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Strukturbasiertes
phage display
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Martin-Luther-UniversitätHalle-Wittenberg
Institut für Biotechnologie
Arbeitsgruppe Proteintechnologie
Ulrike FiedlerGerald BöhmRainer RudolphCarola Reimann
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Phage display und panning
löslichesProtein
eluierter Phage
Selektionsprozess
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Light chain
Heavy chainIntra-chain-disufide bonds
Inter-chain disulfide bond
Active site
Active site
VK VKVH VH
CK CKCH1
CH3
CH2
CH1
CH3
CH2
Structure of Antibody Molecules
Complete antibody
IgG molecule Catalytic antibody
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Application of Antibodies
Diagnostics
Therapy
Monitoring
Purification
tumour diagnosisELISA
cancer
detection and quantificationof bacteria, toxins, viruses, pesticides
affinity chromatographybioremediation
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Antibodies
Affinity
Specificity
Size
Immunogenicity
Low stability
Advantages Disadvantages
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Phagenspezies für das phage display
filamentöse Phagen lytische Phagen
periplasmatisch zytoplasmatisch
Plasmamembran
äußere Membran
Expression in der E. coli-Zelle
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Verwendung von single-chain FvAntikörpern beim phage display
VKVH
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Anwendungen des phage display-Systems
Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern
Herstellung von Immunogenen
Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern
Identifizierung von Peptid-Liganden
Mapping der Substratbindungsstelle
von Proteasen und Kinasen
Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern
Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening
directed Evolution
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Cytochrome b562TendamistatZ-Domäne vomProtein A
Cys2His2-Zink-Finger
Scaffolds für das phage display
Zn
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Ziel des Projektes
Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften
Anforderungen an das Scaffold-Protein:
- kleines Protein
- hohe Stabilität
- geringe Immunogenität
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Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin -
ein scaffold für das phage display?
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sehr stabiles Protein
kleines Protein
kaum immunogen
Kristallstruktur vorhanden
174 Aminosäuren
2 Domänen
4 -Faltblätter mit jeweils 4 -Strängen (greek-keay)
Eigenschaften des Gamma-Kristallins
Gamma-Kristallin als scaffold:
stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften
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Solvent Accessibility
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Acc
essi
bili
ty (
% o
f m
ax.)
Residues 1-85 (N-terminal domain)
2
4
6
15
1719
36
38
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“Inside”
“Outside”
(Glu
) 7
(Ph
e) 5
(Ile) 3
(Th
r) 4
(Ly
s)
2
(Gly
) 1
(Ty
r) 6
(Tyr) 1
6
(Cy
s) 1
8
(Se
r) 1
9
(Glu
) 1
7
(Cy
s)
15
(His
) 1
4
Sequence Variability
(As
p)
38
(Se
r) 39
(Va
l) 37
(Se
r) 34
(Ile) 3
5
(Arg
) 3
6
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Mutagenese im -Faltblatt
Ser 19
MutagenisiertePositionen:
Lys 2Thr 4Tyr 6Cys 15Glu 17Ser 19Arg 36Asp 38
Anzahl der möglichenVarianten:208 = 2.6 E+10
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Ort der Mutagenense
Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2
Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%
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Konstruktion einer kombinatorischenGamma-Kristallin-Bank
Design der Oligonukleotide
Assemblierung
Klonierung
Expression and Selektion
X X X
X X
X X
X
XXX XXX XX
X
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Assemblierung der Oligonukleotide
X X X X XX X
XXX
Assemblierung an der Festphase
SA-coated paramagnetic bead XXX
Kodon-NutzungN/N/N - 64 Kodone für eine Aminosäure
CAT/N/N - kein Stop-Kodon, kein Cystein,
keine aromatischen Aminosäuren
N/N/K (T or G) - 32 Kodone für eine Aminosäure
Tripletts - 20 Kodone für eine randomisierte Amiosäure
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Ergebnisse und Probleme
Herstellung der Bank Größe der Bank
Qualität der eingesetzten Oligo’s
Expression der mutierten Proteinen
Etablierung des phage
display-Systems (scFv)
Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen
Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine
Panning Selektion geeigneter Targets und
panning-Bedingungen
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Target Molecules
Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin, digoxigenin, testosterone
Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor
Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)
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Erste Zielmoleküle
Haptene: OxazoloneBiotin
Proteine: BSALysozymCD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen)
Enzymatische GlucosidaseAktivitäten:
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Weiterführende Arbeiten
Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung
von Triplett-Oligonukleotiden
Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder
Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen
Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE
Stabilitätsuntersuchungen
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Ausblick
weitere Mutagenesen: loop-Region,
Region zwischen N- und
C-terminaler Domäne
random - DNA-shuffling
Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten
mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul)
Panning: an lebenden Zellen
(zellspezifische Targeting-Module)