Nanoskalige Biofunktionalisierung von Oberflächen durch Laserstrahlung zur Erzeugungzellspezifischer Leit- und Wachstumsstrukturen
Dr. Elke Bremus-Köbberling, Dipl.-Phys. Stefan Beckemper, Dr. Arnold Gillner
DFG SPP 1327 – Symposium 12.04.2011 in Berlin
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Gliederung
• Projektziele
• Nanostrukturen durch Interferenzverfahren
V h M i li (PEEK PI PDMS)• Versch. Materialien (PEEK, PI, PDMS)
• Versch. Strukturen (Variation von Rillenabstand und Tiefe)
• Doppelstrukturen (Noppen und Rillen)• Doppelstrukturen (Noppen und Rillen)
• Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren
• Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren
• Zusammenfassung und AusblickZusammenfassung und Ausblick
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Projektziele & Planung 11/2009 -10/2012
Topographisch und chemisch funktionaleNanostrukturen (sub-100 nm)
Erzeugung von Zell-Leitstrukturen sowie zellspezifischen Proteinmustern
• Methodische Weiterentwicklung der Interferenzstrukturierung (Zweistrahl Mehrstrahl Interferenz & ns ps, fs)
• Charakterisierung der Nanostrukturen (REM, AFM) & Zellbesiedelung
• Machbarkeitsuntersuchung: Laterale Strukturgrößen vs. Strukturtiefe
• Auswahl geeigneter photoaktivierbarer Verbindungen g g p g& Nachweis der Photomodifizierung im μm-Maßstab
• Konzepte zur Übertragung der Photochemie auf den Nanometermaßstab
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Mehrstrahlinterferenzaufbau, schematisch
2D- Anordnung
Mx=dielectric coated mirrorsMx dielectric coated mirrorsHx= half-wave-platesPx= polarizing-filters
Intensitätsverteilung auf Probe
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Nanostrukturen durch Interferenzverfahren
PEEK, = 2μm PI, = 250nm
PDMS Abguss 1μmPDMS Abguss, = 1μm
PEEK am, tkPI
= 3 μm -250 nmT = 50 – 600 nm
PDMS A 1 : 0,5
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Zweistrahlinterferenz
Strukturierung von PEEK
Tiefenvariation
Periodizität: 1.9 μm
Steg / Grabenbreite: 950 nm
lFluenz: 1.35 ; 1.85; 2.25 J/cm²
Spotdurchmesser: 450μm
Puls-Dauer: 35nsec
Wellenlänge: 355 nm
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Schematische Darstellung der 3D-Strahlenanordnung
Dreistrahlinterferenzanordnung
Noppenstrukturen
Simulation derIntensitätsverteilung(0°,60°,120°)
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Doppelstrukturen
Prozessstrategie:• 3-Strahl Interferenz NoppenSt a te e e oppe
• 2-Strahl Interferenz größerer Periode Gräben
Stege mit Noppen
Strukturprofil AFM
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Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren
Substrat: Nanorillen (Periode 4 μm, Tiefe 50 – 600 nm) in PEEK (Victrex)
Zellen: 3T3 (Fibroblasten) und B35 (neuronale Zellen)
B35 1300-100.10.tif B35 1000-1000a4.tifB35 1000-100-10.1.tif
Generell gutes Wachstum auf nanostrukturierten PEEK Proben
Richtung der Rillen
Generell gutes Wachstum auf nanostrukturierten PEEK Proben
Hohe Zelldichte: geringer Einfluss der Topographie
Niedrige Zelldichte: tendenzielle Ausrichtung an Topographie
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g g p g p
Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren
Substrat: Nanorillen (Periode 4 μm, Tiefe 50 – 600 nm) in PEEK (Victrex)
Zellen: 3T3 (Fibroblasten) und B35 (neuronale Zellen)
B35 2000-100.9.tif B35 2000-100.10.1.tif
Tiefere Rillen erzeugen tendenziell stärkere Ausrichtung Tiefere Rillen erzeugen tendenziell stärkere Ausrichtung
Starke Uneinheitlichkeit der Proben
Weitere Experimente erforderlich!
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p
DRG Zellen auf PI mit Nanorillen (120 nm)Nanorillen (120 nm)
A s ert ng der Zella sricht ngAuswertung der Zellausrichtung:
• Nanorillen im REM sichtbar (x2K)
• Bestimmung der Richtung der Nanorillen
• Zellen im REM (x500-1K)
• Bestimmung der Zellhauptachsen (ZHS)
• Bestimmung des Winkels zwischenNanorillen und ZHANanorillen und ZHA
• Einteilung in 45 Sektoren: 45 und 136-180 ausgerichtet, 46-135 nicht ausgerichtet
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Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren
Aktueller Versuchsplan:
2/2010 – 12/2010 Erarbeitung Interferenzstrukturierung
b d k ll d f h f
12/2010 – 3/2011 Erarbeitung der Protokolle und Auswerteverfahren für Zellbesiedelung
4/2011 – 10/2011 Reihenuntersuchungen an:
Neuronale B35 Zellen (serumfrei)
PEEKam, PI, PDMS (von PI abgeformt)
Nanorillen ( = 1μm 500nm 200nm) Nanorillen ( = 1μm, 500nm, 200nm)Nanorillen ( = 500 nm mit < 100 nm sub-Struktur)
Doppelstruktur aus Nanonoppen und Nanorillen (500 nm)(500 nm)
18.-20.9.2011 Veröffentlichung der Ergebnisse geplant auf Bionic Engineering Conference, Boston, USA
i li i f l C“Laser Functionalization of Polymers to Create Bio-inspired Surfaces” (Abstract eingereicht)
ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen
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ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen
Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren
Konzept: photochemisch ortsselektiv Ankergruppen einführen zur Immobilisierung von Biomolekülen (z B Proteine)zur Immobilisierung von Biomolekülen (z.B. Proteine)
N C OO
N
OF F
+PEEK
N3 C O N
OF F
NH
C O
O
N
OF FPEEKN
+
+ h (355 nm)
OF FKN2
_
R-NH2+Bestrahlungsregimes:
N C N
O
R
F FPE
UV-Lampen (254 nm, 365 nm), großflächig oder Kontaktmasken
NH
C NH
R
F F
EK
R = Protein, Fluoreszenz-Tag
UV-Laser (266 nm, 355 nm), scannend μm
Interferenztechniken (ns, fs) nm
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Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren
P
N3 C O
O
N
O
O
F F
F F OOF F
P P
F3C
NH2O
F F CF3+
+PEEK
NH
C O
O
N
OF F
PEEK
N2_
PEEK
F3C NH
C
F F
NH
CF3
+ h (355 nm)
Probe Bearbeitung C/F Verh.
PEEK1 F-Azide, irrad. hE, F-Amin 2,9 / 83,4
PEEK2 F-Azide, irrad. nE, F-Amin 8,3 / 77,9
Ref1 F-Azid no irrad F-Amin 3 4 / 81 7Ref1 F-Azid, no irrad., F-Amin 3,4 / 81,7
Ref2 no F-Azid, irrad. hE, F-Amin 5,1 / 80,3
XPS-Ergebnisse bestätigen Ankopplung
Weitere Optimierung notwendig
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Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren
Heterobifunktionelle Linker
Immobilisierung von „Photobiotin“ (Invitrogen)
Nachweis durch
O
DyLight 488-Streptavidin-Konjugat
ONH
NH
SNH
O
FF
O NH
N3
NH
NH
NH
O
F
FNH
O NH
O
S
O
N OO
F
FO N
O
S
O
N OO
F
FO N
O
Fluoreszierende Linie: L= 10mm, D= 10μm Entsprechende Durchlicht-Aufnahme
nur chemische Modifizierung keine topographische Veränderung
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Photomodifizierung
Aktueller Versuchsplan:
10/2010 – 2/2011 Erarbeitung der Protokolle und Auswerteverfahren für Immobiliserung der PhotolinkerImmobiliserung der Photolinker
XPS Nachweis
Funktionalisierung flächig und im μm-Bereich
5/2011 – 7/2011 Wiederholung der Photoimmobilisierungsexperimente
PEEKam, PDMS
355nm (Wdh ) 266 nm (neu)
355nm (Wdh.), 266 nm (neu)
Erzeugung von μm-Strukturen und Fluoreszenznachweis
5/2011 -6/2011 Recherche: Nachweis funktionaler Nanostrukturen mit NP - Nachweis über REM / EDX
7/2011 – 12/2011 Experimente zu chemisch funktionalen Nanostrukturen
ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen
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ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen
Zusammenfassung und Ausblick
• Zwei- / Dreistrahlinterferenz: • Topographische Doppelstrukturen
Phase 1 Phase 2 (geplant)
Zwei / Dreistrahlinterferenz:
Parameteroptimierung hinsichtlich
Material und Geometrie
Topographische Doppelstrukturen
• Topographisch – chemische
Doppelstrukturen
• ns & ps– Interferenz
• Photochemische Modifizierung:
pp
• Photochemische Nanostrukturierung
mit 266 nm Wellenlängeg
Identifizierung einer geeigneten
Chemie (F-Azide, Diazirine, • Fs-Interferenz mit sub-Struktur
(ripples)„Photobiotin“)
• Erzeugung und Nachweis von • Primäre Zellen & Co-Kulturen
„chemischen“ Nanostrukturen
• Zellbesiedelung
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