Download - Seminario: Identification of major rice allergen and their clinical significance in children
Identification of major rice allergen and Identification of major rice allergen and their clinicaltheir clinical
significance in childrensignificance in children
You Hoon Jeon, MD, Se Jo Oh, PhD, Hyeon Jong Yang, MD, Soo Young Lee, MD, Bok Yang Pyun, MD
Manuela ColoradoCarolina Giraldo Benítez
III Semestre MedicinaUPB
INTRODUCTIONINTRODUCTION
AllergyAbnormal, inappropriate and exaggerated reaction of immune system to substances that typically are not well tolerated. Is mediated by IgE
Is produce by allergens
• Food allergy is different from food intolerance
• Allergen: is a substance that can induce a hypersensitivity (allergic) reaction in susceptible people, who have previously been in contact with the allergen.
INTRODUCTIONINTRODUCTION
• Rice is known to be a relatively low allergenic food, but have become a problem.
• A study shows that not eat rice has helped at 76% of 25 patients with atopic dermatitis with IgE-rice positive.
• Is a few reports on the correlation of rice allergen sensitization and their clinical symptoms.
• The immunologic characteristics of rice allergen are unclear.
INTRODUCTIONINTRODUCTION
• Some allergens have been mentioned as possible major allergens of rice:
-Globulin in the embryonic bud of rice
-Albumin with protein bands of 14-16 kDa
• Protein bands of 26, 33, 56 kDa are the major IgE-binding components in rice.
• Some studies reported that rice is less allergenic if it is heating first.
• Heat- and acid-stable protein, lipid transfer protein (LTP) has emerged recently as a relevant factor in symptomatic rice allergies.
GENERAL OBJECTIVEGENERAL OBJECTIVE
• Determine the major allergens in rice and their clinical significance.
Objetivo http://freestyle.bligoo.com.co/objetivos
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
1. Sujetos y grupos de control
Sujetos
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Grupo control44 Pacientes
IgE-Arroz Negativa
2 Grupos
n=18Sujetos sensibilizados, pero
no al arroz
n=26Sujetos no sensibilizados
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
2. Métodos
1. Análisis de sujetos y grupo control
• Historial médico y pruebas de laboratorio Edad, sexo, síntomas de la alergia, IgE en suero, ECP, IgE específica.
Erupción cutánea, eritema, urticaria, angioedema, el síndrome de alergia oral, rino-conjuntivitis, sibilancias, anafilaxia tras la ingesta de arroz con leche, arroz hervido, galletas de arroz, etc.
* Agravación de la dermatitis atópica se excluyó.
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
2. Extracción del alérgeno
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
* Extracto de arroz crudo: 5.6 mg/mL de proteína
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
1. Sodio dodesil sulfato policrilamida gel electroforesis. (SDS PAGE)
• Muestra + Buffer Se calentó
• Electroforesis durante 90 minutos SDS (amortiguación con el marcador)
• Visualización por tinción con azul de coomassie brillante
• Cuantificación de bandas Densitometría
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
4. Análisis de las bandas de proteínas de arroz y arroz cocido
Electroforesis:
Comparación y análisis de distribución de bandas
• Arroz crudo• Arroz cocido• Arroz integral cocido• Arroz semicocido
SDS PAGE Electroforesishttp://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Protein-Gel-Electrophoresis/Protein-Gels/Novex-NuPAGE-SDS-PAGE-Gels.html
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS5. SDS PAGE de arroz tratado con calor, fluido gástrico simulado (SGF) y fluido intestinal simulado (SIF)
•Electroforesis en serie
•Proteína de arroz se hirvió a 100°C 10, 30 y 60 minutos Electroforesis
Se trató con enzima digestiva, SGF y SIF 0, 10, 30 y 60 minutos
5 μL de mezcla en tubos de ensayo12 μL de buffer
y 1 μL de 0,2 M NaCO3
Electroforesis
Comparación de bandas de proteínas
6. Inmunoblot de IgE del arroz
En 18 de los 24 pacientes 4 Sueros para el control
Bandas de proteínas Electrotransferidas desde el gel a una membrana nitrocelulosa
Bloqueada con 3% de albúmina de suero bovino-fosfato-buffer-salino por una hora
Lavado 3 veces con PBS-T durante 10 minutos
Adición de suero alérgico y suero control a la membrana
>16 Horas a 4°C
Lavado con PBS-T
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Conjugación con anticuerpo biotinilado anti IgE humana
2 horas a temperatura ambiente
Conjugación con avidinfosfatasa por 30 minutos
* Las bandas de proteínas del arroz calentado se electrotransfirieron y se les realizó inmunoblot de forma similar.
RESULTADOSRESULTADOS
Fig. 1. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of (A) raw rice, (B) cooked rice, (C) cooked unpolished rice, and (D) semi-cooked rice (Hatban). M, marker; kDa, kilodalton.
RESULTADOSRESULTADOS
SDS-PAGE para alérgeno del arroz
Arroz crudo
Bandas 9, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 28,
31, 33-35, 46, 57, 62, 79, 94, 109 kDa
RESULTADOSRESULTADOS
SDS-PAGE para alérgeno del arroz
Arroz cocido,
Arroz integral cocido
Arroz semicocido
Bandas de proteínas 14-16,
31 - 35 kDa.
intensidad
RESULTADOSRESULTADOS
Fig. 2. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of rice treated with (A) heat, (B) simulated gastric fluid (SGF), and (C) simulated intestinal fluid (SIF). M, marker; kDa, kilodalton.
RESULTADOSRESULTADOS
Cambios en las bandas de las proteínas del arroz después del tratamiento con calor y enzimas digestivas
10’ bandas se mantienen.
30’ bandas se mantienen- desvanecimiento.
60’ bandas degradadas, menos 9,14, 31-35 kDa.
RESULTADOSRESULTADOS
Cambios en las bandas de las proteínas del arroz después del tratamiento con calor y enzimas digestivas
Bandas degradadas inmediatamente.
60’ bandas 9, 14, 28, 31, 35 kDa se mantuvieron.
RESULTADOSRESULTADOS
Cambios en las bandas de las proteínas del arroz después del tratamiento con calor y enzimas digestivas
Pocas bandas degradadas.
RESULTADOSRESULTADOS
Cambios en las bandas de las proteínas del arroz después del tratamiento con calor y enzimas digestivas
9, 14, 31 kDa son estables
después del procesamiento con calor
digerido con las enzimas en el estómago y el intestino
RESULTADOSRESULTADOS
Fig. 3. Rice immunoglobulin E immunoblot of patient sera and control. M, marker; kDa, kilodalton.
RESULTADOSRESULTADOS
Inmunoblot de IgE del arroz crudo
Gel de electro-transferencia
Inmunoblot de IgE suero 18 pacientes sensibilizados
grupo control
Proteínas alergénicas
Actividad de unión al IgE
RESULTADOSRESULTADOS
Inmunoblot de IgE del arroz crudo
Proteínas
masa molecular 9 kDa – 109 kDa
14 kDa 88.9%
79 kDa 50%
109 kDa 44.4%
9,33,46 kDa 38.9%
57 kDa 33.3%
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
Fig. 4. Heated-rice immunoglobulin E immunoblot of patient sera and control. M, marker; kDa, kilodalton.
RESULTADOSRESULTADOS
Inmunoblot de IgE del arroz calentado
Gel de electro-transferencia
Inmunoblot de IgE suero 18 pacientes sensibilizados
control
bandas descoloridas
RESULTADOSRESULTADOS
Inmunoblot de IgE del arroz calentado
Proteínas
14 kDa 38,9%
9 kDa 27.8%
31,33 kDa 38.9%
RESULTADOSRESULTADOS
Inmunoblot de IgE del arroz calentado
Suero de 4 pacientes con
síntomas alérgicos (5,11,15,16)
Reaccionaron con bandas de proteína
31-33 kDa 75%
9 kDa 50%
14 kDa 50%
RESULTADOSRESULTADOS
DISCUSSIONDISCUSSIONNameName ApproachApproach True or FalseTrue or False
Wu KG, et al.
Shin JE, et al.
There are several studies that serum ECP levels in
patients with atopic dermatitis is related with
disease severity.
False: because in food allergy, the
relationship between serum ECP level
with clinical food allergy, sympton is
not evident.
Figueredo E, et al. An atopic woman, who developed anaphylaxis after
drinking beer with a corn made snack, was sensitized
to not only corn and barley, but also to wheat, rye,
oat and rice.
True: because this suggests the
possibility of latent sensitization by a
common epitope.
DISCUSSIONDISCUSSION
NameName ApproachApproach True or FalseTrue or False
Yamada C, et al.
Untersmayr E, et
al.
Kilshaw PJ, et al.
Heat-processing or digestion can alter antigenicity
of allergen. The rice allergen is weak after the
heat-process. The antigen specific IgE of rice
decreases after heating at 100 for 60 minutes.℃
True: because the allergen rice is
weak after heating and the
bands decreased in intensity and others
disappear in cook rice.
Yum HY, et al. Studies have revealed cross reactivity of rice with
buckwheat, barley or wheat and one report
compared the antigenicity of rice and low
allergenic rice.
False: Because the allergens
that actually cause the allergic symptoms
on the patients with sensitization to rice
allergen are not obvious and an
interpretation of the sensitization to rice
is also unclear.
CONCLUSSIONSCONCLUSSIONS
• Although rice isn't has high allergenicity, in Asian countries like Japan and Korea,
the allergenicity has increased in the numbers of patients sensitized to rice
allergen, because it’s the main food in the meals.
• The allergenicity decrease when the rice is cooked, because the protein
bands decreased in intensity and others disappear in cook rice. Also the allergen
rice is weak after heating.
CONCLUSSIONSCONCLUSSIONS
• Total IgE, is an important factor in terms of
sensitivity to rice, because in these cases the IgE
is increased along with the ECP (eosinophil cationic
protein).
• This investigation is very important, because this area
is poorly studied, and also help to find the
inmunologic characteristics of rice allergen .
MAPA CONCEPTUALMAPA CONCEPTUAL
Carolina Giraldo
MAPA CONCEPTUALMAPA CONCEPTUAL
Manuela Colorado
THANKS!THANKS!GRACIAS!GRACIAS!고맙습니다고맙습니다