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Profa. Renata Faier Calegario
Técnicas moleculares:Extração de DNA, detecção de ácidos
nucleicos e sequenciamento
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
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DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
DNA DNA
RNA
PROTEÍNA
Transcrição
Tradução
Replicação
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DNA RECOMBINANTE
Planta Transgênica
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INTRODUÇÃO
Isolamento do DNA da planta
Fundamental para analisar se oDNA exógeno foi inserido nogenoma vegetal
• PCR = Presente ou Ausente
• Southern Blot = Nº de cópias
Planta Transgênica
Técnicas de detecção :
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EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Diferentes protocolos => em função da espécie e do tecido
Maioria => variação de 2 protocolos básicos
• Dellaporta et al. (1983)
• Doyle & Doyle, (1987)Baseado na utilização do detergente CTAB
Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos: por acetato depotássio na presença de SDS
Romper as membranas celulares para liberação do DNA
Romano, 1998
� Isolamento do DNA da planta
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EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Você deve ter em mente:
� Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos,proteínas e polissacarídeos
� Manter Integridade: informação/sequência
�Comp. fenólicos e polissacarídeos = interferem na atividadede enzimas usadas para manipulação de DNA=> ligases, polimerases e enzimas de restrição
� Use tubos plástico novos e esterilizados=> O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)
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EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB
Romano, 1998
NaCl, Tris,
EDTA, βME
H2O Lise celular = liberar o DNA
Evita degradação do DNA
Desnatura proteínas
Lipídeos, polissacarídeos
DNA
Proteínas
Precipita DNA
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EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Etapas básicas de protocolos de extração
� Lise celular = liberar o DNA
• N2 líquido
• Diretamente no Tampão de extração
Tampão de extração
• Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0)
• EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses)
• β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas
=> DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição
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EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
� Tampão de extração (continuação)
• NaCl = liberação de proteínas ligadas aos ácidos nucleicos (íonsrompem ligações de cadeias polipeptídicas)
• CTAB e SDS = detergentes = lise das membranas celulares (liberaos componentes)
⇒ Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA
⇒ Usado para precipitar o DNA seletivamente
• RNAse = elimina RNA
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� Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos• Fenol
• Clorofórmio:álcool isoamílico
⇒ Fase aquosa (superior): DNA + contaminantes (Polissacarídeos e RNAs)
⇒ Interface: proteínas desnaturadas
⇒ Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos
� Recuperação do DNA: Precipitação
• Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita
• Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos
• Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos
Centrifugação
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
� Lavagem do DNA: remoção de sal
• Etanol 70%
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� Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA(oxidação)
� Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso emuito viscoso
� Presença de DNAses endógenas: visualização do DNAgenômico em gel de agarose – degradado (arraste vertical)
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Problemas comumente encontrados:
Baixa qualidade do DNA
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PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES
Ro
ma
no
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Continuação
Romano & Brasileiro, 1998
PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES
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DNA absorve luz no λ 260 nm / Proteínas a 280 nm
• 1 OD 260 = 50 mg de DNA
[[[[DNA]]]] = leitura OD260 x 50 x fator de diluição
• Parâmetro da qualidade do DNA => Relação OD 260/OD 280
Valores < 1,8 => contaminação com proteínas
Valores >1,8 => contaminação com fenol
Avaliação DNA extraído: Concentração e Pureza
1. Análise da OD em espectrofotômetro
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
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2. Eletroforese: Análise em gel de agarose
• Concentração: 0,8% e 1% (varia de acordo com tamanho DNA)
• Marcador: DNA de concentração conhecida = Padrão
• Amostras comparadas aos padrões: possível estimarconcentrações de DNA em cada amostra
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
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ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
1Kb = 1000pb
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ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas
1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz
http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance
Sorgo Folha Arroz Folha Trigo
Kit de extração DNA
HiPurA™ - Hemedia
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Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida
5 Min 30 Min
Tratamento com Topoisomerase
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
A dupla-hélice enrola-se sob si
mesma
Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ouremovendo superenrolamentos
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TESTES MOLECULARES DETECÇÃO
PCR: Polymerase Chain Reaction
� Método in vitro para produzir DNA
� Baseado nas propriedades do DNA:
Reação de Polimerização em cadeia
Elementos necessários:
⇒ DNA molde: Proveniente de extração
⇒ Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers enucleotídeos
Karl Mullis: 1983Prêmio Nobel: 1993
Desnaturação
Renaturação
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REPLICAÇÃO X PCR
Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA?
DNA molde
Abertura das fitas = helicase
Adição de nt = síntese
Primers = Primase
Nucleotídeos
Temperatura
Primer: desenhar
DNA: extrair
Nt Sintéticos
DNA polimerase
CÉLULA IN VITRO
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Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf)
• DNA extraído: 20 a 200ng
• dNTPs: Nucleótidos A, T, C, G
• Par de Primers (iniciadores)=> anelando nas bordas daregião a ser amplificada
• Taq DNA polimerase: Thermus
aquaticus (estável em ↑ T°)
• Tampão 10X: estabiliza pH
• MgCl2: cofatores (Mg+2) Taq eajuda ligação dos primers
REAÇÃO DE PCR
H2O
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
Primer5’ - 3’
Primer3’ – 5’
Taq DNA Polimerase
Mg+2
Tampão 10X
dNTPs
Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/
DNA
25µL
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=> Amplificação da sequência específica do DNA = fragmento
=> Tamanho e sequência definidos
=> Grande quantidade
Ao final da Reação:
PCR
Equipamento necessário:
⇒ Termociclador
⇒ Propicia temperaturas distintas
Desnaturação = 94°C
Anelamento = 54°C
Extensão = 72°C1 Ciclo
500 pb
700 pb750 pb
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PRIMERS
O QUE É UM PRIMER?
� Sequência de nucleotídeos complementar às extremidadesda sequência alvo do DNA
� Tamanho: 17-25 nucleótidos
� Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA aser amplificado
COMO FAZER UM PRIMER ?
� Conhecer a sequência do gene
� Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’
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PRIMERS
…GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTCAACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGTTATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACCATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTTGTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTGATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAGATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTGTTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGGCAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...
5’-
- 3’
Sequência do Gene
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5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’
5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’
3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’
Fita 1 - Molde
Fita 2 - Complementar
Fita 1 - Molde
Fita 2 - Complementar
PRIMERS
5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do PrimerForward (Left)
Amplifica Fita 5’- 3’
molde
Sequência do PrimerReverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’
Amplifica Fita 5’ - 3’
Compl.
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PRIMERS
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� Composição: 50% C+G
� Extremidade 3’: com G ou C
� Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´) = Anelamento inespecífico em
regiões ricas em G ou C
� Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin,
estruturas secundárias)
PRIMERS
Características desejáveis dos Primers
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� Temperatura alta: maior especificidade
� Temperatura baixa: menor especificidade
�Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers
Tm varia de 55-72oC
Tm dos dois primers próximas
PRIMERS
Condições de Anelamento TEMPERATURA
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Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C)
Melting Temperature (Tm) = Temperatura Desnaturação
Fórmula de Wallace
PRIMERS
5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do PrimerForward (Left)
Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4)
Tm = 58°C TA = 53°C
5º C abaixo da Tm
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� Programa Primer 3
� http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
� Colar a sequência do gene
� Pick Primers (Left e Right)
PRIMERS
Uso de Programas
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PROGRAMA: PRIMER 3
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Len: Oligo Length
tm: Melting Temperature
Any: Self Complementarity - a
measure of its tendency to anneal to
itself or form secondary structure
3' : Self Complementarity-taken as
a measure of its tendency to form a
primer-dimer with itself
rep : Mispriming or Mishyb
Library Similarity - The similarity
to the specified Mispriming or
Mishyb library.
seq : Primer Sequence, 5'->3‘ The
sequence of the selected primer or
oligo, always 5'->3', so the right
primer is on the opposite strand
from the one supplied in the source
input. The right primer sequence is
the sequence you would want
synthesized in a primer order.)
LEGENDA
PROGRAMA: PRIMER 3
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PCR
⇒ O que acontece dentro do termociclador??
Desnaturação = 94°CAnelamento = 54°CExtensão = 72°C
1 Ciclo
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REAÇÃO DE PCR
Anelamento
ou
Primer Forward
Primer Reverse
Forward
Reverse
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REAÇÃO DE PCR
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1° CICLO
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APÓS REAÇÃO
Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica
Quantidade de cópias = 2 n
Onde, n = n° de ciclos
2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento
Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers”serve como molde para síntese de uma nova fita.
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ANÁLISE DA PCR
Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse
� Eletroforese: Análise em gel de agarose
• Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento)
• Marcador conhecido: para estimar o peso molecular
Presença de Banda = Positivo
Ausência de Banda = Negativo
• Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanhodo fragmento de DNA amplificado
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ANÁLISE DA PCR
Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
Primers utilizados para PCR e oisolamento do Vip3A
Amplificação confirma a presença do gene
Gene 99,8% idêntico à sequência de nt publicadapara o gene Vip3A
Detecção do gene Vip3A: Bacillus turingiensis
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ANÁLISE DA PCR
Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007
Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco
Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A,compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum
Rep
CP
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- Apresenta alguns falsos positivos
- Importante controles +/-
- Sensível (fentograma: 10-18) - Rápido- Grande n° amostras
Vantagens:
Desvantagens:
PCR
Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
Controle negativo = sem DNA
Controle negativo = com DNA, sem primer
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PCR
- Detecção de genes em DNA genômico
- Clonagem de DNA
- Sequenciamento
- Evolução molecular
- Análise de estrutura genômica
- Identificação de mutações
- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas
- Teste de paternidade
APLICAÇÕES
.....
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HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização
Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex
Teste de complementaridade
DNA
Southern Blot Northern Blot
RNA
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Sonda: sequência complementar de DNA alvo
SOUTHERN BLOT
Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico
COMO?
Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA
� Sondas Radioativas = nt 32P
� Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente)
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KIT DE MARCAÇÃO
Kit Dig DNA
Produto PCR purificado
Fervido: 100° C/10 min => Gelo
PCR desnaturadoNt (primers aleatórios - hexameros)dNTP- DigoxigeninaEnzima Klenow DNA Polimerase I
Δ 37°C 12hs
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Gel: Fragmentos DNA
TRANSFERÊNCIA
HIBRIDIZAÇÃO
SOUTHERN BLOT
REVELAÇÃO
Tratamentos:
Depurinação
Desnaturação
Neutralização
-- --
-
-
-
-
--
-
-
--
-Lavagens
Retira excesso
de sonda
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DNA (-) imobilizado
Sonda fria
Nucleotídeos marcados com
digoxigenina
E E E
Anticorpo contra digoxigenina
ligado a Fosfatase alcalina
Membrana (+)
Adição substrato da enzima Fosfatase alcalina (NBT/BCIP)
=> clivagem e precipitação sobre a membrana
O QUE ACONTECE NA MEMBRANA
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Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos
SOUTERN BLOT
VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja
Gel - 3hs
Hibridização 18hs
α32P: d-CTP3 3
4
1 11
4 4 6 66 6
4
Cópias do transgene
DNA total Hind III Separou o gene
PCR
SoutherBlot
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SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Batata
DNA total digerido Eco RI
1 e 5: Marcador Peso Molecular
2 e 4: DNA total batata transgênica
digerido co Eco RI
3: DNA total batata Não-transgênica
digerido co Eco RI
Southern Blot do gel
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� Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perdadas mesmas ou ao silenciamento
� Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo daplanta, pelo efeito posicional das inserções
Alto número de inserções do transgene:
SOUTERN BLOT
� Importante para a expressão estável
� Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação dareal interação entre as moléculas
Poucas cópias:
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� Sensibilidade (fentograma)
� Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma
� Envio de membranas para outro laboratório
� Demorado
� Caro
� Perigoso (sondas radioativas)
SOUTHERN BLOT
Vantagens:
Desvantagens:
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- Importante experimentos de Transformação => Provamolecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal
- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo dealterações no material genético
- Detecta fragmento específico em meio a milhões defragmentos
- Usado para distinguir estirpes de um organismo
SOUTHERN BLOT
APLICAÇÕES
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SEQUENCIAMENTO DO DNA
• Identificação da sequência exata dos nucleotídeos do DNA
Método Enzimático (Sanger): Similar à PCR
� Baseado no término da cadeia com um nucleotídeo modificado
Reagentes Necessários => Reação de sequenciamento
• DNA a ser sequenciado
• Primer (aprox. 20nt)
• Nucleotídeos: dATP, dGTP, dTTP e dCTP
• Nucleotídeos modificados: ddATP, ddGTP, ddTTP e ddCTP
• DNA polimerase
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SEQUENCIAMENTO DO DNA
Nucleotídeos modificados: ddNT (didesoxirribonucleotídeos)
� Não apresentam OH no Carbono 3’
� Uma vez incorporados = impedem a adição de outro nucletídeo
� Termina o alongamento da cadeia
� São marcados: fluorocromo (emite fluorescência em determinado λλλλ)
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SEQUENCIAMENTO DO DNA
Sequenciador de DNA: leitura dos nucleotídeos marcados
• Deposita amostras em placa (96 cavidades)
• Introduz a placa no equipamento
• Amostras correm pelos capilares preenchidos com um polímero
• Amostras migram ao longo dos capilares até atingirem região do laser
• Excita fluorocromo => emite fluorescência no λ correspondente a cada base
• Equipamento traduz e gera um gráfico = Eletroferograma
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Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir doprimer, interrompidos quando um ddNT é incorporado à fita
SEQUENCIAMENTO DO DNA
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Os fragmentos migram no capilar (menores na frente)São iluminados por um feixe de laser emitem fluorescênciaquando atravessam a janela do feixe.
SEQUENCIAMENTO DO DNA
Feixe de laser
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SEQUENCIAMENTO DO DNA
Eletroferograma
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SEQUENCIAMENTO DO DNA
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1. Amplificação do gene de interesse
2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição
3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo
4. Transformação da planta
5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada:PCR, Southern Blot
6. Sequenciamento
SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO
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BIBLIOGRAFIA
1. Brasileiro, Ana Cristina MirandaManual de Transformação Genética de PlantasEMBRAPA SPI/EMBRAPA-CENARGEN, 1998
2. Oliveira, Márcia Cristina de SenaFundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e deamplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia dapolimerase. EMBRAPA PECUÁRIA SUDESTE, 2007
3. Lima, et. alIdentificação do número de inserções via Southern blot emlinhagens de soja geneticamente modificadas VIII JornadaAcadêmica da Embrapa Soja - EMBRAPA SOJA/LONDRINA