1
ESPECTROFLUORIMETRIAESPECTROFLUORIMETRIA
PROF. FERNANDO B. EGREJA FILHOPROF. FERNANDO B. EGREJA FILHODQ DQ –– ICExICEx –– UFMG UFMG
QUI QUI 221221 –– ANANÁÁLISE LISE INSTRUMENTAL INSTRUMENTAL AA
FOTOLUMINESCÊNCIA
BIOLUMINESCÊNCIA
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
♦♦♦♦ Fluorescência
♦♦♦♦ Fosforescência
LUMINESCÊNCIA
BIOLUMINESCÊNCIA
Luciferin + Luciferase + Oxygen = LIGHT
MINERAIS FLUORESCENTES
LUZ BRANCA LUZ UV
ORGANISMOS FLUORESCENTES
2
Aumento de fluorescência da 1,8-ANS (ácido 1-anilinonaphthaleno-8-sulfônico) ao ligar-se a uma p roteína (albumina de soro bovino).
Candida albicans com branco de calcofluorMicroscópio de fluorescência, X 1000
REAGENTES FLUORESCENTES
LUZ BRANCA LUZ UV
ADITIVOS FLUORESCENTES
LÂMPADA FLUORESCENTE
Ca5(PO4)3F1-xClxDopado com Sb3+ e Mn2+emissão em
254 e 185 nm
LÂMPADA FLUORESCENTELÂMPADA FLUORESCENTE(Ca(Ca55(PO(PO44))33FF11--xxClClxx))
AZUL AMARELO+ = BRANCO
3
Quimioluminescência do produto de reação da codeina com tris(2,2'-bipiridil)ruthenio(III)
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
Identifica-se uma mancha particular como sangue ou não, ou talvez até mesmo revelar
manchas escondidas em materiais escuros ou onde foram feitas tentativas lavar o sangue.
Um teste particular que revela a presença de sangue é o Teste do Luminol. Neste teste as manchas de sangue aparecem sob uma luz azul devido ao produto luminescente da reação de do luminol na presença do ferro da hemoglobina
FOSFORESCÊNCIA
AbsorAbsor çção, geralmente, no UV e ão, geralmente, no UV e emissão, possemissão, poss íível, em todo o vel, em todo o
espectro visespectro vis íívelvel
4
N
OCH3
OH N
CH2
fenantrenoProcessos de desativaProcessos de desativa ççãoão
• Relaxação não radioativa (vibracional)
• Conversão Interna
• Conversão Externa
• Cruzamento Intersistemas
• Pré-dissociação
• Dissociação
Eficiência Quântica (Eficiência Quântica ( ФФ))
absorvidosfótons
emitidosfótons
_
_=φ
dpdciceif
f
kkkkkk
k
+++++=φ
Fatores que afetam a Fatores que afetam a Fluorescência Fluorescência
a) Tipo de transiçãoPrincipal π* → π (100 a 1000x > π* → n) Não ocorre δ* → δ, pois 200 nm = 140 kCal/mol
b) Estrutura: duplas conjugadas (π* → π )c) Rigidez estrutural d) Solvente e Temperaturae) pH f) O2 dissolvido
5
Rigidez estrutural
Fluoreno φ = 1 Bifenila φ = 0,2
Fluorescência x ConcentraFluorescência x Concentra ççãoão
( )IIF −= 0φ
bCbC III
I εε −− ×=∴= 1010 00
( )bCIF εφ −−= 1010
Expandindo o termo exponencial em Expandindo o termo exponencial em sséérie de rie de MaclaurinMaclaurin ::
( ) ( )
−+−= ...
!3
303,2
!2
303,2303,2
32
0
bCbCbCIF
εεεφ
kCIF
bCIF
bC
0
0 303,2
05,0
==
∴<εφ
εSe
16
4
.105
10~−−< LmolxC
ε
Fatores que afetam a Fatores que afetam a linearidadelinearidade
• Auto-supressão: perda de energia por choques em concentrações mais altas;
• Auto-absorção: absorção de radiação por moléculas não excitadas, entre as excitadas e o detector. Importante quando ocorre a fluorescência de ressonância.
FLUORÍMETRO
6
FONTES DE UVFONTES DE UV FLUORFLUORÍÍMETROSMETROS
MEDIDOR DE CLOROFILA EM CAMPO
Bacterial luciferin is a reduced riboflavinphosphate (FMNH2, pictured here)
GambiômetroGambiômetro ((quininômetroquininômetro ))
• Excitação por lâmpada de vapor de mercúrio;
• Detecção por célula fotoelétrica (calculadora solar);
• Detecção por ldr (plotar 1/R x F);
• Sem sistema de seleção de λλλλ ;• Determinação de quinino em água tônica.
Água tônica:Água gaseificada com 20 – 70 mg L-1 de quinino,Benzoato de sódio (C6H4 COONa); Sorbato de potássio (H3C- CH=CH-CH=CH-COOK)Ácido tartárico (HOOC – CH(OH)-CH(OH)-COOH)Ácido cítrico – (HOOCCH2 )2-C(OH)- COOH
7
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
30
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Espectro de Fluorescência (Emissão) λ
EXC = 350 nm
Espectro de Excitação (Absorção)
F (cpsx10
-6)
Abs
orvâ
ncia
λ (nm)
N
OCH3
OH N
CH2
200 300 400 5000.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500 Espectro de Absorção
Tonica Quinina
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de Onda (nm)
GambiômetroGambiômetro ((quininômetroquininômetro ))
VANTAGENSVANTAGENS
• Maior Sensibilidade e menor limite de detecção (até 1000x mais sensível que a espectrofotometria);
• Grande Seletividade nas determinações diretas
DESVANTAGENSDESVANTAGENS
• Exatidão e Precisão 2 a 5 x pior que EAM;
• Fosforimetria menos precisa que a Fluorimetria;
• Alto custo;
• Menor Aplicabilidade.
APLICAAPLICA ÇÇÕES FLUORIMETRIAÕES FLUORIMETRIA
• Espécies orgânicas: Enzimas, coenzimas, agentes medicinais, produtos de plantas, alcalóides, esteróides, vitaminas, ...
• Espécies inorgânicas: metais (quelatosfluorescentes), ânions (inibição de fluorescência)
Métodos fluorimétricos p/ espécies inorgânicas
Íon determinado
Reagente Comprimento de onda (nm)
Sensibilidade (µg mL-1)
Interferentes
Excit. Emis. Al3+ Alizarina
Granada R 470 500 0,007 Be, Co, Cr, Cu,
F-, NO3-, Ni,
PO43-, Th, Zr
F- Alizarina Granada R com
Al3+
470 500 0,001 Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO4
3-, Th, Zr
B4O72- Benzoína 370 450 0,04 Be, Sb
Cd2+ 2-(o-hidroxifenil)-benzoxanol
365 Azul 2 NH3
Li+ 8-hidroxiquinolina 370 580 0,2 Mg Sn4+ Flavonol 400 470 0,1 F-, Zr, PO4
3- Zn2+ Benzoína --- Verde 10 B, Be, Sb,
íons coloridos
Ca2+ Calceína 330 540 0,04 ?
8
NOH
8-hidroxiquinolina:
Al, Be e outros metais
N+
O
Zn
3
complexo fluorescente de
Zn-8-hidroxiquinolina
OH
OH
N N
OH
SO3NaAlizarina granada R
(p/ Al3+, F-)
Ligantes FluorescentesLigantes FluorescentesO
OHO
Flavonol
reag. p/ Zr e Se
O
OH
Benzoína
reag. p/ B, Zn, Ge e Si
OO OH
OH
O
N(CH2CO2-)2(-O2CH2C)2N
Calceína
OO OH
OH
O
Fluoresceína
FOSFORÍMETROAPLICAAPLICA ÇÇÕES FOSFORIMETRIAÕES FOSFORIMETRIA
• Ácidos nucléicos,
• Aminoácidos,
• Purina e Pirimidina,
• Hidrocarbonetos do petróleo,
• Pesticidas
FLUORÍMETROEfeito da substituição da fluorescência do benzeno
Composto Fórmula λ de Fluorescência
(nm)
Intensidade relativa de
fluorescência Benzeno C6H6 270-310 10 Tolueno C6H5CH3 270-320 17
Propilbenzeno C6H5C3H7 270-320 17 Fluorobenzeno C6H5F 270-320 10 Clorobenzeno C6H5Cl 275-345 7 Bromobenzeno C6H5Br 290-380 5 Iodobenzeno C6H5I --- 0
Fenol C6H5OH 285-365 18 Fenolato C6H5O
- 310-400 10 Anizol C6H5OCH3 285-345 20 Anilina C6H5NH2 310-404 20 Anilínio C6H5NH3
+ --- 0 Ácido benzóico C6H5COOH 310-390 3
Benzonitrila C6H5CN 280-360 20 Nitrobenzeno C6H5NO2 --- 0
9