Universitatea din Bucureti Facultatea de Chimie

coala Doctoral n Chimie Departamentul de Chimie Analitic

STUDII ASUPRA INJECIEI VOLUMELOR MARI DE PROB N CROMATOGRAFIA DE

LICHIDE N FAZ INVERS

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Doctorand, Conductor tiinific, tefan Udrescu Profesor Dr. Victor David

Comisia de evaluare: Preedinte: Prof. Dr. Dumitru Oancea, Membru Corespondent al Academiei Romne,

Decanul Facultii de Chimie, Universitatea din Bucureti Prof. Dr. Andrei Medvedovici - Universitatea din Bucureti Conf. Dr. Costel Srbu - Universitatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca C.P. I Dr. Dan Florin Anghel - Institutul de Chimie-Fizic Ilie Murgulescu al

Academiei Romane

2012

2

CUPRINS (numerotarea paginilor este cea corespunztoare tezei de doctorat)

CAPITOLUL 1 ASPECTE TEORETICE I INSTRUMENTALE PRIVIND INJECIA PROBELOR N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN

1.1. Generalitti privind sistemele de injecie 1 1.2. Valva de injecie (principii constructive) 2 1.3. Modaliti de injectare; calificarea operaional a injectoarelor 6 1.4. ncrcarea coloanei 10 1.5. Cromatografia de lichide: mecanismul de retenie n faz normal 16 1.6. Cromatografia de lichide: mecanismul de retenie n faz invers 24 1.7. Modelul adsorbiei aplicat n cromatografia de lichide n faz invers

la injectarea de solveni hidrofobi 30 1.8. Fenomene generale de retenie la injectarea probelor n cromatografia

de lichide n faz invers 37 1.9. Influena volumului de injecie asupra funciei de calibrare 47

CAPITOLUL 2 STUDII ASUPRA INJECIEI VOLUMELOR MARI DE PROB N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE N FAZ INVERS

2.1. Scopul cercetrii asupra volumului de injecie n cromatografia de lichide 51 2.2. Injectare de volume mari de solveni organici miscibili cu faza mobil 53 2.3. Injectare de volume mari de probe apoase 58 2.4. Injectare de volume mari de solventi organici nemiscibili cu faza mobil n

cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de injecie 74 2.5. Injectare de volume mari de solventi nemiscibili cu faza mobil n cazul

analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare dect a solventului de injecie 86 2.6. Aplicaii practice ale injeciei de volum mare pentru analii cu o hidrofobicitate mai

pronunat dect a solventului de injecie 90 2.7. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil

la determinarea indapamidului din snge prin HPLC-MS/MS 102 2.8. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil

la determinarea fenspiridei din plasm prin HPLC-MS/MS 118 Concluzii finale 130 Bibliografie 134

3

PRIVIRE DE ANSAMBLU

Lucrarea intitulat Studii asupra injeciei volumelor mari de prob n cromatografia de lichide n faz inversa fost structurat n dou capitole, primul capitol reprezentnd partea teoretic a lucrrii iar al doilea capitol reprezentnd partea experimental:

Capitolul 1 cuprinde informaii de literatur referitoare la aspectele teoretice i experimentale privind injecia probelor n cromatografia de lichide de nalt performan.

Capitolul 2 cuprinde contribuiile originale, experimentale i teoretice, n ceea ce privete injecia volumelor mari de prob n cromatografia de lichide n faz invers.

Volumul de injecie n cromatografia de lichide este un parametru care influeneaz sensibilitatea i limita de detecie. Asupra acestui parametru exist un numr mare de restricii, n special atunci cnd solventul probei injectate nu este identic sau compatibil cu faza mobil utilizat n procesul de retenie cromatografic.

innd cont de importana acestui parametru n analiza prin cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC) a probelor multicomponent, n lucrarea de fa s-au studiat att influena volumului de injecie asupra parametrilor cromatografici obinui, ct i natura solventului i influena sa asupra procesului de retenie cromatografic.

Au fost selectate trei categorii de solveni de prob pentru studiat: solveni organici miscibili cu faza mobil, solventi aposi (amestec de solvent organic cu ap sau ap n care este dizolvat un aditiv anorganic oarecare, fie el o sare sau un agent de reglare a pH-ului) respectiv solveni organici hidrofobi, nemiscibili cu faza mobil (hidrocarburi alifatice inferioare, alcooli alifatici superiori). Solveni nemiscibili cu faza mobil pot fi mprii n 3 categorii n funcie de hidrofobicitatea pe care o pot avea analiii de interes comparativ cu solventul de injecie (mai mic, mai mare respectiv aproximativ egal). Aceast clasificare a solvenilor este foarte important pentru c diferena de hidrofobicitate ntre solventul de injecie i analitul de interes poate fi critic pentru succesul unei astfel de abordri.

n cele ce urmeaz vor fi prezentate principalele rezultate experimentale i cele mai importante aspecte teoretice, cu meniunea c numerotarea figurilor, tabelelor i trimiterilor bibliografice rmne aceeai cu cea din tez.

4

2.1. Injectare de volume mari de solveni organici miscibili cu faza mobil

Problematica studiului Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n

solveni organici miscibili cu faza mobil a fost ales un grup de compui de hidrofobicitate medie a cror structur i log KOW calculat prin metoda fragmentelor moleculare [folosind programul EPI Suite - KOWWIN versiunea 1.67, al Environmental Protection Agency, SUA] sunt prezentate n tabelul de mai jos. Ca solveni de probe au fost folosii metanol ( C025 = 0,544 cP), acetonitril ( C025 =0,343 cP) i izopropanol ( C025 =1,96 cP). Tria elutropic a acestor solveni creste n ordinea metanol-acetonitril-izopropanol.

Tabel 2.1. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Metil paraben

OH

O OCH3

1,96

Acid salicilic

O OH

OH

2,25

Piroxicam N NH

O

NS

OH

OO

2,58

Propil paraben

OH

O OCH3

2,98

Meloxicam

O

NS

OH

OO

S

N

NH

3,50

Fenofibrat Impuritate A Cl

O

OH

3,31

Condiii experimentale Sistemul cromatografic utilizat a fost de tip Agilent 1100 (produs de Agilent Tehnologies) i a

fost compus din: cabinet de solveni, degazor (G1379A), pomp cuaternar (G1311A); injector automat (G1329A), termostat pentru coloan(G1316A), detector DAD (G1315B).

Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C18, 15 cm x 4,6 mm i.d. x 5 m d.p., termostatat la 25oC. Studiul a fost efectuat n condiii izocratice (35% acetonitril i 65% soluie apoas 0,2% H3PO4) folosind un debit al fazei mobile de 2,0 mL/min. Detecia a fost fcut la lungimea de und de 237 nm.

Concentraiile analiilor de interes n probele injectate au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic s ramn constant (250 ng) pentru cele 4 volume de injecie investigate: 5, 10, 20 i 25 L.

Rezultate experimentale Cromatogramele obinute n condiiile descrise mai sus sunt prezentate pentru cazurile

extreme (volumele de injecie 5 respectiv 25 L) i discutate n cele ce urmeaz. Dup cum se poate observa compoziia fazei mobile a fost aleas n aa fel nct s permit obinerea unei separri bune a compuilor studiai. Ordinea de eluie este: 1- metil paraben; 2- acid salicilic; 3-

5

piroxicam; 4- propil paraben; 5- meloxicam; 6- fenofibrat impuritate A.

Fig. 2.1 Cromatogramele rezultate pentru Vinjecie = 5 L

Fig. 2.4 Cromatogramele rezultate pentru Vinjecie = 25 L

Din datele teoretice existente ar fi de ateptat ca n cazul izopropanolului distorsiunile de form de pic s apar la volume mai mici de injecie dect n cazul folosirii acetonitrilului sau metanolului ca solvent de injecie (att tria elutropic ct i vscozitatea solventului sunt cele mai mari din seria de solveni de prob aleas) i ca distorsiunile de form de pic s fie mai pronunate pentru compuii cu factori de retenie mai mici, n timp ce pentru cei cu factori de retenie mai mari efectele ar trebui s fie mai puin sesizabile.

Dup cum se poate constata din figura 2.2 distorsiunile de form de pic ncep s apar n cazul injeciei de 10 L doar pentru injecia de analii dizolvai n izopropanol. Deformarea picului este abia sesizabil pentru metil paraben care este primul compus n ordinea de eluie (factor de retenie 1,8), i mai pronunat pentru piroxicam (al 3-lea compus n ordinea de eluie, factor de retenie 3,8) i meloxicam (al 5-lea compus n ordinea de eluie, factor de retenie 12,1), n timp ce pentru ceilali compui nu se poate sesiza deformarea picurilor cromatografice.

n momentul n care cretem volumul de injecie la 20 L deformarea formei de pic ncepe s apar i la injeciile de soluii n acetonitril respectiv metanol (n cazul izopropanolului deja putem vorbi chiar de splitare a picului). Deformrile formei de pic sunt mai pronunate pentru acetonitril dect pentru metanol; prin simpla examinare a figurii 2.3 n cazul injeciei de metanol am putea spune chiar c aceste deformri sunt nesemnificative i ca analiii notrii ramn practic neafectai, de aceea suntem nevoii sa examinm i valorile numerice calculate pentru simetria picurilor cromatografice din tabelul de mai jos:

Tabel 2.2. Simetria picurilor analiilor de interes Simetria picului corespunztor Solvent de prob/volum

injecie metil paraben acid

salicilic piroxicam propil

paraben meloxicam fenofibrat

impuritate A metanol/ 5 L 0,93 0,72 0,96 0,98 0,97 1,00 acetonitril/ 5 L 0,93 0,75 0,96 0,97 1,00 1,00

min0 2 4 6 8 10 12

mAU

0 20

40

60

80

100

120

140

160

Metanol

Izopropanol

Acetonitril

Cl

O

OHO

NS

OH

OO

S

N

NH

OH

O OCH3N N

H

O

NS

OH

OO

OH

O OCH3

O OH

OH

min2 4 6 8 10 12

mAU

0

20

40

60

80

0

Metanol

Izopropanol

Acetonitril

6

Simetria picului corespunztor Solvent de prob/volum injecie metil paraben acid salicilic piroxicam propil paraben meloxicam fenofibrat impuritate A

izopropanol/ 5 L 0,92 0,77 0,96 0,98 0,95 1,01 metanol/ 10 L 0,93 0,70 0,95 0,99 0,99 0,98 acetonitril/ 10 L 0,95 0,75 0,97 1,00 0,97 1,00 izopropanol/ 10 L 1,20 0,82 1,53 1,12 1,33 1,03 metanol/ 20 L 1,44 0,89 1,11 1,30 1,30 1,15 acetonitril/ 20 L 1,72 1,33 1,14 1,57 1,29 1,41 izopropanol/ 20 L 3,21 1,86 3,56 2,72 2,92 2,57 metanol/ 25 L 2,04 1,21 1,53 1,93 1,86 1,63 acetonitril/ 25 L 1,99 1,60 1,40 2,15 1,71 1,81 izopropanol/ 25 L 3,68 2,34 4,26 3,57 3,20 2,94

n cazul probelor dizolvate n metanol picurile cel mai puin afectate sunt cele de acid salicilic, piroxicam i fenofibrat impuritate A (al doilea, al treilea respectiv ultimul n ordinea de eluie) iar cele mai afectate sunt metil parabenul, propil parabenul i meloxicamul (primul, al patrulea respectiv penultimul n ordinea de eluie). Pentru probele dizolvate n acetonitril singurul pic cromatografic care poate fi considerat ca neafectat este cel de piroxicam. Dup cum se poate observa din figura 2.4 pentru injeciile de 25 L toate cromatogramele au un aspect nesatisfctor n privina majoritii analiilor (se poate vedea un nceput de splitare i pentru injeciile de metanol sau acetonitril). n cazul folosirii acetonitrilului ca solvent de prob forma de pic cea mai bun se obine pentru piroxicam iar n cazul folosirii metanolului pentru acid salicilic i piroxicam.

Concluzii asupra studiului Pentru grupul de compui investigai (cu factori de retenie cuprini ntre 1,8 i 15,6) efectul

triei elutropice a solventului de prob asupra formei de pic a analiilor este mai seminficativ dect efectul vscozitii solventului, solventul care duce la cele mai bune forme de pic fiind metanolul.

Cea mai important concluzie care poate fi formulat este c teoria empiric cu primii compui n ordinea de eluie sunt cei mai afectai, cei cu factori de retenie mai mari sunt afectai ntr-o mai mic msur sau chiar neafectai nu se confirm. n plus compuii care sunt cel mai puin afectai difer i n funcie de natura solventului organic. Ca o consecin nu se poate prevedea comportarea unui compus oarecare dizolvat ntr-un solvent organic pe baza vscozitii sau triei elutropice a solventului de prob, succesul sau insuccesul experimentului depinznd i de ali factori experimentali nedecelati.

2.2. Injectare de volume mari de probe apoase

Problematica studiului Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume mari de probe apoase a fost folosit

acelai grup de compui de hidrofobicitate medie investigat n capitolul precedent. Probele denumite generic probe apoase sunt n fapt probe dizolvate ntr-un amestec binar de solvent organic i o component apoas (care este de fapt componenta majoritar a solventului de prob). Solventul organic selectat pentru efectuarea experimentelor a fost metanolul (n conformitate cu concluziile capitolului precedent fiind solventul care genereaz cele mai bune forme de pic). Studiul a pornit ca urmare a altui studiu anterior [61], bazat pe efectul salting-out datorat triei ionice a solventului probei.

Condiii experimentale Separarea cromatografic a fost efectuat n condiiile prezentate n capitolul precedent.

Componentele apoase ale amestecului binar folosit ca solvent de injecie au fost: ap, soluie apoas 0,2% H3PO4, soluie apoas 25% NaCl, respectiv soluie apoas 25% NaCl i 0,2% H3PO4. Pentru toi cei 4 solveni apoi menionai mai sus am preparat probe n urmtoarele rapoarte de combinare (v/v) cu metanol:

- 20% metanol/80% solvent apos; - 30% metanol/70% solvent apos; - 35% metanol/65% solvent apos (n cazul solvenilor de probe ce conineau NaCl s-a

7

observat o precipitare parial a acesteia). Concentraiile analiilor de interes au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit

injectat n coloana cromatografic s ramn constant (250 ng) pentru cele 5 volume de injecie investigate: 50, 100, 200, 400 respectiv 500 L.

Rezultate experimentale Cromatogramele obinute pentru injeciile de 500 L sunt prezentate pentru exemplificare

suprapuse cu o cromatograma corespunztoare unei injecii de 5 L de analii dizolvai n metanol n figura 2.5. Pentru cromatograma notat cu (A) solventul de injecie este 20% metanol/80% ap, pentru cromatograma notat cu (B) solventul de injecie este 20% metanol/80% soluie apoas 25% NaCl, pentru cromatograma notat cu (C) solventul de injecie este 20% metanol/80% soluie apoas 0,2% H3PO4 iar pentru pentru cromatograma notat cu (D) solventul de injecie este 20% metanol/80% soluie apoas 25% NaCl i 0,2% H3PO4.

Fig. 2.5 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum maxim prezentate comparativ cu injecia de 5 L n metanol

Se poate observa c n cazul tuturor cromatogramelor (cu excepia cromatogramei (A) forma de pic pentru toi compuii investigai este excelent. n cromatograma (A) doar picul corespunztor acidului salicilic are o form nesatisfctoare, celelalte picuri avnd o form acceptabil. Acidul salicilic are un tailing pronunat i picul este mai lat comparativ cu celelate variante de solvent de probe investigate, fapt ce poate fi pus pe seama diferenei de pH ntre solventul de injecie i faza mobil.

Pe baza timpilor de retenie obinuti experimental au fost calculai factorii de retenie pentru fiecare compus studiat. Au fost determinate dependenele funcionale ntre volumul de injecie (Vinj exprimat n L) i factorul de retenie (k) al compuilor studiai pentru fiecare solvent de prob n parte. n cazul tuturor compuilor i a tuturor solvenilor de proba investigai dependena ntre factorul de retenie i volumul de injecie este liniar i cresctoare.

Ordonata la origine a ecuaiei liniare reprezint factorul de retenie obinut pentru cazul ipotetic al unui volum de injecie nul. Este evident c acest factor de retenie trebuie s fie dependent doar de natura analitului i s nu fie influenat de natura solventului de prob, fapt demonstrat experimental prin calcularea deviaiei relative standard a ordonatei la origine in cazul fiecrui compus considernd toate experimentele efectuate (deviaia relativ standard maxima acceptat este de 2%):

Tabel 2.3. Deviaia relativ standard a valorii lui A Analit RSD (%)

Metil paraben 0,14 Acid salicilic 0,28 Piroxicam 0,43

Propil paraben 0,11 Meloxicam 0,08

Fenofibrat impuritate A 0,10

min0 2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350 Cl

O

OHO

NS

OH

OO

S

N

NH

OH

O OCH3

N NH

O

NS

OH

OO

OH

O OCH3

O OH

OH

5 L MeOH

(A)

(B)

(C)

(D)

8

Pentru valorile pantelor ecuaiilor liniare deviaiile relative standard calculate sunt prezentate n tabelul de mai jos; valorile mai mari obinute pentru fiecare analit n parte pot fi justificate prin valorile absolute foarte mici ale lui B (prin medierea tuturor valorilor individuale se obine valoarea de 9,75 10-4).

Tabel 2.4. Deviaia relativ standard a valorii lui B Analit RSD (%)

Metil paraben 4,50 Acid salicilic 4,44 Piroxicam 9,69

Propil paraben 4,19 Meloxicam 4,36

Fenofibrat impuritate A 5,56

Pasul urmtor a fost ncercarea de a stabili dac exist o dependen funcional ntre volumul de injecie i eficiena picurilor cromatografice ale compuilor studiai pentru fiecare solvent de prob n parte. n marea majoritate a condiiilor experimentale studiate se poate constata un efect pozitiv al creterii volumului de injecie asupra eficienei picurilor analiilor (pentru propil paraben i Fenofibrat impuritate A eficiena crete cu creterea volumului de injecie n toate cazurile studiate ). n cazul acidului salicilic n prezena unui aditiv acid n solventul de prob eficiena crete cu creterea volumului de injecie iar n absena acestuia eficiena scade cu creterea volumului de injecie (fapt explicabil prin diferena de pH ntre solventul de injecie i faza mobil, diferen cu att mai important cu ct volumul de injecie este mai mare).n cazul metil parabenului ceea ce influeneaz comportarea eficienei cu creterea volumului de injecie este procentul de component organic n solventul de injecie (pentru 20% metanol n solventul de injecie eficiena crete cu creterea volumului de injecie n timp ce pentru 35% metanol eficiena scade cu creterea volumului de injecie).

Concluzii asupra studiului Injectarea de volume mari de probe apoase altele dect faza mobil (de fapt chiar i

solventul organic coninut n aceste probe este diferit de cel coninut n faza mobil) poate fi facut fr influene majore negative asupra comportamentului reteniei analiilor pentru toate categoriile de probe apoase investigate de la cea mai simpl (un ameste de ap cu solvent organic) pn la cea mai complex (un amestec coninnd pe lng apa i un solvent organic o sare i un agent care s regleze pH-ul). Influena volumului de injecie asupra factorului de retenie nu numai c este nesemnificativ dar este prefect predictibil i explicabil pentru un interval de volume de injecie de cinci ori mai mare dect intervalul de volume de injecie permis de sistemele de injecie folosite n mod curent n practica de rutin.

n cazul unora din analiii de interes pentru o parte din probele apoase considerate se poate observa o scdere moderat a eficienei cu creterea volumului de injecie, scderea fiind observat n special pentru primii analii n ordinea de eluie sau pentru analiii uor disociabili n condiiile unei diferene ntre pH-ul solventului de injecie i cel al fazei mobile. Aceast posibil scdere trebuie avut n vedere n momentul dezvoltrii unei metode analitice, mici ajustri ale metodei cromatografice propriu-zise (n sensul folosirii unei componente apoase a fazei mobile cu o capacitate mai bun de tamponare sau a creterii moderate a factorului de retenie a analitului int) sau ale compoziiei probei injectate (spre exemplu aditivarea cu un volum mic de acid sau baz a probei, aditivul ales fiind n funcie de proprietile acido-bazice ale analitului de interes) pot permite injectarea fr pierderi semnificative de eficien a unui volum de prob cu cteva ordine de mrime mai mare. Un exemplu de injecii de volum mare de astfel de probe este determinarea simultan a furosemidei, spironolactonei i canrenonei din probe de plasm unde volumul de injecie folosit a fost de 400 L [62].

9

2.3. Injectare de volume mari de solventi organici nemiscibili cu faza mobil n cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de injecie

Problematica studiului Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n

solveni organici nemiscibili cu faza mobil n cazul compuilor mai puin hidrofobi dect solventul de injecie a fost ales un set de compui care ndeplinesc aceast condiie de hidrofobicitate i un set de solveni organici nemiscibili cu faza mobil.

Tabel 2.5. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Isosorbid 2 - nitrat

-0,40

Isosorbid 5 - nitrat

-0,15

Pentoxifilin N

NN

N

O

O

O

0,56

Metil paraben

OH

O OCH3

1,96

Tropicamid NN

OH

O

1,19

Condiii experimentale Experimentele au fost efectuate pe sistemul cromatografic descris n capitolul precedent

folosind dou tipuri de faz staionar (C8 i C18). Separrile cromatografice pe coloan de tip C8 au fost efectuate folosind o coloan Zorbax

Eclipse XDB-C8, 15 cm x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p., termostatat la 30oC. Studiile au fost efectuate n condiii izocratice folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min.

Separrile cromatografice pe coloan de tip C18 au fost efectuate folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C18, 15 cm x 4,6 mm i.d. x 5 m d.p., termostatat la 30oC. Studiile au fost efectuate n condiii izocratice folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min. Concentraiile analiilor de interes au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic s ramn constant (500 ng) pentru volumele de injecie investigate: 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 i 500 L. Parametrii separrii cromatografice sunt prezentai detaliat n tez.

Rezultate experimentale Posibilitatea de a face injecii de volum mare de compui dizolvai ntr-un solvent hidrofob se

bazeaz pe afinitatea mai mare a fazei staionare pentru moleculele de solvent de injecie dect pentru moleculele de compui dizolvai n acesta. Modelul bazat pe adsorpie este singurul model care poate explica fenomenele de retenie ce apar la injectarea de volume mari de solveni hidrofobi nemiscibili cu faza mobil.

Cum solventul de injecie este mai hidrofob dect analitul nti va avea loc adsorpia solventului i abia apoi va fi adsorbit analitul de interes. Ca o consecin logic cantitatea de faz staionar care poate interaciona cu analiii de interes scade liniar cu creterea volumului de solvent de prob injectat n coloan. Factorul de retenie al analitului A va depinde liniar de volumul de solvent hidrofob injectat n coloana cromatografic:

10

SAAA Vk = (2.1) Volumul de injecie pentru care factorul de retenie al analitului A este 0 ( 0=kSV ) este volumul

de solvent care blocheaz complet toate lanurile hidrocarbonate existente n faza staionar. Noul strat hidrofob astfel format nu are nici o afinitate cu analitul A prin urmare analitul nu poate fi reinut n coloan.

A

AkSV

=

=0 (2.2)

Pentru toi analiii de interes au fost studiati 3 solveni hidrofobi: n-hexan, n-heptan i i-octan. Parametrii cromatografici interpretai (k i N) au fost luai n calcul sub forma valorii medii a 3 injecii consecutive pentru fiecare volum de injecie investigat.

Fig. 2.30 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum cresctor de soluii n n-hexan de isosorbid 2-nitrat i isosorbid 5-nitrat pe o faz staionar de tip C8

Fig. 2.33 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum cresctor de soluii n n-hexan de pentoxifilin i metil paraben pe o faz staionar de tip C18

Au fost determinate dependenele funcionale ntre volumul de injecie i factorul de retenie al compuilor studiai pentru fiecare solvent de prob i pentru fiecare faz staionar n parte, n figurile de mai jos sunt prezentate rezultatele obinute pentru hexan:

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

50 L

100 L

200 L

300 L

400 L

500 L

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200

250

300

50 L

100 L

200 L

300 L

400 L

500 L

N

NN

N

O

O

O

OH

O OCH3

11

Fig. 2.36 Dependena factorului de retenie de volumul probei injectate pentru solvent de probe n-hexan i faz staionar de tip C8

Fig. 2.39 Dependena factorului de retenie de volumul probei injectate pentru solvent de probe n-hexan i faz staionar de tip C18

Dependene liniare ntre factorii de retenie i volumul de injecie au fost obinute pentru toi analiii i toi solvenii de injecie investigai, pentru ambele tipuri de faze staionare utilizate pentru separrile cromatografice (C8 i C18).

Parametrii de regresie pentru dependenele ntre volumele de injecie i factorii de capacitate, 0=kSV , precum si coeficienii de corelaie (att pentru factorul de capacitate ct i pentru eficien) sunt redate n tabelele urmtoare.

Tabel 2.6. Parametrii de regresie pentru dependentele dintre factorul de retenie respectiv eficien i volumul de injecie pentru coloana de tip C8

Analit de interes A B 0=kSV (L) R ( ( )injVfk = ) R ( ( )injVfN = ) n-hexan

Isosorbid 2 - nitrat 4,067 -0,00619 658 0,9973 0,9731 Isosorbid 5 - nitrat 6,181 -0,00931 662 0,9955 0,9922

Pentoxifilin 2,701 -0,00372 726 0,9951 0,9318* Metil paraben 7,111 -0,01057 673 0,9997 0,9685* Tropicamid 7,376 -0,01088 678 0,9994 0,9032*

n-heptan Isosorbid 2 - nitrat 4,237 -0,00605 700 0,9988 0,9965 Isosorbid 5 - nitrat 6,314 -0,00913 692 0,9990 0,9963

Pentoxifilin 2,715 -0,00376 715 0,9980 0,9813 Metil paraben 7,143 -0,01041 687 0,9995 0,9960 Tropicamid 7,350 -0,01107 663 0,9900 0,9765*

0 100 200 300 400 5000

2

4

6

8

kVolum injectie (L)

Isosorbid5nitrat Metilparaben Tropicamid Isosorbid2nitrat Pentoxifilin

0 100 200 300 400 5000

2

4

6

8

k

Volum injectie (L)

Isosorbid5nitrat Metilparaben Tropicamid Isosorbid2nitrat Pentoxifilin

12

Analit de interes A B 0=kSV (L) R ( ( )injVfk = ) R ( ( )injVfN = ) i-octan

Isosorbid 2 - nitrat 4,133 -0,00581 711 0,9969 0,9973 Isosorbid 5 - nitrat 6,127 -0,00896 684 0,9988 0,9988

Pentoxifilin 2,633 -0,00355 742 0,9991 0,9982 Metil paraben 6,917 -0,00991 697 0,9995 0,9907 Tropicamid 7,434 -0,01246 597 0,9993 0,9364*

Tabel 2.7. Parametrii de regresie pentru dependentele dintre factorul de retenie respectiv eficien i volumul de injecie pentru coloana de tip C18

Analit de interes A B 0=kSV (L) R ( ( )injVfk = ) R ( ( )injVfN = ) n-hexan

Isosorbid 2 - nitrat 4,630 -0,00818 566 0,9994 0,9612 Isosorbid 5 - nitrat 6,592 -0,01166 565 0,9994 0,9844

Pentoxifilin 2,939 -0,00492 597 0,9990 0,9067* Metil paraben 7,260 -0,0125 581 0,9994 0,9288* Tropicamid 7,121 -0,01229 579 0,9998 0,9368

n-heptan Isosorbid 2 - nitrat 4,794 -0,00832 576 0,9997 0,9540 Isosorbid 5 - nitrat 6,931 -0,01206 575 0,9996 0,9837

Pentoxifilin 2,961 -0,00485 611 0,9985 0,9229* Metil paraben 7,318 -0,01227 596 0,9994 0,9267* Tropicamid 7,159 -0,01253 571 0,9997 0,9261*

i-octan Isosorbid 2 - nitrat 4,626 -0,00779 594 0,9997 0,9877 Isosorbid 5 - nitrat 6,590 -0,01114 592 0,9998 0,9900

Pentoxifilin 2,959 -0,00481 615 0,9981 0,9080* Metil paraben 7,417 -0,01228 604 0,9992 0,9696* Tropicamid 7,128 -0,01227 581 0,9997 0,9848

Notaia * semnifica apariia unor efecte de fronting sau chiar splitare de pic la volume de injecie mari

O observaie interesant este faptul c pentru ambele faze staionare investigate 0=kSV nu a variat n mod semnificativ de la un analit la altul. Mai mult, aceast valoare nu depinde n mod semnificativ nici de natura solventului de prob. Valoarea medie calculat pentru faza staionar de tip C8 (cu un RSD acceptabil de 5,09%) este de 686 L. n cazul fazei staionare de tip C18 valoarea medie calculat pentru toi analiii i solvenii investigai este n mod surprinztor mai mic, de 587 L dar cu o deviaie relativ standard mai bun (RSD=2,68%). n mod evident ar fi de ateptat ca valoarea 0=kSV s fie mai mare pentru faza de tip C18 din cauza lungimii mai mari a lanului hidrocarbonat L, care ar putea s interacioneze cu un numr mai mare de molecule de solvent. Aceast uoar contradicie poate fi explicat considernd granulometria fazelor staionare (3,5 m pentru faza C8 respectiv 5 m pentru faza C18). O dimensiune mai mic de particul a fazei staionare echivaleaz cu o suprafa de contact mai mare care poate favoriza interaciunile ntre faza staionar i solventul de injecie.

Pe de alt parte forma picurilor poate fi distorsionat n cazul injeciilor de volum mare de solveni hidrofobi. De exemplu n cazul injeciilor de pentoxifilin i metil paraben dizolvate n hexan au aprut efecte de fronting pentru volume de injecie mai mari de 200 L, efecte care nu au aprut n cazul heptanului sau hexanului. Cu ct volumul de injecie se apropie de valoarea critic 0=kSV cu ct efectele negative asupra formei de pic sunt mai evidente (fronting sau chiar splitare de pic, cum este cazul tropicamidei dizolvate n hexan). Aceste fenomene pot fi explicate prin posibilitatea adsorpiei att a solventului ct i a analitului de interes pe acelai sit de adsorpie pe suprafaa fazei staionare rezultnd o acoperire neomogen a sitului de adsorpie conform echilibrului:

nnm ASLnASnmL ++ )( , unde n mod evident n < m n cazul experimentelor efectuate pe faz staionar de tip C18 linia de baz devine drastic

afectat pentru volume de injecie mai mari sau egale cu 500 L ca o consecin a fenomenului de emulsificare. Acest fenomen este evident pentru faze mobile cu un coninut mai bogat de ACN (peste 20%). Fenomenul de emulsificare este datorat antrenrii moleculelor de solvent desorbite

13

din faza staionar de ctre faza mobil. n cadrul experimentelor efectuate pe faza staionar de tip C8 acest fenomen nu a fost observat, n cazul n care volumul de injecie a fost de 500 L. O explicaie a acestui rezultat experimental poate fi urmtoarea: la ncrcarea coloanei C18 cu 500 L solvent organic ne situm mult mai aproape de condiia de saturare complet a fazei staionare (

0=kSV = 587 L) dect n cazul in care se folosete o coloan de tip C8, caracterizat printr-un 0=kSV =

686L.

Concluzii asupra studiului Din studiul de fa se poate trage concluzia ca se pot injecta volume mari de analii dizolvai

n solveni organici nemiscibili cu faza mobil i obine rezultate foarte bune dac hidrofobicitatea analiilor e mai mic dect a solventului de injecie. Efectul creterii volumului de injecie este scderea liniar a reteniei analiilor de interes cu creterea volumului de injecie i o uoar diminuare a eficienei picurilor cromatografice. n cazul injeciilor cu un volum mai mare de 200 L pot apare n unele cazuri deformri ale formei de pic (n special pentru procente mai mari de solvent organic n compoziia fazei mobile care pot duce la o miscibilizare parial a solventului de injecie cu faza mobil). n cazurile cele mai favorabile volumul de injecie poate fi crescut pn la 500 L cu obinerea unor forme acceptabile de pic [63]. Singurul impediment major la injectarea unor volume mari dintr-un analit dizolvat ntr-un solvent mai hidrofob dect el este solubilitatea analitului n solventul respectiv.

2.4. Injectare de volume mari de solventi nemiscibili cu faza mobil n cazul analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare dect a solventului de injecie

Problematica studiului Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n

solveni organici nemiscibili cu faza mobil au fost alese dou hidrocarburi aromatice polinucleare al cror log KOW calculat are o valoare apropiat de a solventului de injecie respectiv mai mare dect a solventului de injecie, solventul de injecie folosit fiind i-octanul (log KOW =4,09)

Tabelul 2.8. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Fluoren

4,15

Fluoranten

4,93

Condiii experimentale Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C8, 15

cm x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p., termostatat la 25oC. Studiul a fost efectuat n condiii izocratice (60% acetonitril i 40% ap de uz cromatografic) folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min. Detecia a fost fcut la lungimea de und de 254 nm. Concentraiile analiilor de interes au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic s ramn constant (250 ng) pentru cele 4 volume de injecie investigate: 5, 50, 100 respectiv 200 L.

Rezultate experimentale Se poate observa c pentru volume de injecie mai mari de 50 L forma de pic se

deterioreaz pentru ambii compui. n cazul injeciei de 50 L se poate observa o diferen ntre formele de pic ale celor 2 compui, i anume faptul c forma de pic a fluorenului este net inferioar fluorantenului. n tabelul de mai jos sunt prezentate comparativ valorile calculate pentru eficien i simetrie n cazul volumelor de injecie studiate:

Cromatogramele obinute sunt prezentate n figura urmtoare:

14

Fig. 2.42 Cromatogramele obinute pentru injeciile de analii cu hidrofobicitate egal sau mai mare cu a solventului de injecie

Tabel 2.9. Eficiena i simetria pentru picurile analiilor de interes Volum de injecie (L ) N fluoren N fluoranten Simetrie fluoren Simetrie fluoranten

5 17332 18228 0,83 0,86 50 3695 8197 0,84 0,89

100 854 2250 0,39 0,60 200 159 402 0,20 0,25

Din calcul rezult c 0=kSV este de 795 L n cazul fluorenului respectiv de 748 L n cazul fluorantenului (concordana cu rezultatele obinute pentru analiii cu hidrofobicitate mai mic dect solventul de injecie este mai bun pentru analitul mai hidrofob).

Concluzii asupra studiului Injectarea de volume mari de probe ce conin analii avnd o hidrofobicitate egal sau mai

mare dect a solventului de injecie are efecte negative asupra formei de pic a analiilor de interes suficient de pronunate pentru a nu avea aplicabilitate practic. Acest insucces are dou cauze, cea mai evident fiind necesitatea folosirii unei compoziii de faz mobil bogat n modificator organic; o astfel de compoziie asigur o miscibilitate parial a solventului organic cu faza mobil ceea ce duce n mod evident la distorsiuni ale formei de pic. A doua cauz a insuccesului este legat de diferena mic de hidrofobicitate ntre analiii de interes si solventul de injecie ceea ce duce la o competiie ntre analiii de interes i solventul de injecie pentru centrii de absorpie, competiie care este cu totul defavorabil compuilor minoritari.

Chiar i n aceste condiii complet defavorabile modelul de adsorpie ramne n continuare valabil, fapt dovedit de observaia c numrul de molecule care satureaz un sit de adsorpie este n perfect concordan cu cel obinut n cazul unor analii cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de injecie.

2.5. Aplicaii practice ale injeciei de volum mare pentru analii cu o hidrofobicitate mai pronunat dect a solventului de injecie

Problematica studiului Studiul de fa a constat n dezvoltarea i validarea unei metode care s permit injecia de

volum mare de soluii dizolvate n hexan pentru a permite creterea sensibilitii dozrii acizilor ginkgolici n extractele standardizate de Ginkgko biloba. Aceti compui mpreun cu alchilfenolii nrudii structural cu ei (cardanoli i cardoli) sunt constitueni ai extractelor de Ginkgko biloba [64, 65]. Dei este cunoscut faptul c aceti compui au proprieti antitumorale i antimicrobiale [66] este demonstrat i faptul c au proprieti alergenice, citotoxice, neurotoxice i mutagene [67-70]. Prin urmare prezena unor astfel de compui n produsele derivate din Ginkgko biloba este considerat ca indezirabil [71, 72] iar limita stabilit de Farmacopeea European pentru extractul standardizat de Ginkgko biloba este de 5 ppm [73]. Metoda analitic compendial are dezavantajul unei sensibiliti sczute, sensibilitate care poate fi mbuntit prin extracia acizilor ginkgkolici

min0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80

100 5L

50L

200L

100L

15

ntr-un solvent organic nemiscibil cu faza mobil i injecia direct n coloana cromatografic. Analiii de interes au un caracter hidrofob mai pronunat dect solventul de injecie (hexanul are log KOW =3,29).

Tabelul 2.10. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Acid ginkgolic C13:0

OH

OH

O

8,69

Acid ginkgolic C15:1

OH

OH

O

9,45

Acid ginkgolic C17:1

OH

OH

O

10,43

Condiii experimentale Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C8, 15cm

x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p. termostatat la 35oC. Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de compoziie al fazei mobile, faza mobil fiind compus din acetonitril i soluie apoas 0,1% HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:

Timp (min.) % soluie apoas 0,1% HCOOH % acetonitril 0 70,0 30,0

5,0 70,0 30,0 5,01 20,0 80,0 25,0 20,0 80,0

Prezentarea sistemului cromatografic, a modalitii de prepararea a probelor i a parametrilor operaionali folosii pentru detecia MS/MS sunt prezentai detaliat n tez.

Rezultate experimentale Evaporarea soluiilor obinute prin dizolvarea direct a materialului de referin n hexan sub curent de azot urmat de reluarea n metanol i analiza cromatografic a dus la randamente de regsire inconsistente i lipsite de reproductibilitate. Explicaia cea mai plauzibil este antrenarea cu vapori a acizilor ginkgolici n timpul etapei de evaporare. Aceste date confirm prerile exprimate n literatur privind procedurile de extracie lichid-lichid aplicate acestor dureaz mult timp i le lipsete reproductibilitatea [74, 75]. Pentru a elimina etapa de evaporare se poate folosi un raport volumetric mare ntre stratul apos i cel de hexan. Acest raport a fost setat la 20/1. Fiind vorba de un volum mic de hexan acesta se poate aduga direct n balonul cotat n care s-a realizat soluia de extract standardizat de G.Biloba, mai mult, cum stratul de hexan este stratul superior luarea unei cote pri din el este foarte uor de fcut. n cazul de fat analiii de interes fiind mai hidrofobi dect solventul de injecie problema analitic se poate rezolva ncepnd separarea cromatografic la o compoziie a fazei mobile la care analiii de interes s ramn blocai n capul coloanei n timp ce solventul de injecie s se deplaseze lent n coloana cromatografic. n momentul n care frontul de solvent de injecie este distanat suficient de analiii de interes se poate aplica un gradient de tip treapt la un procent mare de solvent care s permit eliminarea rapid a solventului de injecie i separarea cromatografic a analiilor de interes urmat de detecia lor. Este evident c succesul unei astfel de abordri depinde de trei parametrii cheie: compoziia fazei mobile la nceputul gradientului (primul palier), durata de timp pentru distanarea analiilor de interes de frontul de solvent i compoziia

16

final utilizat pentru eluarea analiilor de interes. O parte din rezultatele experimentale pe care se bazeaz optimizarea metodei sunt redate n tabelul de mai jos:

Tabel 2.12. Influena parametrilor experimentali asupra atributelor de calitate ale picurilor analiilor de interes rezultate n urma injeciilor de soluii n hexan

Condiii experimentale

Volum de injecie

(L) Primul palier

(% ACN) Al doilea

palier (%ACN)

Rezoluie C13:0/C15:1

Timp de retenie pentru C17:1 (min)

Simetrie de pic pentru C17:1

Lrgime la baz C17:1 (min)

25 30 80 2,5 19,7 1,16 0,55 50 30 80 2,1 19,0 1,05 0,79 100 30 80 1,3 18,0 2,56 0,97 50 30 75 2,9 27,3 1,25 0,85 50 30 85 1,6 18,4 1,20 0,70 50 20 70 3,1 28,7 1,72 1,38 50 20 75 3,0 24,2 1,31 0,84 50 20 80 2,1 19,0 1,39 0,63 50 40 80 2,1 18,9 1,56 0,59

Variaii de 33% ale procentului de acetonitril n compoziia primului palier au o influent minim asupra rezoluiei calculate ntre acizii C13:0 respectiv C15:1 i asupra reteniei ultimului analit de interes n ordinea de eluie, fapt care indic reinerea analiilor n faza staionar imediat dup injecie. Palierul final are n schimb o influen major asupra reteniei i lrgimii de pic. Pentru volumul de injecie dorit (50 L) programul optim de gradient este cel prezentat la condiii experimentale. Injecia de probe extrase n hexan n prezena matricei considerate nu are nici un fel de efect negativ asupra coloanei cromatografice. Confirmarea ordinii de eluie i a timpilor de retenie obinui prin detecie UV s-a fcut prin detecie MS/MS.

n figura 2.46 cromatograma notat cu A corespunde concentraiei limit impuse pentru acizii ginkgolici, cromatograma notat cu B corespunde la 20% din concentraia limit impus (monitorizat la 310 nm) iar cea notat cu C aceleiai concentraii ca n cromatograma B dar monitorizat la lungimea de und de 210 nm folosit n metoda compendial. Se poate observa cresterea evident de selectivitate ce rezult prin folosirea unei lungimi de und mai mari, lungime ce nu ar fi putut fi folosit dac modul de lucru al metodei nu ar fi realizat totodat concentrarea de 20 ori a probei.

Metoda cromatografic a fost validat complet, detaliile privind validarea metodei pot fi gsite n tez.

Fig. 2.46 Cromatograme rezultate n urma injectiilor de 50 L acizi ginkgolici extrai n hexan

mAU

-2

0

2

4

6

8

C13:0 12.932

C15:1 13.561

C17:1 19.002

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

DAD: 210 nm

DAD: 310 nm

A

C

*

*

**

**

*** ***

DAD: 310 nm

min

B

17

Concluzii asupra studiului Acizii ginkgolici pot fi extrai n hexan cu un randament de peste 96% din soluie de extract

standardizat de Ginkgko biloba n amestec de ap/acid formic/metanol n proporia volumetric 9/1/10. Cum acest randament se obine pentru un raport ntre soluia de extract standardizat de G. Biloba de concentraia impus de metoda compendial i hexan de 20/1 este evident c se obine o concentrare a analiilor de interes de 20 de ori n hexan. O astfel de concentrare permite folosirea unei lungimi de und de 310 nm care este evident mult mai selectiv dect lungimea de und impus de farmacopee (210 nm) i duce la obinerea unei limte de cuantificare care reprezint 20% din concentraia limit de acizi ginkgolici admis de farmacopee. Metoda a fost validat complet conform cerinelor n vigoare. Identitatea analiilor de interes a fost confirmat prin detecie MS i MS/MS (folosind un detector de tip quadrupol, o interfa de tip electrospray i ionizarea analiilor n pozitiv), mai mult n materialul de referin furnizat de Farmacopeea European au fost identificai alti acizi ginkgolici precum i un compus nrudit cu acetia (cardanol) [76].

Prezenta metod demonstreaz nu numai c n anumite condiii se pot realiza injecii de volum mare de analii cu o hidofobicitate mai pronunat dect a solventului de injecie far a avea pierderi de eficien sau deformri ale picurilor analiilor de interes ci i faptul c o astfel de abordare nu este doar un caz pur teoretic.

2.6. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil la determinarea indapamidului din snge prin HPLC-MS/MS

Problematica studiului Indapamidul prezint proprietatea de se lega direct de suprafaa hematiilor prin urmare

determinarea sa n probe biologice trebuie fcut pe snge integral (care este o matrice mult mai complex i mai dificil dect plasma uman). Concentraiile maxime plasmatice de indapamid n snge sunt mici (n special pentru forma farmaceutic cu eliberare prelungit). Ca o consecin metoda preferat de preparare a probelor n cazul studiilor de bioechivalen efectuate pe indapamid n snge este extracia lichid-lichid urmat de evaporarea solventului de extracie i reluarea ntr-un solvent oarecare miscibil cu faza mobil. O astfel de abordare este laborioas i poate fi considerat ca mare consumatoare de timp (datorit numrului mare de probe ce trebuie procesate n cadrul unui studiu de bioechivalen). S-a dorit dezvoltarea unei metode bazate pe injectarea direct a solventului de extracie n coloana cromatografic, o astfel de abordare eliminnd din prepararea probelor etapa de evaporare i reluare a analitului de interes ntr-un solvent miscibil cu faza mobil. O astfel de metod de preparare a probelor ar trebui s fie comparabil ca durat de timp necesar cu deproteinizarea cu solvent organic iar ca selectivitate i sensibilitate cu extracia lichid-lichid. Un solvent organic nemiscibil cu faza mobil trebuie s ndeplineasc anumite condiii pentru a putea fi folosit n acest scop: s aibe un caracter hidrofob mai pronunat dect indapamidul, randamentul de extracie al indapamidului s fie ct mai apropiat de 100%, randamentul de extracie al standardului intern s fie reproductibil i de preferin densitatea solventului de extracie s fie mai mic dect a matricei biologice (acest lucru simplific etapa de transfer a probei). Solventul organic nemiscibil cu faza mobil folosit este 1-octanolul al crui log KOW calculat este 2,81.

Tabelul 2.17. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Indapamid N

NH

OCl

SO

O

NH2

2,66

Standard Intern (5-cloro-2-metoxi-N-[2-(4-sulfamoil fenil)etil]benzamid)

Cl

ONH

OSO

ONH2

2,55

Condiii experimentale Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax SB C18 Rapid

18

Resolution, 5 cm x 4,6 mm i.d. x 1,8 m d.p. termostatat la 40oC. Coloana de gard folosit a fost de tip Phenomenex C18 (2mm x 4 mm i.d.). Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de compoziie al fazei mobile. Faza mobil a fost compus din amestec acetonitril/metanol 1/1 (v/v) i soluie apoas 0,1% HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:

Timp (min.) Modificator organic (%) Debit (mL/min) 0 5 0,8

2,0 45 0,8 5,50 45 0,8 5,51 100 0,8 6,0 100 0,8 6,50 100 1,2 6,51 5 1,2 7,5 5 1,2

Detaliile privind sistemul cromatografic, parametrii deteciei MS/MS, precum i ai metodei de preparare a probelor sunt detaliai n tez.

Investigarea efectelor ce apar la injectarea de volume mari de analii de interes dizolvai n 1-octanol a fost fcut n condiii izocratice, folosind ca modificator organic acetonitril, metanol respectiv amestec de acetonitril i metanol n proporie volumetric de 1/1. Componenta apoas a fazei mobile a fost soluie 0,1% HCOOH n ap de uz cromatografic. Volumele de injecie folosite au fost 1, 10, 50, 75 respectiv 100 L iar concentraiile soluiilor n 1-octanol au fost astfel setate nct cantitatea de analit injectat n coloan s rmn constant (1 g ).

Pentru a reduce timpul de procesare al unei probe extracia lichid-lichid, centrifugarea i injectarea n sistemul HPLC se pot face folosind un flacon de autoinjector cu un design special. Dup centrifugare se poate prelua o cot parte din stratul de octanol (stratul superior) cu controlul atent al nivelului de inserie al acului n flacon. Astfel se poate elimina etapa de transfer a supernatantului n flaconul de injecie i se reduce manipularea probei. Pentru a putea face acest lucru este necesar un design special al geometriei interioare a flaconului care s permit minimizarea riscului de antrenare accidental a sngelui n acul autoinjectorului (vezi Fig. 2.47). Un numr mic de flacoane de autoinjector au fost confecionate in house din polipropilen conform acestui design pentru a demonstra validitatea presupunerii privind injecia direct din flaconul n care a avut loc extracia i centrifugarea probei biologice.

Fig. 2.47 Design de flacon de autoinjector n care se pot face extracia, centrifugarea i injectarea direct

Metoda analitic a fost aplicat pentru 2 studii de bioechivalen. Primul studiu a fost un studiu multidoz efectuat pentru tablete acoperite cu eliberare prelungit coninnd 1,5 mg de indapamid iar al doilea a fost un studiu cu doz unic efectuat pentru tablete acoperite cu eliberare imediat coninnd 2,5 mg de indapamid.

11,5

5

9,5

14

32

27

3,2

1

7,5

Cea

mai

joa

s po

ziie

de

inse

rie

a

aculu

i

Matrice biologic rezidual

Stratul de 1-octanol

19

Rezultate experimentale Dup cum a fost demonstrat n capitolele precedente pentru a putea obine rezultate bune

injectnd volume mari de solveni de probe nemiscibili cu faza mobil trebuie ndeplinite simultan trei condiii:

i) solventul de injecie are o hidrofobicitate i implicit un timp de retenie mai mare dect analiii de interes;

ii) solubilitatea solventului de injecie n faza mobil este suficient de mic pentru a fora saturarea fazei staionare din capul coloanei cromatografice cu solventul de injecie imediat dup injecie;

iii) solventul de injecie trebuie eliminat din coloana cromatografic nainte de injecia urmtoare.

n afar de aceste considerente teoretice n practic mai este important i obinerea unor randamente consistente de extracie, precum i un proces de extracie ct mai selectiv.

Prin alegerea 1-octanolului ca solvent de extracie se ndeplineste condiia solventului de injecie mai hidrofob dect analiii de interes.

Optimizarea metodei cromatografice s-a bazat pe studiul reteniei i simetriei de pic obinute n condiii izocratice de eluie. Ca modificatori organici au fost luati n considerare succesiv acetonitrilul, metanolul i amestecul 1/1 (v/v) de acetonitril i metanol. Componenta apoas a fazei mobile a coninut n toate cazurile HCOOH 0,1% i debitul fazei mobile a fost setat la 0,8 mL/min. Experimentele au fost fcute succesiv pentru 25% acetonitril, 35% metanol sau 30% amestec acetonitril/metanol n compoziia fazei mobile. Pentru fiecare condiie de eluie au fost efectuate injecii de 1, 10, 50, 75 respectiv 100 L de analii de interes dizolvai n 1-octanol i de 1-octanol (solvent de injecie pur). Dup fiecare cromatogram 1-octanolul a fost eliminat din coloan prin meninerea compoziiei fazei mobile la 100% modificator organic timp de 5 minute, urmat de reechilibrarea n condiiile iniiale timp de alte 5 minute.Conform cu cele demonstrate n capitolele precedente factorii de retenie scad liniar cu creterea volumului de injecie; cifrele negative din figura 2.48 reprezint pantele funciilor de regresie liniare injVbak += .

2.48 Variaia factorilor de capacitate al analiilor de interes n funcie de volumul de injecie

n toate cazurile investigate experimental injeciile de 10 L de analii dizolvai n octanol duc la forme de pic nedistorsionate. Pentru volume de injecie mai mari pot aprea efecte de distorsionare a formei de pic fie pentru primul analit n ordinea de eluie (indapamidul), fie pentru ambii analii, dup cum se poate vedea n figura 2.49 (exemplificare pentru volumul de injecie de 75 L). n unele cazuri se poate constata o distorsionare puternic a formei de pic pentru analiii de interes, acest fenomen fiind datorat unei miscibiliti pariale a soventului de prob cu faza mobil i implicit a unei saturri locale inadecvate cu 1-octanol a fazei staionare (o deviaie evident de la condiia privind solubilitatea minim a solventului de injecie n faza mobil care s foreze blocarea acestuia n capul coloanei).

n cazul n care doar primul compus este afectat este mai plauzibil s nvinuim efectul de viscous fingering pentru rezultatele obinute (vscozitile la temperatura ambiant pentru 1-octanol, acetonitril, metanol i ap sunt de 7,21, 0,34, 0,54, 1,0 cP) [77].

-0,0708

-0,0572

-0,0747

-0,0908

-0,1062

-0,1176

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

0 20 40 60 80 100 120

Volum injecie (uL)

k

Indapamid (25%ACN) Indapamid (35% MeOH) Indapamid (15% ACN+ 15% MeOH) IS (25%ACN)

IS (35% MeOH)

IS (15% ACN+ 15% MeOH)

20

Din dependenele funcionale prezentate n figura 2.48 putem observa c cea mai important scdere a factorului de retenie cu volumul de injecie se obine pentru folosirea ca modificator organic a amestecului de acetonitril/metanol 1/1, ceea ce sugereaz c solventul de injecie satureaz o poriune mai mare a fazei staionare. Prin urmare profilul de gradient a fost optimizat folosind ca modificator organic acest amestec de acetonitril i metanol. Dup cum se poate vedea n figura 2.49 gradientul elimin cu succes distorsiunile formei de pic pentru indapamid i crete eficiena aparent.

Metoda analitic a fost validat conform ghidurilor n vigoare [78, 79] iar caracteristicile ei de calitate sunt prezentate n tabelul Tabelul 2.20. Limita de cuantificare determinat pentru metod a fost de 0,5 ng/mL iar limita superioar a domeniului de liniaritate a fost de 100 ng/mL. Funcia de rspuns a fost o regresie liniar ponderat cu 1/x2 (R2 0,9918).

Fig. 2.49 Cromatogramele rezultate n urma injeciilor de 75L

Tabelul 2.20. Caracteristicile de calitate ale metodei bioanalitice rezultate n urma validrii. Etap Caracteristici

LOD = 0,3 ng/mL (S/N = 3); LLOQ = 0,5 ng/mL (S/N5); ULOQ = 100 ng/mL; Niveluri de concentraie = 0,5/1/5/10/25/50/80 ng/mL; probe individuale/nivel: n = 6 Liniaritate RSD% [4,4 9,7]%; Bias % [-7,4 8,0]%; Funcie de rspuns = liniar, pondere 1/x2 Niveluri de concentraie = 1,5/7,5/35/75 ng/mL; Repetabilitate: n = 10; Reproductibilitate intermediar: n = 6 Repetabilitate: RSD% [0,8 1,3]%; Bias% [-7,9 8,1]% Precizie Reproductibilitate intermediar: RSD% [7,3 8,5]%; % Bias [-3,0 3,3]% nghe/dezghe: n = 5; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la precizie); RSD% [0,7 3,5]%; % Bias [-8,0 12,5]% Termen lung (-40 oC) = 3 luni; n = 4; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la precizie);RSD% [0,9 2,2]%; % Bias [-14,3 12,8]% Termen scurt (25 oC) = 8 ore; n = 5; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la precizie);RSD% [0,8 3,9]%; % Bias [-8 14,6]% Post-preparativ (25 oC) = 48 ore; n = 6; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la precizie);RSD% [0,5 4,9]%; % Bias [-9,6 12,8]%

Stabilitate

IS (soluia stoc; 4 oC) = 30 zile; n = 12; RSD% (arie de pic) = 7,8% Rapoartele n care s-a fcut diluia = 1/10; 1/5; 1/2; Matricea utilizat pentru diluie: a) snge integral; b) soluie apoas NaCl 0,9%; probe individuale efectuate: n = 3

Integritatea diluiei

1/10: snge integral; RSD% = 5,4%; % bias = 13,9%; soluie apoas NaCl 0,9%; RSD% = 0,8%; % bias = 7,9%;

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

100

200

DAD Sig=235,4 Ref=360,10

Izocratic, 25% ACN

Izocratic, 35% MeOH

Izocratic, 15% ACN+15% MeOH

Gradient

IS

Inda

pam

id

NNH

O

ClS

O

O NH2

Cl

O

NHO

SO ONH2

Timp (min) 4,7 4,8 4,9 5 5,1 5,2 5,3 5,4

x103

0

1

2

3

0

1

2

x105

Scal

Inda

pam

id (M

RM

36

4,1

la 18

8,9)

Scal

IS (M

RM 36

7,1

la 17

0,1)

Proba blanc (MRM 364,1 la 188,9)

Inda

pam

id

(0,5

ng/m

L)

IS

(50 ng

/mL)

4

5 3

Gradient cromatogram MS

A

21

Etap Caracteristici 1/5: snge integral; RSD% = 2,8%; % bias = 5,8%; soluie apoas NaCl 0,9%; RSD% = 0,8%; % bias = 2,7%; 1/2: snge integral; RSD% = 0,1%; % bias = -2,9%; soluie apoas NaCl 0,9%; RSD% = 2,6%; % bias = -5,9%;

Se pot observa uoare efecte de memorie pe tranziia corespunztoare indapamidului (vezi Fig. 2.49, detaliul A). Acestea sunt nesemnificative considernd nivelul de arie obinut la LLOQ i nu sunt necesare msuri suplimentare pentru eliminarea lui.

Pantele dreptelor de regresie ce caracterizeaz seturile de probe de calibrare procesate pe parcursul ambelor studii de bioechivalen sunt prezentate n figura 2.52. Datele sunt prezentate n ordinea desfurrii secvenelor analitice, cu meniunea c studiul multidoz s-a desfurat anterior celui unidoz. Datele prezentate n figur demonstreaz reproductibilitatea metodei pe o perioad lung de timp, i dup analizarea unui numr mare de probe.

Fig. 2.52. Variaia pentelor dreptelor de regresie pe parcursul ambelor studii de bioechivalen

Reanaliza probelor din studiu a fost fcut la 2 sptmni dup finalizarea ambelor studii de bioechivalen. De la fiecare voluntar au fost reanalizate 2 probe pe fiecare faz, una corespundea la o valoare mic de concentraie iar cealalt la o valoare mare de concentraie (imediat dup tmax). Asta nseamn c n total pentru studiul multidoz s-au reanalizat 100 probe iar pentru cel unidoz 96 de probe. Datele obinute au fost analizate conform procedurii Bland-Altman [80, 81] rezultatele obinute fiind in limitele admise (cel mult 33% din numrul total de probe reanalizate pot fi n afara intervalului de exactitate de 20%).

Fig. 2.53. Graficul Bland-Altman ce ilustreaz rezultatele obinute la reanaliza probelor dup finalizarea studiului multidoz

Parametrii farmacocinetici determinai prin aplicarea metodei au fost comparai cu valorile experimentale raportate n literatur [82,83]. Datele de literatur existente sunt n bun concordan

-0,300

-0,200

-0,100

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100#

Dife

ren

fa

de

v

alo

are

a m

edi

e

9 2

3 4

5 6 7 8 1

11 12

13 14

15

16 17

10

18

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

1A

2A

3A

4A

5A

6A

7A

8A

9A

10A

11A

12A

13A

14A

15A

16A

17A

18A

19A

20A

21A

22A

23A

24A

25A

Calibrarea nr.

Indapamid 1,5 mg (studiul multidoz) Indapamid 2,5 mg (studiul unidoz)

Media 2 *deviaia standard (RSD% = 15%)

Valo

are

a pa

nte

i

22

cu cele obinute folosind metoda analitic bazat pe injecii de volum mare de probe extrase n 1-octanol.

Concluzii asupra studiului Principiul injeciei directe de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil a fost

aplicat cu succes n 2 studii de bioechivalen. Aceast abordare experimental a premis nu numai simplificarea metodei de preparare a probelor (i implicit scderea duratei de timp necesare pentru aceasta) ci i creterea sensibilitii metodei analitice. Chiar dac sngele uman integral este o matrice extrem de complex aceast modalitate de preparare a probelor permite reducerea substanial a cantitii de matrice rezidual introdus n coloana cromatografic. O eliminare suplimentar a matricei reziduale se face prin reducerea duratei de timp n care efluentul din coloana cromatografic ajunge la sursa MS i prin aplicarea gradientului rapid de splare la sfritul separrii cromatografice (n timpul acestui gradient efluentul provenit din coloana cromatografic este deviat de asemenea la linia de rezidii). Dei principalul scop al gradientului de splare este eliminarea rapid a dopului de 1-octanol din coloan acest gradient elimin i matricea rezidual cu caracter puternic hidrofob (grsimile) care altfel ar putea colmata coloana cromatografic. Eficiena acestui program de splare este demonstrat de faptul c att validarea metodei ct i ambele studii de bioechivalen au fost efectuate pe o singur coloan cromatografic (coloana a rezistat cu succes la circa 3000 de injecii de volum mare de probe biologice extrase n 1-octanol).

Atributele de calitate ale acestei metode au fost demonstrate nu numai n timpul validrii metodei ci i prin rezultatele obinute la analiza/reanaliza probelor reale de la voluntari pe parcursul desfurrii celor 2 studii de bioechivalen. Parametrii farmacocinetici calculai pe baza metodei analitice sunt n bun concordan cu datele de literatur [84].

Este prima dat cnd o astfel de metod cromatografic bazat pe injecie de volum mare de solveni nemiscibili cu faza mobil a fost aplicat la studii de bioechivalen avnd ca matrice snge uman integral. O astfel de metod produce rezultate echivalente cu abordarea clasic utilizat pentru aceast matrice biologic (extracia lichid-lichid urmat de evaporarea solventului de extracie i reluarea reziduului n sovent miscibil cu faza mobil) dar are avantaje evidente n ceea ce privete simplificarea modului de lucru i implicit a duratei de timp necesare pentru prepararea probelor.

2.7. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil la determinarea fenspiridei din plasm prin HPLC-MS/MS

Problematica studiului Cea mai simpl modalitate de preparare a probelor bionanalitice este deproteinizarea cu

solvent organic (de obicei n proporie de 2 pari de solvent organic la o parte de plasm); aceast metod de preparare a probelor are ca principal dezavantaj diluia analitului de interes n proba final, prin urmare poate fi folosit doar n cazul n care sensibilitatea metodei nu este afectat de aceasta. n cazul n care sensibilitatea metodei analitice este insuficient se prefer folosirea extraciei lichid-lichid, urmat de evaporarea solventului de extracie i reluarea reziduului sec obinut ntr-un volum mic de solvent compatibil cu faza mobil (acest abordare permite creterea cantitii absolute de analit injectat n coloana cromatografic). Singurul dezavantaj al unei astfel de metode de preparare a probelor este manipularea extensiv a probelor, care duce nu numai la o durat mare de timp necesar pentru procesarea probelor ci poate cauza i apariia de erori aleatoare n timpul preparrii probelor. n cazul n care un volum mare din solventul de extracie ar putea fi injectat direct n coloana cromatografic ar fi eliminate aceste inconveniente. Ca solvent de extracie a fost folosit 1-octanolul, acesta fiind mai hidrofob dect fenspirida, i ca standard intern a fost folosit trimetazidina. ntruct att fenspirida ct i standardul intern ales au caracter bazic a fost necesar alcalinizarea plasmei pentru obinerea de randamente reproductibile de extracie.

Tabelul 2.23. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai Compus Structur log KOW calculat

Fenspirid NHO

O

N

2,28

23

Compus Structur log KOW calculat

Standard Intern (trimetazidin)

O

OO

NNH

0,63

Condiii experimentale Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax SB C18 Rapid

Resolution, 5 cm x 4,6 mm i.d. x 1,8 m d.p. termostatat la 50oC. Coloana de gard folosit a fost de tip Phenomenex C18 (2mm x 4 mm i.d.). Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de compoziie al fazei mobile. Faza mobil a fost compus din amestec acetonitril i soluie apoas 0,2% HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:

Timp (min.) Modificator organic (%) Debit (mL/min) 0 2 0,8

5,0 30 0,8 5,01 100 0,8 5,50 100 0,8 6,0 100 1,2 6,01 2 1,2

Detaliile privind sistemul cromatografic, parametrii deteciei MS/MS, precum i ai metodei de preparare a probelor sunt detaliai n tez.

Metoda analitic a fost aplicat pentru probele rezultate n urma a 2 studii de bioechivalen efectuate pe tablete acoperite cu eliberare prelungit coninnd 80 mg de clorhidrat de fenspirid. Primul a fost un studiu unidoz (efectuat att n condiii pe nemncate ct i n condiii pe mncate) iar al doilea a fost un studiu multidoz.

Rezultate experimentale Valorile log KOW calculate pentru analiii de interes sunt inferioare celei calculate pentru 1-

octanol, prin urmare acest solvent s-ar preta la injecii de volum mare. Folosind detectorul de indice de refracie a fost determinat i factorul de retenie pentru nceputul frontului de 1-octanol, n figura de mai jos sunt prezentate datele de retenie comparative pentru 1-octanol i cei 2 analii de interes (desigur, n condiii izocratice i pentru un volum de injecie de 100 L 1-octanol). Este evident c frontul de 1-octanol elueaz mult dup analiii de interes pentru toate procentele de solvent organic investigate.

Fig. 2.54 Variaia factorilor de retenie al analiilor de interes i a solventului de injecien funcie de compoziia fazei mobile.

Scderea reteniei analiilor de interes cu creterea volumului de injecie ar trebui s fie liniar datorit saturrii cu solvent de injecie a unui volum proporional de faz mobil din coloana cromatografic. S-a studiat ce se ntmpl cu retenia fenspiridei pentru procentaje diferite de acetonitril n compoziia fazei mobile. Dup cum se poate observa mai jos un procent mai mare de solvent organic n compoziia fazei mobile are efecte negative (un procent mai mare de solvent

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 5 10 15 20 25 30

% ACN

k

k1-octanolktrimetazidinkfenspirid

24

organic n compoziia fazei mobile genereaz o oarecare solubilitate a solventului de injecie n faza mobil, ceea ce duce la rspndirea lui pe o lungime mai mare a coloanei cromatografice fr a genera o saturare complet a unei poriuni din faza staionar).

Fig. 2.55 Variaia factorilor de retenie ai fenspiridei la injecii de volum cresctor pentru diverse compoziii ale fazei mobile.

Dup cum se poate remarca n figura 2.56 nu se poate observa nici un efect de distorsionare a formei de pic sau de lrgire excesiv a picurilor corespunztoare analiilor de interes n cazul injeciilor de 100 L pentru condiiile de eluie izocratice. Avnd n vedere faptul c picul standardului intern este foarte aproape de timpul mort al coloanei pentru procente mai mari de acetonitril n compoziia fazei mobile i c trebuie eliminat dopul de 1-octanol dup fiecare injecie a fost preferat o metod analitic n regim de gradient al fazei mobile.

Fig. 2.56 Injecii de 100 L probe n 1-octanol pentru diverse compoziii ale fazei mobile

Metoda bazat pe injecia de volum mare de 1-octanol este comparabil din punctul de vedere al duratei de preparare a probelor cu deproteinizarea cu acetonitril, de aceea se pune ntrebarea dac nu cumva o astfel de abordare nu este mai avantajoas. Aceast abordare clasic const n precipitarea unei cote pri de 200 L de plasm impurificat controlat cu fenspirid cu 400 L de soluie 15 ng/mL standard intern n acetonitril, urmat de centrifugare,

020

4060

80100

02

46

810

02

4

6810

12

14

16

18

20

Vol. Inj. (L)

% ACN

y = -0,0691*x + 16,387 R^2 = 0,9929

y = -0,0482*x + 13,612 R^2 = 0,9606

y = -0,0251*x + 1,9786 R^2 = 0,9840

y = -0,0103*x + 3,7591 R^2 = 0,9144

y = -0,0095*x + 2,3267 R^2 = 0,9981

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

k

x105

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Timp de achiziie (min) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5

3.13

3

1 2 2 3

6.32

5

2.69

0

6.13

8

1.11

4

3.29

0

1.01

3

2.25

0

0.90

3

1.42

0

3.70

9

2.80

2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

2.2

24

IS FEN 2% ACN

2.5% ACN

5% ACN

7.5% ACN

10% ACN

Gradient

Izocratic

Abu

nden

25

separarea supernatantului i injecia direct n coloana cromatografic. Condiiile de separare au fost pstrate neschimbate, cu excepia volumului de injecie. n aceste condiii volumul maxim de prob care poate fi injectat fr a avea loc nici un fenomen de deformare a picurilor cromatografice este de 2 L. Dintr-un simplu calcul matematic rezult c prin folosirea extraciei cu 1-octanol cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic este de 62,5 ori mai mare dect cea injectat n cazul deproteinizrii cu solvent organic. Acest lucru se poate vedea i din cromatogramele suprapuse n figura 2.57 care sunt obinute n urma injeciei unor probe de plasm impurificat controlat cu fenspirid la nivelul de 15 ng/mL procesat prin cele 2 metode alternative (extracie n 1-octanol respectiv deproteinizare cu acetonitril).

Fig 2.57 Cromatogramele rezultate pentru o prob de plasm coninnd 15 ng/mL fenspirid procesat prin 2 metode alternative

Dup cum era de ateptat timpii de retenie sunt mai mari n cromatograma rezultat n urma deproteinizrii cu acetonitril (nu exist solvent care s blocheze faza staionar n capul coloanei cromatografice). Se poate observa de asemenea i apariia unor interferene pe tranziiile de mas ale ambilor analii de interes (picurile care preced att fenspirida ct i standardul intern), n cazul fenspiridei separarea cromatografic ntre interferen i analitul de interes fiind mai bun dect n cazul standardului intern.La aplicarea metodei de preparare a probelor bazate pe deproteinizarea cu acetonitril nivelul de concentraie de 15 ng/mL poate fi considerat ca LLOQ-ul metodei pe baza raportului semnal/zgomot.

Metoda a fost validat complet conform ghidurilor n vigoare detalii privind validarea metodei fiind prezentate n tez.

Tabelul 2.26 Caracteristicile de calitate ale metodei analitice. Etap Caracteristici

Liniaritate

Niveluri de conc. = 5/10/50/100/250/400/500/600/800/2000 ng/mL; probe individuale/nivel: n = 6;

LOD instrumental = 0,6 ng/mL (S/N = 3); LLOQ instrumental = 1 ng/mL (S/N = 5); LLOQ = 5 ng/mL (din calibrare); ULOQ = 2000 ng/mL;

Funcia de rspuns = liniar, factor de ponderare 1/x2; B: 0,00337 0,00006 (sD); A: 0,0043 0,0008 (sD); coeficient de corelaie (rxy): 0,9982; Valorile reinterpolate: RSD% [0,9 5,6]% ; Bias % [-10,4 9,6]%; IS (RSD% pe ariile de pic pe parcursul ntregii calibrri) = 6,0% Nivelurile probelor QC = 5/15/100/250 ng/mL (studiul unidoz); Nivelurile probelor QC = 10/30/300/700/1500 ng/mL (studiul multidoz); repetabilitate: n = 10; reproductibilitate intermediar: n = 6 Repetabilitate: RSD% [0,7 2,1]%; Bias% [-12,1 6,8]% (studiul unidoz) Repetabilitate: RSD% [0,7 2,3]%; Bias% [-11,4 3,2]% (studiul multidoz)

Precizie

Reproductibilitate intermediar: RSD% [1,8 8,4]%; Bias% [-16,4 (la LLOQ)

Timp de achiziie (min) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5

3.59

1

1 1 2 2 3 3

x104

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1 x103

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1 1.1

1.2

1.3 1.4

1.5

3.10

9

2.75

6

3.90

3

2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6

3.10

9

3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4

3.90

3

Sca

la IS

Sca

la fe

nspi

ride

i

IS

Fens

pirid

Extracie cu 1-octanol

(Vinj=75 L)

Deproteinizare cu ACN

(Vinj=2 L)

IS

Fens

pirid

IS

Fens

pirid

26

Etap Caracteristici 10,9]% Reproductibilitate intermediar: RSD% [1,8 7,4]%; Bias% [-12,5 9,2]% nghe/dezghe: n = 5; Niveluri de conc. = 4 (5/15/250/700 ng/mL); RSD% [1,9 6,4]%; Bias% [-11,9 13,7]% Termen lung (-40 oC) = 4 luni; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [2,7 8,2]%; Bias% [-14,0 7,0]% Termen scurt (-70 oC / ghea carbonic: acoper perioada de transfer de la centrul clinic la laboratorul bioanalitic) = 1 zi; prelevri = 4; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [0,7 4,3]%; Bias% [-7,7 12,0]% Termen scurt la 25 oC = 24 ore; Prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [2,4 8,1]%; Bias% [-14,3 10,5]% Post preparativ (25 oC) = 113 ore; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [2,5 6,7]%; Bias% [-11,8 7,7]% Fenspirid (soluie stoc; 4 oC) = 77 zile; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4; RSD% [0,5 4,8]%; Bias% [-9,1 7,5]%

Stabilitate

IS (soluie stoc; 4 oC) = 70 zile; prelevri = 8; RSD% (arie de pic) = 10,1% Rapoartele n care s-a fcut diluia = 1/10; 1/5; 1/2; Matricea utilizat pentru diluie a) plasm blanc; b) soluie apoas Na2CO3 5%; probe individuale: n = 3 1/10: a) RSD% = 4,8%; Bias%= 5,1%; b) RSD% = 1,1%; Bias%= 11,8%; 1/5: a) RSD% = 3,5%; Bias%= -0,4%; b) RSD% = 2,8%; Bias%= 0,1%;

Integritatea diluiei

1/2: a) RSD% = 3,6%; Bias%= -2,4%; b) RSD% = 2,7%; Bias%= -0,3%;

Parametrii farmacocinetici determinai pentru fenspirid n cadrul studiilor de bioechivalen sunt n concordan cu datele de literatur [85-88].

Concluzii asupra studiului Principiul injeciei directe de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil a fost

aplicat cu succes pentru determinarea fenspiridei din probe de plasm extrase cu 1-octanol. Din punctul de vedere al simplitii operaiilor efectuate i al duratei de timp necesare pentru prepararea probelor aceast metod este net superioar extraciei lichid-lichid i comparabil cu deproteinizarea cu solvent organic. Dei comparabil cu deproteinizarea cu acetonitril (care este abordarea clasic preferat pentru procesarea probelor de plasm) o astfel de metod este superioar deproteinizrii cu acetonitril din punctul de vedere al sensibilitii i al selectivitii. Mai mult, cele peste 4000 de injecii de volum mare de 1-octanol (considernd att validarea ct i studiile de bioechivalen) au fost fcute pe o singur coloan cromatografic, ceea ce demonstreaz retrospectiv fiabilitatea metodei cromatografice.

Metoda a fost validat integral iar atributele ei de calitate au fost demonstrate nu numai n timpul validrii metodei ci i prin rezultatele obinute la analiza probelor reale de la voluntari pe parcursul desfurrii celor 2 studii de bioechivalen. Parametrii farmacocinetici calculai pe baza metodei analitice sunt de asemenea n bun concordan cu datele de literatur [89].

27

Concluzii finale

La finalul acestui material se pot formula unele concluzii in ceea ce privete rezultatele obinute pentru cele trei categorii de solveni de prob investigai.

Prima categorie de solveni de prob investigai a fost reprezentat de solveni organici miscibili cu faza mobil (o categorie de solveni utilizat frecvent n cromatografia de lichide n faz invers). n ceea ce privete aceast categorie de solveni lucrurile sunt destul de evidente, nu este posibil un volum de injecie cu adevrat mare, dac se poate injecta un volum mai mare de 5 L fr efecte nedorite asupra formei de pic este excelent. Asupra cauzei principale a deformrilor aprute exist 2 supoziii n literatur: prima se refer la tria elutropic a solventului (cu ct solventul are o trie elutropic mai mare, cu att efectele negative asupra formei de pic sunt mai severe i apar la un volum de injecie mai mic) iar a doua la efectele diferenei de vscozitate ntre solventul probei i faza mobil. De asemenea mai exist i o teorie empiric primii compui n ordinea de eluie sunt cei mai afectai, cei cu factori de retenie mai mari sunt afectai ntr-o mai mic msur sau chiar neafectai. Prin alegerea unui set de trei solveni cu trii elutropice i vscoziti cunoscute, a unui set de ase compui care n condiiile separrii cunoscute elueaz pe un interval larg de factori de retenie (ntre 1,8 i 15,6) i injectarea de volume cresctoare a fost infirmat n primul rnd teoria empiric, i n al doilea rnd s-a constatat c efectul triei elutropice este mai pronunat dect efectul vscozitii solventului.

A doua categorie de solveni de prob investigai a fost reprezentat de solvenii apoi (acetia reprezint amestecuri binare de solvent organic i ap sau ap n care este dizolvat un aditiv anorganic oarecare, fie el o sare sau un agent de reglare a pH-ului). Influena creterii volumului de injecie asupra factorului de retenie este prefect predictibil dar nesemnificativ n valori absolute (factorul de retenie crete liniar cu volumul de injecie iar panta este apropiat ca ordin de mrime de 1 10-3). Practic creterea volumului de injecie cu 100 L genereaz o cretere a factorului de retenie cu 0,1 uniti. n ceea ce privete eficienta i forma picurilor injeciile de volum mare genereaz forme de pic excelente pentru marea majoritate a analiilor. Excepiile de la aceast regul apar la volume de injecie mari (500 L) fie pentru primii analii n ordinea de eluie, fie pentru analiii analiii uor disociabili n condiiile unei diferene ntre pH-ul solventului de injecie (probele ce conin ap neaditivat) i cel al fazei mobile. Diferena de pH ntre solventul de injecie i faza mobil se poate rezolva prin aditivarea probei cu un agent de reglare a pH-ului iar efectele negative n cazul primilor analii n ordinea de eluie se pot rezolva prin creterea moderat a procentajului de ap n prob i volumul de injecie poate fi crescut astfel cu cteva ordine de mrime, cu creterea implicit a limitei de detecie a metodei analitice date.

A treia i cea mai important categorie de solveni de prob investigai o reprezint solvenii organici nemiscibili cu faza mobil. Aceti solveni pot fi mprii la rndul lor n trei categorii n funcie de hidrofobicitatea pe care o au comparativ cu analiii de interes: solveni mai hidrofobi dect analiii de interes, solveni cu aproximativ aceeai hidrofobicitate ca a analiii de interes i solveni mai puin hidrofobi dect analiii de interes (clasificarea cea mai relevant pentru c n practic trebuie ales un solvent potrivit pentru analiii de interes). Pe parcursul tezei abordarea a fost oarecum invers, pentru un set de solveni hidrofobi nemiscibili cu faza mobil dat au fost

28

investigai analii de interes de hidrofobiciti diferite i n condiii diferite pentru a se putea dezvolta un model teoretic care s poat prevedea n ce condiii injecia de volume mari de analii dizolvai ntr-un solvent nemiscibil cu faza mobil poate fi un succes.

Indiferent de ct de hidrofob este un analit de interes comparativ cu solventul de injecie s-a constatat c retenia scade liniar cu creterea volumului de injecie deoarece cu creterea volumului de injecie crete numrul de centrii de adsorpie din faza staionar blocai de solventul hidrofob injectat (cu toate acestea coeficienii de corelaie ai dependenelor liniare ntre volumul de injecie i factorii de retenie sunt mai buni n cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de injecie).

Din punctul de vedere al formei de pic i al eficienei cromatografice cazul ideal este cel al analiilor mai puin hidrofobi dect solventul de injecie. Se pot injecta volume de pn la 200 L avnd ca singurul efect negativ diminuarea moderat a eficienei picurilor. n cazurile cele mai favorabile (procente de solvent organic de cel mult 5% n compoziia fazei mobile) se pot injecta chiar i 500 L cu obinerea unor forme de pic acceptabile.

n cazul analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare cu a solventului de injecie efectele volumului de injecie asupra formei de pic a analiilor sunt suficient de pronunate ca injecia de volume mari s nu aibe aplicabilitate practic (cel puin pentru metode izocratice). Pentru analiii cu o hidrofobicitate mai mare dect a solventului de injecie exist o posibilitate de a injecta volume mari de prob i de a obine totui forme de pic acceptabile folosind gradieni de tip treapt astfel: proba e injectat la o compoziie a fazei mobile suficient de srac n modificator organic pentru a concentra att analitul ct i solventul de injecie n capul coloanei; apoi compoziia fazei mobile e setat la un procent de modificator organic care s permit eluarea solventului de injecie i s pstreze analiii de interes n capul coloanei. n cele din urm compoziia fazei mobile e setat la un procent de modificator organic suficient de mare pentru a permite eluia analiilor de interes. Pe parcursul tezei a fost demonstrat succesul unei astfel de abordri pentru acizii ginkgolici, totui o astfel de abordare este mai laborioas i reprezint un fel de abordare de rezerv n cazul n care nu se gsete un solvent mai hidrofob dect analitul de interes care s poat fi utilizat cu succes.

Ca o concluzie cele mai bune rezultate injectnd volume mari de probe dizolvate n solveni organici nemiscibili cu faza mobil se obin dac sunt ndeplinite simultan patru condiii:

i) analitul de interes e solubil n solventul de injecie (sau poate extrage analitul de interes din matricea n care se afl);

ii) solventul de injecie are o hidrofobicitate i implicit un timp de retenie mai mare dect analiii de interes;

iii) solubilitatea solventului de injecie n faza mobil este suficient de mic pentru a fora saturarea fazei staionare din capul coloanei cromatografice cu solventul de injecie imediat dup injecie;

iv) solventul de injecie trebuie eliminat din coloana cromatografic nainte de injecia urmtoare.

n practic cea mai bun abordare este un gradient care pleac dintr-un procent mare de solvent apos i permite separarea analiilor de interes sub forma unor picuri cu eficien ct mai

29

mare. Imediat dup eluia acestora procentul de modificator organic e crescut la 100% (sau la procentul maxim care nu genereaz precipitarea srurilor folosite ca aditivi n faza mobil), dopul de solvent de injecie este eliminat din coloan, coloana e reechilibrat i se poate trece la injecia urmtoare.

Aceast modalitate de lucru a fost folosit pentru determinarea indapamidului din snge uman integral i a fenspiridei din plasm uman cu deplin succes, att pe parcursul validrii ct i al studiilor de bioechivalen aferente fiecrui produs.

Ca solvent nemiscibil cu faza mobil 1-octanolul pare s fie de departe cea mai bun variant de ncercat, cel puin n cazul metodelor bioanalitice: un numr mare de compui sunt solubili n el (i implicit pot fi extrai cu 1-octanol), are densitate mai mic dect apa prin urmare stratul de extractant va fi intotdeauna deasupra stratului de plasm/snge i implicit va fi mai uor de prelevat, are volatilitate mic (nu exist riscul evaporrii rapide a solventului n flacoanele de autosampler), este un solvent utilizat pentru multe aplicaii practice (i implicit e uor de procurat i are un pre de cost relativ mic). De asemenea pe parcursul injectrii miilor de probe nu au fost constatate efecte negative asupra garniturilor de etanare ale valvei de injecie. Desigur, n cazul n care 1-octanolul nu e solventul potrivit pentru analitul de interes (fie din cauza hidrofobicitii analitului de interes, fie din cauza solubilitii analitului de interes n 1-octanol) pot fi ncercai ali solveni hidrofobi.

30

Lucrri publicate pe tema tezei de doctorat

S.Udrescu, A.Medvedovici, V.David, Effect of large volume injection of hydrophobic solvents on the retention of less hydrophobic pharmaceutical solutes in RP-LC. Journal of Separation Science, 31 (16-17), 2939-2945 (2008). F.I. = 2,631 S.Udrescu, I.D.Sora, V.David, A.Medvedovici, Large volume injection of hexane solutions in RP/LC to enhance on sensitivity of the assay of ginkolic acids in Gingko biloba standardized extracts. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 33 (1), 133-149 (2010). F.I. = 0,953 D.I.Sora, S.Udrescu, F.Albu, V.David, A.Medvedovici, Analytical issues in HPLC/MS/MS simultaneous assay of furosemide, spironolactone and canrenone in human plasma samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 52 (5), 734-740 (2010). F.I. = 2,733 S.Udrescu, I.D.Sora, F.Albu, V.David, A.Medvedovici, Large volume injection of 1-octanol as sample diluent in reversed phase liquid chromatography: application in bioanalysis for assaying of indapamide in whole blood. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54 (5), 1163-1172 (2011). F.I. = 2,733 A.Medvedovici, S.Udrescu, F.Albu, F.Tache, V.David, Large volume injection of sample diluents not miscible with the mobile phase as an alternative approach in sample preparation for bioanalysis: an application for fenspiride bioequivalence, Bioanalysis, 3 (17), 1935-1947 (2011). F.I. = 1,337