-
1Teknis Pemeriksaan Biomolekular
dengan Metode Real Time PCR
2012
PT Roche Indonesia
-
2Teknis Pemeriksaan Biomolekular
dengan Metode Real Time PCR
Prinsip Metode PCR & Real-Time PCR
Desain Laboratorium PCR
Quality Assurance
Aplikasi Real-Time PCR
-
3Prinsip Metode PCR & Real-Time PC2009
-
4Apakah Metoda PCR ?
Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target.
Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.
Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.
-
5PRINSIP METODE PCR & REAL-TIME PCR
Apakah Metoda PCR ?
Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi
penting seperti bidang penelitian biologi, genetika,
arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik.
Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan
jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya
berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan
bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat
dideteksi
-
6Tahapan Proses PCR
Pre PCR :
Preparasi reagensia
Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA
PCR : proses amplifikasi
Denaturasi (pemisahan rantai DNA)
Annealing (penempelan primer)
Extension (pemanjangan oleh enzim)
Post PCR :
Deteksi/ Analisa Hasil PCR
-
7PRE-PCR
Preparasi spesimen :
isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi.
Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses :
Penghancuran dinding sel
Penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel
Pengendapan DNA/RNA
Pemanenan
-
8Preparasi spesimen :
isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
dengan Metode Phenol
Isolasi DNA Isolasi RNA
-
9 Berikatan dengan glass fleece
Garam kaotropik
Wash and spin
Pelarutan asam nukleat
Analisa selanjutnya
Preparasi spesimen :
isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
dengan Metode Kolom
-
10
Preparasi spesimen :
isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
dengan Metode Magnetik Glass Particle
DNA
or
RNA
1. Lysis,
Stabilization and
Deproteinization
2. Capture
Virus or Cell
3. Wash 4. Elute
Incubation Temperature: 37C
Incubation
Temperature: 80CRoom Temperature
-
11
Sekuen Target
Target Sequence
DNA Strand
Double Helix
DNA StrandSupercoiled
DNA Strand
Chromosome
DNA/ RNA diperoleh dari
hasil isolasi/ purifikasi
target organisme
-
12
DNA Double Helix
-
13
Sekuen NukleotidaHydrogen Bonds
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
Deoxyribose
(Sugar molecule)
Phosphoric Acid
(Phosphate molecule)
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
-
14
Target Denaturation
Primer Annealing
Primers
ExtensionPolymerase & dNTPs
PCR Review
Reverse Transcription
and
Polymerase Chain Reaction
RNA Virus cDNA
Target Amplification
cDNA
Reverse
Transcription
-
15
Deteksi/ Analisa Hasil PCR
Elektroforesis gel agarosa (horizontal)
Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)
Enzym labelling oligonucleotide
Biotin-labelled oligonucleotide
Digoxigenin-labelled oligonucleotide
Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.
-
16
Deteksi Produk PCR:
Elektroforesis Gel agarosa
-
17
Deteksi Produk PCR:
Elisa : Microwell Plate
-
18
PRINSIP METODE PCR & REAL-TIME PCR
Apakah Real-Time PCR ?
Real Time PCR dapat dikatakan sebagai mengoleksi dan menganalisa data yang terjadi selama proses reaksi
Real Time PCR berarti amplifikasi dan analisa terjadi bersamaan Dikenal sebagai Rapid Cycle PCR dengan siklus temperatur antara 20-60
detik Produk PCR dapat dianalisa selama proses amplifikasi Menggunakan pewarna DNA dan probe fluoresensi Data dikoleksi dari tabung yang sama didalam instrumen yang sama Tidak ada transfer sampel, penambahan reagensia atau gel separasi
-
19
Apakah Real-Time PCR ?
Format deteksi :SYBR Green IHybridization Probes (HybProbe Probes)Hydrolysis probes / Taqman ProbesSimpleProbe Probes
Dapat melakukan real-time quantitative PCR Real Time PCR adalah metode yang powerful, sederhana dan cepat
-
20Roche Applied Science
Persiapan Proses Real-Time PCR
H2OReaction Buffer
Primer:
ForwardReverse
dNTPs
Taq DNAPolymerase
RNA/DNA template
- Campur dengan baik, naik turun - Spin down dengan hati2- Di Aliquote kedalam beberapa tabung PCR- Tambahkam sampel kedalam setiap tabung- Spin down dengan hati2- Masukkan kedalam LigthCycler
Reaction capillaryOn LightCycler
MWP
-
21
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 10 20 30 40 50 60
Cycles
No
rm F
luo
rescen
ce
Ct = 33.2
AFL
Real Time-PCR vs. PCR:
Apa perbedaannya?
Real-Time PCR Agarose Gel Electrophoresis
-
22
Format Deteksi Real-Timedengan Pewarna Fluoresensi
2009
-
23
Format SYBR Green I
Ketika SYBR Green I berikatan dengan primer dsDNA, akan terjadipeningkatan fluoresensi
Selama tahapan PCR yang berbeda, intensitas dari sinyal fluoresensiakan berbeda, tergantung dari jumlah dsDNA yang ada
-
24
Format Hybridization Probe / HybProbe
Hybridization probe merubah fluoresensi pada saat hibridisasi denganfluorescene resonance energy transfer (FRET)
2 probe oligonukleotida sekuen spesifik dilabel dengan pewarna yang berbeda (donor & aseptor) dan ditambahkan kedalam master mix
Dalam analisa HybProbe adanya produk amplifikasi spesifik dapat dibacasecara kuantitatif berdasarkan peningkatan fluoresensi
Fluorescein LC Red
-
25
Format Hybridization Probe / HybProbe
Spesifik karena 2 probe dihibridisasi dengan target dengan cara yang sangat sekuen spesifik
Primer-dimer tidak terdeteksi karena probe sekuen spesifik tidakmengenalinya
Dapat untuk aplikasi deteksi mutasi, analisis SNP, genotyping SNP , qPCRdan multiplex tes
-
26
Format Hydrolysis Probes
Dikenal juga dengan nama Taqman Probe
Menggunakan aktivitas exonuclease 5 dari DNA Polymerase
Sebuah probe terdiri dari 2 label, fluorescence reporter dan fluorescenequencher, yang sangat dekat satu sama lain. Ketika probe masih utuh, quencher menahan sinyal fluoresensi reporter
reporter quencher
-
27
Format Hydrolysis Probes
Pada proses extention, aktivitas exonuclease 5 dari DNA Pol memotonghidrolisis probe dan memisahkan reporter dan quencher
Sinyal fluoresensi reporter tidak lagi tertahan dan dapat memancarkansinyal fluoresensi
Peningkatan sinyal fluoresensi dari reporter berbanding langsung denganakumulasi produk PCR
-
28
Format Simple Probes
Simple Probe adalah bentuk sederhana dari hybridization probe danhanya menggunakan 1 probe saja
Ketika terjadi hibridisasi akan memancarkan sinyal fluoresensi yang lebihbesar
-
29
Format Simple Probes
Perubahan sinyal fluoresensi tergantung dari status hibridasi dari probe, semakin stabil hibridisasinya semakin tinggi temperatur melting
Untuk aplikasi SNP genotyping dan deteksi mutasi
-
30
Teknis Pemeriksaan Biomolekular
dengan Metode Real Time PCR
Prinsip Metode PCR & Real-Time PCR
Desain Laboratorium PCR
Quality Assurance
Aplikasi Real-Time PCR
-
31
Laboratory Set-up
-
32
-
33
-
34
-
35
Potential PCR Contamination
-
36
Tips Mencegah Kontaminasi
Area Pre dan Post-PCR harus ruang yang terpisah.
Peralatan pendukung seperti pipet, jaslab danreagensia harus disediakan di area Pre dan Post-PCR.
Sarung tangan disposibel harus selalu dipakai dansering diganti.
Reaksi harus dikerjakan di dalam kotak laminar flow atau UV dead air box/ entkas yang berlampu UV.
-
37
Tips Mencegah Kontaminasi
Cegah kontaminasi silang antar spesimen
Gunakan tip pipet berfilter
Sering ganti sarung tangan
Buat kertas kerja spesimen (work form)
Lakukan preparasi reagen dengan hati untuk menghindarikontaminasi DNA & nuklease
Tempat kerja PCR harus disinar UV
Bersihkan meja kerja dan alat dengan alkohol 70% dan/ataularutan bleach 10%
GOOD LAB PRACTICE!
-
38
Teknis Pemeriksaan Biomolekular
dengan Metode Real Time PCR
Prinsip Metode PCR & Real-Time PCR
Desain Laboratorium PCR
Quality Assurance
Aplikasi Real-Time PCR
-
39
Quality Assurance
Koleksi & proses spesimen
Kualifikasi Reagen pada pergantian no batch/lot
Monitoring data pasien secara sistematik
Rutin quality control
Kalibrasi & perawatan Alat2
Analisa periodik competency assessment
Proficiency Testing
-
40
Quality Assurance
Evaluasi awal dan validasi dari kit
Evaluasi internal quality control berkelanjutanyang sesuai prosedur
Monitoring hasil melalui quality assesment atauprogram pelatihan
-
41
Validasi Klinis
Evaluasi menggunakan sampel yang diketahui positif & negatif
Dibandingkan dengan standar panel
Dibandingkan dengan metode tervalidasi atau gold standard
Validasi semua jenis spesimen dan kondisi yang akan dipakai dilab diagnostik
Bila dilakukan modifikasi yang signifikan, harus dibandingkanlagi dengan prosedur aslinya dengan sampel/ jenis sampel yang sama
Reprodusibilitas harus dilakukan dengan analisa berulang kali menggunakan sampel yang sama
-
42
Parameter Evaluasi
Performance characteristics Accuracy Precision Sensitivity Specificity Genetic variability genotype/subtypes
-
43
QUALITY CONTROL
Kit Controls
Kontrol Positif
Menunjukkan bahwa semua reagensia dan alat berfungsi baik, semua tahapsudah sesuai prosedur
Kontrol Negatif
Menunjukkan bahwa reagensia tidak terkontaminasi atau tidak adamalfungsi alat yang menyebabkan hasil positif
Kedua kontrol harus dijalankan dalam setiappemeriksaan
Kontrol Internal
Menunjukkan bahwa tidak ada inhibisi PCR atau tidak ada malfungsi alatpada hasil sampel yang negatif
-
44
Proficiency Testing Programmes
Royal College of Pathologists, Australia (RCPA)
www.rcpaqap.com.au
Quality Control Molecular Diagnostics, UK (QCMD)
www.qcmd.org
National Reference Laboratory, Australia (NRL)
www.nrl.gov.au
Accutest, USA (Digital PT)
www.digitalpt.com
-
45
Teknis Pemeriksaan Biomolekular
dengan Metode Real Time PCR
Prinsip Metode PCR & Real-Time PCR
Desain Laboratorium PCR
Quality Assurance
Aplikasi Real-Time PCR
-
46
Aplikasi PCR di Bidang Riset / Penelitian
-
47
Aplikasi PCR di Bidang Riset / Penelitian
Gene Detection
Detection of specific DNA/RNA (e.g. oncology research)
Identification of a specific species (e.g. bacteria, virus)
Pathogen detection (e.g. legionella, white spot virus,
herpes virus, IHHNV)
Antibiotic resistance screening (e.g. MRSA, VRE)
Water quality monitoring
Gene Expression
Studies on minimal residual diseases (MRD)
Determination of mRNA expression levels (e.g. cytokines, chemokines)
Gene dosis quantification (e.g. chromosomal aberrations)
Staph. aureus
-
48
Aplikasi PCR di Bidang Riset / Penelitian
Genotyping
Mutation in detection in cancer
Pharmacogenetics
Genetic fingerprint
Evolutional studies
Food Safety Analysis
GMO detection
Pathogene in food (e.g. Salmonella, E. coli)
Screening for beer spoilage
Gene Knockdown
Silencing of genes with siRNA
Zea mays
-
49
Riset / Penelitian
Penyakit Infeksi - Contoh
HIV RNA genotyping HBV DNA - cccDNA HCV RNA micro RNA MTB DNA CMV DNA HPV DNA genotipe 16 & 18 Herpes Virus Toxoplasmosis Fecal Microbiota
Sepsis (gram +/ garm -/ Candida)
EBV
Dengue
Salmonella thyposa
Enterovirus
Rotavirus
H5N1
H1N1
Legionella
Polio Virus
Helicobacter pylori
Dll.
-
50
Riset / Penelitian
Penyakit Non-Infeksi - Contoh
Colorectal cancer : k-ras
Anti-EGFR
Leukemia: Bcr-abl
Thalasemia : Alfa & beta-globin
Breast cancer : P53
Brca1 & brca2
PTEN
Progesteron reseptor
Estrogen reseptor
Cardiovascular disease :
Apo(a)
Apo B
Apo E polimorfisme
Thrombophilia :
Factor II G20210A & Factor V
Metabolisme obat :
2C9
2D6
2C19
CYP 450
Dll.
-
51
Applied Science / In-House / HomebrewContoh
-
52
Terapi Anti-EGFR (contoh : panitumumab & cetuximab) berikatandengan EGFR
Prolifearsi sel2 tumor berhenti
Sel2 tumor dengan mutasi K-RAS :
KRAS tetap On(aktif proliferasi)
Sel2 tumor terus berkembang, walau ada ikatan dengan anti-EGFR.
Efikasi terapi Anti-EGFR :
WT: efikasi lebih tinggi
Mutant: tidak ada efikasi
Aplikasi Bidang Patologi Molekular
Status Mutasi K-RAS & Terapi anti-EGFR
-
53
Mutation Exon Base Change Cosmic ID
12 Asp 1 Gly12Asp (GGT>GAT) 521
12 Ala 1 Gly12Ala (GGT>GCT) 522
12 Arg 1 Gly12Arg (GGT>CGT) 518
12 Cys 1 Gly12Cys (GGT>TGT) 516
12 Ser 1 Gly12Ser (GGT>AGT) 517
12 Val 1 Gly12Val (GGT>GTT) 520
13 Asp 1 Gly13Asp (GGC>GAC) 532
Mutation Coverage
98.5% of mutations reported in CRC
-
54
Step 1 - Biopsi sel tumor.
Jaringan dibuat preparat
Step 2 - Ekstraksi DNA (jar.parafin)........
Step 3 - Target sampel + master mix PCR..........
Step 4 - Sinyal fluoresensi menunjukan adanya mutasi
Pemeriksaan K-RAS
Tahapan
-
55
Real Time PCR with the LightCycler System
LightCycler 2.0
LightCycler Nano
LightCycler 480
-
56
LightCycler Real-Time PCR Platform
Over a Decade of Real-Time PCR Evolution
-
57
High Precision and Reproducibility
High Dynamic Range and Sensitivity
High Temperature Accuracy
Powerful Performance
-
58
High Precision and Reproducibility
High Dynamic Range and Sensitivity
High Temperature Accuracy
Powerful Performance
-
59
Powerful
High Precision and Reproducibility
Excellent resolutionof 2-fold concentrations
TaqMan
Experimental setup: UPL 137 (Parvo) 200 nM, primers 200 nM Taq Man format: FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 2-fold dilution series (1E6 7.81E3 copies) 4 replicates each
-
60
Powerful
High Precision and Reproducibility
Excellent intra-run homogeneity
TaqMan
Experimental setup: 400 nM primers, FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 10 replicates each (wt / het / mut) 2 NTCs Target: add1
-
61
High Precision and Reproducibility
High Dynamic Range and Sensitivity
High Temperature Accuracy
Powerful Performance
-
62
Powerful
High Dynamic Range and Sensitivity
SYBR Green TaqMan
Experimental setup: UPL 137 (Parvo) 200 nM, primers 200 nM FastStart Essential DNA Probes Master or FastStart SYBR Green Master 20 l reaction 10-fold dilution series (1E0 1E9 copies) 3 replicates each
Reliable detection over a broad range from 10E9 down to a
single copy
-
63
High Precision and Reproducibility
High Dynamic Range and Sensitivity
High Temperature Accuracy
Powerful Performance
-
64
Powerful
High Temperature Accuracy
Experimental setup: 400 nM primers LightCycler 480 High Resolution Melting Master 20 l reaction 10 replicates each (wt / het / mut) 2 NTCs Target: Cyp2C9 / SNP Class I (= C T) / 144 bp / plasmid DNA)
Excellent temperature accuracy and resolution for clear HRM results
-
65
Powerful
High Temperature Accuracy
Excellent intra-run homogeneity
TaqMan
Experimental setup: UPL (-Globin) 200 nM, primers 200 nM Taq Man format: FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 32 replicates of Concentration: 1E4
MW 26.77
SD 0.02
Min 26.73
Max 26.81
Max-Min 0.08
-
66
Fast Protocols
Flexible Reaction Vessels
4 Channels
Optimized Workflow
Powerful Design
-
67
Fast Protocols
Flexible Reaction Vessels
4 Channels
Optimized Workflow
Powerful Design
-
68
Powerful DesignSilver Block
2.42.62.833.23.43.6380
385
390
395
400
405
410
415
420
425
Volumetric heat capacity (J/cc-oC)
The
rma
l co
nd
uctivity
(W/m
-K)
Copper (A)
Silver (Nano)
-
69
Powerful DesignFast Protocols
Silver mount and long-life Peltierelements for
qPCR runs down to 25 min
Heating rate: + 5 C/sec
Cooling rate: + 4 C/sec
High temperature uniformity
+ 0.1 C
-
71
Fast Protocols
Flexible Reaction Vessels
4 Channels
Optimized Workflow
Powerful Design
-
72
Powerful DesignFlexible Reaction Vessels
8-well strips or single tubes and reaction volumes of 10-100l for
maximum convenience
-
73
Fast Protocols
Flexible Reaction Vessels
Robust and Versatile Optics
Optimized Workflow
Powerful Design
-
74
Powerful DesignSolid State Optics
Long life and high reliability
Clear results over the full spectrum
No light lost with narrowband filters
High power, stabilized, excitation source
Less noise from condensation and bubbles
No noise introduced by moving parts
-
75
Powerful DesignFast and Easy Set-up
9 pre-calibrated dyes for
Fast set-up
Easy dual color multiplexing
Factory Calibrated Dyes Virtual Channels / nm
SYBR Green I / ResoLight / FAM 2 / 530 548
VIC / HEX / Yellow555 3 / 550 560
LightCycler 610, Texas Red 6 / 610 628
Cy 5 8 / 650 668
-
76
Fast Protocols
Flexible Reaction Vessels
4 Channels
Optimized Workflow
Powerful Design
-
77
Powerful Design
LightCycler Nano Workflow
Design your assay in 1 min.
Lyse cells in
5 min.
Reverse transcribe in
30 min.
Results ready to publish
(MIQE-compl.)
Universal Probe Library
RealTime ready Assays
Rapid Lysis Kit
Transcriptor Universal cDNA Master
FastStart Essential Masters
LightCycler 8-tube Strips
Amplify in
40 min.
-
78
Absolute Quantification
Relative Quantification
Endpoint Genotyping
High Resolution Melting
Tm Calling
Powerful Applications
-
79
FunEasy Programming
-
80
FunEasy Programming
Visual
-
81
FunEasy Programming
FlexibleVisual
-
82
FunEasy Programming
IntuitiveFlexible
Visual
-
83
FunEasy Analysis
Zoom
Drag to select curves
Export
Vector, or CSV, or bitmap
-
84
Fun5 Colors Showing You the Status of the Run
Not loaded
Ready to run, loaded
Heating
Cooling
Run completed
-
85
Fun
Take an easy step into qPCR:
More than 10 years experience in real-time PCR
Excellent quality and reliability of the market leader in Molecular Diagnostics
Application specialists for on-site training and support
Service Engineer in branches
-
86
Terima Kasih