Download - Respuesta neuroendocrina en TB
Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR
Lic. Verónica V. Bozza
Directora: Dra. María Luisa Bay
Estudios moleculares y funcionales en células mononucleares de pacientes con Tuberculosis pulmonar, estimuladas in vitro con Mycobacterium tuberculosis y tratadas con Cortisol y/o Dehidroepiandrosterona
Esta situación es equivalente a más de 10 Boeing 747 llenos de personas muriendo por día a causa de esta crisis global de salud Nature immunology, vol 4, Nº 10 octubre,2003.
¿Por que investigar sobre Tuberculosis?
Es la 1º causa de mortalidad debido a un agente bacteriano.1/3 de la población mundial se encuentra afectada.Mueren 4.900 personas por día
Tuberculosis
Agente causal: Mycobacterium tuberculosis
Bacilo ácido-alcohol resistente
Aerobio estricto y de vida intracelular
Principal vía de transmisión:
AÉREA
Mayor incidencia de TB pulmonar
Eventos cronológicos en la Eventos cronológicos en la patogénesis de la tuberculosis:patogénesis de la tuberculosis:
Inhalación del M. tuberculosis
Eliminación del patógeno
Complejo primario
Estabilización(latencia)
Infección localizada
Diseminación del M. tuberculosis
Infecciónaguda
Estabilización(latencia)
Reactivación(TBC secundaria)
Th
Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:
M
CPA
IL-12
NK
Th1
IFN-
T citotóxico
RIN
RIO
IL-2
Th
Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:
CPA
TNF-
IL-12
NK
Th1
IFN-
T citotóxico
MRIN
RIO
IL-2 Granuloma
EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-ADRENALADRENAL
GC
Sostenido apoptosis de linfocitos
Inhiben la síntesis de citocinas Th1
Inhiben la respuesta inflamatoria favoreciendo la actividad de linfocitos Th2
Optimizan el curso de respuestas biológicas agudas
DHEA
Facilita el patrón Th1
Esteroide sintetizado fundamentalmente en corteza suprarrenal y SNC
En humanos muchas enfermedades caracterizadas por inflamación crónica presentan bajos niveles séricos de DHEA o DHEA-S
OBJETIVO GENERAL DE LA LÍNEA DE TRABAJO
Estudiar los mecanismos inherentes a la interacción inmunoendócrina en pacientes con tuberculosis de distinta severidad, y convivientes íntimos no enfermos de estos pacientes.
MUESTRAMUESTRASS
PACIENTES: PACIENTES:
Enfermos con diagnóstico de TBC pulmonar, basados en criterios clínicos y radiológicos e identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes en el esputo
CLASIFICACIÓN: Leves: pacientes con un único lóbulo
involucrado sin cavidades visibles Moderados: pacientes que presenten
compromiso unilateral de 2 o más lóbulos y las cavidades, de hallarse presentes, no excedan un diámetro total de 4 cm
Severos: enfermedad bilateral con afectación masiva y cavidades múltiples
GRUPO CONTROL:GRUPO CONTROL: Muestras provenientes de individuos sanos
similares en edad y sexo a los pacientes.
Tanto las muestras de los pacientes como las de los controles se analizaron en forma simultánea.
Se excluyen del estudio aquellos sujetos que:
Presenten co-infección con HIV.
Hayan iniciado el tratamiento antituberculoso.
Presenten patologías con compromiso directo
de la glándula suprarrenal.
Presenten patologías que involucren los ejes
hipotálamo-hipófiso-tiroideo y gonadal.
Padezcan patologías que requieran del consumo
de drogas corticosteroideas, inmunosupresoras
o inmunomoduladoras.
Muestra
Células
Tratamientos
Evaluar la
blastogénesis
Obtener sobrenadantes para dosar citocinas
TRATAMIENTOSTRATAMIENTOS
Cortisol (Gc)Cortisol (Gc)
1010-6-6 Molar Molar 1010-7-7 Molar Molar
Dehidroepiandrosterona(DHEA)Dehidroepiandrosterona(DHEA)
1010-7 -7 Molar Molar 1010-8-8 Molar Molar 1010-9 -9 Molar Molar 1010-10-10 Molar Molar
Sonicado de Mycobacterium tuberculosis,
concentración: 8 g/ml (Tso)
Concanavalina A, concentración: 2,5g/ml (Con A)
Los sobrenadantes se levantaron a las 36 hs y 4 días de cultivo Se fraccionaron y congelaron para la posterior determinación de las citocinas
D 10-10D 10-8 D 10-9
GC 10-6
GC 10-7
D 10-7
GC 10-6 GC 10-6GC 10-6
GC 10-7 GC 10-7 GC 10-7
D 10-7
D 10-8
D 10-8
D 10-9
D 10-9
Basal TSO
D 10-7
GC 10-7
D 10-10
GC 10-6
D 10-10
TratamientoTratamiento GruposGrupos
ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros
TsoTso 1274812748(7839-(7839-20834)20834)
25712571(1474-(1474-11049)11049)
64876487(1593-16439)(1593-16439)
42434243(600-(600-
7356)¶7356)¶
Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-6-6
MM
25712571(1333-(1333-8376)8376)**
881881(442-7857)(442-7857)
11351135(469-4620)(469-4620)**
18261826(359-(359-
3563)3563)**
Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-7-7
MM
87948794(3256-(3256-13994)13994)
14961496(1124-(1124-3611)3611)
35093509(794-6380)(794-6380)
27912791(498-(498-
12907)12907)
Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).
Resultados Previos:Scandinavian Journal of Immunology 60, 639–646, 2004
TratamientoTratamiento GruposGrupos
ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros
TsoTso 1274812748(7839-20834)(7839-20834)
25712571(1474-11048)(1474-11048)
64866486(1592-16439)(1592-16439)
42434243
(600-7356) (600-7356) ¶¶Tso +Tso +
Cortisol 10Cortisol 10-6-6 M M25702570
(1333-8376) (1333-8376) **880880
(441-7857)(441-7857)11351135
(469-4620) (469-4620) **18261826
(359-3563) (359-3563) **+ DHEA 10+ DHEA 10-7-7 M M 32193219
(840-9486)(840-9486)809809
(554-4881)(554-4881)17251725
(488-5533)(488-5533)15801580
(449-4314)(449-4314)
+ DHEA 10+ DHEA 10-8-8 M M 26752675(1034-8857)(1034-8857)
906906(471-7925)(471-7925)
11221122(512-4785)(512-4785)
16691669(419-4742)(419-4742)
+DHEA 10+DHEA 10-9-9 M M 27932793(755-9084)(755-9084)
760760(490-5284)(490-5284)
890890(552-6847)(552-6847)
18311831(467-4496)(467-4496)
+ DHEA 10+ DHEA 10-10-10 MM
22172217(822-8990)(822-8990)
809809(498-5812)(498-5812)
895895(713-5942)(713-5942)
21662166(464-3070)(464-3070)
Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).
1- Conocer si las modificaciones observadas en la respuesta inmune específica de las CPM frente a TSO, por el agregado de Cortisol y/o DHEA, se encontrarían asociadas a un patrón diferencial en el proceso de muerte celular programada y analizar los mecanismos implicados en este proceso.
D 10-9D 10-7 D 10-8
GC 10-6D 10-7
GC 10-6 GC 10-6GC 10-6
D 10-8D 10-9
Basal TSOGC 10-6
solo
GC 10-7
soloD 10-7
sola
Determinación de los niveles de apoptosis por citometría de flujo
Anexina V/IP(24 Horas de cultivo)
Hipodiploidía (IP)(4 días de cultivo)
Anexina V/IP
Hipodiploidía (IP) (4 días de cultivo)
Células apoptóticas
Niveles de IL-10
Niveles de TGF-
Niveles de IFN-
Los pacientes TB presentaban:Niveles de
CortisolNiveles de DHEA
Niveles de IL-6
Resultados Previos en Plasma:
CONVIVIENTES: CONVIVIENTES:
Personas que viven con un enfermo diagnosticado y con esputo positivo; sin sintomatología, RX normal y sin trastornos endócrinos
Tanto las muestras de los pacientes como las de los convivientes y controles se analizaron en forma
simultánea
2- Analizar el perfil de citocinas (IFN-γ, TGF-β, IL-10, IL-6 y TNF-α) producidas en la respuesta inmune específica de CPM de pacientes y de convivientes íntimos; así como los niveles plasmáticos de los mencionados mediadores, y de Cortisol y DHEA en los distintos grupos de estudio
Determinación de los niveles de citocinas en sobrenadantes de cultivo:
•IFN-
•TNF-
•IL-6
•IL-10
•TGF-
•24 Hs
•36 Hs
•4 Días
Las determinaciones se realizarán por ELISA, utilizando kits comerciales
Resultados Previos:
Los pacientes TB presentaban:
En la producción de IFN-
En la producción de TGF-
= En la producción de IL-10
CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO:
(VS. CONTROL)
CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO + GC 10-6 M: (VS. CULTIVOS ESTIMULADOS)
En la producción de IFN-
= En la producción de TGF-
= En la producción de IL-10
• Adaptación adherente de la línea original NCI-H295
que crece en suspensión.
• Se originaron a partir de un adenocarcinoma adrenal
proveniente de una mujer de edad media de raza
negra.
• Conservan la capacidad de respuesta a estímulos
fisiológicos produciendo todos los esteroides adrenales.
Línea celular adrenal NCI-H295-R
Producción porcentual de DHEA en sobrenadantes de cultivos de células NCI-H295-R, adicionadas con pool de sobrenadantes de CPM de pacientes tuberculosos y controles sanos con o sin el agregado de TSO.
4- Investigar qué mediador(es) secretados por las células periféricas mononucleares (estimuladas o no con TSO) estarían implicados en la inhibición de la síntesis de DHEA por parte de la línea celular adrenal humana NCI-H295-R.
Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO
Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo
Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal
Cuantificación de DHEA y Cortisol
Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO
Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo
Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal
Cuantificación de DHEA-S y Cortisol
Adición de anti-TGF-
Muestra
Células
Tratamientos
Evaluar la
blastogénesis
Obtener sobrenadantes para dosar citocinas
Obtener células para estudiar apoptosis
Obtener sobrenadantes para exp. con la línea adrenal
HEMOGRAMA
POBLACIONES