Download - mojca kladnik diplomska naloga univerzitetni študij farmacije

Ljubljana, 2010

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MOJCA KLADNIK

DIPLOMSKA NALOGA

UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MOJCA KLADNIK

UGOTAVLJANJE PROTEKTIVNOSTI FULERENOLA IN VIVO

PRI TERAPIJI MALIGNIH NEOPLAZEM Z DOKSORUBICINOM

NA TESTISIH PRI PODGANAH

INVESTIGATION OF PROTECTIVE EFFECTS OF FULLERENOL

IN VIVO DURING DOXORUBICINE THERAPY OF MALIGN

NEOPLASMA ON TESTIS IN RATS

Ljubljana, 2010

Diplomsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom prof. dr.

Boruta Štruklja in somentorstvom doc. dr. Rada Injaca.

ZAHVALA

Za vse strokovne nasvete in velikodušno vsestransko pomoč pri izdelavi diplomske naloge

se iskreno zahvaljujem svojemu somentorju doc. dr. Radu Injacu. Najlepša hvala sestri

Jasni, študentki medicine, za njen čas in mnenja. Zahvaljujem se tudi staršem, ki so mi

omogočili študij in svojemu fantu Urbanu, ki mi je v napornih dneh vedno stal ob strani.

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod delovnim mentorstvom doc.

dr. Rada Injaca.

Mojca Kladnik

Ljubljana, november 2010

VSEBINA

POVZETEK .......................................................................................................................... 1

ABSTRACT .......................................................................................................................... 1

SEZNAM OKRAJŠAV ........................................................................................................... 2

1 UVOD ......................................................................................................................... 3

1.1 Doksorubicin ........................................................................................................ 3

1.2 Mehanizmi toksičnosti doksorubicina in pojav radikalov ................................... 7

1.2.1 Toksičnost doksorubicina na nivoju testisov ............................................. 11

1.3 Različni pristopi za zaščito pred toksičnostjo povzročeno z doksorubicinom .. 13

1.4 Fulerenol ........................................................................................................... 15

1.4.1 Fulereni ...................................................................................................... 15

1.4.2 Fulerenoli in drugi biološko aktivni fulereni .............................................. 17

1.4.3 Lastnosti in sinteza fulerenola C60(OH)24 ................................................... 18

1.5 Potencialna terapevtska uporaba fulerenola C60(OH)24 .................................... 19

1.5.1 Fulerenol C60(OH)24 kot antioksidant ......................................................... 20

2 NAMEN DELA ........................................................................................................... 21

3 MATERIALI IN METODE ............................................................................................ 22

3.1 Priprava in aplikacija C60(OH)24, doksorubicina in vitamina C ........................... 22

3.2 Kemijska povzročitev kolorektalnih tumorjev .................................................. 24

3.3 Koeficient mase testisov in svetlobna mikroskopija tkiva ................................ 25

3.4 Ocena protektivnih učinkov C60(OH)24 na tkivo testisov ................................... 25

3.5 Statistična analiza .............................................................................................. 26

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ......................................................................................... 27

4.1 Makroskopske spremembe ............................................................................... 27

4.2 Mikroskopske spremembe ................................................................................ 30

4.3 Tumorji .............................................................................................................. 34

4.4 Hematološki parametri in aktivnost serumskih encimov ................................. 35

4.5 Oksidativni status .............................................................................................. 38

4.6 Primerjava učinkovitosti fulerenola in drugih antioksidantov pri toksičnem

učinku doksorubicina na testise ...................................................................................... 43

5 SKLEP ........................................................................................................................ 46

6 LITERATURA ............................................................................................................. 47

ŽIVLJENJEPIS .................................................................................................................... 50

Mojca Kladnik Diplomska naloga

1

POVZETEK

V časovnem obdobju treh tednov smo proučevali učinke fulerenola C60(OH)24 v

odmerkih 25, 50 in 100 mg/kg/teden na z doksorubicinom povzročeno toksičnost na tkivo

testisov pri podganah s kolorektalnim rakom. Uporabili smo in vivo model na samcih

podgan vrste Wistar in ugotavljali, ali je fulerenol sposoben preprečiti z doksorubicinom

(1,5 mg/kg/teden v obdobju treh tednov) povzročene kronične poškodbe na testisih. Učinke

smo primerjali z učinki dobro poznanega antioksidanta vitamina C (100 mg/kg/teden v

obdobju treh tednov). Na podlagi rezultatov makroskopskih, mikroskopskih, hematoloških

in biokemijskih raziskav lahko potrdimo, da ima fulerenol v vseh preiskovanih odmerkih

zaščitne učinke na tkivo testisov pred toksičnostjo, povzročeno z doksorubicinom.

ABSTRACT

For a time-span of three weeks the effects of fullerenol C60(OH)24 at doses of 25, 50 and

100 mg/kg/week on testis tissue after doxorubicin-induced toxicity in rats with colorectal

cancer were investigated. In the present study, we used an in vivo Wistar male rat model to

explore whether fullerenol could protect against doxorubicin-induced (1.5 mg/kg/week for

three weeks) chronic toxicity on testis and compared the effect with a well-known

antioxidant, vitamin C (100 mg/kg/week for three weeks). According to macroscopic,

microscopic, hematological, and biochemical results, we confirmed that, at all examined

doses, fullerenol exhibits a protective influence on the testis tissue against chronic toxicity

induced by doxorubicin.


2

SEZNAM OKRAJŠAV

DNA deoksiribonukleinska kislina

RKS reaktivne kisikove spojine

NADH nikotinamid adenin dinukleotid (v reducirani obliki)

NAD+ nikotinamid adenin dinukleotid (v oksidirani obliki)

IRP-1 regulatorni protein za ţelezo

TfR receptor za transferin

NF–κB nuklearni dejavnik kappa B

p53 tumorje zavirajoči gen

EKG elektrokardiogram

AST aspartat – aminotransferaza

ALT alanin – aminotransferaza

GSH reducirana oblika glutationa

GSSG oksidirana oblika glutationa

GSH-Px glutation peroksidaza

GR glutation reduktaza

SOD superoksidna dismutaza

CAT katalaza

MDA malondialdehid

LD50 odmerek, ki povzroči smrt pri polovici testiranih osebkov

CK kreatin kinaza

LDH laktat dehidrogenaza

α-HBDH alfa hidroksibutirat dehidrogenaza

DMSO dimetilsulfoksid ((CH3)2SO)

DMH 1,2 – dimetilhidrazin

TP skupna koncentracija proteinov

Hbg hemoglobin

HCT hematokrit


3

1 UVOD

1.1 Doksorubicin

Doksorubicin je antraciklinski antibiotik, ki se zaradi širokega spektra protitumorske

aktivnosti uporablja v terapiji številnih malignih obolenj. Glavne indikacije za njegovo

uporabo so: limfomi, akutne levkemije ter solidni tumorji, kot so karcinom dojke,

drobnocelični pljučni karcinom, karcinomi sečnega mehurja, ščitnice in ţelodca, sarkomi

mehkih tkiv in osteogeni sarkomi, nevroblastomi in Wilmsov tumor. Vendar pa njegovo

uporabo v terapiji omejujejo neţeleni učinki, kot so mielosupresija, poškodbe sluznice

gastrointestinalnega trakta, zlasti pa kardiotoksičnost (1,2).

Zgodovina antraciklinskih antibiotikov sega v šestdeseta leta 20. stoletja, ko je bil iz

vrste Streptomyices peuceticus izoliran daunorubicin. Temu so sledile intenzivne raziskave

citotoksičnih antibiotikov in leta 1969 so odkrili 14-hidroksi daunomicin, ki so ga zaradi

prvotne lokacije seva S. peuceticus na Jadranskem morju poimenovali z zaščitenim

imenom Adriamycin in ga poznamo kot doksorubicin (1,3).

Slika 1: Struktura doksorubicina ((8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksi-α-L-liksoheksopiranozil)

oksi]-6,8,11-trihidroksi-8-(hidroksiacetil)-1-metoksi-7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-dion).

Doksorubicin (Slika 1) ima planarni aromatski del iz štirih obročev s kinonsko strukturo

in na to tetraciklinsko strukturo je pripet sladkor z amino skupino. Zaradi planarnega dela

se lahko interkelira med bazne pare v DNA, kar povzroči spremembo v strukturi dvojne

vijačnice. Neposredna interakcija doksorubicina z DNA molekulo vpliva na encime

vpletene v procesa replikacije in transkripcije. Z vezavo na DNA tako zavira DNA

polimerazo in s tem sintezo nukleinske kisline. Glavni učinek naj bi bil posredovan preko

topoizomeraze II, ki med podvajanjem cepi obe verigi matrične dvojne vijačnice hkrati in


4

tako omogoči odvitje dvojne verige DNA preko prehodnega preloma. Doksorubicin se

vrine v DNA molekulo in tako stabilizira nastali kompleks med DNA in topoizomerazo II,

po tem, ko sta obe verigi dvojne vijačnice ţe prekinjeni, ter tako ustavi prepisovanje

zaporedja nukleinskih kislin (4-7).

Drug mehanizem delovanja je povezan z nastankom radikalov, in sicer superoksidnega

in vodikovega peroksida ter hidroksilnega radikala. Le ti so odgovorni za poškodbe DNA

in lipidno peroksidacijo v membranah (4,7).

Kot še nekatere citotoksične učinkovine (ciklofosfamid, klorambucil, melfalan,

cisplantin, 5-fluorouracil), tudi doksorubicin vpliva na celice v aktivnih fazah celičnega

cikla, kar pripelje do mehanizmov, ki sproţijo apoptozo. Citostatiki poškodujejo maligne

celice, vendar povzročajo veliko neţelenih učinkov, ki so posledica toksičnosti na

normalne celice. Posebno dovzetne za poškodbe so hitro deleče se celice v prebavnem

traktu, kostnem mozgu, lasnih mešičkih in reproduktivnih organih. Zdrave celice imajo v

primerjavi z rakavimi celicami večjo sposobnost popravljalnih mehanizmov, zaradi česar

zdravljenje s citostatiki poteka v določenih časovnih presledkih, saj tako normalnim

celicam omogočimo čas za regeneracijo. Izredno pomembno je, da odmerek citostatika

natančno določimo glede na potrebe bolnika, njegovo starost in zdravstveno stanje

(funkcija jeter in ledvic). Odmerki mnogih citostatikov se preračunajo glede na telesno

površino, ki jo izračunamo s pomočjo pacientove mase in višine (1,4,5).

Običajni enkratni odmerki doksorubicin – hidroklorida pri zdravljenju so od 60 mg/m2

do 75 mg/m2

oziroma 1,2 – 2,4 mg/kg telesne mase enkrat na tri tedne. Alternativni reţim

odmerjanja je 20 – 25 mg/m2 dnevno tri dni zapored na tri tedne, vendar se tako lahko

poveča incidenca za mukozitis zaradi neţelenega učinka na sluznice v ustih, predelu

poţiralnika, ţelodca kot črevesja. Z večanjem kumulativnega odmerka doksorubicina se

povečuje tveganje za pojav kardiomiopatije in srčnega popuščanja in nevarno naraste, če se

prekorači maksimalni kumulativni odmerek, ki je 450 – 550 mg/m2 telesne površine (7-9).

Odstotek odraslih bolnikov z doksorubicinom povzročenim kongestivnim srčnim

popuščanjem je 5% pri kumulativnem odmerku 400 mg/m2 in se poveča na 16% pri

odmerku 500 mg/m2, pri odmerku 700 mg/m

2 ta odstotek znaša ţe 48% (6).

Z enkratnim tedenskim odmerkom 20 mg/m2 na tri tedne zmanjšamo nevarnost

kardiotoksičnosti, poleg tega danes poznamo še druge obetavne pristope za povečanje

učinkovitosti in zmanjšanje neţelenih učinkov doksorubicina, kot na primer novi dostavni

sistemi učinkovin, kot so liposomi in nanodelci. Poleg navedenih zdravil (Preglednica 1) je


5

v Sloveniji na voljo zdravilo v katerem se doksorubicinijev – klorid nahaja v obliki

pegiliranih liposomov, kar upočasni hitrost metabolizma doksorubicina in podaljša čas

zadrţevanja učinkovine v krvnem obtoku ter zmanjša neţelene učinke na zdrave celice. Ta

oblika se uporablja v odmerku 20 mg/m2 enkrat na dva do tri tedne pri zdravljenju

Kaposijevega sarkoma bolnikov s sindromom pridobljene imunske pomanjkljivosti

(AIDS). Za zdravljenje karcinoma dojk in napredovanega raka jajčnikov je priporočeni

odmerek liposomske oblike 50 mg/m2 enkrat na štiri tedne (5,6,8,9).

Preglednica 1: Registrirana zdravila z doksorubicinom v Sloveniji (9).

Naziv zdravila Proizvajalec

ADRIBLASTINA 10 mg raztopina za injiciranje,

škatla z 1 vialo s 5 ml raztopine

Pfizer Luxembourg SARL

ADRIBLASTINA 50 mg raztopina za injiciranje,


Pfizer Luxembourg SARL

CAELYX 2 mg/ml koncentrat za pripravo raztopine za

infundiranje,

škatla z 1 vialo s 25 ml koncentrata in

škatla z 1 vialo z 10 ml koncentrata

Schering-Plough Europe, Belgija

DOXORUBICIN EBEWE 2 mg/ml koncentrat za raztopino

za infundiranje,


škatla z 1 vialo s 100 ml koncentrata

EBEWE Pharma Ges.m.b.H.

Nfg.KG, Avstrija

DOXORUBICIN EBEWE 2 mg/ml, koncentrat za pripravo

raztopine za infundiranje,


škatla z 1 vialo s 5 ml koncentrata

EBEWE Pharma Ges.m.b.H.

Nfg.KG, Avstrija

DOXORUBIN 2 mg/ml,

škatla z 1 vialo s 5 ml raztopine in


Pharmachemie B.V., Nizozemska,

Zaradi izredno slabe absorpcije antraciklinskih antibiotikov iz črevesja, se ti dajejo

intravensko, in sicer v obliki infuzije ali počasne injekcije (3 min) ob vzporedni infuziji

fiziološke raztopine, 5% glukoze ali 0,9% raztopine natrijevega klorida in 0,5 % glukoze.

Ekstravazacija na mestu injiciranja citostatika lahko povzroči hudo lokalno nekrozo tkiva,

zato se doksorubicin in ostali antraciklinski antibiotiki ne smejo dajati intramuskularno ali

subkutano (4,8).

Po aplikaciji se doksorubicin iz krvi hitro porazdeli v tkiva, in sicer v pljuča, jetra, srce,

vranico in ledvica. Hematoencefalne bariere ne prehaja, lahko pa prehaja preko placente in

se porazdeljuje tudi v materino mleko. Razpolovna doba doksorubicina je 2 do 10 ur.

Metabolizem poteka v jetrih, kjer se delno pretvori v aktivni metabolit doksorubicinol, ki

se presnavlja naprej in se v glavnem izloča z ţolčem. Pribliţno od 40 do 50% začetnega


6

odmerka se izloči z ţolčem v sedmih dneh, od tega polovica učinkovine v nespremenjeni

obliki. Samo okrog 5% začetnega odmerka se izloči preko ledvic v času petih dni. Sočasna

uporaba hepatotoksičnih citostatikov zmanjša njegov očistek v jetrih, kar pa privede do

povečane toksičnosti doksorubicina (5,6,8).

Ta antraciklinski antibiotik se v klinični praksi mnogokrat uporablja v kombinaciji

(Preglednica 2) z ostalimi zdravili, ki delujejo na novotvorbe (1). V takem primeru

moramo odmerek doksorubicina primerno zmanjšati, kljub temu pa so uspehi takšnega

pristopa neizmerno večji. Začetki kombinirane kemoterapije, ki vključuje tudi druge

pristope, kot sta radioterapija in imunoterapija, segajo v leto 1960 (1,5,6).

Preglednica 2: Različne kombinacije doksorubicina z ostalimi učinkovinami v terapiji raka (6).

DOKSORUBICIN in INDIKACIJA

docetaksel rak dojk

docetaksel, ciklofosfamid

ciklofosfamid, etopozid rak pljuč

ciklofosfamid, vinkristin

ciklofosfamid, vinkristin, prednizolon ne-Hodgkinov limfom

metotreksat, ciklofosfamid, vinkristin, prednizolon, bleomicin

bleomicin, vinblastin, dakarbazin Hodgkinov limfom

vinkristin, prednizolon, etopozid, ciklofosfamid, bleomicin

vinkristin, prednizolon akutna limfoblastna levkemija

fluorouracil, mitomicin rak pankreasa

vinkristin, deksametazon multipli mielom

ciklofosfamid, vinkristin, metilprednizolon

liposomska oblika rak jajčnikov, rak dojk

Obstajajo določeni kriteriji za izbor primerne kombinacije zdravil za zdravljenje raka:

vsaka uporabljena učinkovina mora izkazovati aktivno antineoplastično delovanje;

kot druge učinkovine ne smemo uporabiti snovi, ki bi le povečala nastajanje

aktivnega presnovka prve učinkovine;

vsaka uporabljena učinkovina mora imeti drugačen mehanizem delovanja in drugo

tarčo v maligni celici, tako se namreč poveča učinkovitost terapije in hkrati se

zmanjša verjetnost za pojav rezistence;

vsaka uporabljena učinkovina naj bi povzročala toksičnost na drugem mestu

(organu); vendar pa je pri citostatikih neizogibna toksičnost za tkiva s hitro

delečimi se celicami (5).


7

1.2 Mehanizmi toksičnosti doksorubicina in pojav radikalov

Kljub številnim študijam na celičnih kulturah in na ţivalih, toksični mehanizmi

doksorubicina na celice še vedno niso povsem pojasnjeni. Raziskan je mehanizem

interkeliranja planarnega aglikona učinkovine med sosednje bazne pare, kar spremeni

sposobnost delovanja encima topoizomeraze II. Topoizomeraza II je DNA giraza, ki je še

posebej izraţena v celicah v fazi delitve. DNA giraze so prvič odkrili leta 1976 v

bakterijskih celicah. Ugotovili so, da encim omogoča spreminjanje topološkega stanja

zaprtih dvoveriţnih DNA in ima tako ključno vlogo pri replikaciji DNA. Prehod med

različnimi topoizomeri molekule DNA je moţen le s cepitvijo ene ali obeh verig DNA. V

nadaljnjih raziskavah na celicah sesalcev so opisali dva glavna razreda encimov, in sicer

topoizomerazo I, ki cepi eno verigo dvovijačne DNA, in topoizomerazo II, ki izvede

cepitev na obeh verigah dvojne vijačnice hkrati. Doksorubicin deluje kot inhibitor

topoizomeraze II in je genotoksičen, saj povzroči poškodbe v DNA molekuli (6,9,10).

Slika 2: Oksidacijsko-redukcijske pretvorbe doksorubicina (11).

Antraciklinski antibiotiki, kamor sodi tudi doksorubicin, lahko zaradi vsebujoče

kinonske strukture sproţijo redukcijo molekularnega kisika O2, kar privede do nastanka

reaktivnih kisikovih spojin (RKS), ki poškodujejo proteine, nukleinske kisline in celične

lipidne membrane. Kinonski del deluje kot akceptor elektronov v reakcijah z encimi, kot

sta mitohondrijska NADH dehidrogenaza in citokrom P450 reduktaza. S pripajanjem

dodatnega elektrona dobimo semikinon. Semikinonska struktura je zelo reaktivna in hitro

preide nazaj v kinonsko obliko z redukcijo kisika v superoksidni anion O2˙- (Slika 2).

Vodikov peroksid H2O2 je produkt redukcije molekularnega kisika z dvema elektronoma in


8

je eden izmed najbolj stabilnih intermediatov pri redukciji O2˙-

v vodnih raztopinah

(11,12). Vodikov peroksid H2O2 vstopa v Haber – Weissovo reakcijo, pri kateri nastaja še

bolj nevaren hidroksilni radikal HO˙ (10,11). Kot katalizator v tej reakciji delujejo Fe2+

ioni, zato v bioloških sistemih to reakcijo bolje poznamo pod imenom Fentonova reakcija:

Fe2+

+ H2O2 → Fe3+

+ HO− + HO˙(12).

Doksorubicin lahko tvori komplekse z ţelezovim ionom Fe3+

v razmerju 3:1. Nastali

kompleks prav tako omogoča pretvorbo O2˙- in H2O2 do hidroksilnega radikala HO˙, ki je

zelo reaktiven in lahko reagira skoraj z vsako biološko molekulo. Vir ţeleza v celicah je

skladiščni protein feritin, v katerem se ţelezo nahaja v feri obliki (Fe3+

). Vendar je jasno,

da v celicah pravzaprav ni na voljo nevezanega ţeleza oziroma je ta količina izredno

majhna, kar pomeni moţnost, da mora biti z doksorubicinom povzročena apoptoza

povezana tudi s spremembo regulacije homeostaze ţeleza v celicah. In vitro študije kaţejo,

da izmenjavo elektronov in posledično nastanek semikinonske oblike doksorubicina in O2˙-

spremlja sproščanje ţeleza iz feritina. Superoksidni anion O2˙- je majhna molekula in lahko

s penetracijo prehaja v skladiščni protein za ţelezo. Ker ima O2˙- niţji redukcijski potencial

kot ţelezo v hidroksidni obliki (sterični in termodinamski vplivi), lahko izzove redukcijo

feri (Fe3+

) v fero (Fe2+

) obliko in sproščanje ţeleza iz feritina (Slika 3) (11).

Slika 3: Sproščanje železa iz feritina pod vplivom doksorubicina (11).

V novejših študijah je opisano, da antraciklinski antibiotiki verjetno posegajo v

regulacijo homeostaze ţeleza preko O2˙-, ki naj bi induciral post-translacijske modifikacije

feritina, kar sproţi redukcijo ţeleza Fe2+

in njegovo sproščanje. Še en opisan mehanizem

pa vključuje poseganje učinkovine v delovanje lizosomov in/ali proteasomov, ki

posredujejo razpad skladiščnega proteina za ţelezo (10,11).


9

Tudi sekundarni metabolit doksorubicinol izzove toksične učinke na celice (Shema 1).

Raziskano je, da tvori interakcije s katalitično [4Fe-4S] skupino regulatornega proteina za

ţelezo IRP-1, ki je v bistvu citoplazemska akonitaza. Akonitaza je encim, ki z aktivno

skupino [4Fe-4S] katalizira stereospecifično izomerizacijo citrata v izocitrat. Posledica te

interakcije je izguba atoma ţleza Fe2+

iz akonitaze, kar privede do zmanjšane aktivnosti

encima. Temu sledijo zapleteni mehanizmi, ki niso povezani samo z glavno aktivnostjo

encima, da omogoča pretvorbo citrata, ampak zajemajo še ekspresijo proteina feritina in

receptorjev za transferin (TfR), kar pogojuje natančno uravnavanje ravni ţeleza za potrebe

celic (10,11).

Shema 1: Toksičnost doksorubicina in zaščitni pristopi.

Glede na opisano aktivnost presnovka, je očitno, da je doksorubicinol precej bolj

toksičen od nastalega O2˙- oziroma H2O2, saj povzroči pospešeno oddajanje ţeleza iz 4Fe-

4S klastra. Prosto ţelezo bistveno prispeva k nastajanju radikalov v organizmu, kot so

reaktivne kisikove zvrsti (RKS). Radikalske reakcije vodijo do apoptoze celice preko

spodbujanja kompleksnih signalnih poti, ki vključujejo aktivacijo jedrnega dejavnika–κB

(NF–κB) in razgradnjo inhibitorne podenote IκBα (6,9,11).


10

V procesu programirane celične smrti ima vlogo tudi tumor supresorski gen p53.

Številne predklinične in klinične študije potrjujejo aktivacijo p53 pod vplivom

doksorubicina, vendar se pojavlja še nekaj negotovosti, kar lahko pripišemo različnim

dejavnikom kot so heterogenost tumorjev, uporaba metode za ocenjevanje statusa p53 in

odziv tumorja. Ni še povsem jasno, kakšno vlogo ima p53 v regulaciji celičnega cikla pri

celicah na katere delujemo z antraciklinskimi antibiotiki. Znano je, da z doksorubicinom

povzročena aktivacija p53 prispeva k indukciji proteina WAF1/CIP1 p21, ki je močan

zaviralec od ciklina odvisne kinaze p21 in sodeluje pri prehodu celičnega cikla iz G1 faze

v S fazo (11).

Najresnejša toksičnost, povezana z doksorubicinom je kardiotoksičnost. Poleg ţe prej

opisanih mehanizmov, ki vodijo k nastanku RKS, je dokumentiranih še nekaj drugih

razlogov za kardiotoksične učinke doksorubicina, kot sta hipoteza o preobremenitvi

miokarda s Ca2+

in hipoteza o metabolitih doksorubicina ter mitohondrijska disfunkcija

(6,7,9). Akutna kardiotoksičnost se lahko začne takoj po aplikaciji zdravila in se pokaţe

kot aritmija oziroma spremembe v EKG-ju. Kronična okvara se kaţe z znaki srčnega

popuščanja in je največkrat ireverzibilna. Srčno popuščanje se lahko razvije nenadoma v

času zdravljenja, pogosteje pa nekaj mesecev ali celo let po zdravljenju. Tveganje za

nastanek kardiomiopatije narašča z večanjem kumulativnega odmerka zdravila in je večje

pri bolnikih z ţe prisotno boleznijo srca, zato je pri teh bolnikih potrebno spremljati

funkcijo delovanja srca pred vsakim ciklom kemoterapije. Pri bolniku se mora nadzorovati

tudi krvna slika, saj doksorubicin zavira delovanje kostnega mozga. Neţeleni učinki, ki se

odraţajo na gastrointestinalnem traktu so slabost, bruhanje, mukozitis in diareja (6,8,9).

Doksorubicin se kot večina učinkovin presnavlja v jetrih. Toksičnost na jetra se kaţe v

povišanih vrednostih AST, ALT in bilirubina v plazmi. Na bioptu jeter so opisali ţarišče

infiltracije vnetnih celic in steatozo. Doksorubicin je toksičen tudi za ledvice in pljuča.

Mehanizem pulmotoksičnosti še ni pojasnjen, medtem ko so na temo o nefrotoksičnosti

doksorubicina ţe narejene določene raziskave. Študije na podganah kaţejo kronično

okvaro glomerulne funkcije. Nefropatija se kaţe kot huda proteinurija, ki nastane zaradi

nabrekanja in vakuolizacije epitelijskih celic. Z doksorubicinom povzročena okvara ledvic

je kronična in kontinuirana ter vodi v končno ledvično odpoved. Toksičnost povzročena

preko RKS je torej prisotna skoraj v vseh organih (6,9).


11

1.2.1 Toksičnost doksorubicina na nivoju testisov

Zdravljenje z doksorubicinom vpliva na kvaliteto in količino spermijev, kar je lahko

glavni vzrok za pojav neplodnosti pri bolnikih. Testi na podganah so pokazali padec v

številu še nezrelih moških spolnih celic spermatogonijev, morfološke nepravilnosti sperme

in spremembo v motiliteti spermijev. Doksorubicin sproţi večjo pojavnost apoptoze vseh

celic na različnih stopnjah cikla dozorevanja spolnih celic (spermatogoniji, spermatociti,

spermatide). Številne ugotovitve podpirajo hipotezo, da je z doksorubicinom povzročena

toksičnost posledica povečanega oksidativnega stresa zaradi nastanka RKS. Povečana

oksidativna poškodba membrane spermijev, proteinov in DNA, je povezana s spremembo

v mehanizmih signalov, ki lahko vplivajo na plodnost (13-16).

Ţe samo merjenje telesne mase in mase testisov pri samcih podgan vrste Wistar, je

pokazalo značilno zmanjšanje obeh parametrov, kar nakazuje na očitno poškodbo celic.

Glavni razlogi za spremembo v masi testisov naj bi bili v zmanjšanju števila epitelijskih

celic semenskih kanalov, morfoloških spremembah spolnih celic in kritičnemu upadu

števila spermatogonijev (Shema 2). To je najverjetnejša razlaga rezultata poskusa, ker so

testisi v osnovi zgrajeni iz zarodnega epitelija, ki ga sestavlja ogromno število zarodnih

celic v različnih fazah razvoja (13).

Shema 2: Različni pristopi za oceno poškodbe na nivoju testisov.

Zvišane vrednosti lipidnih peroksidov so posledica pospešenega nastanka RKS in

vodijo v poškodbe in funkcionalne motnje lipidnih membran in celičnih organelov v

testisih. Prahalathan C. in ostali (13) so po ţrtvovanju ţivali pripravili raztopino 10%

homogenata tkiva testisov v 0,01M Tris-HCl pufru (pH 7.4) in izmerili aktivnost encimov

SOD, CAT, GSH-Px in GR. V skupini ţivali, ki je dobila doksorubicin, so zabeleţili očiten

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prahalathan%20C%22%5BAuthor%5D


12

padec aktivnosti vseh merjenih encimov v primerjavi s kontrolno skupino. Zmanjšana

dejavnost encimov SOD, CAT in GSH-Px po aplikaciji doksorubicina pomeni manjšo

sposobnost celic za zaščito pred radikali in nevtralizacijo H2O2. GR ima pomembno vlogo

v redukciji GSSG do GSH in njegova nezadostna aktivnost pomeni upad količine GSH, ki

je nepogrešljiv pri odpravljanju RKS. Zaradi spremembe razmerja med GSSG in GSH

tkivo testisov nima več zadostnega antioksidativnega statusa in je bolj dovzetno za

oksidativne poškodbe, ki lahko pripeljejo do apoptoze še posebno občutljivih zarodnih

celic (13).

Toksične učinke doksorubicina in potencialno zaščito s standardiziranim izvlečkom

rastline Ginkgo biloba na nivoju testisov pri podganah Sprague-Dawley so z uporabo več

metod dobro označili tudi Yeh YC. in sodelavci (15). Ţivali, ki so bile tretirane izključno z

doksorubicinom, so dosegle manjšo celotno telesno maso kot kontrolna skupina. Tudi

sama masa testisov je bila v prvi skupini manjša. Poleg tega so v tej skupini zabeleţili višje

vrednosti MDA ter niţjo aktivnost SOD in GSH-Px, kar kaţe na močan pro-oksidativni

vpliv doksorubicina na tkivo testisov. Raziskovalna skupina Yeh YC. (15) je ugotavljala še

pojav apoptoze celic s TUNEL (ang. »terminal deoxynucleotidyl transferase nick-end

labelling«) in z metodo pretočne citometrije. TUNEL je metoda merjenja fragmentacije

DNA na nivoju posameznih celic. Fragmentacija DNA je namreč ključni dogodek pri

celični apoptozi, zato lahko tako določimo odstotek celic testisov, ki so v fazi apoptoze

(15,17). Pretočna citometrija pa je močno orodje za razlikovanje zarodnih celic na

posameznih stopnjah delitve in omogoča vrednotenje sprememb prevladujočih celic

testisov po uporabi zdravila (15). V tej raziskavi so potrdili večjo stopnjo apoptoze celic, ki

so bile tretirane izključno z doksorubicinom. Z imunološko metodo za detekcijo proteinov

(Western blot) in imunofluorescenčo mikroskopijo so Yeh YC. in ostali (15) raziskovali

tudi signalizacijske poti v procesu programirane celične smrti in potrdili povečano

ekspresijo pro-apoptotičnih faktorjev (Bax, Bad) ter manjše izraţanje anti-apoptotičnih

proteinov (Bcl-2, Bcl-xL). Pomen teh proteinov, vključno s citokromom C in kaspazo 3, v

apoptozi povzročeni z doksorubicinom so pred tem ugotavljali na spolno dozorelih miših

moškega spola (18).

Te študije so neizpodbiten dokaz, da doksorubicin lahko resno poškoduje tkivo testisov

in znatno vpliva na spermatogenezo. Oksidativni stres ima torej ključno vlogo v poškodbi

zarodnih celic in tako pripelje do apoptoze, ki pa lahko vodi celo v neplodnost, kar je še

posebej problematično pri mlajših pacientih.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yeh%20YC%22%5BAuthor%5D




13

1.3 Različni pristopi za zaščito pred toksičnostjo povzročeno z doksorubicinom

Ker ima ta antraciklinski antibiotik izreden pomen v terapiji malignih obolenj, so

raziskave usmerjene v iskanje potencialnih načinov za preprečevanje oziroma zmanjšanje

njegovih neţelenih učinkov. Predlagani so bili ţe različni pristopi, kot je optimizacija

odmerka, sinteza in uporaba različnih analogov doksorubicina in uporaba kombinirane

terapije. Ţelenih rezultatov pri zmanjšanju neţelenih učinkov niso dosegli, prav tako

uporaba različnih analogov doksorubicina ni pokazala ne manjše toksičnosti, kot tudi ne

boljšega antineoplastičnega učinka (6,9).

Temeljni mehanizem toksičnosti doksorubicina je povezan z nastankom radikalov, zato

je na nivoju uravnavanja antioksidativnega statusa smiselna uporaba naravnih

antioksidantov. Spojine, ki so največkrat uporabljene in tudi najbolj raziskane, so naravni

antioksidanti, in sicer vitamini (C, E, A in karotenoidi), koencim Q, flavonoidi, polifenoli,

deviško oljčno olje, antioksidanti rastlinskega izvora ter selen. V preglednici 3 so

predstavljene nekatere izmed mnogih študij z drugimi naravnimi produkti, ki so bile

izvedene z namenom zaščite organov pred toksičnostjo povzročeno z doksorubicinom

(6,15,19,20).

Preglednica 3: Naravni produkti kot možna zaščita organov pred toksičnostjo doksorubicina (6).

Naravni produkt Odmerek nar. pr. Odmerek doks. Uporabljen model Rezultati

kombinacija

vitamina C + E

250 mg/kg + 400

IU/kg na dan 30

dni p.o.

15 mg/kg i.p.

v enkratnem

odmerku

In vivo – samci podgan

Wistar

kardioprotektivnost

flavonoidi

različne

koncentracije

2 mg/mL In vitro – celična linija

kardiomiocitov,

kardiomioblastov in

vzorci človeških jeter

kardioprotektivnost

hepatoprotektivnost

likopen

4 mg/kg p.o.

1.) enkrat dnevno

10 dni pred doks.

2.) 2 dni pred in 3

dni po doks.

10 mg/kg i.p. v

enkratnem

odmerku


Sprague-Dawley

kardioprotektivnost

nefroprotektivnost

aminokislina

cistationin

10 mg/kg i.p. v

enkratnem

odmerku

5 mg/kg i.p. v

enkratnem

odmerku

In vivo – samci miši

Swiss albino

hepatoprotektivnost

propolis

100 mg/kg/dan

p.o. 4 dni zapored

20 mg/kg i.p. v

enkratnem

odmerku

In vivo – samice

podgan Wistar

kardioprotektivnost

hepatoprotektivnost

Ginkgo biloba

(standardizirani

izvleček)

5 mg/kg i.p. na

2 dni po odmerku

doks., 3 odmerki

3 mg/kg i.p. na

2 dni, 3 odmerki


Sprague-Dawley

zaščita testisov

Allium sativum

(standardizirani

izvleček)

250 mg/kg p.o. na

dan 28 dni

25 mg/kg i.p. v

enem odmerku

27. dan


Wistar

kardioprotektivnost


14

Na osnovi zaključkov izbranih preiskav (Preglednica 4) lahko trdimo, da nekatere

znane in dobro uveljavljene zdravilne učinkovine, kot tudi nove in potencialne učinkovine

izkazujejo pomembno zaščitno vlogo v terapiji z doksorubicinom (6,11,16,18).

Preglednica 4: Primeri znanih in potencialnih učinkovin v zaščitni vlogi pred doksorubicinom (6).

Učinkovina Odmerek uč. Odmerek doks. Uporabljen model Rezultati

amifostin 400 mg/kg i.p. 15 min

pred doks.

5 mg/kg i.p. v

enem odmerku

In vivo – samci

podgan Wistar

zaščita testisov

deksrazoksan 30 in 60

mg/kg/dan i.p.

30 min pred doks., 6 dni

3 mg/kg/dan i.p.

6 dni

In vivo – samci

podgan

Sprague-Dawley

kardioprotektivnost

doksiciklin 2.5 mg/kg/dan i.p.

vsak drugi dan,

3 odmerki

3 mg/kg/dan

i.p. vsak drugi dan,

3 odmerki

In vivo – samci

miši ICR

zaščita testisov

morfin 10 mg/kg i.p. 4x

tedensko 4 tedne

30 min pred doks.

1,25 mg/kg i.p.

4x tedensko 4

tedne

In vivo – samci

podgan

Sprague-Dawley

kardioprotektivnost

Amifostin je organski fosforiliran tiol, ki se po defosforilaciji z membranskimi

alkalnimi fosfatazami pretvori v aktivno obliko. Njegova koncentracija je še posebno

visoka v zdravih tkivih, kar omogoča selektivno zaščito normalnih celic brez vpliva na

protitumorsko učinkovitost doksorubicina (6,16).

Na različnih ţivalskih modelih (miši, psi, prašiči) je bilo dokazano, da deksrazoksan

dobro omejuje z antraciklinskimi antibiotiki povzročene poškodbe na mitotično aktivnih

tkivih (kostni mozeg, testisi, epitelij gastrointestinalnega trakta) in zmanjšuje pojavnost

akutne in kronične kardiotoksičnosti (11). Deksrazoksan je v Evropi in ZDA registriran kot

zdravilo za preprečevanje ekstravazacijske škode povzročene z antraciklini (6).

Doksiciklin je tetraciklinski antibiotik z močnim protivnetnim delovanjem. Njegovo

zaščitno vlogo pred z doksorubicinom povzročenim oksidativnim stresom in apoptozo so

opazili v in vivo študiji na mišjih testisih (18).

V eni od raziskav so ugotavljali morebitne zaščitne učinke morfina na kardiotoksičnost

izzvano z doksorubicinom. Kljub spodbudnim rezultatom, je zaradi narkotičnih učinkov

uporaba morfina vprašljiva, saj so na voljo še nekatere druge učinkovine kot so nebivolol,

amlodipin in eritropoetin, ki prav tako izkazujejo kardioprotektivnost in imajo manj

neţelenih učinkov (6). Izredno obetaven pristop za povečanje učinkovitosti in zmanjšanje

stranskih učinkov doksorubicina so novi dostavni sistemi, kot so nanodelci, liposomi in

sistemi za tarčno zdravljenje raka. Te nove oblike tehnologij so zelo drage in zapletene,

vendar izredno pomembne pri terapiji rakavih obolenj (6).


15

1.4 Fulerenol

1.4.1 Fulereni

Fulereni so nova skupina ogljikovih spojin, in sicer predstavljajo tretjo alotropsko

modifikacijo ogljika. Leta 1985 je bila odkrita struktura fulerena C60, ki je sestavljen iz

šest-členskih in pet-členskih obročev ogljika. Poimenovali so ga buckminsterfulleren

oziroma buckyball po arhitektu Richardu Buckminsterju Fullerju, ki je v svojem projektu v

konstrukcijo kupole Geodezijskega doma v Montrealu leta 1967 vključil heksagonske in

pentagonske strukture. Za odkritje in razrešitev strukture molekule C60 je bila leta 1996

podeljena Nobelova nagrada za področje kemije, ki so jo prejeli raziskovalci Harold W.

Kroto, Robert F. Curl in Richard E. Smalley. Tako so se znanima strukturama grafita in

diamanta pridruţile nove kristalne oblike ogljika, ki so sestavljene iz ogljikovih atomov

zdruţenih v sferične grozde (C60), elipsoide (C70) ali pa so v obliki cevi (Slika 4) (2,21-23).

V naravi so našli le manjše količine fulerenov. Krätschmer s sodelavci je bil prvi, ki je

leta 1990 razvil postopek za pridobivanje fulerenov v gramskih količinah, kar je povzročilo

hiter razvoj tridimenzionalne kemije polifunkcionalnih sferičnih ogljikovih molekul in

nanocevk, ki so postale sinonim za nanotehnologijo. Krätschmer je uporabil tehniko

sublimiranja ogljika z iskrenjem grafitnih elektrod, ki mu sledi kondenzacija ogljikovih par

v kubično strukturo. Pri tem je dobil črne kristale z značilnim IR spektrom in intenzivno

absorpcijo v UV območju. Bil je tudi med prvimi, ki so poskušali ugotoviti strukturo trdnih

C60 z uporabo praškovne rentgenske analize (ang. »powder X-ray diffraction«) (22,23).

Slika 4: Različne strukturne oblike fulerenov (22).


16

Osnovno strukturo fulerenov lahko opišemo s številom ogljikovih atomov, ki je

2×(10+M), M ≥ 0, in vsebuje konstantno število 12 pentagonov. Prvi visoko stabilni

fuleren je homolog C60, ki ima simetrijo prisekanega ikozaedra. Kristalna struktura C60 je

izredno slabo stisljiva, saj ogljikove atome v molekuli med seboj povezujejo zelo močne

vezi. Visoka stopnja simetrije C60 pomeni, da so si ogljikovi atomi v strukturi enakovredni,

kar potrjuje NMR spekter, ki pokaţe samo en pik (2,22).

Najstabilnejša molekula fulerena C60 je sestavljena iz 20 heksagonov in 12 pentagonov,

ki zmanjšajo napetost molekule. Čeprav so vsi ogljikovi atomi v strukturi ekvivalentni, pa

vezi, ki povezujejo tri sosednje C atome, niso povsem enake, ker je med dvema šest-

členskima obročema dvojna vez, medtem ko sta na stranici, ki povezuje peterokotnik in

šesterokotnik, dve enojni vezi. Tako dobimo zaključeno okroglo obliko iz konveksnih

pentagonov, ki povzročijo zakrivljenost, in heksagonov okrog njih, ki sestavljajo planarne

površine (22,23).

Fulereni so izredno hidrofobne molekule, dobro topne v organskih topilih, vendar slabo

topne v polarnih topilih, kar omejuje njihovo biološko uporabnost. Za izboljšanje topnosti

v vodi so uporabili ţe številne pristope, in sicer dodajanje površinsko aktivnih snovi,

intenzivno in dolgoročno mešanje v vodi ter vključevanje v vodotopne komplekse, kot so

ciklodekstrini. Poleg tega so pripravili ţe liposome s fulerenom, kot tudi foto-aktivne

oblike C60, vendar vsi ti postopki povzročijo nastanek v vodi stabilnih agregatov, kar pa

lahko pomembno vpliva na absorpcijo, kot tudi na aktivnost molekule C60 (21).

Agregati fulerena C60 so v poskusih na človeških celicah pokazali veliko toksičnost, ki

temelji na nastanku izredno reaktivnega singletnega kisika (1O2) in superoksidnih radikalov

(O2˙-) pod vplivom UV/VIS ţarkov. Singletni kisik nastaja fotokemično in tudi v nekaterih

kemijskih reakcijah iz tripletnega kisika (3O2). Temu sledi tvorba hidroperoksilnega

radikala HOO˙ in vodikovega peroksida H2O2 (Slika 5). Singletni kisik (

1O2) lahko v

izredno kratkem časovnem obdobju reagira z večino organskih spojin v celici. Končni

rezultat delovanja RKS je poškodba celične membrane in fragmentacija DNA (2,22).

Slika 5: Fotoekscitacije molekule C60 ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti (2).


17

1.4.2 Fulerenoli in drugi biološko aktivni fulereni

Med citotoksičnostjo in antioksidativnim delovanjem fulerenov je torej izredno ozka

meja, zato so z modifikacijo molekule C60 iskali nove derivate, ki bi bili manj toksični in

bolje topni v vodi. Zelo obetavno so se tako v in vitro, kot tudi in vivo študijah, izkazali

polihidroksilirani derivati C60-fulerenoli (C60(OH)n, n = 2-28), ki so pokazali visoko

antioksidativno aktivnost in izrazito manjšo toksičnost (2,22,24).

Toksičnost fulerena C60 za celice ni samo posledica tvorbe RKS, ampak je moţen

razlog tudi vezava molekule C60 in njenih derivatov na DNA, kar dokazujejo nastali

agregati med molekulo DNA in fulerenom v pufrski raztopini. Z uvedbo določenih

funkcionalnih skupin v molekulo fulerena so dobili nove strukture fulerenov, ki bi jih

zaradi neposrednega delovanja na DNA, lahko uporabili pri genski terapiji (2,25).

Z vezavo polarnih funkcionalnih skupin (-OH, -COOH, -NH2) na lipofilno molekulo

C60 dobimo v vodi topne derivate, ki so novi potencialni kandidati za biološko uporabo v

zvezi z zaščito celic, inhibicijo določenih encimov, antimikrobnim delovanjem,

zdravljenjem raka, kot tudi za diagnostiko v medicini. Če na molekulo fulerena uvedemo

OH skupine, nastanejo polihidroksilirane strukture, katerih elektronske lastnosti in

reaktivnost so močno odvisne od števila in poloţaja hidroksilnih skupin na osnovni rešetki.

Kemijske lastnosti lahko pomembno vplivajo na biološko aktivnost fulerenolov. Temeljni

mehanizem njihovega antioksidativnega učinka je povezan s katalitičnim delovanjem v

končni stopnji radikalskih reakcij, natančneje na radikalsko-adicijskih reakcijah

hidroksilnega radikala na dvojne vezi molekule fulerenola (2,21,22)

Slika 6: Strukturi C3 in D3 izomerov heksakarboksilnih derivatov fulerena C60 (2).

Za C3-karboksifulerene (tris in bis derivati; slika 6) je znana antioksidativna vloga v

dopaminergičnih delih moţganov, kar razširja moţnosti uporabe vodotopnih derivatov

fulerena v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova


18

bolezen. Dokazali so, da z injiciranjem fulerenovega derivata dimalonske kisline

zmanjšamo nastale poškodbe na dopaminskih receptorjih, ki so posledica oksidativnega

stresa zaradi dodatnega vnosa ţeleza v intrastrialni del bazalnih ganglijev. Opisano je tudi,

da lahko zaradi delnega vgrajevanja karboksifulerenov v membrano mitohondrijev,

preprečijo celično smrt, kar potrjuje zaščitne učinke na periferne krvne mononuklearne

celice. Lastnosti karboksifulerenov, ki delujejo kot lovilci radikalov, so proučevali v

različnih študijah z namenom, da bi preprečili celično smrt več vrst celic; ţivčne, jetrne,

epitelijske. Inhibitorni učinek fulerenovega derivata dimalonske kisline na relaksacijo aorte

kunca, ki je posledica vazodilatatornega delovanje dušikovega oksida (NO), so pojasnili z

nastankom superoksida in posledično nevtralizacijo dušikovega oksida (NO) s

superoksidnim anionom. Ta učinek je ob prisotnosti encima superoksid-dizmutaze prikrit.

Poleg tega pa so C3-karboksifulereni dobri blokatorji virusne replikacije in vplivajo tudi na

vzdrţevanje ionske homeostaze v celicah (2,22).

1.4.3 Lastnosti in sinteza fulerenola C60(OH)24

Fulerenol C60(OH)24 (Slika 7) je v vodi teţko do

zmerno topen derivat molekule C60 z izboljšanimi

kemijskimi lastnostmi in potencialno biološko uporabo

kot lovilec radikalov, ki so posledica nastalega

oksidativnega stresa pod vplivom ksenobiotikov in

radioaktivnega sevanja. Zaradi slabe topnosti v vodi (44

mg/mL) je v raztopino za parenteralno aplikacijo

potrebno dodati površinsko aktivno snov ali sotopilo (21).

Sinteza spojine C60(OH)24 poteka na osnovi popolne substitucije iz polibromiranega

derivata C60Br24 v alkalnem mediju (NaOH, pH=10) (2,21,24). 150 mg C60Br24 pomešamo

s 5 mL 0,1 M NaOH in nato ob sprotnem mešanju 30 minut pri sobni temperaturi z

dodajanjem 0,1 M HCl zniţujemo pH do 4,5.

H2O

Reakcija: C60Br24 + 24 NaOH ────► C60(OH)24 + 24 NaBr

Dobljeno reakcijsko zmes nato pod zniţanim tlakom pri 40 °C uparimo do suhega. Sledi

spiranje s trikrat po 25 mL metanola in dvakrat s 25 mL vodne raztopine etanola (1:1, v/v).

Na koncu fulerenol speremo še s 50 mL prečiščene vode in sušimo pri 50 °C. Kljub temu,

Slika 7: Struktura C60(OH)24 (22).


19

da postopek sinteze ni zahteven, pa je pridobivanje produkta s stopnjo čistosti nad 95

odstotkov izredno teţavno (2).

Fulerenol C60(OH)24 je higroskopen prašek, rjave barve in je stabilen pri dnevni svetlobi

na sobni temperaturi. Odporen je tudi na visoke temperature: po 24 urah pri 150 °C več kot

80 odstotkov spojine ostane nespremenjene. V alkalnem se nahaja v ionizirani obliki

(C60(OH)24-n (ONa)n), v kislem pa je stabilen. Vodna raztopina je rjave barve in v UV/VIS

spektru ne daje značilnih vrhov (2).

1.5 Potencialna terapevtska uporaba fulerenola C60(OH)24

Da bi lahko ocenili moţnosti biološke uporabe fulerenola v in vivo sistemih, je potrebno

poznati njegovo farmakokinetiko. Ena od metod za ugotavljanje vpliva organizma na

molekulo fulerenola je radioaktivno označevanje snovi. Preučevanje distribucije fulerenola

na miših in kuncih je pokazalo, da se 99m

Tc-C60(OH)x porazdeljuje v vsa tkiva, razen

moţganov. Rezultati v času 48 ur so pokazali zadrţevanje velikega deleţa aktivne oblike v

organizmu, še posebej izrazito je bilo kopičenje v ledvicah, kosteh, vranici in jetrih

(21,22). Podobne študije, ki so bile izvedene še na modelu psa v času 24 ur, so prav tako

potrdile, da se je radioaktivno označen fulerenol 99m

Tc[CO3(H2O)]+3

v prvih urah

akumuliral v jetrih, vranici in srcu. Po 4 urah je bila zabeleţena njegova prisotnost v

črevesju in ţlezah slinavkah, 21. uro po aplikaciji je bila spojina zaznana v vranici, jetrih,

ţlezah slinavkah in ledvicah, vendar ne več v tankem črevesju (22).

V molekuli fulerenola C60(OH)24 so najbolj reaktivne dvojne vezi. Prisotni reaktivni

radikali v biološkem sistemu, se po vnosu fulerenola veţejo na njegovo površino, vendar

nastala vez ni kovalentna. Prvi moţni mehanizem temelji na radikalski adiciji

hidroksilnega radikala (HO˙)2n na dvojne vezi fulerenolovega ogrodja do produkta

C60(OH)24 + (HO˙)2n (n = 1-12). Druga moţnost pa je, da fulerenol odda svoj vodik

hidroksilnemu radikalu HO˙, pri čemer nastane stabilni radikal C60(OH)23O˙ (2,22).

Pri nizkih koncentracijah C60(OH)24 torej deluje kot antioksidant, medtem ko imajo

višje koncentracije ţe prooksidativno delovanje, kar bi potencialno lahko izkoristili za

protibakterijske učinke in citotoksično terapijo rakavih celic (21,22). Zaradi zelo dobre

distribucije v skoraj vsa tkiva bi spojino C60(OH)24 torej lahko uporabili tudi pri

zdravljenju raka, za antioksidativno zaščito različnih organov zaradi oksidativnega stresa

(srca, ledvic, pljuč) in kot radioprotektor (21,22).


20

Antiproliferativno aktivnost fulerenola C60(OH)24 so ugotovili v in vitro raziskavah s

človeškimi in z ţivalskimi celicami različnih linij (adenokarcinoma dojk, Burkitovega

limfoma, eritrolevkemije, fibroblastoma pri miših, nefrona hrčka). Molekula C60(OH)24 v

nanomolskih koncentracijah ţe v prvih 48 urah zavira rast navedenih tumorskih celičnih

linij, z izjemo Burkitovega limfoma, ki kaţe zelo nizko stopnjo inhibicije (2).

Na celicah človeške eritrolevkemije K-562, obdelanih s fulerenolom C60(OH)24, so v še

eni raziskavi proučevali sposobnost sinteze DNA, mitotsko aktivnost in celični cikel.

Sintezna in mitotska faza celičnega cikla je bila ocenjena na osnovi mitotskega in

proliferacijskega indeksa. Mitotski indeks celic (MI = [število celic v mitozi] / [skupno

število celic]), ki so bile tretirane s fulerenolom, je bil manjši kot pri kontrolni skupini. To

potrjuje hipotezo, da molekula C60(OH)24 inhibira tvorbo delitvenega vretena in

mikrotubulov, in sicer ne glede na čas inkubacije s fulerenolom. Zaradi vpliva C60(OH)24

pride do sprememb celičnega cikla celic humane eritrolevkemije K-562, poleg tega ima

C60(OH)24 večjo citostatično kot citotoksično aktivnost, kar kaţe visoka stopnja preţivelih

celic, ki so bile obdelane s fulerenolom (2).

Fulerenol v koncentracijah od 1 do 103 μg/mL v in vitro razmerah na človeških

limfocitih periferne krvi ni pokazal genotoksičnosti. V preliminarnih in vivo raziskavah na

miših je bila pri odmerku 100 mg/kg (intraperitonealno, pred obsevanjem) dokazana

zadovoljiva radioprotekcija (2).

1.5.1 Fulerenol C60(OH)24 kot antioksidant

V mnogih patoloških stanjih je oksidativni stres glavni krivec za oksidativne poškodbe

celic. V takem primeru lahko pride do depolarizacije mitohondrijev, čemur sledi

sproščanje proapoptotičnih molekul kot je citokrom C, posledično pride do aktivacije

kaspaz in na koncu do apoptoze. Polihidroksilirani derivati C60 imajo citoprotektivne

antioksidativne učinke, ker se lahko veţejo na mitohondrije. Poleg tega so raziskovali še en

mehanizem delovanja derivatov C60, in sicer sposobnost lovljenja dušikovega oksida (21).

Kot donor NO so uporabili natrijev nitroprusid (Na2[Fe(CN)5NO]) in ugotovili, da je bila

redukcija nitrita v raztopinah odvisna od odmerka C60(OH)24 (2).

Na gladkomišičnem tkivu miši so naredili primerjalno analizo antioksidativnih učinkov

fulerenola in vitamina C. Fulerenol se je na dveh celičnih linijah izkazal kot bolj učinkovit.

Določena je bila tudi akutna toksičnost fulerenola na modelu miši po intraperitonealnem

vnosu in znaša LD50 = 1,2 g/kg (2).


21

2 NAMEN DELA

Zaradi negativnih vplivov na večino organov v telesu mora biti terapevtska uporaba

antraciklinskih antibiotikov skrbno nadzorovana. Oksidativni stres pomembno vpliva na

patogenezo z doksorubicinom povzročeno toksičnost na nivoju testisov. Namen raziskave

je proučiti potencialne protektivne vplive antioksidanta fulerenola C60(OH)24 na osnovi

kronične poškodbe testisov, povzročene z doksorubicinom. V časovnem obdobju treh

tednov smo proučevali učinke fulerenola C60(OH)24 v odmerkih 25, 50 in 100 mg/kg/teden

na tkivo testisov podgan s kolorektalnim rakom, ki smo ga povzročili kemijsko z aplikacijo

DMH-ja (1,2-dimetilhidrazina). Uporabili smo in vivo model na samcih podgan vrste

Wistar in ugotavljali, ali je fulerenol sposoben preprečiti z doksorubicinom (1,5

mg/kg/teden v obdobju treh tednov) povzročene kronične poškodbe na testisih. Učinke

smo primerjali z učinki dobro poznanega antioksidanta vitamina C (100 mg/kg/teden v

obdobju treh tednov).


22

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Priprava in aplikacija C60(OH)24, doksorubicina in vitamina C

Raztopina fulerenola C60(OH)24 (Novi Sad, Srbija) je bila pripravljena neposredno pred

uporabo v aseptičnih pogojih v LAF (ang. »laminar air flow«) komori, in sicer so

C60(OH)24 raztopili v sterilizirani in apirogeni raztopini NaCl (0,9%) : DMSO (80 : 20;

m/m), oboje v koncentraciji 10 mg/mL (Slika 8). Proizvajalec pri raziskavi uporabljenega

doksorubicina (Adriablastina®

) za i.v. (intravensko) uporabo je Pharmacia & Upjohn

(Milano, Italija). Raztopino za i.p. (intraperitonealno) aplikacijo so prav tako tik pred

uporabo raztopili v sterilizirani in apirogeni 0,9% raztopini NaCl (2 mg/mL) v komori z

laminarnim tokom zraka (LAF). Vitamin C®, proizvajalca Galenika a.d. (Beograd –

Zemun, Srbija), v 5 mL ampulah, ki vsebujejo po 500 mg L-askorbinske kisline na ampulo,

so raztopili v vodi za injekcije.

Slika 8: Fulerenol C60(OH)24: makroskopski izgled (kristalna oblika); raztopljen v fiziološki

raztopini (optični mikroskop, veliko število agregatov fulerenola z velikostjo 50 – 100 μm),

raztopljen v raztopini DMSO / 0,9% NaCl (optični mikroskop, nekaj agregatov fulerenola; velikosti

< 20 μm); vrstična elektronska mikroskopija SEM (ang. »scanning electron microscope«);

porazdelitev velikosti delcev (Malvern metoda); strukturna shema (26).

Poskusi so bili izvedeni na samcih podgan vrste Wistar (Medicinski eksperimentalni

center, Ljubljana, Slovenija), starih 7 tednov in nameščenih po 3 ali 4 na kletko pri sobni


23

temperaturi 22-23 °C, vlaţnosti 55 ± 10% in 12 urnem ciklu svetloba/tema. Ţivali so imele

prost dostop do standardne laboratorijske prehrane (Altromin, Nemčija) in vode. Vse

poskuse je odobrila Etična komisija za poskuse na ţivalih Republike Slovenije (številka

dokumenta 34401-61/2007/7). Študije so bile izvedene v skladu z Evropsko konvencijo za

zaščito vretenčarjev (ang. »European Convention for the protection of vertebrate

animals«), ki se uporabljajo za poskusne in druge znanstvene namene (ETS 123).

Ţivali so bile naključno razdeljene v devet skupin (po 10 na skupino), kot sledi:

1) Kontrolna zdrava skupina – podgane, ki so enkrat na teden prejele fiziološko

raztopino 0,9 % NaCl;

2) Kontrolna skupina s kemijsko povzročenim rakom – podgane, ki so prejele

DMH, obdelan s fiziološko raztopino 0,9 % NaCl/DMSO (80/20; m/m, na teden);

3) Dox skupina – podgane, ki so prejele DMH in doksorubicin 1,5 mg/kg/teden;

4) Frl/Dox skupina – podgane, ki so prejele DMH in fulerenol 100 mg/kg/teden 30

minut pred doksorubicinom 1,5 mg/kg/teden;





7) Vitamin C/Dox skupina – podgane, ki prejele DMH in vitamin C 100

mg/kg/teden 30 minut pred doksorubicinom 1,5 mg/kg/teden;

8) Frl skupina – podgane, ki so prejele DMH in fulerenol 100 mg/kg/teden;

9) Vitamin C skupina – podgane, ki so prejele DMH in vitamin C 100 mg/kg/teden.

Vsem 80 podganam (razen kontrolne zdrave skupine) je bil enkrat na teden v obdobju

15 tednov i.p. (intraperitonealno) apliciran DMH (1,2-dimetilhidrazin) (Slika 9).

Slika 9: Eksperimentalni protokol (26).


24

Pri 24., 25. in 26. tednu starosti so bile podgane tretirane z doksorubicinom (1,5 mg/kg),

fulerenolom (25, 50, 100 mg/kg), in/ali vitaminom C (100 mg/kg). Odmerki fulerenola

C60(OH)24 so bili izbrani glede na predhodne študije na zdravih odraslih podganah vrste

Wistar in nadaljnjih raziskavah akutne toksičnosti, povzročene z doksorubicinom, na

modelu raka dojk pri podganah (26). Sedem dni po zadnji aplikaciji (v 27. tednu starosti)

so podgane ţrtvovali z uporabo CO2. Odstotek preţivetja poskusnih ţivali do konca

poskusa je bil 100%.

3.2 Kemijska povzročitev kolorektalnih tumorjev

Kolorektalni rak je bil povzročen z DMH-jem (Fluka Chemie, Švica), ki se pripravlja po

standardni metodi, pri kateri se DMH raztopi v 0,001 M EDTA, čemur sledi uravnavanje

pH vrednosti na 6,8 z 0,1 M raztopino NaOH. Pred uporabo se vedno pripravi sveţo

raztopino. Med obdukcijo ţivali je bilo odstranjeno črevesje, vzdolţno odprto, očiščeno s

tekočo vodo in fiksirano v 10 % pufranem formalinu.

Slika 10: Usmrtitev živali, priprava na obdukcijo

Temu je sledil makroskopski pregled na prisotnost tumorjev. Vzdolţno prerezano

debelo črevo je bilo poslano na histološki pregled celotnega tkiva za makroskopsko vidne


25

poškodbe. Vsi vzorci tkiv so bili shranjeni v parafinu in obarvani z kromovim barvilom

Kreyberg-Jareg.

3.3 Koeficient mase testisov in svetlobna mikroskopija tkiva

Koeficient tkiva testisov glede na telesno maso smo izračunali kot razmerje med tkivom

organa (mokra masa v mg) glede na telesno maso (g). Med obdukcijo so bili testisi izrezani

in stehtani. Vzorci vsakega testisa, kot tudi vse makroskopske spremembe so bile določene

v 10% pufranem formalinu za histološko analizo. Vsi vzorci tkiv, razrezani v serijah na

debelino 4 µm, so bili hranjeni v parafinu in obarvani z barvilom Haematoxylin-Eosin

(H&E) in nato slepo ocenjeni brez predhodnega poznavanja obravnavanega statusa ţivali.

3.4 Ocena protektivnih učinkov C60(OH)24 na tkivo testisov

Kri za analizo po prvem in drugem tednu po aplikaciji agensov je bila odvzeta iz

orbitalnega venskega sinusa. Po ţrtvovanju pa s punkcijo srca po torakotomiji. V krvi so

bili določeni hematološki parametri: levkociti, eritrociti, hemoglobin (Hbg), hematokrit

(HCT) in retikulociti. Za analizo aktivnosti encimov LDH in α-HBDH smo uporabili

serum. Test za določanje LDH smo izvedli s komercialnimi reagenti in v skladu z navodili

Chema Diagnostica (Jesi, Italija). Tudi za določitev ravni encima α-HBDH smo uporabili

komercialne reagente, in sicer Dialab (Dunaj, Avstrija). Rezultate za LDH in α-HBDH

smo podali v U/L (27).

Slika 11: Odvzem krvi in odstranitev organov.

Vsak organ je bil hitro odstranjen iz ţrtvovane podgane in postavljen v ledeno hladno

raztopino. Maščobno tkivo je bilo obrezano. Na koncu smo razkosano tkivo testisov

homogenizirali v raztopini Tris-buffer (pH 7,4; organ/pufer = 1/10; m/m) in razdeli na dva

dela. Prvi del smo uporabili za določitev MDA, drugega pa smo centrifugirali pri 13.000×g


26

20 minut pri 4 °C (hladilnik Beckman, Ultracentrifuga). Supernatant smo nato uporabili za

merjenje skupne koncentracije proteinov (TP), GSH, GSSG, GSH-Px, GR, SOD, CAT,

LDH in α-HBDH. Vse analize so bile izvedene v skladu z ţe prej uporabljenimi protokoli

(27).

Proste koncentracije GSH in GSSG v mg/L smo izmerili s komercialnim kompletom za

HPLC analizo Chromsystems Diagnostic (München, Nemčija). Iz dobljenih rezultatov smo

izračunali razmerje koncentracij GSH/GSSG. Delali smo na sistemu HPLC Agilent HP

model 1100, opremljenim z avtomatskim vzorčevalcem in fluorescenčnim detektorjem

(Waldbronn, Nemčija). Za določitev ravni SOD, GSH-Px, GR in TP smo uporabili

naslednje komercialne reagente: Randox komercialni sistemi (Crumlin, Velika Britanija),

in sicer Ransod kit za SOD, Ransel kit za GSH-Px in GR, nato pa še Sentinel Diagnostic

sisteme (Milano, Italija) za merjenje skupne koncentracije proteinov (TP).

Aktivnost katalaze (CAT) v tkivnem homogenizatu smo določili v skladu z Aebi (27)

metodo, v kateri H2O2 reagira s celičnim lizatom. Začetno stopnjo porabe H2O2 (0 – 60 s)

smo izmerili spektrofotometrično pri valovni dolţini 240 nm. Vrednosti za SOD in CAT

smo podali v U/mg celokupnih proteinov TP, vrednosti za GSH-Px in GR pa v U/g

celokupnih proteinov TP (27).

Koncentracijo MDA smo določili na osnovi tvorbe kompleksa MDA-tiobarbiturna

kislina (MDA-TBA), ki ga dobimo po reakciji MDA s tiobarbiturno kislino pri nizkem pH

in pri povišani temperaturi (28). Raven tkivne TBARS (ang. »Thiobarbituric acid reactive

substance«) v µg/L smo merili s HPLC metodo s komercialnim kompletom Chromsystems

Diagnostic (München, Nemčija).

3.5 Statistična analiza

Vrednosti so izraţene kot srednja vrednost ± standardni odklon (SD). ANOVA, ki mu

sledi LSD Post Hoc test (SPSS 15.0 za Windows), je bila uporabljena za primerjavo

skupin, in vrednosti p < 0,05 so se štele za statistično značilne (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p

< 0,001).


27

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Makroskopske spremembe

Obdukcija je pokazala oteklo tkivo jeter pri vseh skupinah, ki so prejemale doksorubicin

in/ali fulerenol. Pomembno dejstvo, ki so ga ugotovili med obdukcijo, je, da se kar 20 %

fulerenola pri uporabljenem najvišjem odmerku 100 mg/kg ni absorbiralo zaradi svoje

velikosti delcev in slabe topnosti (Slika 8). Zaradi tega je neraztopljeni fulerenol ostal v

ventralni strani trebuha, zlasti na ventralni površini jeter, trebušnega maščobnega tkiva in

na območju mod (Slike 12a-12e). Na navedenih območjih je povzročil nastanek

granulomov, ki so v bistvu nakopičeni kristali neraztopljenega fulerenola skupaj z

makrofagi v fazi fagocitoze delcev fulerenola.

Kopičenje neraztopljenega fulerenola v trebušni votlini je bilo odvisno od začetnega

odmerka, saj se je deleţ nerazporejenega fulerenola zmanjšal s spremembo odmerka iz 100

mg/kg na 25 mg/kg. Kljub temu neraztopljeni delci fulerenola, ki so se skoncentrirali v

trebušni votlini, ne bi mogli imeti kumulativnega učinka na organizem. Prav tako je

fulerenol v odmerku 100 mg/kg pokazal zaščitne učinke proti citotoksičnosti povzročeni z

DMSO. Protektivnost fulerenola na tkivo testisov proti toksičnosti doksorubicina se je v

bistvu večala z manjšanjem odmerkov fulerenola (26).

Rezultati makroskopskih sprememb potrjujejo dejstvo, ki je ţe bilo ugotovljeno, da pri

nizkih koncentracijah C60(OH)24 deluje kot antioksidant, medtem ko imajo višje

koncentracije ţe delno prooksidativno delovanje (21). V nekaterih prejšnjih študijah so ţe

dokazali, da lahko z uporabo drugih potencialnih antioksidantov, kot sta standardizirani

izvleček iz rastline Ginkgo biloba (15) in intestinalni metabolit-I (GIM-I; 20-O-β-D-

glukopiranozil-20(S)-protopanaksadiol) iz rastline Panax ginseng (30), učinkovito

zmanjšamo neţelene učinke doksorubicina na tkivo testisov. Znanstvena skupina Yeh YC.

(15) je v raziskavi na podganah sicer uporabila višje doze doksorubicina (i.p. 3 mg/kg na

vsake dva dni; skupaj 3 injekcije) in v končnih zaključkih potrdila, da doksorubicin

nedvoumno poškoduje tkivo testisov ter signifikantno zmanjša produkcijo sperme, medtem

ko lahko z uporabo potencialnih antioksidantov (Ginkgo biloba) zelo dobro omejimo pojav

apoptoze. Kang J. s sodelavci (30) je v raziskavi na miših ugotovil, da intestinalni

metabolit standardiziranega izvlečka rastline Panax ginseng zmanjša toksične učinke

doksorubicina na tkivo testisov.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kang%20J%22%5BAuthor%5D


28

Slike 12a-12e: Makroskopske spremembe na testisih in v trebušni votlini pri podganah, ki so bile

tretirane s fulerenolom. (A) Črno-rjave pike na testisih. (B) V trebušni votlini, zlasti na območju

jeter (C) in mezenterične (mezenterij = oporek tankega črevesja) maščobe okrog jeter, lahko

opazimo črne in rjave delce fulerenola. (Č) Jetra in testisi pri skupini živali, ki je prejemala

doksorubicin (1,5 mg/kg) in fulerenol (100 mg/kg). (D,E) Testisi in maščobno tkivo.

V preglednici 5 so predstavljeni rezultati, in sicer telesna masa podgan ter koeficient

testisov po ţrtvovanju ţivali. Koeficient testisov glede na telesno maso smo izračunali kot

razmerje med tkivom testisov (mokra masa (mg)) in telesno maso (g). Rezultati kaţejo na

pomembne razlike glede na ustrezno skupino (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001).

A

E D

Č C

B


29

Vse skupine od druge do devete se statistično značilno razlikujejo (p ˂ 0,001) od prve

oziroma kontrolne skupine. Telesna masa pri tretiranih ţivalih v navedenih skupinah se je

značilno zmanjšala glede na kontrolno zdravo skupino, ki je enkrat na teden prejemala

fiziološko raztopino. Pri podganah od tretje do sedme skupine, ki so dobivale

doksorubicin, je porast telesne mase statistično značilno manjša (p ˂ 0,001) v primerjavi s

prvo skupino. Vpliv doksorubicina tako na telesno maso, kot tudi izključno na tkivo

testisov, je bil opisan ţe v nekaterih prejšnjih študijah (13,15,18). Prahalathan C. s

sodelavci (13), kot tudi raziskovalni skupini Yeh YC. (15,18) v dveh raziskavah, so ţe

opazili značilno manjše povečanje telesne mase pri skupinah testiranih ţivali (podgane,

miši), ki so jim aplicirali izključno doksorubicin.

Preglednica 5: Telesna masa in koeficient testisov.

Skupina Telesna masa

(g)

Koeficient testisov

(mg/g)

1 526.4 ± 21.0 3.7 ± 0.2

2 410.1 ± 36.31c

4.4 ± 0.81c

3 387.7 ± 15.61c

4.7 ± 0.41c

4 390.4 ± 27.01c

4.7 ± 0.61c,2a

5 377.9 ± 26.01c2b

4.7 ± 0.31c,2a

6 368.5 ± 20.61c2b

4.8 ± 0.41c

7 390.6 ± 33.21c

4.6 ± 0.41c,2a

8 399.0 ± 22.11c6a

4.7 ± 0.91c,2c,3b

9 434.1 ± 24.41c2a3c4c5c6c7c8b

4.6 ± 0.31c,2b

Iz naše preglednice je razvidno, da se osma skupina, ki je prejemala izključno fulerenol,

statistično značilno razlikuje od prve skupine (p ˂ 0,001), kar nakazuje na moţnost, da

lahko sam fulerenol v višjih koncentracijah (100 mg/kg) deluje kot prooksidant. Osma

skupina se glede na mejo statistične značilnosti p ˂ 0,05 razlikuje od šeste skupine, kar

pomeni, da sam fulerenol v višji koncentraciji (100 mg/kg/teden) manj vpliva na

zmanjšanje telesne mase, kot fulerenol v kombinaciji z doksorubicinom. Zanimiva je

deveta skupina (vitamin C), kjer lahko opazimo, da je porast telesne mase statistično

značilno višja kot pri vseh skupinah od druge do osme. Podgane s kemijsko povzročenim

rakom, ki so prejemale izključno vitamin C, so dosegle povprečno višjo telesno maso kot

skupine, ki so prejemale izključno doksorubicin (3. skupina) ter doksorubicin in fulerenol

(4., 5. in 6. skupina) v različnih koncentracijah (p ˂ 0,001).

Koeficient testisov pri skupinah od druge do vključno devete se je statistično značilno

(p ˂ 0,001) povečal glede na prvo skupino. Najmanjšo vrednost navedenega koeficienta

smo določili pri prvi (kontrolni zdravi) skupini, temu sledi druga skupina. Izračunani




30

koeficienti pri ostalih skupinah so si po vrednostih zelo blizu skupaj. Vse skupine od

vključno četrte do devete, z izjemo šeste skupine, ki je poleg doksorubicina prejemala

najniţji odmerek fulerenola (25 mg/kg/teden), se po koeficientu testisov pomembno

razlikujejo od druge (kontrolna skupina s kemijsko povzročenim rakom), kar pomeni, da

zdravljenje z doksorubicinom v kombinaciji s fulerenolom ali vitaminom C oziroma ţe

aplikacija izključno fulerenola ali vitamina C, pomeni značilno povečanje razmerja med

tkivom testisov in telesno maso.

Podoben trend, in sicer porast relativne mase testisov (razmerje absolutne mase testisov

glede na končno telesno maso) v primerjavi s kontrolno skupino pri skupini podgan

moškega spola vrste Sprague-Dawely, ki so bile zdravljene z doksorubicinom, so dokazali

ţe Yeh YC. in sodelavci v raziskavi, pri kateri so ugotavljali vpliv standardiziranega

izvlečka iz rastline Ginkgo biloba na z doksorubicinom induciran oksidativni stres in

apoptozo na testisih pri podganah (15).

4.2 Mikroskopske spremembe

Doksorubicin ţe pri nizkih odmerkih vpliva tako na kvaliteto kot tudi količino

spermijev, saj lahko izzove morfološke nepravilnosti celic zarodnega epitelija. Ali bo

neţelena posledica zdravljenja s citostatiki ireverzibilna sterilnost, ne moremo povsem

predvideti. V literaturi opisani testi na podganah so pokazali padec v številu zarodnih celic,

in sicer nezrelih moških spolnih celic spermatogonijev in spermatocitov, kot tudi

zmanjšanje števila epitelijskih celic semenskih kanalov, intraepitelijsko vakuolizacijo in

spremembe v obliki jedra spermatid. Doksorubicin torej nedvoumno poveča stopnjo

apoptoze na vseh stopnjah cikla dozorevanja spolnih celic (15,16,18,30).

Ţe same spremembe v koeficientu mase testisov pri skupinah od druge do devete glede

na prvo kontrolno skupino nam kaţejo na patološke procese v tkivu testisov pod vplivom

apliciranih snovi. Za oceno histopatološkega statusa tkiv testisov je bila uporabljena

svetlobna mikroskopija. Določen je bil histopatološki status vseh vzorcev tkiv, ocenjena pa

je bila tudi stopnja apoptoze.

Mikroskopska slika zdravega tkiva testisov (Slika 13) je pomembna za primerjavo

ostalih vzorcev. Testisi so v osnovi zgrajeni iz zarodnega epitelija in ogromnega števila

celic v različnih fazah razvoja: spermatogoniji, spermatociti, spermatide. Med

posameznimi semenskimi tubuli, ki jih obdaja semenski epitelij, je intersticijsko vezivo.



31

Pri zdravi kontrolni skupini ni posebnosti. V lumnu semenskih tubulov je razvoj spolnih

celic na normalnem nivoju. Pri tretji skupini ţivali, ki je bila tretirana izključno z

doksorubicinom, so bile zaznane motnje v spermatogenezi, in sicer je prišlo do precej

močne apoptoze, kar je razvidno iz slike 13B.

Slika 13: Tkivo testisov obarvano z barvilom Haematoxylin-Eosin (H&E) pod svetlobnim

mikroskopom, 400 × povečava. (A) Zdrava kontrolna skupina. (B) Močna apoptoza pri skupini, ki

je prejemala doksorubicin. (C) Pri odmerku 100 mg/kg fulerenola poleg doksorubicina je apoptoza

celo bolj izražena.

Še močneje izraţena apoptoza je bila potrjena pri vzorcu, pridobljenem iz tkiva testisov

pri skupini, ki je poleg doksorubicina prejemala še fulerenol v najvišjem testiranem

odmerku 100 mg/kg/teden (Slika 13C). Ţe na osnovi rezultatov makroskopskih sprememb

smo povzeli dejstvo, da C60(OH)24 v nizkih koncentracijah deluje kot antioksidant, medtem

ko imajo višje koncentracije ţe delno prooksidativno delovanje. Patohistološki rezultati ne

odstopajo od glavnih ugotovitev po makroskopskem pregledu tkiva.

Skupno število pregledanih vzorcev je bilo tolikšno, kot je bilo število vseh testiranih

ţivali, torej 88. Vsi vzorci so bili slepo ocenjeni brez predhodnega poznavanja

obravnavanega statusa ţivali. Nivo ponovljivosti apoptoze vzorcev znotraj posameznih

skupin smo določili s pomočjo metode Bonferroni (p < 0,05). Iz preglednice 6 je razvidno,


32

da je visoka ponovljivosti apoptoze vzorcev le pri prvi kontrolni skupini in pri deveti

skupini, ki je bila tretirana z vitaminom C. Pri ostalih skupinah ponovljivost ni tako visoka,

ampak je srednja ali nizka.

Preglednica 6: Metoda Bonferroni (p < 0,05), nivo homogenosti/ponovljivosti apoptoze vzorca

znotraj skupine je lahko (1) visoka (2) srednja in (3) nizka.

Skupina Število Srednja vrednost Homogene skupine

1 8 0,3 (1)

2 10 1,3 (2)

3 10 2,5 (3)

4 10 2,2 (3)

5 10 2,8 (2)

6 10 3,7 (2)

7 10 2,9 (3)

8 10 2,8 (2)

9 10 5,1 (1)

Uporaba ANOVA-e razčleni varianco apoptoze na dva dela: gre za primerjave podatkov

med skupinami in znotraj skupin. F-razmerje, ki v tem primeru znaša 2,70, je razmerje med

oceno med skupinami in oceno znotraj skupin. Ker je izračunana P-vrednost F-testa manj

kot 0,05, obstaja statistično pomembna razlika med povprečno apoptozo iz ene ravni

skupine v drugo pri 95,0% stopnji zaupanja. Če ţelimo ugotoviti, katere skupine se

bistveno razlikujejo od katerih, je potrebno izbrati Multiple Range Test. Rezultati takega

pristopa so prikazani v preglednici 7 in na grafu 1.

Preglednica 7 : Povzetek celotne statistike apoptoze na osnovi uporabe Multiple Range Test-a.

Skupina Število Srednja vrednost Mediana Standardna deviacija Koeficient variacije Standardna napaka

1 8 0,3 0,0 0,462 185,1% 0,163

2 10 1,3 0,5 1,702 130,9% 0,538

3 10 2,5 2,5 1,715 68,6% 0,542

4 10 2,2 2,0 1,873 85,1% 0,592

5 10 2,8 3,0 1,873 66,9% 0,592

6 10 3,7 3,0 3,164 85,5% 1,000

7 10 2,9 3,0 2,514 86,7% 0,795

8 10 2,8 3,0 2,394 85,5% 0,757

9 10 5,1 4,0 4,605 90,3% 1,456

Skupaj 88 2,7 2,5 2,723 101,9% 0,290

Na grafu 1 so prikazane razlike v številu apoptoz med posameznimi skupinami. Vse

skupine, ki so prejemale doksorubicin in/ali fulerenol se statistično značilno razlikujejo od


33

kontrolne zdrave skupine, s tem da je rezultat pri najvišji uporabljeni koncentraciji

fulerenola 100 mg/kg (4. in 8. skupina) v primerjavi z ostalimi navedenimi skupinami

številčno primerljiv in niţji. Omenjena razlika ni statistično značilna, ampak je številčno

opazna. Na končen rezultat je pomembno vplivala homogenost rezultatov znotraj skupine.

Graf 1: Multifunkcijska ANOVA, analiza z LSD Post-Hoc testom. Razlike v številu apoptoz med

preiskovanimi skupinami. Številke v grafu kažejo na pomembne razlike glede na določeno skupino

(a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001).

Vitamin C je imel zelo močan vpliv na poškodbo tkiva, kar nam nakazuje tudi graf 1.

Vzroke za to lahko najdemo v samih lastnostih molekule vitamina C oziroma v pH-ju

mikro-okolja po i.p. aplikaciji raztopine. Fulerenol je poleg svoje antioksidativne

aktivnosti na molekularnem nivoju, kar kaţejo biokemijski parametri, pokazal izredno

močan makroskopski (fizična poškodba tkiv zaradi slabe topnosti) in posledično

mikroskopski vpliv na strukturo tkiva. Omejitveni faktor za nadaljne raziskave je prava

formulacija fulerenola in seveda način aplikacije (parenteralno ali peroralno).

Pričakovano je sam doksorubicin povzročil velik upad števila zarodnih celic v testisih,

kar so potrdili ţe v prejšnih razskavah na poganah, kjer so proučevali vpliv doksorubicina

na tkivo testisov (15,16). Z aplikacijo standardnega izvlečka rastline Ginkgo biloba so

morfološke spremembe v semenskih tubulih zelo dobro omejili, saj so mikroskopski

rezultati pokazali skoraj normalno morfologijo tkiva (15). Tudi učinkovina amifostin se je

izkazala kot potenciali citoprotektor proti z doksorubicinom povzročeni toksičnosti na

tkivo testisov, kar so potrdili obširni patohistološki testi (16).


34

4.3 Tumorji

Histopatološka analiza črevesja je pokazala, da fulerenol C60(OH)24 (100 mg/kg) in

vitamin C kot antioksidanta zmanjšata razvoj spremenjenih kriptnih ţarišč (ang. ACF

»aberrant crypt focuses«), kar je v skladu z ţe objavljenimi raziskavami v preteklosti (26).

Dokazano je, da doksorubicin nima nobenega vpliva na število preneoplastičnih lezij, toda

potrdili smo, da bistveno vpliva na razvoj karcinoma. V skupini podgan zdravljenih z

doksorubicinom, ki so predhodno dobivale še 100 mg/kg fulerenola, so rezultati pokazali

še boljši zaščitni učinek proti pojavu karcinoma kot v skupini, ki je bila tretirana samo z

doksorubicinom. Ti zaključki potrjujejo nekatere rezultate, pridobljene in vitro, da ima

fulerenol citotoksične učinke na karcinogene celice. Razlike v številu kolorektalnih

tumorjev med preiskovanimi skupinami so prikazane v Grafu 2.

Graf 2: Razlike v številu kolorektalnih tumorjev med preiskovanimi skupinami. Številke kažejo na

pomembne razlike glede na določeno skupino (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001). Histološka

ocena vzorcev tkiv je bila izvedena slepo, torej brez predhodnega poznavanja statusa za vsako

žival. Kriptna žarišča (ACF) so bila ocenjena po merilih, ki se rutinsko uporabljajo pri patologiji.

Mikroskopske poškodbe, ki vsebujejo dve do pet displastičnih kript, so razvrščene kot ACF, tiste, ki

pa so sestavljene iz več kot pet, so opredeljene kot adenom. Histološki kriteriji za določanje

adenomov in karcinomov temeljijo na mednarodni klasifikaciji tumorjev pri glodalcih (26).


35

4.4 Hematološki parametri in aktivnost serumskih encimov

Iz preglednice 8 lahko razberemo statistično pomembne spremembe nekaterih

hematoloških parametrov v obdobju treh tednov (Slika 9) in pri ţrtvovanih ţivalih po treh

tednih po prvi aplikaciji doksorubicina, fulerenola in/ali vitamina C. Gre za rezultate

meritev bele krvne slike (levkociti) in rdeče krvne slike (eritrociti, hemoglobin (Hbg),

hematokrit (HCT) in retikulociti). Primerjava posameznih hematoloških parametrov v

obdobju treh tednov v isti skupini (eksponenti pred vrednostmi, preglednica 8) in

primerjava med skupinami v okviru istega tedna (eksponenti po vrednostih, preglednica 8)

ni pokazala tako znatne razlike, kot je bila opisana v akutni fazi z doksorubicinom

povzročene toksičnosti po enkratnem odmerku 8 mg/kg v dveh raziskavah (27,29). Vzrok

za takšno opaţeno razliko bi lahko bil v uporabljenem odmerku doksorubicina, ki je v

našem primeru bliţje terapevtskemu odmerku (1,5 mg/kg/teden) in tako je toksičnost po

enkratnem odmerku manjša, kot drugi vzrok pa bi lahko navedli še daljše časovno obdobje,

v katerem se ţivali prilagodijo stresnim pogojem po aplikaciji zdravila.

Po prvem tednu lahko glede na ostale testirane skupine (izjema je 5. skupina) opazimo

statistično pomembno razliko v vrednosti levkocitov pri skupinah osem in devet, ki sta

dobivali izključno fulerenol oziroma vitamin C. Poleg tega je izrazita razlika pri

koncentraciji retikulocitov po drugem tednu v skupini sedem, ki je prejemala doksorubicin

in vitamin C, če rezultat primerjamo z ostalimi testiranimi skupinami v istem tednu.

Retikulociti so nezreli eritrociti, ki vsebujejo še ostanke jedra, in so pokazatelji razvoja

celic rdeče vrste (eritropoeza). Pri vseh testiranih skupinah ţivali tako opazimo porast

vrednosti retikulocitov po treh tednih glede na rezultate po prvem tednu, izjema je peta

skupina (doksorubicin in fulerenol 50 mg/kg/teden), kjer po drugem tednu zabeleţimo

intenziven padec vrednosti (iz (1178 ± 150)x10-9

/L na (742 ± 43)x10-9

/L) in nato kar

precejšen porast (na (998 ± 228)x10-9

/L), ki pa ne presega vrednosti po prvem tednu.

Skupine od četrte do sedme, ki so dobivale doksorubicin in fulerenol v različnih odmerkih

oziroma doksorubicin in vitamin C, se glede na vrednosti retikulocitov statistično značilno

razlikujejo tako od prve kot druge skupine v istem časovnem obdobju, to je tretjem tednu.

Hematokrit je razmerje med volumnom krvnih celic in volumnom celotne krvi. Če

pogledamo rezultate (preglednica 8), je očitno, da se vrednosti za HCT med skupinami

gibljejo med 0,4 in 0,5 %. Pri vrednostih hemoglobina ni posebnosti, razen pri peti, osmi in

deveti skupini, ki se glede na mejo statistične značilnosti p ˂ 0,05 razlikujejo od druge

skupine v prvem tednu.


36

Preglednica 8: Hematološki parametri in vrednosti serumskih encimov v obdobju treh tednov v isti skupini (eksponenti pred vrednostmi) in v okviru istega tedna med skupinami (eksponenti po vrednostih). Številke kažejo na pomembne razlike glede na ustrezno skupino (a:p

< 0,05; b:p < 0,01; c:p < 0,001); * po prvi aplikaciji. S

ku

pin

e

9

8.7

±2.5

1a2

a3b

4a6

a7a

9.5

±1.8

8.0

±1.9

1c2

a4b

5a6

a7b

8.6

±0.6

8.4

±0.8

8.4

±0.4

158.4

±9

.92a

153.4

±10

.8

150.3

±8

.7

0.5

±0.0

2a7

a

0.5

±0.0

0.5

±0.0

7a

574±

67

4a5

c6b

7a

Ic775±

76

7a

IIb615

±79

3b

4c5

c6c7

c

1054±

393

2b

4b

7b

Ia631±

246

2c3

c4b5

a6c

Ib407

±11

64

a5a6

b7a8

b

303±

110

1a4

b7b

Ib151

±25

1c2

c3c4

c5b

6c

Ic103±

25

1c2

a7c

0.3

3±

0.0

51a2

c

0.2

8±

0.0

71

b7a

0.4

1±

0.1

51c

8

9.7

±1.8

1b

2b

3c4

b6

b7

b

9.2

±1.8

7.3

±1.4

1a

8.6

±0.3

8.3

±0.2

8.2

±0.7

158.2

±4

.82a

156.0

±4

.7

149.6

±12

.1

0.5

±0.0

0.5

±0.0

0.5

±0.0

691±

82

5c6

b

767±

123

7a

714±

75

4b

5c6

c7c

1093±

274

2b

4a7

b

Ib658

±16

92

c3c4

b6c

IcII

b26

9±

58

2b

3a7

c

288±

59

1a4

c7c

Ib180

±43

1b

2c3

c4b

5a6

b

IcII

b71

±19

1c2

b3

b7c

0.2

7±

0.0

41

b2c

0.3

1±

0.0

71

b

0.3

3±

0.0

61c

7

6.5

±1.9

7.8

±1.4

6.4

±0.9

8.3

±0.6

1b

4a

7.9

±0.5

7.8

±0.7

1a

153.2

±5

.1

145.8

±8

.4

143.0

±13

.4

0.4

±0.0

1b

0.4

±0.0

1b

4a5

a

0.4

±0.0

1c2

a6a

819±

54

2a5

b

949±

180

1b

2c3

b4

b5

b6a

Ia1013

±170

1b

2c3

b

1502±

431

1a2

c3b

5a6

b

Ic545±

316

1b

2c3

c4c5

b6

c

Ic529±

215

1b

3a4

c5c6

c

538±

104

2c3

b5b

6b

Ic156±

56

1c2

c3c4

c5b

6c

Ic214±

63

2b3

b4

c5c6

c

0.3

3±

0.0

22c

0.3

7±

0.0

36a

0.3

9±

0.0

81c

6

6.4

±0.7

Ia7.9

±1

.2

IIa 6

.6±

0.9

8.3

±0.2

1b4a

7.8

±0.3

5a

IIa 8

.4±

0.5

153.6

±1

.5

146.2

±2

.6

151.3

±8

.3

0.4

±0.0

1b

0.4

±0.0

1b5a

IIb0.5

±0

.0

958±

224

1b2b3b5a

798±

153

2a

982±

259

1b2b3b

1006±

152

2b4b

1083±

307

1b5a

IcII

c 210

±46

2c3

a

298±

58

1a4

b

344±

43

3a

IcII

c 102

±29

1c2

b3a

0.2

8±

0.0

11b2c

0.2

9±

0.0

21c

IaII

a 0.4

4±

0.1

11c2

a

5

8.2

±1.6

2a3

a

8.9

±1.0

IIb6.9

±1

.1

8.7

±0.4

8.8

±0.5

IIa 8

.3±

0.3

156.6

±8

.92a

159.4

±6

.12a

IIa 1

47

.8±

7.8

0.5

±0.0

0.5

±0.0

2a

0.4

±0.0

1a

1178±

150

1c2

c3c4

b

Ib742

±43

IIa 9

98±

228

1b2c3

b

1239±

318

2b4a

977±

327

2a3

b

IcII

b24

6±

66

2b

294±

76

1a4

b

303±

68

3b

IcII

c 103

±23

1c2

a

0.2

6±

0.0

31b2c

Ib0

.35±

0.0

41a

Ib0

.35±

0.0

51c

4

6.5

±1.4

Ia8.0

±1

.3

IIa 6

.5±

0.7

8.9

±0.4

8.7

±0.5

Ia8.4

±0

.3

156.0

±6

.1

157.4

±9

.7

150.6

±5

.7

0.5

±0.0

0.5

±0.0

0.5

±0.0

808±

325

741±

77

IIa 8

99±

204

1a2

a

1558±

302

1a2

c3b

Ib108

6±

152

IcII

c 262

±62

2b

529±

116

2c3

b

Ib344

±49

3a

IcII

c 103

±13

1c2

a

0.3

4±

0.0

32c

0.3

2±

0.0

21b

0.3

7±

0.0

91c

3

6.0

±1.1

Ib8

.6±

1.4

IIa 6

.9±

1.5

8.4

±0.7

1a

8.0

±1.2

7.9

±0.7

1a

154.5

±8

.1

147.8

±11

.0

146.2

±9

.3

0.5

±0.0

0.4

±0.0

1a

0.4

±0.0

1b

662±

303

697±

168

774±

172

962±

68

2a

Ia1311

±29

1b

IcII

c 322

±81

322±

40

Ia451±

93

IbII

c 13

4±

23

1a

0.3

3±

0.0

42c

0.3

5±

0.0

41a

0.3

4±

0.0

81c

2

6.3

±0.6

7.0

±1.2

6.8

±1.1

8.4

±0.3

1a

8.1

±1.3

8.3

±1.4

147.2

±7

.91a

145.6

±19

.8

149.7

±15

.7

0.4

±0.0

1c

0.4

±0.1

1a

0.5

±0.1

1a

603±

176

650±

106

Ib745

±86

429±

93

1b

Ic1190

±333

1a

IIc 4

26±

154

1a

238±

47

1b

Ia377±

74

IaII

c 151

±57

0.5

8±

0.1

41a

Ib0

.34±

0.0

51b

Ib0

.33±

0.0

61c

1

6.4

±1.2

6.9

±2.0

5.9

±0.6

9.1

±0.4

8.6

±0.5

8.6

±0.6

158.5

±7

.4

154.3

±13

.2

151.9

±5

.9

0.5

±0.0

0.5

±0.0

0.5

±0.0

612±

86

663±

103

Ib749

±40

1048±

278

829±

104

IcII

b29

5±

79

513±

182

361±

96

IbII

a 17

6±

45

0.4

4±

0.1

8

0.4

3±

0.0

7

IaII

a 0.6

7±

0.1

0

Ted

en*

I II

III

I II

III

I II

III

I II

III

I II

III

I II

III

I II

III

I II

III

Par

amet

er

lev

ko

citi

(x 1

09/L

)

erit

roci

ti

(x 1

012/L

)

hem

og

lob

in

Hb

g

(g/d

L)

hem

ato

kri

t

HC

T

(%)

reti

ku

locit

i

(x 1

09/L

)

LD

H

(U/L

)

α-H

BD

H

(U/L

)

α-H

BD

H/

LD

H


37

Sedem dni po vsaki aplikaciji doksorubicina, fulerenola in/ali vitamina C v obdobju treh

tednov, se je zbiralo vzorce krvi za oceno vrednosti encimov LDH in α-HBDH, ki so

podani v preglednici 8. Izračunali smo tudi razmerje α-HBDH/LDH.

Laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27, LDH) je encim, ki je v visokih vrednostih prisoten

v ledvicah, srcu, jetrih in skeletnih mišicah, najdemo pa ga tudi v drugih tkivih. Znatno

povišane vrednosti LDH so pokazatelj miokardnega infarkta, ledvične odpovedi, hepatitisa,

anemije, malignih obolenj ali poškodb skeletnih mišic. Obstaja najmanj pet različnih

izoencimov in vsak izmed njih je značilno prisoten v določenem tkivu, njihovo

diferencialno določanje pa ima visoko diagnostično vrednost. α-hidroksibutirat

dehidrogenaza (α-HBDH) je eden izmed izoencimov LDH. Za analizo aktivnosti se

uporablja princip na osnovi reakcije v kateri LDH katalizira reakcijo pretvorbe piruvata do

L-laktata v prisotnosti NADH, ki se oksidira do NAD+ (28).

Na osnovi rezultatov lahko sklepamo, da je po tretjem tednu zdravljenja s terapevtskim

odmerkom doksorubicina (1,5 mg/kg/teden) v organizmu testiranih podgan prišlo do

adaptacije biokemičnih poti v jetrih, kar nakazujejo aktivnosti LDH in α-HBDH

(preglednica 8) (26). Najvišje vrednosti LDH in α-HBDH po tretjem tednu smo zabeleţili

pri sedmi skupini, ki je prejemala vitamin C (100 mg/kg/teden) 30 minut pred

doksorubicinom. Če pogledamo skupine, ki so bile tretirane s fulerenolom (4., 5., 6. in 8.),

lahko opazimo, da so vrednosti merjenih encimov LDH in α-HBDH po treh tednih izrazito

niţje kot pri ostalih skupinah. Prav tako za te skupine po zadnjem merjenju obstaja

statistično značilna razlika v vrednostih obeh encimov (LDH, α-HBDH) glede na drugo

skupino kar pomeni, da sam fulerenol ali v kombinaciji z doksorubicinom vpliva na upad

preiskovanih serumskih označevalcev. V prvi, tretji in ţe v prej navedenih skupinah so

vrednosti preiskovanih encimov v tretjem tednu statistično niţje glede na prvi in drugi

teden, če rezultate primerjamo znotraj posameznih skupin. Izmed vseh skupin najbolj

izstopa sedma skupina, ki se ţe po drugem tednu po vrednostih LDH in izoencima α-

HBDH, statistično značilno razlikuje od vseh skupin od prve do šeste. Najniţjo vrednost

LDH po zadnjem merjenju po treh tednih smo zabeleţili pri šesti skupini (210 ± 46 U/L),

ki je poleg doksorubicina prejemala najniţji odmerek fulerenola, najniţjo vrednost α-

HBDH pa pri osmi skupini, ki je prejemala izključno fulerenol.

V preglednici 8 je navedeno tudi razmerje α-HBDH/LDH, ki se uporablja za

razlikovanje med boleznimi jeter in srca (27,29). Po treh tednih se vse skupine po

vrednostih α-HBDH/LDH statistično značilno (p ˂ 0,001) razlikujejo od prve skupine.


38

4.5 Oksidativni status

Oksidativni stres je definiran kot porušitev ravnoteţja med prooksidativnimi in

antioksidativnimi procesi v celici, v korist prvega, kar pogostokrat vodi do oksidativnih

poškodb. Načeloma je oksidativni stres posledica zmanjšanja količine antioksidantov v

telesu, povečanega vnosa ţelezovih in nekaterih drugih kovinskih ionov ali povečane

produkcije RKS in dušikovih oksidov (29). Poškodbe celic z radikali so lahko epigenetične

(poškodbe strukturnih in funkcijskih molekul v celici) ali genotoksične (posredne ali

neposredne poškodbe dednega materiala). Način delovanja RKS je odvisen od mesta

nastanka, reaktivnosti in polarnosti RKS. Pri zaščiti pred radikali sta udeleţeni dve vrsti

encimov, in sicer hidroperoksidaze (katalaza (CAT) in peroksidaze) ter superoksidna

dismutaza (SOD). To so antioksidantni encimi (12).

Preglednica 9: Učinek fulerenola na različne parametre oksidativnega stresa pri z doksorubicinom

povzročeni toksičnosti na nivoju testisov pri podganah. Številke kažejo na statistično pomembne

razlike glede na ustrezno skupino (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001).

Skupina TP

g/L

LDH

U/L

SOD

(U/mg proteina)

GSH-Px

(U/g proteina)

GR

(U/g proteina)

CAT

(U/mg proteina)

1 7.39±4.22 97.98±12.95 1.95±0.80 38.47±19.83 2.94±1.34 1.58±1.05

2 20.90±2.991c 100.45±74.84 1.45±0.251b 22.93±3.981c 1.35±0.371c 1.31±0.41

3 21.07±4.041c 407.43±167.251c,2c 1.43±0.221b 11.53±4.181c,2b 0.87±0.481c 0.64±0.321b,2b

4 20.20±3.661c 419.24±167.421c,2c 1.49±0.241b 17.53±2.831c 0.83±0.501c,2a 0.79±0.341b,2a

5 18.51±2.311c 350.97±74.771c,2c 1.59±0.211a 18.34±3.161c,3a 0.90±0.401c 0.73±0.311b,2a

6 21.83±3.351c,5a 81.82±47.913c,4c,5c 1.43±0.251b 18.85±2.991c,3a 1.36±0.181c,4a 1.04±0.571a

7 21.32±3.631c 202.36±51.861a,2a,3c,4c,5b,6a 1.43±0.211b 17.26±3.381c 1.23±0.681c 0.86±0.261b,2a

8 23.18±3.031c,5b 28.26±20.003c,4c,5c,7b 1.26±0.201c,5a 16.20±3.581c,2a 1.44±0.441c,3a,4a,5a 0.65±0.351b,2b

9 20.05±5.401c 220.45±58.651b,2a,3c,4c,5b,6b,8c 1.56±0.291a,8a 18.10±5.361c 1.83±0.451c,3c,4c,5b,7a 0.89±0.571a

Superoksidna dismutaza (EC 1.15.1.1, SOD) je ime za druţino encimov, ki so vsi

metaloproteini in katalizirajo isto reakcijo, pretvorbo visoko reaktivnega superoksidnega

radikala do manj reaktivnega H2O2 (2O2˙- + 2H

+ → H2O2 + O2). Metode za določanje

aktivnosti SOD večinoma temeljijo na kemičnih reakcijah s standardnimi komercialnimi

reagenti pri katerih nastanejo produkti, ki jih določimo spektrofotometrično (12,28).

Katalaza (EC 1.11.1.6, CAT) katalizira reakcijo neposredne pretvorbe H2O2 do vode in

molekularnega kisika (2H2O2 → 2H2O + O2). Za določanje CAT so prav tako na voljo

komercialni reagenti, postopek določanja pa temelji na prekinitvi reakcije z dodajanjem


39

inhibitorja. Preostanek H2O2 oksidira nek kromogen, dobimo kromofor, ki je intenzivno

obarvan in ga tako določimo spektrofotometrično (28). Mi smo za določanje CAT

uporabili Aebi metodo (27).

Glutation peroksidaza (EC 1.11.1.19, GSH-Px) odstranjuje H2O2, tako da ga porablja za

oksidacijo glutationa (GSH): 2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O. Glutation-disulfid

reduktaza (EC 1.8.1.7, GR) je encim, ki je pomemben za ohranjanje razmerja med

reducirano in oksidirano obliko glutationa. Omogoča pretvorbo oksidirane oblike do

reducirane oblike glutationa: GSSG + NADPH + H+ → 2GSH + NADP

+ (28).

Da bi ocenili vpliv fulerenola in vitamina C na z doksorubicinom povzročeni

oksidativni stres na tkivo testisov, smo izmerili tkivne koncentracije TP, LDH, GSH,

GSSG, MDA in aktivnost antioksidantnih encimov SOD, GSH-Px, GR in CAT

(preglednica 9, graf 3 in graf 4). Skupna koncentracija proteinov (TP) v tkivu testisov je

pri vseh skupinah statistično značilno višja (p ˂ 0,001) od vrednosti kontrolne skupine.

Najvišjo vrednost TP smo zabeleţili pri osmi skupini, ki je prejemala 100 mg/kg/teden

fulerenola. Navedena skupina se statistično značilno razlikuje še od pete skupine.

Če pogledamo vrednosti za LDH (preglednica 9), ki smo jih določili v tkivu testisov,

lahko opazimo najniţjo vrednost pri osmi skupini (tretirana izključno s fulerenolom 100

mg/kg/teden), in sicer je izmerjena vrednost (28.26 ± 20.00 U/L) statistično značilno niţja

(p ˂ 0,001) od vrednosti pri tretji (407.43 ± 167.25 U/L), četrti (419.24 ± 167.4 U/L) in

peti (350.97 ± 74.77 U/L) skupini. Očitno je sam fulerenol pri uporabi 100 mg/kg/teden

močno vplival na padec koncentracije LDH, medtem ko je doksorubicin sam ali v

kombinaciji s fulerenolom povzročil intenziven porast LDH. Izjema v opisanem trendu je

šesta skupina (81.82 ± 47.91 U/L), ki je poleg doksorubicina prejemala najniţji odmerek

fulerenola. Vrednost LDH pri omenjeni šesti skupini se statistično značilno ne razlikuje ne

od prve in ne od druge skupine.

Encim SOD naj bil imel določeno vlogo tudi pri tudi zorenju spolnih celic in

spermatogenezi v testisih pri podganah. Kakršnekoli spremembe v aktivnosti SOD v tkivu

testisov bi lahko vodile do zaostanka v razvoju spolnih celic (13). Najvišjo aktivnost SOD

smo zabeleţili pri kontrolni zdravi skupini, najniţjo pa v osmi skupini, ki je bila tretirana

izključno s fulerenolom (100 mg/kg/teden). Aktivnost SOD se je pri vseh skupinah glede

na prvo skupino statistično zniţala.

Podobno se je zgodilo tudi pri aktivnostih ostalih merjenih antioksidantnih encimov

(GSH-Px, GR in CAT), kjer so izmerjene aktivnosti najvišje v prvi skupini. Najvišjo


40

vrednost GSH-Px torej vidimo pri prvi skupini, sledi ji druga skupina. Skoraj štirikrat

manjšo aktivnost GSH-Px glede na kontrolno zdravo skupino smo izmerili pri tretji

skupini, ki je dobivala samo doksorubicin. Meritve GR v skupinah od tretje do pete so

pribliţno trikrat manjše v primerjavi s prvo skupino. Najniţjo vrednost CAT smo zabeleţili

pri tretji skupini, ki je bila tretirana izključno z doksorubicinom, po vrednosti ji je zelo

blizu osma skupina.

Pri osmi skupini, ki je prejemala izključno fulerenol (100 mg/kg/teden), sta vrednosti

CAT in GSH-Px statistično značilno niţji glede na drugo skupino (kontrolna skupina s

kemijsko povzročenim rakom). Tudi vrednost za SOD je v navedeni osmi skupini precej

niţja kot pri drugi skupini, kljub temu da v tem primeru ne gre za statistično značilno

razliko. V tem konceptu lahko ponovno podpremo trditev, da se pri visokih koncentracijah

fulerenola ţe pojavljajo prooksidativni učinki (21), kar nakazujejo niţje vrednosti

antioksidantnih encimov SOD, CAT in GSH-Px pri osmi skupini. Iz rezultatov v

preglednici 9 je razvidno, da so vrednosti prej omenjenih encimov glede na osmo skupino

nekoliko višje pri peti in šesti skupini, v katerih so testirane ţivali poleg doksorubicina

prejemale še fulerenol v niţjem odmerku (50 mg/kg/teden oz. 25 mg/kg/teden). Ravno

obratno pa je pri aktivnostih GR, kjer je vrednost pri osmi skupini statistično značilno višja

od vrednosti GR pri peti skupini.

Pri tretji skupini, ki je bila zdravljena z doksorubicinom, je prišlo do precejšnega padca

aktivnosti antioksidantnih encimov glede na kontrolno zdravo skupino. Ta upad je v vseh

primerih statistično značilen. Zmanjšanje aktivnosti CAT in GSH-Px pomeni manjšo

sposobnost tkiva za odstranjevanje toksičnega H2O2. Upad aktivnosti navedenih

antioksidantnih encimov (SOD, GSH-Px, GR in CAT) v tkivu testisov pri podganah po

terapiji z doksorubicinom so Prahalathan C. in sodelavci zaznali ţe v eni izmed prejšnjih

raziskav (13). Oksidativni status po terapiji z doksorubicinom v tkivu testisov na osnovi

aktivnosti SOD in GSH-Px sta določali raziskovalni skupini Yeh YC. v okviru dveh študij

(15,18) na dveh različnih ţivalskih modelih (podgane, miši). Ugotovili so, da je

doksorubicin izrazito inhibiral aktivnost merjenih antioksidantnih encimov. V obeh

primerih je prišlo do statistično značilnega upada aktivnosti SOD in GSH-Px (15,18).




41

Glutation je tripeptid (glutaminska kislina-cistein-glicin) in je, poleg tega da je kofaktor

za GSH-Px, udeleţen še v številnih metaboličnih procesih. Visoko razmerje GSH/GSSG je

nujno za zagotavljanje zadostne zaščite tkiva proti oksidativnem stresu (28,29).

Graf 3: Razmerje prostega GSH/GSSG v testisih. Številke kažejo na statistično pomembne razlike

glede na ustrezno skupino (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001).

Iz grafa 3 lahko razberemo, da je bila najvišja vrednost opisanega razmerja GSH/GSSG

doseţena pri šesti skupini, ki je poleg doksorubicina (1,5 mg/kg/teden) dobivala najniţji

odmerek fulerenola (25 mg/kg/teden). Po vrednosti izstopa četrta skupina (doksorubicin in

fulerenol 100 mg/kg/teden), kjer smo določili najniţjo vrednost, medtem ko je rezultat pri

naslednji peti skupini ţe statistično značilno višji tako od druge, tretje in prav tako četrte

skupine. Iz grafa 3 je razvidno, da obstaja značilna razlika med tretjo skupino in skupinami

pet, šest, sedem in devet. Fulerenol v niţjih odmerkih (pri peti in šesti skupini), kot tudi

dobro poznan antioksidant vitamin C (pri sedmi in deveti skupini) sta ugodno vplivala na

porast razmerja GSH/GSSG. Res da je vrednost razmerja GSH/GSSG pri osmi skupini

prav tako precej višja kot pri tretji skupini (za pribliţno 10 %), kljub temu pa sam fulerenol

v odmerku 100 mg/kg/teden ni statistično značilno vplival na porast razmerja med

reducirano in oksidirano obliko glutationa glede na tretjo skupino.


42

Malondialdehid (MDA) je eden izmed bolje poznanih toksičnih sekundarnih produktov

lipidne peroksidacije in ga pogosto uporabljamo kot pokazatelja poškodb celične

membrane. Za MDA se predpostavlja, da je mutagen in deluje kot karcinogen iniciator

(28,29). Najbolj razširjena metoda za določanje MDA je spektrofotometrično določanje

roza fluorescence kompleksa MDA-tiobarbiturna kislina (MDA-TBA), ki ga dobimo po

reakciji MDA s tiobarbiturno kislino pri nizkem pH in pri povišani temperaturi. Reakcija

temelji na napadu monoenolne oblike MDA na aktivno metilensko skupino TBA (28). Za

določitev koncentracije MDA smo uporabili HPLC s fluorescenčnim detektorjem.

Graf 4: Vrednosti MDA v testisih. Številke kažejo na statistično pomembne razlike glede na

ustrezno skupino (a: p < 0,05; b: p < 0,01; c: p < 0,001).

Graf 4 kaţe, da je vrednost MDA pri kontrolni skupini s kemijsko povzročenim rakom

statistično značilno višja (p < 0,01) kot pri kontrolni zdravi skupini. Tudi pri ostalih

skupinah od tretje do devete, z izjemo sedme skupine, lahko opazimo, da se je stopnja

lipidne peroksidacije statistično značilno povečala glede na prvo kontrolno skupino.

Najvišjo koncentracijo MDA smo določili pri tretji, izključno z doksorubicinom zdravljeni

skupini. Izrazito povečanje vrednosti MDA v tkivu testisov po uporabi doksorubicina glede

na kontrolno zdravo skupino poskusnih ţivalih (podgane, miši) je bilo ţe prej opisano v

dveh raziskavah, ki sta jih izvedli raziskovalni skupini Yeh YC. (15,18).



43

Vse skupine, ki so bile tretirane s fulerenolom (4., 5., 6. in 8.) se glede na stopnjo

statistične značilnosti p < 0,001 značilno razlikujejo od tretje skupine, kar potrjuje dejstvo,

da fulerenol lahko potencialno ugodno vpliva na zmanjšanje stopnje lipidne peroksidacije

v celicah. To je v skladu z rezultati prejšnjih študij, ki so bile sicer izvedene na tkivu jeter

in/ali srca podgan, in kaţejo, da fulerenol lahko učinkovito zaščiti celice pred lipidno

peroksidacijo (26,27,29). Mehanizem zaviranja peroksidacije lipidov s fulerenolom

verjetno vključuje neposredno odstranjevanje začetnih radikalov, ki bi lahko sproţili

iniciacijo radikalske reakcije v lipidni membrani, in sicer gre predvsem za nastanek

hidroksilnega radikala HO˙ in peroksinitrita (ONOO-) (29).

4.6 Primerjava učinkovitosti fulerenola in drugih antioksidantov pri toksičnem učinku doksorubicina na testise

Zdravljenje z doksorubicinom je vedno povezano s povečanjem oksidativnega stresa v

organizmu. Številne raziskave podpirajo hipotezo, da so oksidativne poškodbe lahko

posledica zdravljenja z antraciklinskimi antibiotiki. Porast oksidativnih poškodb,

povezanih z nastalimi radikali, povzroči večjo dovzetnost tkiva testisov za poškodbe na

nivoju lipidnih membran spermijev, proteinov in DNA (13,14,31).

Številne naravne snovi, kot tudi nekatere učinkovine z antioksidativnimi lastnostmi,

lahko učinkovito prispevajo k zaščiti celic in tkiva testisov ter tako omejijo poškodbe z

nastalimi RKS pri zdravljenju z doksorubicinom (31). V naši raziskavi smo proučili

potencialne protektivne vplive antioksidanta fulerenola C60(OH)24 pri z doksorubicinom

zdravljenih podganah. Uporabili smo fulerenol C60(OH)24 v odmerkih 25, 50 in 100

mg/kg/teden in iz rezultatov lahko zaključimo, da fulerenol v vseh uporabljenih

koncentracijah kaţe antioksidantne učinke. Za boljši pregled in ovrednotenje učinkov smo

rezultate primerjali še z učinki dobro uveljavljenega antioksidanta vitamina C (100

mg/kg/teden).

V nekaterih prejšnjih študijah so uporabili druge antioksidante in v preglednici 10 so

zbrani rezultati najbolj reprezentativnih kazalcev oksidativnega stresa pri zdravljenju

testiranih ţivali z doksorubicinom. Vrednosti MDA so se v vseh primerih zvišale, kar je

dokaz, da doksorubicin poveča stopnjo lipidne peroksidacije v testisih. Če še enkrat

pogledamo graf 4, je jasno, da so vrednosti MDA pri skupinah od četrte do sedme višje kot

pri prvi kontrolni skupini, kar je prikazano tudi v preglednici 10. Vendar pa so vrednosti

MDA pri prej navedenih skupinah statistično značilno manjše od vrednosti pri tretji


44

skupini, ki je prejemala izključno doksorubicin (graf 4). Do podobnih ugotovitev so prišli

v še dveh raziskavah (15,18), kjer so ugotavljali antioksidativno delovanje rastline Ginkgo

biloba (standardizirani izvleček) in doksiciklina. Pri skupinah ţivali, ki so bile tretirane

izključno z doksorubicinom, je prišlo do drastičnega porasta vrednosti MDA, medtem ko je

aplikacija omenjenih učinkovin očitno zmanjšala stopnjo lipidne peroksidacije v testisih,

kljub temu da je zabeleţen porast glede na kontrolno zdravo skupino (preglednica 10).

Preglednica 10: Primerjava različnih antioksidantov/učinkovin glede na enostavno oceno

vrednosti (višje ↑ oz. nižje ↓ ali normalo) MDA, SOD, GSH-Px, GR in CAT v primerjavi s

kontrolno zdravo skupino. Znak x pomeni, da podatka ni.

Uporabljeni

antioksidant

Odmerek

doksorubicina

Uporabljeni

model

in vivo

Ocena vrednosti glede na kontrolno zdravo skupino

MDA SOD GSH-

Px

GR CAT Referenca

fulerenol

100 mg/kg

(4.skupina)

1,5

mg/kg/teden

i.p. 3 tedne

samci

podgan

Wistar

↑ ↓ ↓ ↓ ↓ naša

raziskava

fulerenol

50 mg/kg

(5.skupina)

1,5

mg/kg/teden

i.p. 3 tedne

samci

podgan

Wistar

↑ ↓ ↓ ↓ ↓ naša

raziskava

fulerenol

25 mg/kg

(6.skupina)

1,5

mg/kg/teden

i.p. 3 tedne

samci

podgan

Wistar

↑ ↓ ↓ ↓ ↓ naša

raziskava

vitamin C

100 mg/kg

(7.skupina)

1,5

mg/kg/teden

i.p. 3 tedne

samci

podgan

Wistar

↑ ↓ ↓ ↓ ↓ naša

raziskava

DL-α-lipojska

kislina

35 mg/kg,

24 ur pred

doksorubicinom

1

mg/kg/teden

i.p. 10 tednov

samci

podgan

Wistar

x ↓ norm. norm. ↓ 13

Ginkgo biloba

(standardizirani

izvleček)

5 mg/kg/ na 2

dni, skupaj 3

odmerke

3

mg/kg/na 2

dni i.p.,

skupaj

3odmerke

samci

podgan

Sprague-

Dawley

↑ ↓ ↓ x x 15

doksiciklin

2,5 mg/kg/ na 2

dni, skupaj 3

odmerke

3

mg/kg/na 2

dni i.p.,

skupaj

3odmerke

samci miši

ICR ↑ ↓ ↓ x x 18

DL-α-lipojska

kislina

35 mg/kg,

24 ur pred

doksorubicinom

1

mg/kg/teden

i.p. 10 tednov

samci

podgan

Wistar

x ↓ ↓ ↓ x

31

Vrednosti antioksidantnih encimov pri vseh opisanih primerih v preglednici 10 so

upadle glede na kontrolno zdravo skupino. Izjema sta GSH-Px in GR v prvi navedeni


45

študiji ugotavljanja antioksidativnih lastnosti DL-α-lipojske kisline, kjer določana encima

ostaneta v območju normalnih aktivnosti. Pri tem je potrebno upoštevati, da je bil

uporabljen odmerek doksorubicina nekoliko niţji kot v našem primeru (1 mg/kg), vendar

je opisana raziskava potekala daljše časovno obdobje (10 tednov) (13).

Lipojsko kislino imenujejo tudi »univerzalni antioksidant«, in sicer je v bistvu nujno

potreben kofaktor, vključen v metabolične reakcije prenosa acilnih skupin. Skupaj z

reducirano obliko dihidrolipojsko kislino delujeta kot učinkovito sredstvo proti

oksidativnemu stresu v celicah. Zaščita proti poškodbam tkiva in celic z RKS je tudi

posledica sinergističnega delovanja DL-α-lipojske kisline z drugimi antioksidanti, kot sta

vitamin C in vitamin E (13,31).

Če si podrobneje pogledamo rezultate antioksidantnih encimov SOD, GSH-Px ,GR in

CAT pri obeh študijah z α-lipojsko kislino, opazimo manjši upad aktivnosti navedenih

encimov oziroma ni sprememb glede na kontrolno zdravo skupino (13,31). Vzrok za večjo

porabo antioksidantnih encimov v tkivu testisov je verjetno povečana koncentracija RKS

zaradi toksičnih mehanizmov doksorubicina. Podobno situacijo kaţe tudi naša raziskava. V

vseh primerih (preglednica 10) smo zabeleţili upad vrednosti merjenih encimov glede na

prvo skupino. Ob podrobnejšem pregledu preglednice 9 pa postane jasno, da je glede na

tretjo skupino (izključno z doksorubicinom tretirana skupina) uporaba antioksidantov

fulerenola (v vseh odmerkih) in vitamina C smiselna.

Z uporabo antioksidantov torej omejimo neţelene učinke antraciklinskega antibiotika

doksorubicina na tkivo testisov. Do podobnih zaključkov sta prav tako prišli raziskovalni

skupini Yeh YC. (15,18) v dveh raziskavah, kjer so pri tretiranju ţivali z doksorubicinom

ugotavljali vpliv še dveh antioksidantov na aktivnost SOD in GSH-Px. Za liste rastline

Ginkgo biloba je znano, da se ţe tisočletje uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini.

Danes je v uporabi standardizirani izvleček, ki vsebuje 24 – 25% flavonoidov in 6%

terpenskih laktonov. Klinične študije potrjujejo njegovo nevroprotektivno delovanje in

antioksidativne lastnosti. Dokazano je, da omenjeni izvleček omeji nastajanje radikalov in

poveča aktivnost antioksidantnih encimov. Glede na kontrolno skupino so sicer zabeleţili

upad vrednosti SOD in GSH-Px (preglednica 10), vendar pa v primerjavi z

doksorubicinom tretirano skupino opazimo statistično značilen porast merjenih encimov

(15). Zelo podobno se je kot antioksidant izkazal doksiciklin, ki se v glavnem uporablja kot

tetraciklinski antibiotik z močnim protivnetnim delovanjem (18).



46

5 SKLEP

Na osnovi dobljenih opisov makroskopskih in mikroskopskih sprememb in zaključkov

hematoloških in biokemijskih meritev lahko potrdimo, da se je fulerenol C60(OH)24 v vseh

uporabljenih odmerkih (25, 50 in 100 mg/kg) izkazal kot potencialni antioksidant, ki ima

precej obetavne zaščitne učinke na tkivo testisov pred kronično toksičnostjo, povzročeno z

doksorubicinom.

Končni pregled vrednosti MDA nam pokaţe, da je fulerenol v vseh koncentracijah

zmanjšal stopnjo lipidne peroksidacije v tkivu glede na tretjo skupino, ki je dobivala

izključno doksorubicin. Najboljšo učinkovitost smo zabeleţili pri najniţjem odmerku.

Enako lahko trdimo za razmerje GSH/GSSG, kjer smo najvišjo vrednost zabeleţili pri

skupini, ki je poleg doksorubicina prejemala 25 mg/kg telesne mase fulerenola na teden.

Za oceno oksidativnega stresa smo določili še aktivnosti antioksidativnih encimov SOD,

GSH-Px, GR in CAT in rezultati pri skupinah ţivali, ki so prejemale fulerenol, kaţejo na

povečanje aktivnosti omenjenih encimov v primerjavi s tretjo skupino, ki je prejemala

doksorubicin. V skupnem pregledu aktivnosti encimov SOD, GSH-Px, GR, CAT in pri

močnem upadu tkivne vrednosti LDH se je najboljše izkazal najniţji odmerek fulerenola.

Ţe makroskopske in tudi mikroskopske spremembe so pokazale, da se je protektivnost

fulerenola v bistvu povečevala z manjšanjem odmerka, poleg tega pa je pri najvišjem

odmerku (100 mg/kg) prišlo do kopičenja neraztopljenih delcev fulerenola v trebušni

votlini. Njegova izredno slaba topnost v vodi bi lahko omejila nadaljno raziskovanje

antioksidativnega delovanja fulerenola v smislu zaščitnih učinkov na celice, vendar so naši

rezultati kot tudi rezultati v prejšnjih opisanih raziskavah na drugih organih (26-29) zelo

obetavni. K izboljšanju topnosti v vodnih raztopinah se danes posluţujemo številnih novih

pristopov, zato menim da to vsekakor ne more biti razlog, ki bi oviral prihodnje raziskave

na področju potencialne uporabe fulerenola v biomedicini.


47

6 LITERATURA

1. Priestman, T. Cancer chemotherapy in clinical practice. Springer-Verlag, London,

UK (2008).

2. Injac, R., Kočevar, N. in Štrukelj, B. Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna

učinkovina. Farm vestn 59, 257-262 (2008).

3. Hasan, S., Dinh, K., Lombardo, F., et al. Doxorubicin Cardiotoxicity in African

Americans. J Natl Med Assoc. 96, 196-199 (2004).

4. Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M. and Flower., R.J. Rang and Dale´s

Pharmacology (6th ed.). Churchill Livingstone, Edinburgh, UK, 718-733 (2007).

5. Waller, D.G., Renwick, A.G. and Hillier, K. Medical Pharmacology and

Therapeutics (2nd ed.). Elsevier saunders, Edinburgh, UK, 635-662 (2005).

6. Injac, R. and Strukelj, B. Recent Advances in Protection Against Doxorubicin-

induced Toxicity. Technol Cancer Res Treat. 7, 497-516 (2008).

7. De Beer, E.L, Bottone, A.E. and Voest, E.E. Doxorubicin and mechanical

performance of cardiac trabeculae after acute and chronic treatment: a review. Eur

J Pharmacol. 415, 1-11 (2001).

8. Sweetman, S.C., Martindale: the complete drug reference (35th ed.).

Pharmaceutical Press, London, UK 646-648 (2007).

9. Injac, R. Ugotavljanje protektivnosti fulerenola in vivo v akutni in kronični

kardiomiopatiji pri terapiji malignih neoplazem z doksorubicinom pri podganah.

Doktorska disertacija (slo/ang). Fakulteta za farmacijo. Univerza v Ljubljani

(2008).

10. Luft, F.C. Doxorubicin toxicity in the Iron Age. J Mol Med 84, 529-531 (2006).

11. Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., et al. Molecular Advances and

Pharmacologic Developments in Antitumor Activity and Cardiotoxicity.

Pharmacol Rev 56, 185-229 (2004).

12. Ribarič, S. Izbrana poglavja iz patološke fiziologije (9. izdaja). Medicinska

fakulteta, Inštitut za patološko fiziologijo, Ljubljana (2005).

13. Prahalathan, C., Selvakumar, E. and Varalakshmi, P. Remedial effect of DL-α-

lipoic acid against adriamycin induced testicular lipid peroxidation. Mol Cell

Biochem. 267, 209-214 (2004).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hasan%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dinh%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lombardo%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Beer%20EL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bottone%20AE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Voest%20EE%22%5BAuthor%5D

http://cobiss4.izum.si/scripts/cobiss?ukaz=FFRM&mode=5&id=1742557320126169&PF1=AU&PF2=TI&PF3=PY&PF4=KW&CS=a&PF5=CB&run=yes&SS1=%22Sweetman,%20Sean%20C.%22


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Selvakumar%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Varalakshmi%20P%22%5BAuthor%5D


48

14. Prahalathan, C., Selvakumar, E. and Varalakshmi, P. Modulatory role of lipoic acid

on adriamycin-induced testicular injury. Chem Biol Interact. 160, 108-114 (2006).

15. Yeh, YC., Liu, TJ., Wang, LC., et. al. A standardized extract of Ginkgo biloba

suppresses doxorubicin-induced oxidative stress and p53-mediated mitohondrial

apoptosis in rat testes. Br J Pharmacol. 156, 48-61 (2009).

16. Vendramini, V., Sasso-Cerri, E. and Miraglia, SM. Amifostine reduces the

seminiferous epithelium damage in doxorubicin-treated prepubertal rats without

improving the fertility status. Reprod Biol Endocrinol. 1-13 (2010).

17. Shinoda, K., Mitsumori, K., Yasuhara, K., et. al. Doxorubicin induces male germ

cell apoptosis in rats. Arch Toxicol. 73, 274-281 (1999).

18. Yeh, YC., Lai, HC., Ting CT., et. al. Protection by doxycycline against

doxorubicin-induced oxidative stress and apoptosis in mouse testes. Biochem

Pharmacol. 74, 969-980 (2007).

19. Quiles, J.L., Huertas, J.R., Battino, M., et. al. Antioxidant nutrients and adriamycin

toxicity. Toxicology. 180, 79-95 (2002).

20. Alkreathy, H., Damanhouri, Z.A., Ahmed. N., et. al. Aged garlic extract protects

against doxorubicin-induced cardiotoxicity in rats. Food Chem Toxicol. 48, 951-

956 (2010).

21. Injac, R., Radic., N., Govedarica, B. et. al. Bioapplication and activity of fullerenol

C60(OH)24. African Journal of Biotechnology 7, 4940-4050 (2008).

22. Radić, N. Efekat fulerenola na antioksidativni status srca pacova nakon

jednokratne aplikacije doksorubicina. Diplomska naloga (besedilo v srbskem

jeziku). Fakulteta za medicino, Univerza v Novem Sadu, Novi sad (2007).

23. Rao, C.N.R., Seshadri, R., Govindaraj, A. et. al. Fullerens, nanotubes, onions and

related carbon structures. Materials Science and Engineering 15, 209-262 (1995).

24. Bogdanović, V., Stankov, K., Ičević, I. et. al. Fullerenol C60(OH)24 Effects on

Antioxidative Enzymes Activity in Irradiated Human Erythroleukemia Cell Line. J.

Radiat. Res. 49, 321-327 (2008).

25. Bogdanović, G., Kojić, V., Dordević, A. et. al. Modulating activity of fullerenol

C60(OH)24 on doxorubicin-induced cytotoxicity. Toxicol In Vitro. 18,629-637

(2004).





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liu%20TJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20LC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vendramini%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sasso-Cerri%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miraglia%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shinoda%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mitsumori%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yasuhara%20K%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lai%20HC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ting%20CT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Quiles%20JL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huertas%20JR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Battino%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Alkreathy%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Damanhouri%20ZA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ahmed%20N%22%5BAuthor%5D


49

26. Injac, R., Perse, M., Cerne, M. et. al. Protective effects of fullerenol C60(OH)24

against doxorubicin-induced cardiotoxicity and hepatotoxicity in rats with

colorectal cancer. Biomaterials 30, 1184-1196 (2009).

27. Injac, R., Perse, M., Obermajer N. et. al. Potential hepatoprotective effects of

fullerenol C60(OH)24 in doxorubucin-induced hepatotoxicity in rats with mammary

carcinomas. Biomaterials 29, 3451-3460 (2008).

28. Injac, R. The Analysis of Pharmacologically Active Compounds and Biomolecules

in Real Samples. Transworld Research Network, Kerala, India (2009).

29. Injac, R., Perse, M., Boskovic, M. et. al. Cardioprotective Effects of Fullerenol

C60(OH)24 on a Single Dose Doxorubucin-induced Cardiototoxicity in Rats With

Malignant Neoplasm. Technol Cancer Res Treat, 15-26 (2008).

30. Kang, J., Lee, Y., No, K. et. al. Ginseng intestinal metabolite-I (GIM-I) reduces

doxorubicin toxicity in the mouse testis. Reprod Toxicol 16, 291-298 (2002).

31. Prahalathan, C., Selvakumar, E. and Varalakshmi, P. Lipoic acid ameliorates

adriamycin-induced testicular mitochondriopathy. Reprod Toxicol. 20, 111-116

(2005).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kang%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22No%20K%22%5BAuthor%5D





50

ŢIVLJENJEPIS

Rodila sem se 3.8.1985 v Kranju kot najstarejši otrok v petčlanski druţini. Osnovno

šolo sem obiskovala v Črni na Koroškem v letih 1992-2000 in jo končala z odličnim

uspehom. V višjih razredih osnovne šole sem se udeleţevala številnih tekmovanj iz

matematike, kemije, fizike, slovenščine in zgodovine. Po končani osnovni šoli sem šolanje

nadaljevala na gimnaziji v Ravnah na Koroškem. Vseskozi sem imela veliko zanimanje za

naravoslovne predmete in matematiko. V okviru obveznih izbirnih vsebin sem v prvem

letniku obiskovala kroţek Galenska farmacija. Tam sem prvič spoznala delo farmacevta v

bolnišnični lekarni Slovenj Gradec.

Julija leta 2004 sem uspešno opravila maturo in se jeseni istega leta vpisala na Fakulteto

za farmacijo v Ljubljani. Po redno končanem tretjem letniku sem se med študijskimi

počitnicami avgusta 2007 seznanila z delom farmacevta v lekarni. V četrtem letniku študija

sem dobila kadrovsko štipendijo pri javnem zavodu Koroške lekarne. Praktično

usposabljanje sem v okviru 10. semestra leta 2009 opravljala v lekarni Prevalje (Javni

zavod Koroške lekarne) pod mentorstvom Polone Reiter, mag. farm. in Irene Pušnik, mag.

farm., spec. Program obvezne prakse v lekarni sem uspešno opravila, skozi delovni proces

sem osvojila predpisane in ţelene kompetence.

Download - mojca kladnik diplomska naloga univerzitetni študij farmacije

Top Related