![Page 1: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/1.jpg)
STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEK
![Page 2: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/2.jpg)
![Page 3: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/3.jpg)
1nm 10 102 103 104 105 106 107
(the wave) X-ray UV/VIS Infrared Microwave Radio Frequency
(the transition) electronic Vibration Rotation Nuclear(spectrometer) X-ray UV/VIS Infrared/Raman NMR
Fluorescence
![Page 4: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/4.jpg)
Možnosti
• RTGsouřadnice atomů, mezimolekulové interakce, 80 %
struktur v databázi• Elektronový mikroskop
velké komplexy, elektronový obal, nízké rozlišení• NMR
torzní úhly, nepřímé stavení meziatomové vzdálenosti H-H pomocí rezonance, dynamická informace • FRET
meziatomové vzdálenosti
![Page 5: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/5.jpg)
RTG strukturní analýza – proč???
• Elektromag. záření interaguje s objekty jejichž velikost je srovnatelní s vlnovou délkou λ
• Limit rozlišení RTG analýzy je λ/2• Používaná vlnová délka 0.1 – 10 nm• Vzdálenost atomů v krystalu 0.1 – 0.3 nm
Vzdálenosti mezi atomy:C−C 1.54 ÅC=C 1.23 ÅC−N 1.45 Å
![Page 6: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/6.jpg)
RTG strukturní analýza
• Max von Laue, Walter Friedrich a Paul Knipping (1912) ozářili krystal modré skalice svazkem RTG a zjistili, že rozptýlená energie se od krystalu šíří pouze v určitých směrech, zatímco v jiných vyhasíná.
![Page 7: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/7.jpg)
RTG strukturní analýza
• Nedestruktivní interakce RTG záření s krystalickými materiály.
• Jedna z nejdůležitějších metod pro určení struktury.• V RTG difrakčním obrazci je zakódována informace o
vnitřní struktuře (William L. Bragg)
![Page 8: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/8.jpg)
RTG strukturní analýza
• NC za chemii (1962) – výzkum struktury globulárních proteinů J.C. Kendrew a M.F. Perutz
![Page 9: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/9.jpg)
RTG strukturní analýza
• NC za lékařství (1962) – za určení molekulární struktury nukleových kyselin – F.H.C. Crick, J.D. Watson a M.H.F. Wilkins
• Za sto let vývoje metody – 12 NCRosalind E. Franklin
![Page 10: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/10.jpg)
RTG strukturní analýza - princip
• Až na defekty uvnitř krystalové mříže je krystal upořádán trojrozměrně periodicky (větší podjednotka ribozomu 64 tisíc atomů!) → krystalová struktura (nepřesně krystalová mřížka) → aproximace – prostorová mřížka → elementární buňka
• Elementární buňky jsou identické co do rozměrů tak hmotné náplně a jejich orientace v prostoru.
• Stanovení krystalové struktury znamená určení a upřesnění souřadnic a parametrů teplotních pohybů všech atomů v elementární buňce.
![Page 11: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/11.jpg)
RTG strukturní analýza - princip• 230 prostorových grup
Základní buňka
Záření se rozptyluje na elektronech → tato interakce je příliš slabápro detekci rozptylu na jedné molekule → použití krystalů s triliony molekul v identické orientaci.
![Page 12: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/12.jpg)
RTG strukturní analýza - principKrystal ozářen monochromatickým RTG zářením
Difrakční obraz
Dopadající primární záření se pružně rozptyluje na elektronech měřeného krystalu (vznik sekundárního – difraktovanéhozáření).
![Page 13: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/13.jpg)
RTG strukturní analýza - princip
• Difrakce (reflexe) a interference• Braggův zákon
2dsinθ = nλ
Známe úhel a vlnovou délku → určíme vzdálenost d mezi rovinami, které lze prokládat krystalovou strukturou
![Page 14: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/14.jpg)
RTG strukturní analýza - princip
• Reflektující roviny v krystalu se rozlišují hodnotami Millerových indexů hkl
• Každý bod obsahuje informaci o všech atomech!• Difrakční vzor obsahuje informace o velikosti buňky a
symetrii. Ze systematického vyhasínání určíme prostorovou grupu.
• Strukturní informace je určena z intenzity bodů (přesná poloha atomů a teplotně-vibrační faktory).
• Pro obdržení dostatečného množství informací je pořízeno více snímků z rozdílných úhlů.
![Page 15: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/15.jpg)
RTG strukturní analýza - princip
• Pozice atomů je určena výpočtem mapy distribuce elektronové hustoty. Maxima mapy (těžiště elektronových obalů těžkých atomů) dobře souhlasí s pozicemi jader izolovaných atomů.
• Pozice se upřesňují pomocí více měření.
![Page 16: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/16.jpg)
RTG strukturní analýza - nevýhody
• Výchozí materiál – monokrystal nebo polykrystalický materiál (práškový - u malých molekul)
• RTG podává statickou informaci• Krystalová struktura je prostorově zprůměrovaná do jedné
elementární buňky a časově do délky trvání difrakčního experimentu → přicházíme o informace o defektech reálné kryst. struktury (lze řešit pomocí metody difrakčního kontrastu).
• Lze, ale sledovat měnící se strukturu látky během chemické reakce in situ (časově rozlišená RTG krystalografie)
![Page 17: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/17.jpg)
RTG strukturní analýza
• Dosažený stupeň rozlišení závisí na kvalitě monokrystalu.• Počet difrakcí nutných k řešení souvisí se složitostí
měřeného krystalu (od několika desítek u krystalu kovů až po několik milionů u krystalu virů).
• Doba sběru dat od hodin po několik dnů.• Měření se provádí za chlazení (většinou dusíkem) – 100-
150 K (potlačení teplotně-vibračních pohybů a ochrana před radiačním poškozením)
![Page 18: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/18.jpg)
RTG strukturní analýza – elektronová hustota
• K výpočtu jsou potřeba i údaje o fázových úhlech difraktovaných paprsků (nejsou dostupné z experimentu)
• Úvodní neznalost fází – fázový problém• Hodnoty fází lze extrahovat ze souboru
naměřených intenzit tzv. přímými metodami -aplikací vztahů založených na nerovnostech, statistice a počtu pravděpodobnosti → na základě vztahů se vybere nejvíce pravděpodobné fázování reflexí a to se použije pro výpočet mapy elektronové hustoty a určení pozic atomů
![Page 19: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/19.jpg)
• Amplitudy a fáze jsou zakódované přímo v paprscích záření rozptýlených atomy krystalu
• Amplituda s rovná druhé odmocnině intenzity rozptýleného záření (změřeno difrakčním experimentem)
• Fáze rozptýlené vlny nemůže být změřena přímo (fázový problém)
![Page 20: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/20.jpg)
Fázový problém
• Přímá metoda – pro malé systémy, založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi
• Metoda molekulárního nahrazení - na základě podobnosti s již určenou strukturou, vzrůstající popularita se vzrůstajícím počtem struktur
• Metoda těžkých atomů - experimentálně pomocí anomálního rozptylu těžkých atomů (Hg, Fe, Pb, I, Se …) obsažených ve zkoumané molekule (například MAD – multiple wavelengthanomalous dispersion – použitím vícečetné nebo jednoduché anomální difrakce MIR – Multiple isomorphous replacement použitím vícečetného
isomorfního nahrazení )• Upřesnění proteinové struktury se provádí výpočetně a
manuálně s využitím speciálních programů (SOLVE, SHELL-X, Phaser)
![Page 21: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/21.jpg)
Proteinová krystalografie
• Nutnost vysoké koncentrace• Údaje o primární struktuře – z nukleotidových sekvencí
kódujících nukleových kyselin• Kvartérní struktura – elektronová mikroskopie• Sekundární a kvarterní struktura – RTG analýza až s
rozlišením 1 Å
![Page 22: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/22.jpg)
Vstupní struktura
![Page 23: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/23.jpg)
Vstupní struktura• Původní organismus
přirozená forma včetně všech modifikací malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy,
složitá izolace …
• Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení možné problémy s modifikacemi postranních řetězců
• Chemická syntéza velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným
sbalením proteinu
• In-vitro translace vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení drahé, posttranslační modifikace
![Page 24: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/24.jpg)
Proteinová krystalografie - krystalizace• Hledání vhodných podmínek (koncentrace
proteinu a srážedla, teplota, pH, čistota vzorku proteinu, použitá metodika …)
• Zavádění robotizace a automatizace• Difrakční kvalita je často nedostatečná a
proměnlivá• Nutnost velkého množství krystalů
![Page 25: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/25.jpg)
Difrakční experiment• Velikost základní buňky desítky
až stovky Å• Nízká úroveň uspořádanosti• Nutnost použít silný zdroj záření
(rotační anoda nebo zdroj synchrotronového záření)
• omezení radiačního poškození proteinových monokrystalů použitím nízké teploty (80-120 K)
![Page 26: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/26.jpg)
RTG strukturní analýza - rozlišení
5Å - helixy jsou obtížně viditelné (jen obecné vlastnosti molekuly)3Å - peptidový řetezec, postranní řetězce pouze jeli známa sekvence2Å - konformace postranních řetězců
![Page 27: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/27.jpg)
Krystalové kontakty
• Mezi atomy jsou velké kanálynaplněné rozpouštědlem
• Kontakty molekul v rámci krystalumohou a nemusí mít vliv na strukturu → záleží na pozicikontaktu
![Page 28: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/28.jpg)
Teplotní B-faktor• Popisuje lokání nepřesnost v elektronové hustotě• Vysoký B-faktor → více nepřesná pozice atomu• Ideální B < 20 - 30 Ų
Důvody vysokých hodnot B-faktoru:1. Termální pohyb atomů2. Rozdílná konformace postranních řetězců3. Neuspořádanost proteinu
![Page 29: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/29.jpg)
Kontrola struktury • Ramachandranův
graf WHATIFMOLPROBITY
• Free R value (Brünger 1992)‚Test set‘ of reflection is omitted in the modelling and refinement process (5-10 %).
![Page 30: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/30.jpg)
Nukleární magnetická rezonance• Nukleární – nukleární spin a nukleární magnetický
moment
• Magnetická – jádro v magnetické poli → precesní pohyb jader a Larmorova frekvence, Zeemanův jev a Boltzmanova distribuce
• Rezonance – rezonance jader v magnetickém poli
![Page 31: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/32.jpg)
Vlastnosti jader• Nukleární spin – vlastní moment hybnosti jádra daného izotopu
∑ (orbitální + spinový moment nukleonu)• pouze jádra s nenulovým spin mohou absorbovat/emitovat
elektromagnetické záření• (1) hmotnostní číslo M liché → poločíselný spin• (2) hmotn. číslo M sudé + počet protonů A sudý → nulový spin
nulový magn. moment - nepoužitelné v NMR (např. )• (3) hmot.číslo M sudé + počet protonů A lichý → celočíselný spin
• Skoro každý prvek má nějaký stabilní isotop s nenulovým spinem.(Výjimky: Ar, Tc, Ce, Pm)
O168
W0(MHz) 0 30 75 121 280 300 320 Nucleus 15N 13C 31P 19F 1H 3H
![Page 33: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/33.jpg)
Nukleární magnetická rezonancevysoké přirozené zastoupení vysoká citlivost (1.00) malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)
velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.11 %) nízká citlivost (1.76⋅10−4); po 100% isotopovém obohacení 1.59⋅10−2
střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) nízké přirozené zastoupení (0.37 %) nízká citlivost (3.85⋅10−6); po 100% isotopovém obohacení 1.04⋅10−3
speciální účely
1H
13C
15N
2H
![Page 34: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/34.jpg)
Nukleární magnetická rezonance• měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-
chemických vlastností prostředí • sledování průběhu biochemických dějů • vysoce selektivní odezva na úrovni atomů
Omezení:velikost molekuly:• do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA] – lze řešit přímo kombinací COSY,
TOCSY a NOESY experimentů • do 20 kDa [< 180 AA] – nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N • –do ~100 kDa – 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo
úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)
• větší proteiny – přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura
koncentrace vzorku – alespoň 0,2 mMdlouhodobá stabilita vzorku – několik týdnů
![Page 35: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/35.jpg)
Nukleární magnetická rezonance - vzorek
• koncentrace proteinu alespoň 0,2–0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe)
• filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění
• úprava pH pufrem (pH typicky 4–8) • vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků
s molekulami vody a ztrátu signálů • přidání redukčních činidel (R–SH) • zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení
vzorku • přidání 5–10 % D2O • referenční jádro pro spektrometr (lock)
![Page 36: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/36.jpg)
Potlačení signálu vody• jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O• fyziologické prostředí • při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za
deuterium → tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O → její signál je 104–105x intensivnější než signály měřené látky
![Page 37: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/37.jpg)
Jednodimensionální 1H NMR spektrumproteinu• obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v
daném proteinu • k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají
všechna jádra: 1H, 13C a 15N
![Page 38: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/38.jpg)
Vícedimenzionální spektrarozlišení informací obsažených v 1D spektrech • korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N • propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin • pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít
izotopové obohacení
![Page 39: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/39.jpg)
NMR – ověření kvality proteinuSbalený proteinNesbalený protein
![Page 40: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/40.jpg)
NMR - přiřazení• přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule
(nutnost znát sekvenci)1. přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO) 2. přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)
Páteřpro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů • přenos magnetizace pomocí skalárních interakcí (1J, 2J)
![Page 41: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/41.jpg)
NMR - Páteř
![Page 42: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/42.jpg)
![Page 43: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/43.jpg)
![Page 44: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/44.jpg)
Postranní řetězce
![Page 45: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/45.jpg)
Strukturní parametry
• NOE - meziatomová vzdálenost
• skalární interakční konstanta - dihedrální úhel
• chemický posun - chemické okolí
• residuální dipolární interakce - vzájemná orientace vazeb
• vodíkové vazby - detailní lokální struktura
![Page 46: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/46.jpg)
Nukleární Overhauserův efekt (NOE) • přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy A a B vlivem
křížové relaxace • hlavní zdroj informace o struktuře proteinu.• Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a
jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule.
• Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů.
• Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity.
• Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å.
![Page 47: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/47.jpg)
![Page 48: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/48.jpg)
Skalární interakce – dihedrální úhly
![Page 49: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/49.jpg)
Chemický posun
![Page 50: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/50.jpg)
![Page 51: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/51.jpg)
Vodíkové vazby
![Page 52: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/52.jpg)
NMR shrnutí určení struktury• Postranní řetězce
COSY, NOESY, 3D-NMR• Sekundární struktura
chemické posuny (páteř)dipolární interakceJ-interakce (torze)
• Terciální strukturaNOE intenzity
![Page 53: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/53.jpg)
Elektronový mikroskop • Optický přístroj, kde fotony jsou nahrazeny elektrony a
skleněné čočky elektromagnetickými čočkami• Elektromagnetická čočka – cívka co vytváří tvarované
magnetické pole
• TEM (transmisní elektronový mikroskop)• SEM (rastrovací elektronový mikroskop)
![Page 54: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/54.jpg)
![Page 55: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/55.jpg)
TEM (NC 1986, objev 1932 Ruska)• Zobrazuje pomocí prošlých elektronů (transmisní –
elektrony projdou skrz vzorek a až pak jsou detekovány)• Vysoké urychlovací napětí elektronů (100-400 kV)• Pro tenké vzorky (do 100 nm)
![Page 56: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/56.jpg)
SEM• Zobrazuje povrch vzorku pomocí sekundárních elektronů
nebo zpětně odražených elektronů• Urychlovací napětí elektronů (0.1-30 kV)• Rastrovací - elektronový svazek se pohybuje po vzorku
řádek po řádku v jakémsi neviditelném rastru a výsledný obraz se vytváří postupným skenováním
• Snadná příprava vzorku• Snadná interpretace
![Page 57: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/57.jpg)
Kryo-elektronová tomografie• 200kDa – 400 MDa umožňuje zobrazení velkých struktur,jako jsou buňky a organely v téměř nativním stavu• Zahrnuje šokové zmrazení• Rozlišení 15 – 30 Å
![Page 58: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/58.jpg)
Kryo-elektronová mikroskopie• používá pro „jednotlivé částice“ především na bázi
makromolekulárních komplexů, které byly izolovány a purifikovány (vyčištěny) biochemickou cestou.
![Page 59: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/59.jpg)
FRET – Fluorescence (Förster) resonance energy transfer• rezonanční přenos energie z donoru v excitovaném stavu
na akceptor (mezi dvěma chromofory)• hybridizace DNA, konformační změny, interakce
biomolekul, senzory.
![Page 60: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/60.jpg)
Chemický posun
![Page 61: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/61.jpg)
NOE
![Page 62: STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEKfch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/11/stanoveni_struktury.pdf · struktur v databázi ... • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040508/5e4b4f4ca7dac566602d381e/html5/thumbnails/62.jpg)
Skalární interakce