1
Reaktivniacute formy kysliacuteku
v lidskeacutem těle
Vyacutezbroj fagocytů
MUDr Jan Plaacuteteniacutek PhD
Uacutestav leacutekařskeacute biochemie a laboratorniacute diagnostiky 1LF UK
Co je volnyacute radikaacutel
- molekula atom nebo ion schopnyacute
samostatneacute existence kteryacute obsahuje alespoň
jeden nepaacuterovyacute elektron
O2middotndash
radikaacutel ion
molekula
2
K čemu vlastně potřebujeme kysliacutek
Přenos elektronů (oxidace) z organickyacutech laacutetek na kysliacutek uvolňuje obrovskeacute množstviacute energie
Př Glukosa
CC66HH1212OO66 + 6 O+ 6 O22 rarrrarrrarrrarr 6 CO6 CO22 + 6 H+ 6 H22OO
∆∆∆∆∆∆∆∆GGoorsquorsquo = = ndashndash 2820 2820 kJkJ mol mol (180 g glukosy)(180 g glukosy)
Reaktivitu kysliacuteku lze naviacutec regulovat katalyacutezou přechodnyacutemi kovy (železo měď)
Hořiacute cukr
3
4
Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je
biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům
bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces
bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli
bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku
Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute
mitochondriaacutelniacute membraacuteny
5
elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho
potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku
celkovaacute reakce
NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O
∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1
Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute
protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
2
K čemu vlastně potřebujeme kysliacutek
Přenos elektronů (oxidace) z organickyacutech laacutetek na kysliacutek uvolňuje obrovskeacute množstviacute energie
Př Glukosa
CC66HH1212OO66 + 6 O+ 6 O22 rarrrarrrarrrarr 6 CO6 CO22 + 6 H+ 6 H22OO
∆∆∆∆∆∆∆∆GGoorsquorsquo = = ndashndash 2820 2820 kJkJ mol mol (180 g glukosy)(180 g glukosy)
Reaktivitu kysliacuteku lze naviacutec regulovat katalyacutezou přechodnyacutemi kovy (železo měď)
Hořiacute cukr
3
4
Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je
biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům
bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces
bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli
bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku
Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute
mitochondriaacutelniacute membraacuteny
5
elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho
potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku
celkovaacute reakce
NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O
∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1
Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute
protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
3
4
Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je
biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům
bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces
bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli
bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku
Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute
mitochondriaacutelniacute membraacuteny
5
elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho
potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku
celkovaacute reakce
NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O
∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1
Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute
protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
4
Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je
biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům
bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces
bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli
bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku
Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute
mitochondriaacutelniacute membraacuteny
5
elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho
potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku
celkovaacute reakce
NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O
∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1
Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute
protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
5
elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho
potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku
celkovaacute reakce
NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O
∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1
Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute
protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
6
Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu
O2
2H2O
+4 e-
(+4 H+)
O2middotndash
superoxid
H2O2peroxid vodiacuteku
OHmiddothydroxylovyacute
radikaacutel
+3 e-
(+3 H+)
+2 e-
(+2 H+)
+1 e-
( +H2O )
Superoxidbull Zdroje v těle
ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek
- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech
- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa
ndash NAD(P)H Oxidasa
- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)
- Nefagocytaacuterniacute buňky
ndash Některeacute enzymy
- Xanthinoxidasa
- Cyklooxygenasa
- Lipoxygenasa
ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem
ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)
O2middotndash
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
7
Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci
bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)
bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu
Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu
Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
8
Superoxid
bull Vlastnosti
- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo
- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)
- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů
bull Osud
ndash Dismutace
ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem
O2middotndash
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)
Peroxid vodiacuteku
bull Tvorba v těle
ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)
ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa
bull Monoaminooxidasa (MAO)
H2O2
O2middotndash + O2
middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
9
Peroxid vodiacuteku
bull Vlastnosti
- Neniacute radikaacutel
- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny
- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute
- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)
bull Osud
ndash Fentonova reakce
ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou
H2O2
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
hydroxylovyacute radikaacutel
Hydroxylovyacute radikaacutel
bull Vznik v těle
ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute
ndash Fentonova reakce
bull Vlastnosti
- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku
OH middot
H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
H2O rarr H + OHmiddot
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
10
Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)
bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash
ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot
bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2
ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3
ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2
Oxid dusnatyacute
bull Vznik v těle
ndash NO synthasovaacute reakce
ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)
NO middot
L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
11
Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva
ceacutevniacute stěny
Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy
(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute
inaktivace)
- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)
- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)
NO middot
NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit
OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2
kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
12
Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)
bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2
bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+
ndash Nitroxyl NOndash
ndash Kyselina dusitaacute HNO2
ndash Oxid dusityacute N2O3
ndash Oxid dusičityacute N2O4
ndash Nitronium NO2+
ndash Peroxynitrit ONOO ndash
ndash Alkylperoxynitrit ROONO
Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul
bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech
bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace
bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
13
Peroxidace
lipidů (žluknutiacute)
Dalšiacute osud lipoperoxidů
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
14
Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody
H2O + hν rarr H + OHmiddot
Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu
Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2
middotndash
Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2
middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2
Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
15
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy
Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce
Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH
FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O
FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH
Kde jsou RONS prospěšneacute
I Aktivniacute centra enzymů
bull Monooxygenasy (cytochromy P450)
bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)
bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)
bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy
ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze
Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin
ndash Myeloperoxidasa neutrofilů
ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech
SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O
(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
16
Kde jsou RONS prospěšneacute
II Signalizace
bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny
gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis
ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti
ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)
Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO
OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami
Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček
atd
SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami
Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd
A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute
NO + O2middotndash rarr OONOndash
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
17
Koncept redoxniacute signalizace
bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD
bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny
ndash Fe-S centra
bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory
ndash proteinkinasy a fosfatasy
Redoxniacutesignalizace
bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory
bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk
bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute
(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
18
hellip a velmi
komplikovaneacute
Kde jsou RONS prospěšneacute
III Fagocytoacuteza
bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie
bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)
bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici
ndash Rozpoznat
ndash Pohltit
ndash Zabiacutet
ndash Straacutevit
copy 1998 Garland Publishing
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
19
Neutrofilniacute granulocyt
(polymorfonukleaacuter)
bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)
granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy
bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa
bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy
Obrhttpblausencom
Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
20
Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky
Respiračniacute vzplanutiacute
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)
bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)
NADPH oxidasa
bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu
bull Katalyzuje reakci
NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash
bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu
bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute
granulomatosa)
bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
21
Myeloperoxidasa
bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu
hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje
předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O
bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky
Kyselina chlornaacute
- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute
chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O
- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)
- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel
HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot
- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy
R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O
HClO
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu
22
Dalšiacute zbraně neutrofilů
bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad
bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů
bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v
bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA
a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně
Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi
např HClO inhibuje α1-antitrypsin
RONS ve vyacutezbroji fagocytů
iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu