RNA interference
phenotype
Forward genetics
Reverse genetics
Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO
RNA antisenso
RNA interference
RNA interference:Introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento
induce il silenziamento del gene target
Esempio di Silenziamento Genico Post Trascrizionale (PTGS):
Già noto nelle piante: transgeni ad alto numero di copie e altamente trascritti inducono il silenziamento del gene endogeno
Può essere considerato come un primitivo sistema di autodifesa contro RNA esogeno (virus) o RNA endogeno trascritto in modo aberrante (trasposoni)
Un nuovo potente strumento di modulazione dell’espressione genica
Nuove e inattese rivelazione sui meccanismi di regolazione genica
fliesfungi worms mammalsplants
La Scoperta dell’ RNAiPotent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegansFire et al, 1998
In C. elegans:
introduzione di dsRNA è molto più potente nell’indurre il silenziamento genico rispetto a sRNA e asRNA
dsRNA corripsondenti a regioni introniche o al promotore non funzionano
dsRNA microiniettato nelle gonadi induce silenziamento genico in tessuti mitotici: amplification-spreading
In Drosophila:
Un estratto citoplasmatico di Drosophila + luciferasi mRNA esogeno + dsRNA luciferasi: silenziamento genico
dsRNA guida la formazione di un complesso citoplasmatico che determina la degradazione specifica di mRNA omologo
RNA interfernce is mediated by 21 and 22-nucleotide RNAsElbashir et al, 2001
Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro Tuschl et al, 1999
In Drosophila:
dsRNA è processato a 21-22nt dsRNA con 5’P, 2nt protruding
21-22-dsRNA sono sufficienti a indurre RNAi
Produzione di siRNA21-22 dsRNA, 5’ P, 2nt overhang
Riconoscimento e taglio endonucleasico del mRNA target
DICER: RNAse III ribonuclease familyspecifico per dsRNAAltamente conservato in flies, plants, worms e human
RISC-RNA Induced Silencing ComplexEndonuclease non identificata: SLICERCopurifica con ARGONAUTE e EIFC2 (elongation factor) e elicasi
DICER
RISC
I vermi sono diversi…
In C. elegans
SPREADING:dsRNA microiniettato nelle gonadi causa RNAi in tessuti mitotici nel resto dell’organismo
AMPLIFICATION: RNAi efficiente anche a partire da quantità minimi di dsRNA
TRANSITIVE RNAi: il silenziamento genico può agire in TRANS e in CIS. Movimento 3’ -5’ dell’attività nucleasica e generazione di nuovi dsRNA
RdRP:RNA polimerasi RNA dipendente
Sid1: canale di membrana
Un ruolo biologico per l’RNAi?
RNAi: Un primitivo sistema immunitario contro virus e retrotrasposons
Inattivazione dell’RNAi causa diffetti nello sviluppo in diversi organismi
Mutationi in ARGONAUTE (dsRNAbinder in RISC) causano diffetti nello sviluppo in A. thaliana, C. elegans e Drosophila
microRNApiccoli (21-22nt) ssRNA scoperti in C.elegans (Lin4 and Let7: worms development)
Altamente conservati nell’evoluzione
Silenziamento genico a livello postraduzionale: mRNA binding-blocco sintesi proteica
21-22 nt single strand RNA processati da dsRNA precursori a 70nt (miRNA)!!
Link to RNAi:DICER ko hanno alti livelli miRNA precursoridi Lin4 e Let7
RISC
DICER
Non solo mRNA….Chromatin remodelling!
Geni non codificanti nell’uomo?
mRNA
tRNA
ncRNA
snRNA: spliceosome
snoRNA: rRNA-tRNA-snRNA modifications
rRNA
GENE
PROTEINA
Cis-AS-RNA: XIST
miRNA
asRNA
NB: computationl tools developed on the basis of known miRNA seq identified 255 putative human miRNA encoding genes!
miRNA nell’uomo
miR181 is a hematopoietic specific miRNA that drive differentiation of stem cell to the Blineage
52% of analized miRNA map to genomic site involved in cancer
mRNA Antisenso nell’uomo
RNAi un nuovo strumento per lo studio della funzione genica nei mammiferi
Major limitationlong dsRNA >30nt is effective in mammals, but induce many protective pathway
Long dsRNA trigger
PKR IFN RNAseL
apoptosis dsRNA degradation
Block of protein synthesis
Phosp of ElF2a
Elbashir, S. M. et al.
Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (2001). 2nt increase stability
easier synthesis
Source for siRNA:
Dharmacon MWGAmbion
siRNA transfection
TRANSIENT: siRNA are stable, Rate of cell growthDilutionProtein half-life
EFFICIENCY OF TRANSFECTION:Some cells are refractory to transfectionElectroporation leads to cell death
COST:siRNA are chemically sinthetized, therefore very expensive AND NOT RENEWABLE….
Use in vivo?????
siRNA is transfection is very efficient in most cell lines
siRNA silencing is immediate
PRO CONTRO
Vettori a DNA per RNAi ?
promoteri RNA polIII: U6 e H1 sintesi di short hairpin RNA (shRNA) e siRNA in vivo Nessuna sequenza richiesta dopo start site per la trascrizione
TTTT: sufficiente per terminazione
More efficiently processed by DICER!!
DNA mediated RNAi. H1/U6 clonati in vettori plasmidici
VIRUS vector mediated RNAi: H1/U6 clonati in vettori retrovirali: lintegrazione stabile nel genoma
oncoretrovirus MoMuLV or MSCVsilenziamento del provirus durante lo sviluppole cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate
lentivirus HIV-1nessun silenziamento: Topi transgeniciinfettano cellule quiescenti (cellule staminali….)
PROCheapStable clones for long term experimentsLong half life protein targeted
CONTROInterference require trasncription: timing….Transfection is less efficient
Plasmid vector
retroviral vector
RAS (GTP binding protein): tra gli oncogeni più frequentemente mutati nei tumori umani (30-50%)
(RAS-v12: Attivazione costituiva nello stato legato a GTP)
Proliferazione, differenziamento, migrazione e sopravvivenza cellulare.
wtRAS è essenziale per la sopravvivenza della cellula
Growth signal RAS proliferazione
H1 promotercloned in ppMSCV puro retroviral vector:pRETROsuperStably integrates in cell genome
retroviral vector
siRNA nel trattamento dei tumori umani:Terapia anticancro:
Nessuna tecnologia è in grado di colpire esclusivamente l’espressione di un oncogeno mutante attivato
tetOFF/ON H1 and U6 promoter system
Limitazioni dell’RNAi stabile:
impossibile studiare geni essenziali per sopravvivenza cellulare (housekeeping) e sviluppo
Sviluppo di nuovi vettori per l’espressione condizionale-inducibile dei shRNA
tossicitàbackground
Disegnare l’siRNA perfetto
1) stability of the hairpin2) access to RISC
9nt loop2nt TT overhangLow GC content
Empirical observationStructure of miRNA
Mittal, Nature Review Gentic, 2004
Regole per la produzione di siRNA
29 su 30 dsRNA inducono più 50% silencing su 6 geni target
Specificità…?
SI NO
siRNA against endogenous GFP expression didn’t affecct any other gene
siRNA against endogenous gene can affect other genes with weak sequence similarity
Use indipendent siRNA against same target
Rescue the observed Loss of Funtion phenotype by expressing the target gene with a silent mutation in the target region
High-throughput functional screenings
Genomewide screenings for critical players in human cancer
normal cell cancer cell
Genetic lesions
Attivazione di ONCOGENi
Inattivazione di TUMOR SUPPRESSOR
controlled growth uncontrolled growth
Tumori diversi hanno caratteristiche comuni
Hannan and Weinberg, 2000
p53pRb
Tumor suppressors
Target mRNA
Overspressione di un oncogene
Silenziamento di un TS
Possibile ruolo dei miRNA nei tumori umani
Normal cell + siRNA library
Cancer cell + siRNA
Identificazione di nuovi oncogeni o TS
Tumor phenotype
reversion of tumor phenotype
RNAi silenzia un Tumor suppressor
RNAi silenzia un oncogene
?
Genome wide functional screenings
Sequenziamento del genoma umano
Annotazione di tutte le possibili ORF
Costruzione di siRNA contro tutti i geni umani
Loss of funtion screenings by RNAi
Infect cells
with siRNA library
Phenotype of interest
The targeted gene is required for the phenotypeHow can we identify the targeted gene?
PCR with primer flanking the siRNA encoding DNA sequnece cloning sequencing
CELL SYSTEMPrimary Human fibroblast (BJ) infected with temperature sensitive LargeT from SV40:
ASSAY
Colony formation: primary cells plated at low density undergo growth arrest and senescence
Human fibroblast (BJ)+ts largeT
PCR with primer flanking the siRNA oncoding DNA sequence
cloning
sequencing
single clone isolation
shRNA library: 7914 genesCell-cycleTranscriptionSignal transductionMethabolismGenes involved in cancer
To increase knockdown:
3 shRNA/gene70%inhibition for 70% of the genes
RPS6KA6, HTATIP, HDAC4, CCT2, KIAA0828
THE EFFECT IS GENE SPECIFIC
THE targeted GENES ARE IN THE p53 PATHWAY
IONIZING RADIATION
U2OS: osteosarcoma cells
p21bax
Identified genes affect the expression of a p53 target gene
Limitations: single clone isolationre-cloning and retesting
siRNA BAR-CODE screens
Relative abundance of BARCODE in a cell population reflect the effect of the knockdown on cell viability
Infect cells
Single cell derived clones
PCR of hairpin sequence
Re-Cloning and sequencing
Test again
select phenotype
Fluorescent labelingHybridize to DNA Microarray containing hairpin sequences from library
Identification of highly represented shRNA
Infect cells select population with phenotype
Stably integraetd vectors introduce a molecular fingerprint in the infected cell: The 19 hairpin sequence is gene specific and behave as a MOLECULAR BARCODE
Silenziamento genico specifico, efficiente e stabile nel tempo (economico e veloce).Genetica inversa alla portata di tutti.
Genome-wide functional screenings.
Terapia genetica antitumorale.
Rivoluzione nella comprensione dei meccanismi di regolazione dell’espressione genica.