LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
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PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO: VISÃO GERAL E PAPEL NA INTERAÇÃO PLANTA-MICRORGANISMO
Michele de Cássia Pereira e SilvaWelington Luiz de Araújo
Sumário
Visão geral das proteínas de choque térmico
Interação planta-microrganismo – mecanismos e consequências
Proteínas de choque térmico na interação – “papel”
Conclusões
Heat Shock Proteins – proteínas de choque térmico (HSP)
São encontradas em todos os organismos, de bactérias a humanos.
Auxílio no dobramento de polipeptídeos recém sintetizados e proteínas parcialmente desnaturas por estresse, alterações ambientais ou metabólicas (Chaperonas moleculares).
DefiniDefiniççãoão
ConformaçãoNativa
ProteínasFuncionais
Chaperonas moleculares (HSP 70, HSP 90, DnaK)
Chaperoninas(HSP 60, GroEL)
Lodish et al, 2005. Biologia Celular e Molecular
Classes de Classes de ChaperonasChaperonas
Proteínaparcialmente
dobradas
Proteínadobrada
corretamente
Proteínadobrada
corretamente
Proteína
Proteína
Ribossomo
PrincipaisPrincipais FamFamííliaslias
Classes Membros Representativos Localização Intracelular Principais Funções
Previnir agregados, auxiliardobramento, importação e translocação de proteínas, transduçãode sinais, ativação transcricional
CitosolCloroplasto, mitocôndriaRetículo EndoplasmáticoCitosol
Dobramento de protéinas e re dobramento
Cloroplasto, mitocôndriaCitosol
CitosolCloroplastoMitocôndriaRetículo Endoplasmático
Facilita maturação de moléculas sinais, tampão genético
Subfamília
Subfamília
HSP – atuação emconjunto
AtuaAtuaççãoão
Síntese de HSP/chaperonase outras proteínas de resposta ao estresse
Desnaturação Protéica
Agregados
Hsp 70, Hsp 90Sinalização para chaperonas e
Ativação da transcrição
sHsp, Hsp 70Estabilização e prevenção de
agregados
Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90Re dobramento
Hsp 100/ClpRessolubilização
Estresse
Degradação
Reconhecimento do microrganismo - elicitores
Fragmentos do patógeno (carboidratos, proteínas, glicoproteínas
Fragmentos da membrana do hospedeiro
Como ocorre reconhecimento??
InteraInteraççãoão plantaplanta--microrganismomicrorganismo
RespostaResposta dada PlantaPlanta HospedeiraHospedeira
“Teoria gene a gene” – Harold H. Flor (1942)
Plantas com gene dominante de resistência ( gene
R - moléculas receptoras) --- patógenos com gene
dominante de avirulência (gene Avr - moléculas
indutoras).
Patógeno
Avirulento Virulento
Planta Suscetível + +
Resistente - +
+ = ocorre doença – Interações Compatíveis
- = planta sadia – Interações Incompatíveis
RespostaResposta dada PlantaPlanta HospedeiraHospedeira
Qual a resposta de defesa daplanta??
Resposta de Hipersensibilidade (Hypersensitive Reponse)
Ativada no ponto de agressão
RespostasRespostas de de DefesaDefesa dada PlantaPlanta
Interação - Produçãode moléculas
Indução de morte celular – limitação dainfecção
Indução de outras respostas de defesa, próximas ou não do local de lesão
OO22..--, H, H22OO22, OH, OH.., NO, NO
Sistema integrado e amplificado de sinalização
Induzida por fatores abióticos, mas principalmente bióticos
Estabelecimento de resposta sistêmica - SAR
EspEspééciescies ReativasReativas de de OxigênioOxigênio -- EAOsEAOs
Cross linking da parde celular; efeitosantimicrobianos, ativação de genes de proteção(GST, GPX); SAR
Morte Celular
EspEspééciescies ReativasReativas de de OxigênioOxigênio -- EAOsEAOs
Ativação de estado de resistência contra doenças
Ativação de mecanismos de resistência associados a conjuntode genes de defesa
Espécies reativas de oxigênio: H2O2 SA – forte sinal indutor
Resistência Sistêmica Adquirida (SAR)
RespostasRespostas de de DefesaDefesa dada PlantaPlanta
ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo
A colonização de plantas por microrganismos - produção de EAOs e enzimas antioxidantes.
Exposição de hospedeiro e microrganismo a ambienteestressante.
O que pode acontecer???
ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo
Produção proteínas de choque térmico (HSPs)
Produção de substâncias que atuam na sua interação com a planta
MicrorganismoPlantaProdução proteínas de choque térmico (HSPs)
Respostas de defesa (HSPs)
Estresse
Introdução
RAR1 e SGT1 - componentes essenciais de resistência conferida por muitos genes R
RAR1 interage com SGT1
Resultados e Discussão
Estrutura de HvHSP 90 (Cevada)
Domínio ATPaseN-Terminal
(N)
Domínio de ligação aosubstrato
(M)
Domínio C-TerminalLigação à
domínios TPR de cochaperonas
(C)
Resultados e Discussão
RAR 1 interage com HvHSP 90
1. HvRAR1 e AtRAR1 interagem com Hv HSP 90 – funções dessa ligaçãoconservadas em mono e dicotiledôneas.
2. Interação específica com CHORD-I
Resultados e Discussão
SGT 1 interage com HvHSP 90
1. HvSGT1 e AtSGT1 interagem com Hv HSP 90 – funções conservadasem mono e dicotiledôneas.
Resultados e Discussão
Testar se GDA afeta HR em Arabidopsis mediada por RMP1 e RPS2GDA: Geldanamicina – inibe atividade de HSP 90
Linhagens de P. syringae pv. Tomato (Pst) contendo genes de avirulência avrRpm1 e avrRpt2
1. 10µM de GDA não afetou HR dependentede RPM1
2. 10µM de GDA diminui HR dependente de RPS2 em 20hpi.
Folhas (lado direito) - infiltradas com Pst DC3000 (vetor, avrRmp1 e avrRpt2).
Tripan Blue – HR visível
Resultados e DiscussãoGDA afeta resistência mediada por genes R contra Pst DC 3000
1. avrRpm1 – GDA afetacrescimento bacteriano com 2 dpi (~ 6x) --- inibição daresistência.
2. avrRpt2 – GDA inibiu ~ 6x com 1dpi --- inibição mais acentuadada resistência mediada por RPS2.
Linha rosa: solução com GDA; Linha azul: solução sem GDA
Conclusão
A atividade de HSP 90 é requerida para resistência a doença dependente de RPS2 e RPM1, e na HR mediada por RPS2.
SGT1 e RAR1 ---- estruturas e interações --- co chaperonas ----modulação, junto com HSP 90, da atividade/ estabilidade de substratos protéicos importantes na resistência.
Resultados
Xylella fastidiosa foi afetada em uma correlação direta com o aumento da concentração da droga
Variação no transcriptoma - modulação de 665 genes
Análise da Resposta a Estresse Oxidativo de Xylella fastidiosa através de Hibridações de Microarranjos de DNA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação Interunidades emBiotecnologia da Universidade de São Paulo/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas
Muniz, C.R. (2006)
Genes Superexpressos: Enzima responsáveis pela detoxificação direta de peróxido de
hidrogênio (enzima alquil-hidroperóxido desidrogenase)
Fatores associados ao revestimento celular
Fator associado à ativação de moléculas de hemolisina
Bacteriocinas
Adesinas (biofilme)
Análise da Resposta a Estresse Oxidativo de Xylella fastidiosa através de Hibridações de Microarranjos de DNA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação Interunidades emBiotecnologia da Universidade de São Paulo/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas
Muniz, C.R. (2006)
Interação com outros microrganismos
Interação com a planta
Introdução
P. shigelloides – patógeno intestinal
Interação patógeno-hospedeiro – invasão de células Caco-2 por P. shigelloides induz apoptose
HSP: - estudos recentes indicam que algumas podem ser expressas na superfície bacteriana
- transporte de proteínas através de membranas, dobramento
Investigar envolvimento de GroEL nos estágios de adesão
Caracterização do perfil transcricional de P. shigelloides durante infecção de células Caco-2 por RT-PCR
Cinética de expressão de GroEL durante infecção por P. shigelloides.
GroEL
Resultados
Marcador Adesão Invasão Indução de apoptose
Resultados
A) Linha pontilhadas: células Caco-2 controle; Linha fina: células Caco-2 infectadas com P. shigelloides; Linhagrossa : células Caco-2 pré tratadas com 10, 20 e 30 µg de GroEl
B) Idem A porém tratadas com BSA (controle)
• Células não infectadas: 2,23
Papel de GroEL na adesão celular73,81
150,93
231,64
49,23
50,07
53,89
RT-PCR de ICAM-1 expressa por células Caco-2 estimuladas por 10µg, 20µg e 30µg de GroEL.
Capacidade de GroEL de P. shigelloides de estimular expressão de ICAM-1
Resultados
Conclusão
Contato patógeno-hospedeiro - sinal para P. shigelloides – superexpressão de GroEL.
GroEL de P. shigelloides estimula sua adesão às células hospedeiras – “superexpressão” de receptor envolvido na adesão celular.
GroEL desempenha importantes funções no estabelecimento da infecção
Objetivo
Identificar proteínas produzidas especificamente durante colonização da filosfera (folhas) através de comparações de proteomas de M. extorquens colonizando folhas, raízes e crescida em meio de cultura.
A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth
Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.
PNAS 2006; 103;13186-13191
Identificação de 40 proteínas super reguladasdurante colonização dafilosfera.
Pontos em laranja: filosfera. Pontos em azul: meio de cultura.
Resultados
A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth
Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.
PNAS 2006; 103;13186-13191
Tabela 1: Lista de proteínas de M. extorquens AM1 induzidas durante a colonização da filosfera (P) relativo ao meio de cultura (MM) e colonização na rizosfera (R)
Resultados
Identificação de um suposto regulador de resposta (PhyR –Phyllosphere-induced regulator)
Importância de PhyR:- NCBI: Domínio semelhante a RpoE (δE) em N-terminal ---- papel
na manutenção da integridade do envelope celular, e naresistência a estresses ambientais
- Domínio fosforeceptor em C-Terminal
N-Terminal C-Terminal
Resultados
Avaliação da importância de PhyR na colonização da planta
A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth
Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.
PNAS 2006; 103;13186-13191
Servera diminuição nacolonização da planta pormutantes.
Resultados
Identificação de proteínas positivamente reguladas por PhyR
Comparação do proteoma de linhagem superexpressandophyR com linhagem mutante deficiente.
A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth
Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.
PNAS 2006; 103;13186-13191
Conclusão
PhyR - papel chave na adaptação de M. extorquens ao ambiente da planta, frente aos vários fatores de estresse que a bactéria possa enfrentar.
δB – regulador de resposta a estresse emGamaproteobactérias
Importância de proteínas de estresse na colonização
A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth
Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.
PNAS 2006; 103;13186-13191
Estudo
Identificação de genes alterados em Erwinia chrysanthemi3937 isolada da planta hospedeira, em comparação com a crescida em laboratório em meio de cultura, por meio de microarranjos.
Resultados
Regulação gênica Classe Número
Genes hipo regulados na planta Síntese de proteínas 5Transcrição 5TCA/ fosforilação oxidativa 4
Resultados
Reguação gênica Classe Subclasse Número
Genes super reguladosna planta
Transporte e nutrição Transporte de ferroTransporte de sulfatoTransporte de aa ou peptídeosTransporte de polissacarídeosOutros
QuimiotaxiaAnaerobioseProteínas regulatórias
Regulador traducionalOutras proteínas regulatórias
Síntese de peptídeosEnzimas de degradação Enzimas pécticas
ProteasesResistência e xenobióticosOutros genes de estresse
Defesa contra estresse
Reparo de DNA e recombinaçãoElementos transponíveisComponentes de fagosHomólogos de proteínas desconhecidasORFs sem homólogos significantes
Conclusão
Grande número de genes envolvidos em resistência a xenobióticos, resposta ao estresse oxidativo e térmico indica sua importância frente a colonização e adaptação.
Conclusões Finais
HSP --- papel em processos onde há necessidade de alteração de conformação de proteínas.
Pouco conhecimento sobre papel de HSP na interação planta-microrganismo.
Estudos em organismos eucarióticos sugerem importante papel na colonização do hospedeiro por microrganismos.
ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo
Proteínas de interação
com a planta
Adesinas
Interação (estresse)
HR e resistência
mediada porgenes R
Proteínas de interação com
outrosmicrorganismos
Bacteriocinas
HSP
Estabilidadede
substratosproteícos