Download - Teknik Biakan Murni Bakteri
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Di alam populasi mikroorganisme tidak terpisah menjadi spesies
tersendiri tetapi terdapat bersama-sama. Di laboratorium populasi campuran
tersebut dapat dipisahkan menjadi kultur murni. Kultur murni mengandung
hanya satu jenis organisme dan dapat dipelajari selanjutnya mengenai
morfologi, sifat biokimia dan lain sebagainya.
Koloni merupakan massa pertumbuhan mikroorgsnisme secara
makroskopis dapat terlihat pada permukaan medium padat, masing-masing
menunjukkan multiplikasi dari satu organisme. Teknik umum yang
digunakan untuk mengisolasi koloni diskret harus dilakukan pengurangan
jumlah inokulum. Dengan pengurangan tersebut, inokulasi berikutnya, maka
sel akan terpisah cukup jauh dari sel lainnya pada permukaan medium agar
sehingga terbentuk spesies berbeda akan terpisah. Beberapa teknik untuk
isolasi adalah sebagai berikut :
1. Metode “streak plate” merupakan metode isolasi kualitatif yang dapat
dilakukan dengan cepat. Perlu dilakukan teknik pengenceran dengan
menggunakan ujung jarum inokulasi bulat untuk membantu
menyebarkan kultur pada permukaan medium.
2. Teknik “spread plate” membutuhkan campuran mikroorganisme yang
diencerkan sebelumnya. Selama inokulasi sel-sel akan terpisahkan ke
1
seluruh permukaan medium padat dengan menggunakan batang kaca
yang berujung L sedang cawan petri di putar menggunakan suatu alat
“lazy-susan”.
3. Teknik “pour plate” membutuhkan pengenceran seri dari kultur
campuran dengan menggunakan jarum inokulasi atau pipet. Inokulum
yang telah diencerkan kemudian ditambahkan ke dalam medium agar
yang telah dicairkan ke dalam cawan petri, ocok kemudian biarkan
membeku.
1.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan diadakannya praktikum kali ini adalah untuk mempelajari
prosedur inokulasi untuk memisahkan kultur campuran sehingga dapat
diisolasi koloni diskret.
1.3 Perumusan Masalah
Permasalahan yang diangkat adalah “ bagaimanakah prosedur inokulasi untuk
memisahkan kultur campuran sehingga dapat diisolasi diskret?”
2
BAB II
KAJIAN TEORI
Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau
lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga
diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke
tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas
dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain.
Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat
yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar
air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi
oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan.
Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton
dan Sainsbury, 2006).
Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari
berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber
bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200
bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni
yang berasal dari bakteri tunggal.
Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan
jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk
menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores
dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan
3
metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread
plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu
menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan
periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi
cocok untuk pertumbuhan bakteri. (Harley dan Presscot, 2002).
Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan
menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan
harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari
ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk
koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya
agar didapatkan biakan murni.
Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan
mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC
kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan
suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya
dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya
masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga
terbentuk koloni tunggal.
Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan
suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata
dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual,
kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal.
4
Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk
mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan
memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang
menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni.
Bakteri dapat ditumbuhkan dalam suatu medium agar dan akan
membentuk penampakan berupa koloni. Koloni sel bakteri merupakan
sekelompok masa sel yang dapat dilihat dengan mata langsung. Semua sel
dalam koloni itu sama dan dianggap semua sel itu merupakan keturunan
(progeny) satu mikroorganisme dan karena itu mewakili sebagai biakan
murni.
5
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Ose.
b. Inkubator.
c. Cawan petri steril.
d. Bunsen.
e. Korek.
2. Bahan
a. Nutrien agar (NA) dan nutrien broth (NB).biakan bakteri.
B. Cara Kerja
1. Cara Goresan (Streak Plate Method)
a. Cairkan nutrien agar dalam penangas air.
b. Dinginkan sampai temperatur ± 50°.
c. Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri
steril secara aseptik dan biarkan sampai dingin dan padat.
d. Ambil 1 ose suspensi bahan yang mengandung bakteri
atau campuran bakteri secara aseptik, kemudian dibuat
goresan pada permukaan agar.
e. Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan
dibalik untuk mencegah terjadinya tetesan air pada
permukaan agar dari hasil kondensasi uap air.
f. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik pada
suhu 300C, minimal selama 1x24 jam
g. Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada bekas goresan.
Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan yang
lebat setelah diinkubasikan, sehingga akan sukar diisolasi.
6
Tiap koloni yang terpisah mungkin berasal dari 1 macam
sel bakteri.
h. Salah satu koloni dipilih dari masing-masing tipe koloni
yang tumbuh, kemudian diamati bentuk koloninya.
2. Cara Tuang (Pour Plate Method)
a. Medium untuk pertumbuhan bakteri (nutrien agar) yang
telah dicairkan dalam penangas air (100°C), dinginkan
sampai temperatur 50°C, kemudian diinokulasikan dengan
satu ose suspensi secara aseptis.
b. Dituangkan ke dalam cawan petri steril berlabel secara
aseptis, kemudian digoyang perlahan supaya cepat
mengering.
c. Diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing
pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke
dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar
terhindar dari kontaminan.
d. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar
secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk
mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur
mikroba.
e. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam
posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar,
minimal selama 1x24 jam.
f. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati.
3. Cara Sebar (Spread Methode)
a. Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan.
b. Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer
dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.
7
c. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari
gelas berbentuk huruf L. Pada teknik ini sterilisasi penyebar
dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan
kemudian dipanaskan sampai alkohol terbakar habis.
d. Penyebar didinginkandahulu sebelum digunakan untuk
menyebar cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran
cairan contoh ( sampel ) dilakukan dengan memutar agar
lempengan tersebut.
8
BAB IV
HASIL PENGAMATAN
Tabel. Macam-macam teknik isolasi
No
.Metode Isolasi Gambar Pengamatan
1 Streak Plate dan
Pour Plate
Semua bakteri (E. coli, bakteri lingkungan dan bakteri di badan)
2 Streak Plate
E. coli
9
3 Pour Plate
E. coli
No
.Metode Isolasi Gambar Pengamatan
4 Pour Plate
Bakteri di badan (kaki)
5 Pour Plate
Bakteri Lingkungan
6 Medium Cair
10
E. coli
BAB V
PEMBAHASAN
Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang
hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen
kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Yang terakhir ini boleh disebut
penyerbu yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri
patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan
siapa yang diboncengi diberikan pedoman “siapa yang kedapatan di situ
lebih dulu, dan siapa yang datang terkemudian”. Untuk menyendirikan suatu
spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu:
1. Dengan Pengenceran
Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia
berhasil memiara murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari
susu yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa
campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung
11
tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi.
Dan dari pengenceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih
lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk
disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan
mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi
mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang
demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies
ini dapat kita jadikan biakan murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni
tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran
dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.
2. Dengan Penuangan
Robert Koch (1843 – 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu
dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan,
dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan
gelatin encer. Dengan demikian yang diperoleh hanyalah suatu piaraan
adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam
kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap
murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, maka
akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.
Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat
berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan dengan tutup yang sekarang
terkenal sebagai cawan Petri (Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Hese
12
yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Memang agar-agar
ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental suatu medium.
Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95o C.
3. Dengan Penggesekan
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu
memakan waktu, tapi dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat
tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu
setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium
padat, maka beberapa waktu kemudian daripada itu (kurang lebih setelah 12
jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebat di permukaan
medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya
terpencil, maka akan diperoleh suatu biakan murni.
Ada beberapa teknik penggesekan yakni :
a. Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada
bagian luar dasar cawan petri.
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan
sinambung.
Panaskan ose dan biarkan dingin kembali
Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan
goresan di daerah II.
13
Pijarkan kembali ose dan biarkan dinginkembali
Prosedur di atasdiulangi untuk daerah III.
b. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T , hanya
lempengan agar dibagi menjadi 4.
c. Goresan Radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan
Ppijarkan ose dan dinginkan kembali
Putar lempengan agar 90o dan bbuat goresan terputus
dimulai dari bagian pinggir lempengan
Putar lempengan agar 90o dan buat goresan terputus di atas
goresan sebelummya.
Pijarkan ose.
d. Goresan Sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah
permukaan lempengan agar.
Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180o, gunakan sisi
mata ose yng sama dan gores pada sisa permukaan
lempengan agar.
4. Dengan Mengucilkan Satu Sel (Sincle Cell Isolation)
Kita mempunyai alat yang dapat mengambil satu bakteri dari sekian
banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu disebut
mikropipet. Alat itu ditempatkan pada tangan-tangan suatu
mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung
14
pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan di bawah obyektif
mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka
dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer
dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini
dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran,
lagi pula, mikromanipulator itu sangat mahal.
5. Dengan Inokulasi Hewan
Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua
bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak
dari seseorang yang sedang menderita tbc. Jika dahak itu disuntikkan ke
dalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu
tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc
saja. Biakan Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian
juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu
akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai.
Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di
bawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di
dalam rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Redi).
15
BAB VI
KESIMPULAN
Dari uraian di atas dapat disimpulkan bahwa teknik isolasi kultur
murni dapat dilakukan dengan menggunakan metode antara lain ;
1. Teknik pengenceran
2. Teknik penuangan
3. Teknik penggoresan
4. Teknik penyebaran
5. Cara pengucilan satu sel
Dan teknik yang dilakukan adalah dengan teknik penggoresan (streak -
plate), ini cara yang paling umum dan ekonomis. Namun memerlukan
keterampilan.
Ada beberapa metode untuk mengisolasi bakteri diantaranya
metode streak plate, spread plate dan pour plate. Metode streak plate
tekniknya sulit dilakukan namun kontaminan mudah dibedakan. Metode
16
pour plate, mudah dilakukan dan dapat ditumbuhi mikrobia aerob maupun
anaerob tetapi kontaminan sulit dibedakan. Metode spread tehniknya sama
dengan pour plate tetapi menggunakan alat untuk menyebar medianya.
DAFTAR PUSTAKA
Barazandeh, N. 2008. Microbiology Titles. Jerman. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media , pp 9-11
Pelczar, M.J.Jr, and E. Chan.1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit UI Press. Jakarta. p:23-24.
Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology. 7th Ed. McGraw-Hill Book Company Inc. USA, p: 113-116
Seiler, J. P. 2000. Good Laboratory Practice. Swiss. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media , p 61.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang, p: 61-67.
17