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PCR(polymerase chain reaction)
Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen (genomische DNA, cDNA (c…complementary) …..)
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PCR-History• Erfunden 1983 von Dr. Kary Mulles• Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für
Chemie• Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen • PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete
(Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise…..)
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Einsatzmöglichkeiten der PCR• Amplifikation von DNA Bereichen• cDNA-Klonierung und cDNA-Genbanken• DNA-Foot- & Fingerprinting• DNA-Sequenzierung• Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen)• Isolierung von DNA-Fragmenten• Markierung von DNA-Fragmenten• Mutagenisierung von DNA-Fragmenten
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Prinzip PCR• Welche Nukleinsäuresequenz soll
amplifiziert werden?• Welche DNA wird als Vorlage-Template
verwendet (Genomische, cDNA…)
• Primer setzen und suchen (Kriterien)• Temperaturprogramm wählen• DNA aus PCR Gemisch isolieren• Weiterverwendung der isolierten DNA
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Primer setzen und suchen
• Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5´- 3´Amplifikation)
• Komplementär zu je einem Strang• Mit oder ohne Startcodon/Stopcodon• Wie lang sollen die Primer sein
Schmelztemperatur berücksichtigen Verhältnis G:C zu A:T beachten!!
• Sollen neue Schnittstellen kreiert werden?
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PCR-Gemisch
• Template DNA (100 ng cDNA, 500 ng genomische DNA)
• Primer (10 µmolar)• DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus)
• dNTPs (Nukleosidtriphosphate)• PCR-Puffer• dd H2O• MgCl2 / DMSO (optional)
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Temperatur- und Zeitprogramm• Denaturieren zum Einzelstrang (94°C, 30 sec)• Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec)
kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an umso höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt
• Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72°C, 2-4 min)kommt auf Größe des Produkts an!!mittels hitzestabiler Taq-Polymerase(proof reading oder nicht?)
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Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch
• Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt?• Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)?• Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere?
bei vielen Banden muß PCR nochmal und spezifischer gemacht werden
• Ausschneiden der Spezifischen DNA-Bande aus dem Gel
• Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit)• Weiterverarbeitung der DNA (NB, Klonierung, etc)
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Laufrichtung DNA auf Agarosegel
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Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches
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Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches
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