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UNIVERSITA’ degli STUDI di MILANOFacoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Scienze Biologiche
DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMOLECOLARI E BIOTECNOLOGIE
Studio dell’ espressione proteica in cervelletto di topo wild type e knock out per Ras-GRF1,
uno scambiatore neuronale di Ras
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CICLO delle PROTEINE Ras
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• Topi knock out sono vitali e fertili e non mostrano difetti morfologici
• Mostrano però alcune peculiarità:
1. Difetti nei fenomeni di plasticità sinaptica e nei meccanismi di formazione della memoria a lungo termine
2. Cellule ippocampali di topi knock out mostrano un’aumentata
eccitabilità neuronale intrinseca
3. Topi knock out sono maggiormente suscettibili a trattamenti con agenti convulsivanti
4. Topi knock out sottoposti a trattamento cronico con cannabinoidi non sviluppano tolleranza nei fenomeni analgesici e locomotori
TOPI KNOCK OUT PER Ras-GRF1
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Confronto del pattern proteico da estratti di cervelletto di topi wt verso topi ko per Ras GRF1
• Frazionamento cellulare attraverso centrifugazioni differenziali in tre estratti: - citosol S1 - mitocondri P1 - Microsomi/membrane P2
Mediante frazionamento è possibile arricchire l’estratto in proteine specifiche per una determinata frazione • Prima dimensione: IsoElettroFocalizzazione (IEF) pH 3-10 NL
• Seconda dimensione : Elettroforesi su Gel di PoliAcrilammide (SDS-PAGE)
• Colorazione con nitrato d’argento (Silver Staining)
• Acquisizione immagini (Image Master 2D Platinum)
• Analisi dei dati.
Scopo:
• Gli esperimenti sono stati eseguiti su tre topi per ogni singola condizione.
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WT
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KO
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PROTEINE CITOSOLICHE ANALIZZATE MEDIANTE MALDI-TOF
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Conclusioni:
•Analisi qualitativa mostra un numero molto ridotto di proteine presenti in un caso ed assenti nell’altro.
•Una delle proteine identificate mediante MALDI-TOF risulta essere l’ enzima amminoacilasi 1
•Per gli altri spot siamo ancora in attesa dell’analisi di spettrometria di massa
Prospettive future:
• Analisi quantitativa: cambiamento del livello di espressione proteico• Analisi funzionale delle proteine identificate • Studiare le differenze di espressione proteica fra topi trattati cronicamente con THC