Avances en transformación en PapaAvances en transformación en Papapara inducir resistencia a tizón tardío*para inducir resistencia a tizón tardío*
MSc. Martha Vergara Espinoza
Rómulo Aycachi Inga
Universidad Nacional “Pedro Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”Ruiz Gallo”
Docente :Alumno :
* María Luisa Guevara Fujita; Bióloga; MSc.Centro Internacional de la Papa – Departamento de Mejoramiento y Recursos Genéticos.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Produccion de papa en elmundo se ve afectada
ENFERMEDADES
VIRUS BACTERIAS HONGOS
Graves pérdidas en laproduccion agrícola
Tizón tardío de la papa Phytophthora infestans
•Ocasiona pérdidas de mas de 15% de la pro-ducción mundial.•Causante de hambruna 1845 – 1847.•Distribución mundial (en casi todas las zonaspaperas del mundo).
¿Qué se estaba haciendo?¿Qué se estaba haciendo?Mejoramiento convencional
Combinación de progenitores altamente resistentes
al tizón tardío
Complejidad de características genéticas del patógeno que son heredadas de forma cuantitativa
Dificultades
Presencia de nuevas cepasMas resistentes (recom-
Binación sexual)
¿Qué se está haciendo ahora?¿Qué se está haciendo ahora?
Introducción de genes fo-ráneos que confieran re-sistencia a la enfermedad
¿Qué es lo busca hacer este trabajo?¿Qué es lo busca hacer este trabajo? Usar genes que expresen pp. con efecto
antifúngico y antimicrobiano con la idea de incrementar las respuestas defensivas de la planta frente al ataque del patógeno
Se busca un efecto sinérgico en la acción de estos genes cuando se usan más de dos genes por evento de transformación.
¿Cómo hacerlo?¿Cómo hacerlo?
Osmotina, lisozima (bovina y del fago T4) y glucanasa.
¿Qué se utilizó?¿Qué se utilizó?
Osmotina: pp. que se expresa en las plantas en
respuesta a situaciones de estrés (salinidad
estímulo hormonal, ataque de patógenos).
Familia de genesaltamente con-servada en So-
lanaceas
↑ resistencia a infec-ciones causadas
por hongos
Glucanasa: pp. que cataliza la hidrólisis de poli-
Sacáridos presentes en la pared celular del hongo.
Lizosima: pp. con actividad antimicrobiana, a ni-
Vel de la pared celular de las bacterias.
En
¿Cómo se hizo?¿Cómo se hizo?Desarrollo de construc-
ciones genéticas
Llevan uno, dos y tres delos genes mencionados
Se hicieron clonamientos a par-tir de un ADNc de osmotina
pA13 de S. commersonii
Vector binario de transforma-ción (pMOG800)
Lisozima bovina c2 y la lisozimadel fago T4
Estos genes con sus respectivos pro-motores y terminadores, han sidoaislados en ambos sentidos de ori-entación respecto al vector inicial
Se adicionaron
Gen de glucanasa
ADNc (clon G46) de S. tuberosumEs
Se le escogió el promotor Ubiquitin 3
Ha sido insertado entre la osmotinay lisozima en una sola orientación
Transformación delas plantas
Se seleccionó variedad Amarilis INIA
Resistencia moderada alTizón tardío
Estos genes se introdujeron en la ce-pa LBA4404 de Agrobacterium
Efiencia de esta variedades relativamente baja
Regeneración y selección
Se hicieron modificacionesa los medios de
regeneración
Medio de selección a basede kanamicina, también
fue modificada
De 100 mg/L a 50 mg/Lya que los explantes adosis altas sufrían ne-
crosis y morían
Regenerantes obtenidos fue-Ron colocados en ½ con anti-
Biótico (Km 50 mg/L)
Luego fueron pasados a“Magentas”
Líneas transgénicas ob-tenidas
Prueba de callos
PCR
↑ dosis de Km, formaci-de callos → transgén.
Primers de Km, selec.Líneas amplif. Produc.
Matar a P. infestans
Osmotina
Célula vegetal
Osmotina
ADNc pA13 de S. commersonii
Agrobacterium
DNAc Osmotina
Kanamicina
Vector binario de transformación pMOG800
Se le adiciona lisozi-ma bovina c2 y del
fago T4
Clonamientos
Cepa LBA4404
Transformación de las plantas
Variedad AmarilisINIA
Medio de regene-ración Km 50 mg/L
Medio de selec-ción Km 50 mg/L
Prueba de callos yPCR
Chequeo
Se logró transformar algunas líneas.Eficiencia de transformación baja: 30%
(32/107 líneas chequeadas).Estas líneas serán sometidas a infección
por el patógeno, tanto a nivel de laboratorio como de campo.
Se espera aumentar el número de genes en aquellas construcciones que sean prometedoras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN
¡¡¡Gracias!!!¡¡¡Gracias!!!