior ao valor observado nas células MNNG/HOS (IC50= 0,67 ± 0,17 µM) (Tabela 2). A
DOX é substrato de transporte da BCRP e da Pgp, dois transportadores membranares
pertencentes à superfamília ABC, que estão sobre-expressos em células estaminais como
mecanismo de defesa contra exposição a citotóxicos (107).Estas proteínas conferem um
fenótipo de resistência a múltiplos fármacos, devido à sua capacidade de diminuir a acumulação
intracelular de agentes de quimioterapia. A sobre-expressão da Pgp e de BCRP está também
associada ao fraco prognóstico e à resistência à terapia evidenciada por vários tipos de cancro,
entre os quais o OS (108). A sobre-expressão destas proteínas já foi comprovada em CSCs de OS
por Martins-Neves et al. (29), o que sugere a sua participação activa no desenvolvimento de
resistência das CSCs à DOX. Além disso, a co-administração de verapamil, um inibidor da
actividade funcional destas proteínas, reverteu a resistência das CSCs à DOX, o que reforça a
hipótese destes transportadores fazerem a extrusão da DOX prevenindo a sua acumulação
intracelular em concentrações tóxicas capazes de induzir apoptose (29).
4. Discussão
39
Os resultados da análise da citotoxicidade da DOX sobre a proliferação celular, utilizando
o ensaio de incorporação com BrdU, foram contraditórios. Neste caso, a DOX diminuiu a
proliferação celular das CSCs a uma baixa concentração (IC50=0,03±0,01µM), e significativamente
inferior, cerca de 6 vezes, à observada nas células parentais MNNG/HOS (IC50=0,19 ± 0,06 µM). O
facto de se ter observado uma redução na taxa de proliferação das CSCs, para uma concentração
não tóxica de DOX (0,03 ± 0,01 µM) para a qual não foram observadas alterações na viabilidade
celular de acordo com o ensaio de MTT, sugere que as CSCs interrompem o processo de divisão
celular ao serem expostas à DOX, entrando num estado de quiescência que as protege da DOX,
que se sabe ser tóxica para células em proliferação. Desta forma, as CSCs podem re-entrar no
ciclo celular e iniciar o seu processo de divisão celular assim que encontrarem as condições
ideais. Esta capacidade de entrarem num estado quiescente ou de baixa actividade proliferativa
é considerada um mecanismo de defesa intrínseco de células mais indiferenciadas, que assim
ficam protegidas dos efeitos dos agentes de quimioterapia que afectam essencialmente células
em rápida divisão celular, induzindo a morte celular (109).
Os resultados obtidos com o ensaio de TUNEL, para avaliação do processo de morte
celular por apoptose, reforçam esta hipótese. A percentagem de células MNNG/HOS em
apoptose após a exposição à DOX foi significativamente superior ao valor observado nas CSCs
(Tabela 3), o que revela claramente que as CSCs possuem mecanismos eficazes que lhes
conferem a capacidade de resistir aos efeitos citotóxicos mediados pela DOX. Nas CSCs a
percentagem de células em apoptose não ultrapassou os 1,5% para a concentração máxima de
DOX testada (25 µM), enquanto na população parental MNNG/HOS, a percentagem de células
em apoptose para essa mesma concentração foi de 21%.
O facto da DOX praticamente não induzir a apoptose nas CSCs sugere que possa haver
uma desregulação no mecanismo de activação da apoptose nestas células, neste caso em
particular na via intrínseca ou mitocondrial, uma vez que é a via de activação da apoptose
induzida pela DOX. Esta via envolve a activação das proteínas pró-apoptóticas que inclui a Bak e
Bax e a inactivação dos membros anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-XL, que culmina na activação das
caspases efectoras como a caspase-3, levando à morte celular. A activação desta via é altamente
dependente do balanço entre os membros pró- e os anti-apoptóticos, sendo que os primeiros
tendem a destabilizar a membrana externa da mitocôndria com consequente libertação de
mediadores apoptóticos (tais como o citocromo c) que irão activar as caspases, enquanto os
segundos tendem a prevenir este efeito mantendo intacta a permeabilidade mitocondrial. Os
nossos resultados revelaram haver um desequilíbrio na regulação da expressão dessas proteínas
nas CSCs às 24h e 48h após exposição à DOX.
4. Discussão
40
Os níveis de expressão da proteína pró-apoptótica Bak diminuíram de forma significativa
(p<0,05) nas CSCs em relação à situação de controlo, enquanto nas células parentais MNNG/HOS
se observou um aumento significativo (p<0,05) na expressão dessa mesma proteína (Figura 3.8
A). A Bak é uma proteína pró-apoptótica com um papel importante na via mitocondrial da
apoptose, e que é estimulada pela acção de agentes de quimioterapia. Dada a sua importância
na indução da apoptose, os níveis de expressão desta proteína aumentam nas células de tecidos
normais quando estas são sujeitas a estímulos nocivos. Nas células cancerígenas esta situação
nem sempre se verifica. Há estudos que mostram que as células tumorais apresentam níveis de
expressão diminuídos desta proteína pró-apoptótica, como é o caso de células cancerígenas de
adenocarcinomas colo-rectais (110) e gástricos (111), comparativamente aos níveis encontrados
no tecido normal, o que sugere que esta proteína desempenha um papel importante nas fases
iniciais da progressão destes tumores. Além disso, também já foram encontradas mutações na
Bak nestes tipos de cancro (112), o que sugere que perturbações na apoptose mediada pela Bak
possam contribuir para a patogénese deste tipo de tumores e contribuir para a maior resistência
aos agentes de quimioterapia (113).
Os níveis de expressão da outra proteína pró-apoptótica Bax não sofreram alterações
significativas após exposição à DOX nem nas CSCs nem nas células parentais MNNG/HOS (Figura
3.8 B), o que sugere que esta proteína não é recrutada/activada pela exposição à DOX nesta
linhagem celular. Apesar de ser uma proteína relevante na indução da apoptose uma vez que
juntamente com a Bak forma poros homo- ou hetero-oligoméricos na membrana mitocondrial,
que permitem a libertação do citocromoc e consequente activação da cascata proteolítica, não é
condição obrigatória que esteja activada para que a apoptose prossiga. Há estudos que sugerem
que a sua função pode ser parcialmente substituída pela Bak, e que é necessário que haja uma
deficiência na expressão das duas proteínas pró-apoptóticas para que as células se tornem
completamente resistentes à apoptose induzida pela DOX (114). Além disso, a expressão desta
proteína pode ainda, em certas circunstâncias, ser essencial para a sobrevivência celular (110),
daí que a manutenção dos seus níveis de expressão possam ser cruciais mesmo nas CSCs para a
manutenção da homeostasia. Na literatura encontramos casos em que os níveis de expressão
desta proteína se mantêm relativamente constantes em adenocarcinomas colo-rectais (110) e
gástricos (111), comparativamente ao tecido normal.
Os nossos resultados também mostraram diferenças significativas na expressão das
proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL entre as CSCs e as MNNG/HOS após exposição à DOX
(Figura 3.9 A e B). O aumento significativo (p<0,05) da expressão das proteínas anti-apoptóticas
Bcl-2 e Bcl-XL observado nas CSCs explicam a sua menor susceptibilidade à apoptose em
4. Discussão
41
comparação com as células parentais MNNG/HOS, nas quais se verificou um decréscimo na
expressão tanto da Bcl-2 como da Bcl-XL.
A Bcl-XL é capaz de inibir a libertação do citocromo c, impedindo desta forma a activação
do complexo APAF-1 e a consequente activação da cascata das caspases, inibindo a apoptose em
condições de stresse celular. Vários estudos na literatura indicam que asobre-expressão da Bcl-
XLem células tumorais as tornam menos susceptíveis à acção de agentes de quimioterapia que
induzem a morte celular pela via apoptótica (115). De facto, a Bcl-XL encontra-se sobre-expressa
em cancros da próstata (116) e da mama (117), em carcinomas hepatocelulares (115), e em
adenocarcinomas colo-rectais (110), o que promove a resistência à quimioterapia
frequentemente observada nestes tumores. Ainda no estudo realizado nos adenocarcinomas
colo-rectais (110), os autores mostraram que expressão da Bcl-XL está mais aumentada nos
adenocarcinomas mais indiferenciados, o que sugere que as alterações na expressão desta
proteína são desencadeadas durante fases iniciais do desenvolvimento destes tumores.
Os nossos resultados estão de acordo com estudos prévios que mostram igualmente um
aumento na expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 ou Bcl-XL em CSCs isoladas de
diferentes tumores que apresentam um fenótipo de resistência à quimioterapia ou radioterapia.
Konopleva et al. (118) num estudo realizado em amostras de LMA observaram um aumento na
expressão das duas proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL em células CD34+ em estado
quiescente versus células proliferativas e sugerem o seu envolvimento no desenvolvimento da
quimioresistência e na regulação do ciclo celular. Num outro estudo, Wang et al. (119)
demonstraram que as CSCs isoladas de cancro de mama expressam níveis mais elevados de Bcl-
XL, e que por isso se apresentam mais resistentes a vários agentes de quimioterapia e à radiação.
Resultados semelhantes foram observados em CSCs CD133+ isoladas de glioblastoma (88).
Também nesta patologia, os autores verificaram que as CSCs eram mais resistentes a vários
agentes de quimioterapia e apresentavam níveis de expressão aumentados da Bcl-XLe da Bcl-2
comparativamente aos níveis de expressão encontrados nas células CD133- (88).
Há evidências de que as várias proteínas pró- e anti-apoptóticas se ligam entre si por
homo- ou heterodimerização, regulando a sua actividade mutuamente (110). Por exemplo, a
acção anti-apoptótica da Bcl-2 pode ocorrer por interacção com a Bax, sequestrando-a na
mitocôndria, induzindo-lhe alterações conformacionais ou competindo por locais que seriam
ocupados pela Bax na mitocôndria, impedindo-a de exercer o seu efeito pró-apoptótico. Assim,
as proporções relativas de proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas da família Bcl-2
determinam a sensibilidade das células aos diferentes estímulos que podem levar à morte
celular por apoptose (110). Num estudo realizado envolvendo 256 doentes com LMA, os autores
4. Discussão
42
concluíram que um valor elevado para a razão Bcl-2/Bax é considerado um factor de mau
prognóstico (120).
Os nossos resultados mostraram que a razão entre as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2
ou Bcl-XL, e a proteína pró-apoptótica Bak, está aumentada nas CSCs (cerca de 11 vezes)
comparativamente às células parentais MNNG/HOS, para o período de 48h de incubação com
0,7µM de DOX (Figura 3.10A e B). Este resultado é explicado pelo facto de nas CSCs o aumento
na expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 ou Bcl-XLter sido acompanhado de uma
diminuição na expressão da proteína pró-apoptótica Bak.
O aumento da razão entre as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL e a proteína pró-
apoptótica Bax, nas CSCs comparativamente às MNNG/HOS, apesar de significativo, não foi tão
pronunciado (Figura 3.10 C e D), uma vez que não foram observadas alterações significativas nos
níveis de expressão da Bax após o tratamento com a DOX.
Nas CSCs, em adição à desregulação na expressão das proteínas reguladoras da
apoptose foi observada uma diminuição nos níveis de expressão da caspase-3 (Figura 3.11) que
corresponde ao fragmento de 17 kDa resultante da clivagem da pró-caspase 3 que na sua forma
inactiva tem um peso molecular de 32 kDa. Sendo a caspase-3 a principal caspase efectora da
apoptose, uma diminuição na sua expressão/actividade é indicador de resistência à apoptose, o
que é demonstrado pelos nossos resultados do ensaio de TUNEL, que mostram que apenas um
pequeno número de CSCs entra em apoptose mesmo para exposição a concentrações elevadas
de DOX. Já no caso das células parentais MNNG/HOS, em que foi observado um aumento na
expressão da caspase-3 após as 48h de exposição à DOX (Figura 3.11), observou-se um aumento
progressivo na percentagem de células em apoptose com o aumento da concentração da DOX.
Estes resultados mostraram que as CSCs são mais resistente do que células MNNG/HOS à
indução da apoptose pela DOX, e que essa resistência está associada a uma desregulação nas
vias de sinalização anti- e pró-apoptóticas.
Na literatura já foi observada a activação das vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt
em vários tipos de cancro humanos, e que estas desempenham um papel importante na
resistência às terapias anti-cancro, o que pode ser explicado pela importância destas vias de
sinalização no controlo da apoptose e nos mecanismos de resistência evidenciados pelas células
tumorais (121, 122). De facto, Dreesen et al. (123) propuseram que ambas as vias de sinalização
estão constitutivamente activadas e/ou sobre-expressas em células de vários tipos de cancro. Os
autores associaram a desregulação destas vias à actividade de hiperproliferação demonstrada
por inúmeros tipos de cancro, entre os quais, cancro do cólon e do pâncreas, e com a
manutenção do estado indiferenciado pelas células estaminais embrionárias. No nosso
4. Discussão
43
laboratório já foram efectuados estudos que nos mostraram que as vias de sinalização
MAPK/ERK e PI3K/Akt se encontram significativamente aumentadas nas CSCs após exposição à
DOX, uma vez que se verificou um aumento dos níveis de expressão da pERK e da pAkt nas CSCs
para concentrações reduzidas deste fármaco (cerca de 0,25 µM), enquanto que nas células
parentais MNNG/HOS o aumento dos níveis de expressão da pERK e da pAkt se verificaram para
concentrações mais elevadas de DOX (concentrações mais próximas de 0,58 µM), o que nos
indica que as CSCs activam estas vias mais precocemente do que as células parentais
MNNG/HOS, o que lhes confere vantagens de sobrevivência face aos agentes de quimioterapia
que induzem a apoptose (106).
Já foi evidenciado na literatura que certas quinases envolvidas nas vias de sobrevivência,
tais como a Akt, são capazes de fosforilar e inactivar proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2
(124, 125), bloqueando desta forma a morte celular por apoptose. Além disso, a inibição da via
MAPK/ERK pode levar à morte celular e à diferenciação celular (126). Lee et al. (127) mostraram
que essa inibição pode estar relacionada com a diminuição da actividade da ERK1/2 e dos níveis
da proteína Bcl-2 em células cancerígenas. Outro estudo demonstrou ainda que a forma activa
da caspase-3 (proteína executora da apoptose) se encontra sobre-expressa em células de
hepatocarcinoma após a inibição da via de sinalização da ERK (128), o que nos indica que a
inibição desta via de sobrevivência leva à indução da apoptose nas células deste tipo de cancro.
Em conjunto, estes estudos sugerem que as CSCs podem activar as vias de sinalização
PI3K/Akt e MAPK/ERK em resposta ao tratamento com DOX ou outro agente antineoplásico, e
que estas por sua vez vão fosforilar proteínas pró-apoptóticas e comprometer a regulação do
processo apoptótico.
A evasão da apoptose apresenta-se assim como um dos mecanismos pelo qual as CSCs
conseguem evadir os efeitos citotóxicos da DOX e resistir à terapia, o que sugere a necessidade
de desenvolver novas estratégias terapêuticas direccionadas às CSCs capazes reverter a
resistência à apoptose. A sobreexpressão dos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas
Bcl-2 e Bcl-XL e a diminuição da proteína pró-apóptotica Bak induzidas pela DOX mostram
claramente que há uma desregulação na via intrínseca ou mitocondrial da apoptose nas CSCs. A
administração de inibidores de proteínas anti-apoptóticas, bem como de fármacos que
promovam a actividade das caspases e das proteínas pró-apoptóticas tornam-se numa potencial
estratégia terapêutica no combate à resistência das CSCs e por conseguinte numa melhoria da
taxa de sobrevida dos doentes com OS.
45
5. Conclusão
Este trabalho teve como principal objectivo explorar o papel da via mitocondrial ou
intrínseca da apoptose na resistência de CSCs de OS aos efeitos citotóxicos da DOX.
Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que o OS contém uma subpopulação de
células tumorais com características de células estaminais (CSCs) que podem ser isoladas pelo
método de formação de esferas.
Os estudos de citotoxicidade mostraram que essa subpopulação celular é mais resistente
á apoptose induzida pela DOX do que as células parentais MNNG/HOS, como demonstrado pelo
ensaio de TUNEL e de viabilidade celular com MTT.
A desregulação da via intrínseca ou mitocondrial da apoptose parece estar implicada na
resistência das CSCs à DOX como demonstrado pelo aumento observado nas das duas proteínas
anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL e uma concomitante diminuição da expressão da proteína pró-
apoptótica Bak e da actividade da caspase-3 após exposição à DOX.
A redução na taxa de proliferação observada nas CSCs para concentrações não tóxicas
de DOX, sugere que estas células entram num estado de quiescência ou de baixa taxa de
proliferação protegendo-se assim dos efeitos citotóxicos da DOX que é mais eficaz para as
células com elevada actividade proliferativa.
Em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a existência de CSCs no OS contribui
para o desenvolvimento de resistência às terapias actuais utilizadas no tratamento desta
doença, o que reforça a necessidade de desenvolver novas abordagens terapêuticas que
contemplem a eliminação dessas células.
47
6. Trabalhos Futuros
Para complementar os estudos realizados nas CSCs isoladas da linha celular humana de
OS MNNG/HOS outros trabalhos poderão ser realizados. O estudo da acção de inibidores das
proteínas anti-apoptóticas (como por exemplo o ABT-737, um inibidor da Bcl-2), e de
potenciadores das proteínas pró-apoptóticas, bem como das caspases torna-se numa
importante estratégia terapêutica no combate ao cancro. Pelo que estudos nas CSCs e nas
células parentais MNNG/HOS expostas à DOX e na presença destes inibidores podem ser
efectuados para complementar os estudos por nós realizados, e assim estabelecer a relação
entre a resistência das CSCs aos agentes de quimioterapia e a desregulação da via mitocondrial
da apoptose.
Estudos sobre os efeitos sinergéticos dos principais agentes de quimioterapia utilizados
actualmente com outros fármacos não tóxicos já existentes no mercado podem ser efectuados
para encontrar uma forma de diminuir as doses administradas nos doentes que padecem de OS,
uma vez que estes agentes de quimioterapia apresentam variados efeitos secundários que
devem ser contornados para melhorar a resposta à terapia.
Estudos sobre a interacção entre a via da apoptose e as vias de sinalização MAPK/ERK e
PI3K/Akt devem ser efectuados, no sentido de estudar se o facto de inibir estas vias de
sobrevivência se torna num método mais eficaz na inibição da apoptose nas CSCs, que
apresentam uma maior resistência a este tipo de morte celular.
Além disso, novas vias de sinalização envolvidas na resistência das CSCs à terapia devem
ser aprofundadas, no sentido de encontrar novos agentes de quimioterapia mais eficazes na
erradicação destas células.
Progressos nos estudos in vivo também são de extrema importância no entendimento
das CSCs como células responsáveis pelo desenvolvimento do OS.
49
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