Download - Obilježene Imunokemijske Metode 4
-
Obiljeene imunokemijske metode
-
Princip imunokemijskih metoda: reakcija At-Ag Ako se u otopinu ili gel s
antitijelom dodaje otopina s antigenom, kod odreene koncentracije antigena (u zoni ekvivalencije) poet e se stvarati precipitat. Ako se dodavanje nastavi, precipitat e se otopiti
Princip razliitih imunokemijskih metoda i u otopini i u gelu
HeidelbergerKendall-ova krivulja precipitacije
-
Pripadaju najvanijim analitikim metodama u klinikoj kemiji
Princip mjerenja: mjeri se primarna reakcija izmeu Ag i At uz
koritenje obiljeenih reaktanata obiljeivai pojaavaju osjetljivost Monoklonska antitijela - vea specifinost
Podjela: Kvantitativne i kvalitativne metode Metode u otopini i metode na vrstom nosau
Velika osjetljivost metoda: omogueno je mjerenje tvari koje se u organizmu
nalaze u vrlo malim koliinama
Obiljeene imunokemijske metode
Ag
At
-
Kvantitativne obiljeene imunokemijske metode
Mjerenje koncentracije spojeva koji se u biolokim tekuinama nalaze u vrlo niskim koncentracijama Vitamini, hormoni, tumorski biljezi, autoantitijela....
Antigeni ili antitijela se obiljeavaju razliitim spojevima: radioizotopom - radioimunokemijske metode (RIA) enzimom, inhibitorom, kofaktorom ili supstratom
enzima - enzimimunokemijske metode, (ELISA) luminiscentnim spojem - luminoimunokemijske
metode (LIA) fluorescentnim spojem - fluoroimunokemijske
metode (FIA) i Osjetljivost metoda 10-15 do 10-20 mol/L
-
Radioimunokemijske metode (RIA) Metode s radioaktivno obiljeenim At ili Ag
Obiljeivai: I125 , I131... Prve obiljeene imunokemijske metode
(inzulin, 1960. god.); vrlo osjetljive Kompetitivni princip testa: Neobiljeeni (hladni") Ag (iz uzorka) se natjeu
za slobodna mjesta na At (iz reagensa) i zamjenjuju radioaktivno obiljeene Ag. Ag vezani za At se centrifugiranjem odvajaju od slobodnih Ag, a radioaktivnost vezanih Ag se mjeri scintilacijskim brojaem (cpm). Koncentracija ispitivanog Ag se oitava iz krivulje
Koncentracija Ag je obrnuto proporcionalna koliini izmjerenih cpm
Odreivanje hormona, autoantitijela (npr. AChR)..
Nedostatak: RADIOAKTIVNOST!
-
Enzimimunokemijske metode (EIA) Metode kod kojih je Ag ili At obiljeeno enzimom Najee koriteni enzimi: peroksidaza, alkalna
fosfataza Heterogene metode ELISA
Ag ili At se prvo vee na vrsti nosa (epruvete, mikrotitarske ploice, magnetske estice), a zatim se kvantitativno mjeri samo koliina vezanog. Nosa odvaja vezano od nevezanog At ili Ag
Homogene metode EMIT Nema odvajanja vezanog od nevezanog Ag ili At,
jednostavnije Npr. uzorak s nepoznatom koliinom Ag (npr.
serum) mijea se s poznatom koliinom istog Ag obiljeenog enzimom (konjugat). Dodaje se ograniena (poznata) koliina At, a neobiljeeni Ag i konjugat kompetiraju (natjeu se) za vezna mjesta na At. Vezivanjem konjugata s At blokira se enzimska aktivnost. to je vea koliina neobiljeenog Ag vea je enzimska aktivnost.Intenzitet obojene reakcije proporcionalan je koliini Ag u smjesi.
KOMPETITIVNE I NEKOMPETITIVNE METODE
-
Kompetitivne enzimimunokemijske metode Reakcije se odvijaju uvijek uz viak
Ag (ispitivana supstanca) Ag obiljeen enzimom (konjugat)
mijea se s uzorkom koji sadri nepoznatu koliinu Ag (serum) kompeticija za vezna mjesta na poznatoj koliini At vezanog na nosau
Obiljeeni Ag i neobiljeeni Ag se veu na At u omjeru u kojem su u otopini - to je vie neobiljeenog Ag, manje e se obiljeenog Ag vezati na At - obrnuto proporcionalni odnos
Indikatorska enzimska reakcija: dodatkom supstrata nastaje obojeni spoj, mjeri se intenzitet boje obrnuto proporcionalan koncentraciji ispitivanog Ag
-
Nekompetitivne enzimimunokemijske metode Heterogene metode, na vrstom
nosau Kod odreivanja koncentracije Ag,
At vezano na nosa je uvijek u suviku u odnosu na ispitivani Ag. U prvoj reakciji se vee sav Ag iz uzorka.
Koriste se dva At: primarno (specifino za Ag kojeg se odreuje) i sekundarno (specifino za primarno At) sendvikompleks
Sekundarno At je obiljeeno enzimom
Odreivanje koncentracije antigena u uzorku
-
Ag je vezan na vrstom nosau Nakon dodatka uzorka, At (ako su
prisutna) se veu za Ag Sekundarno At obiljeeno enzimom Dodatak supstrata razvija se boja;
intenzitet boje proporcionalan je koliini At u uzorku
Odreivanje koncentracije antitijela u uzorkuNekompetitivne enzimimunokemijske metode
-
Razliite izvedbe EIA metoda u praksi!
Sloeni sustavi za detekciju stvorenog Ag-At kompleksa
Velika osjetljivost metoda iroka primjena u klinikoj praksi
-
Kemiluminiscentne imunokemijske metode (ECLIA)
Biotinizirano monoklonsko Ag- specifino antitijelo i monoklonsko Ag-specifino At obiljeeno rutenij-kompleksom reagira s Ag iz uzorka stvarajui sendvi kompleks. U drugoj inkubaciji se sendvikompleks vee za mikroestice obloene streptavidinom putem biotin-streptavidin interakcije
U mjernoj jedinici mikroestice se magnetski veu za povrinu elektrode. Primjenom napona na elektrodu inducira se kemiluminiscentna emisija iji intenzitet se mjeri fotomultiplikatorom
Potpuno automatizirane metode brzina!
-
Primjer: mjerenje T4 iz seruma
-
Obiljeene imunokemijske metode -kvalitativne
Specifino dokazivanje, ali kvalitativno (ima-nema)
Najee: imunoblot tehnike Western blot
Princip: proteini se razdvoje elektroforezom u gelu, a razdvojeni proteini se prenesu na vrsti nosa (nitrocelulozni ili najlonski filtar) na kojem se izvodi identifikacijska reakcija (Ag-At)
-
Imunoblot
1. Prijenos (transfer) proteina s gela na nosa (nitroceluloza)
2. Specifina identifikacija uz pomo monoklonskog ili poliklonskog atitijela
3. Detekcija enzimskom reakcijom nastaje obojeni produkt
Prijenos proteinskih vrpci nakon elektroforeze s gela na membranu s ciljem detekcije na membrani
-
Princip imunoblota:
I stupanj: prijenos proteina razdvojenih elektroforezom na membranu
Membrane: Nitrocelulozna (NC) Polivinildifluorid (PVDF)
Signal za detekciju(kolorimetrija, kemiluminiscencija)
Enzimski supstratEnzim kovalentno vezan na sekundarno antitijelo
Antitijelo na ciljni protein (primarno antitijelo)
Ciljni proteinMembrana
II stupanj: identifikacija proteina
Sekundarno antitijelo(na primarno)
-
Primjena imunoblota u laboratorskoj dijagnostici:
Dokazivanje razliitih strukturnih varijanti (fenotipova) proteina npr. alfa-1-antitripsina, haptoglobina, apoproteina i dr.
Fenotipovi alfa-1-antitripsina (deficijentni aleli Z i S)
-
Primjena IK metoda: brzi testovi
-
Prednosti imunokemijskih metoda
Vrlo osjetljive Specifina identifikacija Mogunost automatizacije Brzina Cijena?
-
Nedostaci imunokemijskih metoda Interferencije (obiljeivai) Krine reakcije (vezivanje At na neke
druge supstance osim ciljnog Ag) Nespecifina vezanja (ivotinjska At,
npr. HAMA* uzokuju lano pozitivne nalaze)
Utjecaj matriksa Utjecaj endogenih tvari (npr.
albumina ili komplementa) Hook effect- kod vrlo visokih
koncentracija Ag - lano negativni rezultati zbog potronje At iz reagensa (tumorski biljezi!)
* HAMA=human anti-mouse antibodies
Interferencije se mogu smanjiti kvalitetnim reagensima!