Download - Teza Seleniu
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
ALIMENTELE ŞI SUPLIMENTELE NUTRITIVE –
SURSE DE SELENIU PENTRU ORGANISM
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
COORDONATOR ŞTIINŢIFIC:
PROF. UNIV. DR. RODICA CUCIUREANU
DOCTORAND:
VLAD - IOAN TEODOR
IAŞI, 2011
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi
Facultatea de Farmacie
Doamnei/Domnului
Vă facem cunoscut faptul că în ziua de 30 noiembrie 2011 la ora
9.00, în sala S.M.N. Iaşi va avea loc susţinerea publică a tezei de doctorat
intitulată “Alimentele şi suplimentele nutritive – surse de seleniu pentru
organism” elaborată de farmacist Vlad - Ioan Teodor, conducător ştiinţific
prof. Dr. Rodica Cuciureanu, în vederea conferirii titlului ştiinţific de
doctor în Domeniul fundamental Ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.
Vă invităm să participaţi la această manifestare!
Comisia de doctorat are următoarea componenţă:
PREŞEDINTE: Decan Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu,
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi,
Facultatea de Farmacie
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi,
Facultatea de Farmacie
REFERENŢI OFICIALI:
Prof. Univ. Dr. Vasile Dorneanu
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi,
Facultatea de Farmacie
Conf. Univ. Dr. Lorena Filip
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-
Napoca, Facultatea de Farmacie
Conf. Univ. Dr. Ana Corina Ioniţă
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Carol Davila” Bucureşti,
Facultatea de Farmacie
CUPRINS
Introducere................................................................................................................................. 1
Partea generală ......................................................................................................................... 5
CAPITOLUL I. SELENIUL ŞI ORGANISMUL UMAN.................................................... 6
I.1. Seleniul şi organismul uman. Aspecte generale.................................................................... 6
I.1.1. Scurt istoric................................................................................................................... 6
I.1.2. Stare naturală. Surse de seleniu. Cciclul biologic al seleniului.................................... 6
I.1.3. Seleniul – microelement eseţial pentru organism......................................................... 12
I.2. Farmacocinetica seleniului.................................................................................................... 18
I.3. Rolul seleniului în organismul uman..................................................................................... 20
I.3.1. Seleniul şi metabolismul uman..................................................................................... 20
I.3.2. Acţiunea detoxifiantă a seleniului................................................................................. 26
I.3.3. Necesarul zilnic de seleniu........................................................................................... 28
I.4. Patologia provocată de deficitul de seleniu........................................................................... 33
I.4.1. Deficitul de seleniu şi Boala Keshan (cardiomiopatia) ............................................... 33
I.4.2. Deficitul de seleniu şi Boala Kashin-Beck (boala Urov) ............................................. 33
I.4.3. Deficitul de seleniu în cretinismul mixedematos endemic.......................................... 34
I.4.4. Implicaţii ale seleniului în carcinogeneză..................................................................... 34
I.4.5. Deficitul de seleniu şi funcţia imună............................................................................ 36
I.4.6. Rolul seleniului în infecţiile virale .............................................................................. 37
I.4.7. Deficitul de seleniu şi bolile cardiovasculare.................................................................. 37
I.4.8. Seleniul şi funcţia respiratorie...................................................................................... 38
I.4.9. Seleniul şi funcţia tiroidiană......................................................................................... 38
I.4.10. Seleniul şi funcţia pancreatică.................................................................................... 38
I.4.11. Seleniul - implicaţii în alte patologii ......................................................................... 38
I.5. Patologia provocată de excesul de seleniu............................................................................ 39
I.6. Surse alimentare de seleniu................................................................................................... 41
I.6.1. Alimente de origine vegetală - surse de seleniu........................................................... 41
I.6.2. Alimente de origine animală – surse de seleniu........................................................... 43
I.6.3. Metode de îmbogăţire a conţinutului de seleniu al alimentelor.................................... 45
I.6.4. Suplimente nutritive – surse de seleniu......................................................................... 48
Partea experimentală.................................................................................................................. 51
CAPITOLUL II. ESTIMAREA APORTULUI DE SELENIU PRIN CONSUM DE
ALIMENTE................................................................................................................................
52
II.1. Introducere............................................................................................................................ 52
II.2. Determinarea spectrofotometrică a seleniului din produse alimentare................................ 54
II.2.1. Protocol de validare analitică a metodelor spectrofotometrice................................... 54
II.2.2. Stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei spectrofotometrice de determinare a
seleniului din produse alimentare...........................................................................................
59
II.2.2.1. Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă........................... 60
II.2.2.2. Stabilirea volumului soluţiei de acid clorhidric necesar sistemului seleniu
(IV) - iodură de potasiu-albastru variamin.....................................................................
61
II.2.2.3. Stabilirea volumului soluţiei albastru variamin necesar sistemului seleniu
(IV) - iodură de potasiu- albastru variamin...................................................................
62
II.2.2.4. Stabilirea volumului soluţiei de iodură de potasiu necesar sistemului
seleniu (IV) - iodură de potasiu-albastru variamin ...................................................... 62
II.2.2.5. Stabilirea volumului soluţiei de acetat de sodiu necesar sistemului seleniu
(IV) - iodură de potasiu - albastru variamin...................................................................
63
II.2.2.6. Studiul influenţei EDTA asupra sistemului seleniu (IV)-iodură de potasiu
- albastru variamin.........................................................................................................
63
II.2.2.7. Studiul stabilităţii produsului de reacţie......................................................... 64
II.2.3. Raportul de validare a metodei de analiză a seleniului..................................................... 65
II.2.3.1. Liniaritatea....................................................................................................... 65
II.2.3.2. Precizia metodei................................................................................................. 67
II.2.3.2.1. Repetabilitatea detecţiei.................................................................. 67
II.2.3.2.2. Precizia intermediară...................................................................... 68
II.2.3.2.3. Repetabilitatea metodei.................................................................. 68
II.2.3.3. Exactitatea metodei......................................................................................... 69
II.2.3.4. Randament de recuperare................................................................................ 70
II.2.3.5. Limita de detecţie (LD) şi limita de cuantificare (LC).................................... 71
II.2.4. Determinarea seleniului din produse alimentare............................................................... 71
II.2.4.1. Probe de analizat.............................................................................................. 71
II.2.4.2. Separarea seleniului din probele de analizat (material vegetal,
pâine,seminţe) (JAOAC, 2000) ....................................................................................
71
II.2.4.3.Determinarea seleniului din probele de produse alimentare............................ 72
Concluzii...................................................................................................................................... 74
CAPITOLUL III. ROLUL SUPLIMENTELOR NUTRITIVE ÎN ASIGURAREA
APORTULUI DE SELENIU PENTRU ORGANISM.......................................................
76
III.1. Suplimente nutritive: aspecte generale................................................................................ 76
III.2. Suplimente nutritive cu seleniu........................................................................................... 78
III.2.1. Determinarea seleniului prin metoda spectrofotometrică cu iodură de potasiu -
albastru variamin.................................................................................................................
80
III.2.2. Determinarea seleniului din probele de suplimente alimentare.............................. 81
III.2.3. Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive.................................. 82
Concluzii...................................................................................................................................... 88
CAPITOLUL IV. EVALUAREA ROLULUI PROTECTOR AL SELENIULUI ÎN
INTOXICAŢIA ACUTĂ CU ACRILAMIDĂ PE BAZA UNOR PARAMETRI
BIOCHIMICI, HEMATOLOGICI ŞI HISTOPATOLOGICI............................................
90
IV.1. Introducere ......................................................................................................................... 90
IV.1.1. Expunerea populaţiei la acrilamidă.......................................................................... 92
IV.1.2. Toxicitatea experimentalăa acrilamidei................................................................... 94
IV.2. Obiectivele cercetării.......................................................................................................... 97
IV.3. Investigaţii biochimice....................................................................................................... 98
IV.3.1.Determinarea activităţii transaminazelor................................................................. 98
IV.3.1.1. Determinarea activităţii alanin-amino-transferazei (ALT) ........................ 99
IV.3.1.2. Determinarea aspartat-amino-transferazei (AST) ...................................... 100
IV.3.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei (GGT) ............................................ 101
IV.3.3.Determinarea lactat dehidrogenazei (LDH) ............................................................ 103
IV.3.4. Determinarea fosfatazei alcaline (ALP) ................................................................ 104
IV.3.5. Determinarea creatin kinazei (Creatin-fosfokinaza, CK)....................................... 105
IV.3.6. Determinarea albuminelor din sânge...................................................................... 106
IV.3.7. Determinarea proteinelor totale........................ ..................................................... 107
IV.3.8. Determinarea bilirubinei....................... ................................................................. 109
IV.3.8.1. Determinarea bilirubinei totale....................... ........................................... 109
IV.3.8.2. Determinarea bilirubinei directe................................................................ 109
IV.3.9. Determinarea colesterolului.................................................................................... 110
IV.3.10. Determinarea LDL – colesterolului...................................................................... 111
IV.3.11. Determinarea trigliceridelor.................................................................................. 112
IV.3.12 .Determinarea calciului total.................................................................................. 113
IV.3.13. Determinarea magneziului.................................................................................... 114
IV.3.14. Determinarea ferului............................................................................................. 115
IV.3.15. Determinarea sodiului şi potasiului..................................................................... 116
IV.3.16. Determinarea nivelului plasmatic al ureei............................................................ 119
IV.3.17. Determinarea creatininei....................................................................................... 120
IV.3.18. Determinarea acidului uric.................................................................................... 121
IV.3.19. Determinarea triiod-tironinei (T3) ....................................................................... 123
IV.3.20. Determinarea tiroxinei (T4) .................................................................................. 124
IV.3.21. Determinarea cortisolului...................................................................................... 126
IV.3.22. Determinarea glicemiei......................................................................................... 128
IV.3.23.Evaluarea potenţialului protector al seleniului asupra stresului oxidativ
provocat de intoxicaţia cu acrilamidă.................................................................................
129
IV.3.23.1. Determinarea superoxid dismutazei (SOD) ............................................ 132
IV.3.23.2. Determinarea glutationperoxidazei în sânge total................................... 133
IV.3.23.3. Determinarea glutationului redus............................................................. 135
IV.3.23.4. Determinarea malondialdehidei (MDA).................................................. 136
IV.3.23.5. Determinarea statusului total antioxidant (TAS)..................................... 138
IV.4. Evidenţierea modificărilor histopatologice........................................................................ 149
Concluzii...................................................................................................................................... 154
CAPITOLUL V. CONCLUZII GENERALE........................................................................
Bibliografie..................................................................................................................................
157
159
1
INTRODUCERE
Seleniul a fost cunoscut, încă de la descoperirea sa de către
Berzelius, în anul 1817, ca fiind un element toxic. Cercetările ulterioare au
demonstrat că acesta este de fapt, un nutrient esenţial pentru organismul
uman, cu rol fiziologic împortant în prevenirea şi chiar vindecarea unor
afecţiuni. Din punct de vedere biochimic, seleniul este un component al
enzimei glutation-peroxidaza care, alături de alte enzime cum sunt
superoxid-dismutaza, catalaza şi de vitamina E, protejează componentele
celulare de efectele negative produse de acumularea de peroxizi în ţesuturi.
Seleniul este un important antioxidant biologic, acţiune la care
participă în diferite moduri; este constituent al glutation-SH-peroxidazei,
seleno-enzimă care catalizează reducerea peroxizilor lipidici şi a
peroxidului de hidrogen, şi în acest mod previne efectele nocive ale
peroxidării lipidelor cu un conţinut ridicat în acizi graşi nesaturaţi şi
protejează eritrocitele de hemoliză.În plus, seleniul protejează celulele şi
membranele celulare de procesele oxidative, facilitând reacţia dintre oxigen
şi hidrogen şi transferul ionilor la nivel membranar; în concentraţii mici are
acţiune antinecrotică.
Alături de vitamina E şi de tioaminoacizi, seleniul reprezintă un
factor hepatoprotector, numit curent factorul 3-hepatoprotector. De
asemenea, este binecunoscută acţiuna detoxifiantă a seleniului; în
concentraţii mici reduce acţiunea nocivă a unor ioni metalici toxicogeni:
Hg2+, Cd2+, Pb2+, Cu2+, As3+.
Deficitul de aport alimentar de seleniu (semnalat în regiunile în
care solul este sărac în acest element chimic) este corelat cu apariţia unor
manifestări patologice specifice: anemie hemolitică; cardiopatii (mai ales la
copii - maladia Keshan); maladia Kashin-Beck caracterizată prin rigiditate
musculară, dureri articulare, osteoartrită generalizată; malnutriţie proteico-
calorică. În concentraţii mari are acţiune carcinogenă.
Alimentaţia echilibrată asigură necesarul zilnic de seleniu. Alimente
mai bogate în seleniu sunt: carnea, viscerele (ficat, rinichi), peştele (mai ales
cel de apă sărată), laptele şi derivatele, oul, cerealele, unele legume şi fructe;
concentraţia de seleniu în alimente este dependentă de concentraţia acestuia în
sol. Concentraţiile seleniului în sol variază în medie între 0,1 şi 2 mg/kg, în
zonele selenifere putând ajunge până la 1200 mg/kg.
Seleniul este în mod eficient transferat din sol prin intermediul
plantelor şi alimentelor de origine animală în organismul uman. Cantitatea
de seleniu din alimente variază în limite largi în funcţie de zona geografică
de provenienţă şi de cantitatea de seleniu din solul regiunii respective.
2
Aportul inadecvat de alimente, respectiv absorbţia incompletă a
principiilor nutritive conduce progresiv la stări de dezechilibru concretizate
prin simptome de carenţă. Explorarea status-ului nutriţional al organismului
este necesară pentru a corecta prompt fenomenele de carenţă sau de aport
excesiv de principii nutritive.
Utilizarea suplimentelor alimentare autorizate este justificată numai
în cazul unei carenţe dovedite; dozele recomandate trebuie sa corespunda
nevoilor fiziologice. Doza zilnică de seleniu din dietă nu este întotdeauna
de ajuns pentru nevoile nutriţionale ale organismului, mai ales pentru
persoanele care locuiesc în zone cu soluri sărace în acest element.
Numeroşi medici recomandă mărirea dozei de seleniu din dietă şi folosirea
de suplimente nutritive cu acest produs, mai ales ca mijloc de a reduce
riscul apariţiei unor forme de cancer. Acest lucru presupune o grijă sporită
pentru a găsi forma potrivită de seleniu din suplimente, a supraveghea
calitatea produselor de pe piaţă, siguranţa lor şi modul în care sunt ele
consumate. Suplimentarea cu seleniu ar trebui să se facă cu forma care
apare în alimentele consumate în mod uzual.
MOTIVAŢIA CERCETĂRII
Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un
subiect de mare actualitate şi importanţă pentru descifrarea mecanismelor
prin care seleniu, ca microelement, este implicat în efortul comun al
farmacologilor şi nutriţioniştilor de a preveni bolile neoplazice.
Subiectul este cu atât mai important cu cât datele din literatura de
specialitate privind rolul seleniului în prevenirea carcinogenezei şi,
respectiv acţiunea carcinogenă a aportului excesiv de seleniu sunt
controversate. Implicarea seleniului, sub diferite forme (compuşi minerali,
respectiv compuşi organici) suscită încă interesul specialiştilor.
Studiile epidemiologice confirmă faptul că nivelele scăzute de
seleniu plasmatic reprezintă indicatori al riscului crescut de apariţie şi
dezvoltare a maladiilor neoplazice. S-a demonstrat că există o corelaţie
directă a nivelului redus de seleniu plasmatic cu incidenţa cancerului
tiroidian, existenţa de leziuni pre-canceroase la nivelul cavităţii bucale, a
adenomului colo-rectal, cancerului pulmonar, gastric, de sân sau de
prostată.
Seleniul are acţiune dublă: compuşii seleniului, printre care
selenitul de sodiu, au acţiune pro-oxidanta directă conducând la toxicitate
acută dar şi acţiune antioxidantă, prin inglobarea în selenoproteine şi
participarea reglarea diferitelor procese biologice din organism. Ca parte
3
componentă a glutation peroxidazei (GSH-Px), seleniul aparţine primului şi
celui de al doilea nivel de protecţie antioxidantă a celulei. Doze crescute de
selenit de sodiu pot reduce inflamaţia printr-un efect direct pro-oxidativ şi
poate creşte capacitatea antioxidantă a celulei prin incorporarea seleniului
în selenoenzime.
Conţinutul în seleniu în alimentelor este dependent de concentraţia
acestuia în sol. În România, se cunoaşte faptul că solul este sărac în seleniu
şi, în consecinţă este posibil ca necesarul zilnic să nu fie acoperit. În aceste
condiţii, pacienţii cu diferite afecţiuni, dar şi populaţia generală apelează,
cu sau fără recomandarea medicală, la consumul de suplimente nutritive
care conţin seleniu. Trebuie să recunoaştem că aceasă practică de a
consuma suplimente nutritive a devenit o „modă”. Dar, nu trebuie să uităm
că administrarea acestor suplimente, fără a şti dacă organismul are sau nu
nevoie de nutrientul respectiv implică riscuri, uneori cu consecinţe grave
pentru organism.
În România, problematica asigurării aportului optim de seleniu pentru
organismul uman a fost abordată sporadic, atât din punct de vedere analitic cât
şi prin prisma evaluării statusului acestui microelement în organismul uman.
Studierea relaţiei dintre seleniu şi cancer a presupus că acesta îşi exercită
efectele ca antioxidant. Ca şi componentă a glutation peroxidazei (GPx), o
funcţie biochimică larg recunoscută a seleniului este inactivarea speciilor
oxigen reactive (ROS). Deşi s-a demonstrat că statusul scăzut al Se se asociază
cu activitate GPx scăzută, observaţia că efectele anticarcinogene au continuat
să se manifeste după ce GPx a atins nivelurile optime a fost o sugestie că Se şi-
ar putea exercita activitatea anticarcinogenă prin alte mecanisme.
Acrilamida este o substanţă toxică, din categoria „probabil
cancerigenă pentru om” prezentă constant în alimentele tratate termic.
Obiceiurile alimentare ale populaţiei din România exced în consumul de
alimente, care în procesul culinar intens (cartofi prăjiţi, carne bine friptă,
chipsuri etc) favorizează formarea acestui toxic.
Specialiştii recomandă aplicarea unor măsuri care să limiteze
conţinutul în acrilamidă al alimentelor, respectiv, reducerea toxicităţii
acesteia. Printre acestea se numără consumul de alimente care conţin
componente cu rol antioxidant. In cercetările noastre am iniţiat un studiu
experimental privind capacitatea seleniului de a influenţa unii parametri
biochimici şi histopatologici modificaţi în intoxicaţia subacută cu
acrilamidă. Considerăm că rezultatele acestor cercetări vor sta la baza altor
studii care vor contribui la optimizarea alimentaţiei populaţiei şi, implicit la
menţinerea sănătăţii.
4
OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT
Obiectivele cercetărilor experimentale care au condus la realizarea
tezei de doctorat au urmărit:
Adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de
determinare a seleniului din produse alimentare;
Determinarea seleniului din probe de produse alimentare prin
metoda validată;
Determinarea seleniului din suplimente alimentare conţinând
acest microelement. Studiul cedării seleniului din suplimente
nutritive;
Evaluarea potenţialului protector al seleniului la şobolani, în
intoxicaţia subacută experimentală, pe cale orală, cu doze crescute
de acrilamidă, prin determinarea unor parametri biochimici şi
hematologici.
Studiul comparativ al modificărilor histopatologice apărute în
intoxicaţia subacută cu acrilamidă după administrarea de seleniu, la
şobolani.
5
PARTEA GENERALĂ
Capitolul I
SELENIUL ŞI ORGANISMUL UMAN
I.1. Seleniul şi organismul uman. Aspecte generale
I.1.1. Scurt istoric
Seleniul ca element chimic a fost identificat în 1817 de către renumitul
chimist Berzelius ca element rezidual ce contamina producţia de acid sulfuric
într-o fabrică din Stockholm. Seleniul are proprietăţi similare cu ale telurului,
descoperit cu 35 de ani mai devreme, şi a fost numit după denumirea grecească
a Lunii, selene (telurul şi-a căpătat numele după latinescul tellus, pământ).
Berzelius îşi publică noua descoperire anul următor, în 1818, în „Annales de
chimie et de physique“. Vreme de un secol, puţine lucruri s-au mai auzit despre
acest element, dar în 1996 se estima că seleniul este subiectul a peste 100 000
de lucrări ştiinţifice. Mai târziu, acest nou element este găsit şi în unele
minerale, de către alţi cercetători. (Oldfield, 2002; Selenium in Nutrition, 1983;
Environmental Health Criteria 58, 1987).
În 1937, A.L. Moxon a publicat un raport în care seleniul era
identificat ca vinovat de îmbolnăvirea unor cirezi prin consumul de plante
toxice, boala fiind greşit denumită «alkali disease»-boala alcalină, numită
astăzi selenoza. În 1957, biochimistul de origine germană Klaus Schwarz a
publicat o lucrare care va schimba radical percepţia publică asupra
seleniului. El era preocupat de problema necrozei ficatului la şobolanii de
laborator hrăniţi cu drojdie. Când a înlocuit drojdia „torula” cu drojdia de
bucătărie (Saccharomyces), problema a dispărut. După îndelungate
cercetări, a descoperit că torula era deficitară în seleniu, identificând, deci,
prima boală cauzată de defictul de seleniu. În prezent, seleniul a fost
identificat ca nutrient mineral esenţial (McCoy et al., 1969).
Primele utilizări ale seleniului au fost minore: în colorarea sticlei şi
în ceramică. În anul 1851, Hittorf observă că seleniul – ca şi sulful –
prezintă mai multe stări alotropice, iar în 1873, May şi Smith, pe de o parte,
şi Sale, pe de altă parte, constată schimbarea conductibilităţii electrice a
seleniului sub acţiunea luminii (deci proprietăţi fotochimice). Fenomenul
acesta este lămurit în 1907 de Marc şi, într-adevăr, aceste proprietăţi i-au
deschis seleniului căi în utilizări moderne, extrem de importante în
fotometrie, telefotografie, redresoare etc. (Oldfield, 2002; Environmental
Health Criteria 58, 1987).
6
I.1.2. Stare naturală. Surse de seleniu. Ciclul biologic al
seleniului
Distribuţia seleniului pe glob este neuniformă. În distribuţia şi
transportul acestui element, ca şi în ciclul său, sunt implicate procese:
- naturale: geografice şi biologice
- umane: industriale şi agricole.
Ciclul biologic al seleniului nu este în întregime descifrat, deşi au
existat mai multe încercări de a realize diagrame ale acestui proces (Fig. I.1).
Plante Soluri
Animale
Om
Viaţa acvatică
Oceane, mări şi lacuri
Ape curgătoare şi de suprafaţă
Sedimente şi roci sedimentare
Roci vulcanice
Miezul Pământului
Atmosfera
Vulcanism
Roci topite
Fig. I.1. Ciclul seleniului în natură (Adaptare după National Research Council
(U.S), Subcommittee on Selenium, 1983)
I.1.3. Seleniul – microelement eseţial pentru organism
Seleniul este un oligoelement esenţial, îndeplinind criteriile care
definesc acest tip de elemente (Reilly, 2004):
- au o concentraţiei relativ constantă;
- deficitul induce schimbări biochimice specifice;
- schimbările sunt acompaniate de anormalităţi echivalente la
specii diferite;
- suplimentarea aportului acestui element corectează carenţa.
7
Seleniul îndeplineşte o serie de roluri esenţiale în organismul uman.
Ca parte a unui număr de selenoproteine active funcţional are
funcţie de protejare a celulelor împotriva distrugerilor cauzate de radicalii
liberi, de hidroperoxizi sau de lipoperoxizi.
Seleniul este implicat în controlul şi sinteza prostaglandinelor,
prostaciclinelor, leucotrienelor şi tromboxanilor. Funcţiile organelor
reproductive şi hormonale depinde de un status suficient al seleniului din
organism.
Seleniul joacă, de asemenea, un rol important în funcţionarea
creierului. S-a dovedit că seleniul poate influenţa funcţia cognitivă şi starea
emoţională. Îndepărtarea genei selenoproteinei P a dus la scăderea nivelului
de seleniului din creier şi la disfuncţii neuronale. Tot selenoproteina P
poate promova supravieţuirea celulei neuronale. Schimbările statusului
seleniului pot avea implicaţii în boala Alzheimer sau în boala Parkinson.
Seleniul este important şi pentru că are rol protector împotriva
perturbărilor genetice apărute ca rezultat al stresului oxidativ excesiv.
Selenoproteine
Ca selenocisteină, al 21-lea aminoacid, seleniul este component al
selenoproteinelor, unele dintre acestea având funcţii enzimatice. Toate
aceste enzime sunt dependente de seleniu. În prezent se cunosc până la 100
de selenoproteine în sistemele enzimatice ale mamiferelor, dintre care în jur
de 30 au fost identificate. Majoritatea selenoproteinelor prezintă funcţii
redox enzimatice care le conferă activitate antioxidantă şi catalitică.
Selenoproteinele pot fi împărţite în două grupe:
- reductazele tioredoxinei Sel S (selenoproteina S), Sel R
(selenoproteina R), Sel O (selenoproteina O), Sel I (selenoproteina I). Sec =
L seril – tARN (Seleniu transferază) se află în regiunea C- terminal.
- a doua grupă include restul selenoproteinelor, caracterizate prin
prezenţa Sec în regiunea terminal-N.
O altă clasificare pentru selenoproteinele mamiferelor (Behne et
al.,2001), le împarte în trei categorii:
- proteine ce conţin seleniu încorporat nespecific;
- proteine ce conţin seleniu legat specific;
- selenoproteine specifice care conţin selenocisteina.
Selenoproteine umane
Glutation peroxidaza
Glutation peroxidaza (GPx) a fost prima selenoproteină
caracterizată din punct de vedere funcţional.
8
Această selenoproteină prezintă patru izoforme: citosolică
(GPx1), gastrointestinală (GPx2), plasmatică (GPx3) şi fosfolipid
hidroperoxid glutation peroxidaza (GPx4).
Glutation peroxidazele sunt enzime tetramerice, fiecare monomer
conţinând câte un atom de seleniu sub formă de selenocisteină în poziţia
35 a lanţului polipeptidic. Glutation peroxidaza este o enzimă
antioxidantă endogenă care catalizează reacţia de descompunere a
peroxidului de hidrogen sau a altor peroxizi organici.
GSH-Px intervine la concentraţii mici de H2O2 şi protejează
celulele de stresul oxidativ produs de speciile reactive ale oxigenului.
Glutation peroxidaza reduce H2O2 şi transformă hidroperoxizii
lipidici şi fosfolipidici în produşi inofensivi (apă şi alcooli).
Enzima foloseşte ca substrat glutationul (GSH) şi acţionează
conform reacţiei:
ROOH + 2GSH GSH -Px > R - OH + GSSG + H2O
în care: ROOH - poate fi H2O2 sau un peroxid organic
GSSG - glutation disulfidul (forma oxidată a glutationului)
Glutationul cedează enzimei electronii necesari reducerii peroxidului
de hidrogen sau a altor peroxizi. Seleniul este centrul redox al enzimei. În
prima etapă, el se oxidează de la starea de oxidare (-2) în enzimă, la starea de
oxidare zero într-un compus de tip acid selenenic (-SeOH).
Acesta reacţionează cu glutationul formând un compus de tip
selenilsulfid (-Se-SG). Prin adiţia unei molecule de glutation, se reface
glutation peroxidaza activă prin gruparea de tip selenolat şi, respectiv,
glutation disulfidul (GSSG)
Tioredoxin reductaza (TR)
Tioredoxin reductaza (Koishi et al, 2000; Zhong et al, 2000)
(TR) este o enzimă recent identificată, care conţine un rest de
selenocisteină în secvenţa terminală şi are trei izoforme (TR 1, TR 2, TR
3). Aceasta catalizează reducerea tioredoxinei dependentă de NADPH
precum şi a altor constituenţi sau oxidaţi ai celulelor.
Fiind o enzimă reducătoare, cu specificitate redusă pentru substrat,
tioredoxin-reductaza contribuie la homeostazia redox şi este implicată în
prevenirea şi ameliorarea dereglărilor provocate de stresul oxidativ generat
de peroxidul de hidrogen.
Activitatea tioredoxin reductazei umane este influenţată atât de
deficienţa de seleniu în dietă cât şi de suplimetarea excesivă a acestuia.
9
Iodotironin deiodinazele
Iodotironin deiodinazele reprezintă o altă clasă de selenoproteine
de importanţă majoră; iodotironin 5'-deiodinaza conţine seleniu sub formă
de selenocisteină şi are trei izoforme (DI 1, DI 2, DI 3). Ele catalizează
mono-deiodinarea-5’5 a tiroxinei prohormon (T4) în hormonul tiroidian
activ 3,3’5-triiodotironin (T3) şi conversia rezervei inactive de T3 în 3-
3’diiodotironină. Hormonii tiroidieni joacă un rol reglator în expresia
enzimei hepatice şi în funcţia neutrofilă (Arthur JR et al., 1993).
I.2. Farmacocinetica seleniului
Seleniul, sub forma de compuşi, poate ajunge în organism prin
inhalare sau prin ingestie. Rata de absorbţie variază în funcţie de forma
seleniului. Biodisponibilitatea orală a seleniului este independentă de
nivelul de expunere, dar poate să crească la persoanele care au deficit de
seleniu. Selenatul şi selenometionina sunt absorbite nemodificate la nivelul
intestinului, iar selenitul şi selenocisteina sunt metabolizate în timpul
absorbţiei.
Mecanismul absorbţiei intestinale este cunoscut. Mecanismele
absorbţiei cutanate şi pulmonare nu sunt complet elucidate.
Seleniul absorbit este transportat de sânge, fiind distribuit către
ţesuturi. Ajuns în sânge, seleniul este legat în proteine, iar selenitul este
acumulat în eritrocite printr-un mecanism de transport activ, aşa după cum
demonstrază studiile in vitro. Seleniul este incorporat în selenoproteine ca
selenocisteine.
Indiferent de forma de administrare, modelele de distribuţie sunt
similare, dar concentraţia atinsă este mai mare la administrarea de seleniu
organic (selenometionina) decât la seleniul anorganic.
Selenometionina nu este sintetizată de organismul uman, dar poate
fi incorporată în proteine în locul metioninei. De aceea, selenometionina e
păstrată mai mult timp în organism decât formele anorganice, putând să
reprezinte o formă de a depozita seleniul. Selenocisteina şi seleniul
anorganic sunt metabolizate. Selenocisteina incorporează seleniul în
selenoproteine, dar numai sub această formă.
I.3. Rolul seleniului în organismul uman
I.3.1. Seleniul şi metabolismul uman
Seleniul este încorporat sub formă de selenoaminoacizi la centrul
activ al unui mare număr de proteine, unele dintre ele având importante
10
funcţii enzimatice. În condiţii fiziologice, seleniul din selenocisteine este
aproape în întregime ionizat şi, prin urmare, este un catalizator biologic
extrem de eficient.
Selenoaminoacizii, în principal selenocisteina şi selenometionina,
sunt aminoacizi în care atomul de sulf din cisteină şi respectiv metionină
este înlocuit cu seleniu.
Studiile lui Sunde (1990) au subliniat rolul crucial al selenidului sau al
unei forme echivalente chimic a seleniului în procesul conversiei formelor
anorganice de seleniu în forme organice. Sinteza selenoaminoacizilor, a
selenoproteinelor, a seleno-tARN şi a genelor care controlează aceste procese
pentru sistemele bacteriene este cunoscută. În studiile pe forme mutante de E.
Coli au fost identificate cel puţin patru tipuri de gene, Se1A, Se1B, Se1C şi
Se1D ca esenţiale pentru sinteza proteinelor ce conţin selenocisteină.
c. Metabolismul seleniului în organismul uman
Biotransformările suferite de compuşii seleniului la om sunt
asemănătoare celor de la animale. Metabolismul seleniului în organismul
uman este complex şi depinde de forma chimică a seleniului. Căile
metabolice ale seleniului sunt prezentate schematic în figura 10. Formele
organice ale seleniului sunt selenocisteina şi selenometionina, iar cele
anorganice sunt selenitul şi selenatul. Compuşii organici ai seleniului-
selenocisteina, selenometionina, Se-metilselenocisteina-, cât şi cei
anorganici – selenit, selenat- sunt metabolizaţi la diferiţi metaboliţi ai
seleniului. Dintre formele organice, selenometionina este forma
predominantă în alimentaţie. Atât formele organice, cât şi cele anorganice
par să fie utilizate cu aceeaşi eficacitate în organism pentru a produce
selenoproteine (Shiobara et al., 1998), dar seleniul pătrunde în metabolism
în momente diferite, în funcţie de forma chimică, (figura I.11) .
11
Metabolismul
reducător
SELENAT
Na2SeO4
SELENIT
Na2SeO3
Proteinele generale ale
corpului
SELENOMETIONINA
SELENOCISTEINA
GS-Se-SG
GSH GS-SeH
GSH/NADPH
SELENID
Na2Se
Incorporare în
selenoproteine
SELENOFOSFAT
SELENURA DE HIDROGEN H2Se
METILSELENOL
CH3SeH
Calea metilării
TRIMETILSELENONIU
(CH3) 3Se+
DIMETILSELENID
(CH3)2Se
Se-METILSELENOCISTEINA
ACID METILSELENIC SELENOBETAINĂ
METILSELENOCIANAT
Prezent în aerul
expirat la doze
toxice de Se
Excretat în urină la doze toxice de
Se
Metioninază
Fig. I.12. Metabolismul seleniului în organismul uman
(adaptare după Meuillet et al., 2004)
I.3.2. Acţiunea detoxifiantă a seleniului
Seleniul reduce toxicitatea unor metale grele precum cadmiul,
mercurul anorganic, metilmercurul, taliul şi chiar a argintului, prin
formarea unor compuşi inerţi, neabsorbabili.
I.3.3. Necesarul zilnic de seleniu
Nu există criterii universal acceptate pentru stabilirea necesarului
zilnic de seleniu şi, prin urmare, nici estimări coerente pentru acest necesar,
deşi au existat preocupări în acest sens (Thomson, 2004).
Multe dintre estimările şi recomandările privind necesarul de
seleniu au la bază cercetările făcute în China, unde distribuţia seleniului în
sol este variată (de la un conţinut foarte scăzut la un conţinut crescut).
12
Estimările necesarului sunt dificil de făcut, ţinând cont şi de aportul zilnic
de seleniu din diferite ţări ale lumii.
T
Necesarul de seleniu (WHO/FAO, 2004)
Categoria de populaţie Greutate
medie
Media recomandată Doza
recomandată
(μg/zi) μg/ kgc/zi) μg /zi)
Sugari şi copii
0-6 luni 6 0,85 5,1 6
7-12 luni 9 0,81 8,2 10
1-3 ani 12 1,13 13,6 17
4-6 ani 19 0,92 17,5 22
7-9 ani 25 0,68 17,0 21
Adolescenţi
Fete 10-18 ani 49 0,42 20,6 26
Băieţi 10-18 ani 51 0,50 22,5 32
Adulţi
Femei 19-65 ani 55 0,37 20,4 26
Femei 65+ ani 54 0,37 20,2 25
Bărbaţi 19-65 ani 65 0,42 27,3 34
Bărbaţi 65+ ani 64 0,41 26,2 33
Sarcină
Trimestrul II 28
Trimestrul III 30
Alăptare
0-6 luni după naştere 35
6-12 luni după naştere 42
*DRN, Doza de Nutrient Recomandată, derivată din SeR + 2x deviaţia standard
asumată (12,5%).
Statusul seleniului în organism se apreciază pe termen scurt şi,
respectiv, pe termen lung:
statusul seleniului pe termen scurt: concentraţia de seleniu din
urină, plasmă, ser;
statusul seleniului pe termen lung: concentraţia din unghii, păr,
eritrocite.
Valorile de referinţă ale seleniului au fost stabilite, în general, prin
evaluarea cantităţii necesare pentru maximizarea activităţii GPx din sânge
sau plasmă(Thomas, 2004).
13
I.4. Patologia provocată de deficitul de seleniu
Carenţa de seleniu în organismul uman este responsabilă de efecte
şi sindroame specifice.
I.4.1. Deficitul de seleniu şi Boala Keshan (cardiomiopatia)
Această maladie a fost descrisă în China încă de acum peste 100 de
ani şi a avut un puseu important în 1935; legătura dintre boală şi deficitul
de seleniu a fost descoperită relativ recent (Ge et al.,1993). Cercetătorii au
realizat studii clinice în zonele în care boala este endemică, pe aproximativ
10 000 probe de sânge, păr, cereale locale, din care au analizat concentraţia
de seleniu şi măsurători ale glutation peroxidazei şi ale nivelului excreţiei
seleniului în urină. În timpul studiilor au fost suplimentate dietele celor
implicaţi cu selenit de sodiu. Totalul populaţiei tratate excede un milion de
persoane. Rezultatele cercetării confirmă relaţia strânsă între seleniu şi
boala Keshan.
I.4.2. Deficitul de seleniu şi Boala Kashin-Beck (boala Urov)
Boala Kashin-Beck este o osteoartropatie endemică care a fost
detectată la copii de 5-13 ani din China şi mai puţin la cei din Siberia de
sud-est. Se caracterizează prin necroză asociată cu degenerarea în regiunea
epifizeală a articulaţiilor mâinilor şi picioarelor şi duce la scurtarea
structurală a degetelor şi oaselor lungi cu întârzierea creşterii şi chiar
oprirea acesteia.
I.4.7. Deficitul de seleniu şi bolile cardiovasculare
Seleniul poate avea acţiune protectoare în afecţiunile
cardiovasculare. Această ipoteză se bazează pe abilitatea GPx de a combate
modificarea oxidativă a lipidelor şi de a reduce agregarea plachetară.
Mortalitatea cauzată de bolile de inimă a scăzut cu aproximativ 61% în
perioada 1972-1992 în Finlanda, lucru care se datorează, în parte, şi
creşterii nivelului de seleniu din dietă după introducerea, în 1985, a
fertilizării cu seleniu (se ştie că nivelul de seleniu din solul finlandez este
foarte scăzut) (Brown &Arthur, 2001).
Studiile epidemiologice au ajuns la rezultate diferite. Unii
cercetători au constatat o creştere de 2-3 ori a morbidităţii cardiovasculare
şi a mortalităţii din această cauză la persoanele cu concentraţia seleniului în
ser mai mică de 45 µg/L, comparativ cu subiecţi cu o concentraţie în
seleniu în ser mai mare, alte studii nu prezintă o asociere clară între
14
riscurile cardiovasculare şi concentraţia mică a seleniului (Salonen et al.,
1982;Virtamo et al., 1985). Totuşi în zonele cu deficienţă mai mare de
seleniu s-a putut remarca o asociere inversă între nivelul seleniului şi riscul
infarctului de miocard.
I.4.9. Seleniul şi funcţia tiroidiană
Deşi activitatea deiodinazei este relativ protejată în condiţiile unei
disponibilităţi reduse de seleniu, nivelul seleniului la populaţiile din Europa
şi din alte regiuni poate compromite totuşi metabolismul tiroidian. În
zonele cu deficit sever de seleniu, incidenţa tiroiditelor este mai mare, din
cauza scăderii activităţii glutation peroxidazei dependentă de seleniu din
celulele tiroidei. Enzimele dependente de seleniu influenţează şi ele
sistemul imunitar. Chiar şi o deficienţă mai uşoară de seleniu contribuie la
dezvoltarea şi menţinerea bolii tiroidiene autoimune (Negro, 2008). Carenţa
de seleniu asociată cu cea de iod exacerbează hipotiroidismul şi poate
determina chiar cretinismul mixedematos aşa cum se întâmplă în unele
zone din Zair, unde ambele elemente sunt deficitare. Suplimentarea cu
seleniu este benefică în cazul bolnavilor cu tiroidită autoimună (Gärtner et
al., 2002). Suplimentarea cu seleniu în timpul sarcinii şi după naştere
inhibă progresia tiroiditelor cronice autoimune (Negro et al., 2006).
I.5. Patologia provocată de excesul de seleniu
Toxicitatea seleniului este cunoscută indirect încă din evul mediu;
în timpul călătoriei în China în secolul al XIII-lea, Marco Polo şi însoţitorii
săi au fost avertizaţi asupra plantelor „otrăvitoare”. Astăzi se ştie că aceste
plante sunt cele acumulatoare de seleniu din genul Astragalus (Reilly,
1996).
Efectele toxice la animale sunt bine cunoscute şi sunt diferite în
funcţie de specie. Toxicitatea depinde de doza şi durata ingerării, dar şi de
forma chimică a seleniului. Toleranţa la toxicitatea seleniului depinde de
rata excreţiei, iar aceasta depinde de rata metilării seleniului (Mézes &
Balogh, 2009).
Selenoza este prezentă la majoritatea rumegătoarelor, din cauza
consumului de plante acumulatoare de seleniu, care transformă seleniul
anorganic în seleniu organic.
La om, aportul toxic este de aproximativ 850-900 µg/zi.
Simptomele intoxicării sunt greaţă, căderea părului, modificări în structura
unghiilor; la dozele mai mari, poate surveni decesul.
Toxicitatea seleniului este cunoscută de multă vreme, şi, deşi este
mai periculoasă, este mai puţin luată în seamă în comparaţie cu a altor
15
elemente, cum ar fi arsenul. Toxicitatea seleniului provoacă unele confuzii
din mai multe cauze.
În primul rând, seleniul este un nutrient esenţial utilizat de
selenoproteine. În al doilea rând, seleniul are beneficii majore pentru
sănătatea umană. În al treilea rând, toxicitatea seleniului este complexă.
Toate formele de seleniu sunt toxice, dar concentraţiile necesare pentru a
atinge nivelurile toxice similare diferă foarte mult. De asemenea, dieta
individuală joacă un rol important în ceea ce priveşte pragul toxicităţii. La
diete echilibrate, cu aceeaşi cantitate de seleniu, dar cu diferenţe în ceea ce
priveşte cantitatea de vitamina E, un individ poate fi sănătos (dacă vitamina
E este în exces) sau se poate îmbolnăvi (dacă vitamina E este în cantitate
mai redusă).
I.6. Surse alimentare de seleniu
Alimentaţia este sursa principală de seleniu pentru organismul
uman (şi este naturală). Cantitatea de seleniu pe care o luăm din alimente
depinde de tipul alimentului, de influenţa factorilor de mediu asupra
alimentului respectiv (tipul de sol pe care a crescut planta, tipul de hrană de
care a beneficiat animalul), de intervenţia umană asupra alimentului.
Intervenţia obişnuită a omului asupra alimentului este prelucrarea materiei
prime (măcinatul grâului, de exemplu) şi gătitul. În ceea ce priveşte
seleniul, se ştie că mulţi dintre compuşii seleniului sunt instabili şi volatili.
Unele vegetale care, în mod obişnuit, au nivele ridicate de seleniu
(sparanghelul) pierd în jur de 40% din conţinutul de seleniu în procesul
culinar (Higgs et al., 1972). Adăugarea de sare, pH-ul acid sau gătitul prea
intens duc la pierderi ale conţinutului de seleniu (lucru valabil şi pentru alţi
nutrienţi). De obicei însă, gătitul obişnuit nu are efecte semnificative.
Măcinatul şi fierberea cerealelor (Ferretti & Levander, 1974)), tratamentul
termic pentru carne de pui sau peşte nu au impact semnificativ pentru
conţinutul de seleniu.
I.6.3. Metode de îmbogăţire a conţinutului de seleniu al
alimentelor
Scăderea cantităţii de seleniu din organismul uman, constatată în
unele zone ale lumii, poate fi rectificată prin diversificarea în dietă,
suplimente minerale la subiecţii umani sau la animale, fortificarea
alimentelor în timpul procesării sau biofortificarea recoltelor.
De vreme ce alimente precum nucile de Brazilia, viscerele şi carnea
de crab, care conţin în mod natural nivele ridicate de seleniu, nu sunt
16
consumate, de regulă, în cantităţi mari, potenţialul pentru diversificarea
dietei este limitat.
Folosirea suplimentelor cu conţinut ridicat de seleniu, inclusiv
formule pe bază de drojdie, pare o opţiune eficientă şi sigură pentru
subiecţii umani. Totuşi, suplimentele sunt relativ scumpe, restricţionate la
folosire în unele zone sau ineficiente.
O altă metodă ar fi biofortificarea, creşterea concentraţiilor
biodisponibile ale elementelor esenţiale în porţiile comestibile ale plantelor
cultivate prin folosirea îngrăşămintelor (biofortificarea agronomică) sau
prin selecţia recoltelor sau raselor (biofortificarea genetică).
1.6.4. Suplimentele nutritive – surse de seleniu
Suplimentele nutritive sunt destinate compensării nevoilor crescute
în principii nutritive în urma efectuării unor activităţi particulare (sportivi),
fumătorilor şi, în egală măsură prevenirii sau optimizării unor stări
(oboseală, memorie), încetinirea îmbătânirii şi chiar, pentru a permite
scăderea greutăţii corpului.
Conform datelor dintr-un studiu apărut în revista Genome Biology
(Lobanov et al., 2008) anumite suplimente alimentare conţinând seleniu ar
putea să nu fie la fel de benefice pentru majoritatea indivizilor, care în
cursul evoluţiei au suferit modificări fiziologice de natură să li se reducă
nevoile de seleniu. Consumul de suplimente pe bază de seleniu este
justificat în unele regiuni din China (maladia Kesham, prin deficit de
seleniu) şi din Africa (cretinism endemic, prin deficit de seleniu şi iod)
unde solul este foarte sărac în aceste oligoelement, dar trebuie recomandat
cu precauţii pentru populaţia sănătoasă, în general.
Referitor la uşurinţa cu care populaţia acceptă şi consumă
suplimentele alimentare Hercberg (2006) afirmă că cea mai bună sursă de
acoperire a nevoilor de nutrienţi a organismului este alimentaţia. A priori,
în afara indicaţiilor medicale foarte exacte pentru suplimentarea aportului la
femeile însărcinate, la persoanele supuse unor regimuri restrictive, la
subiecţii vârsnici cu polimedicaţie nu există nici o justificare ,,nici
biologică, nici clinică, nici epidemiologică pentru a recomanda consumul
de suplimente alimentare pentru populaţia generală”. În plus, au apărut
semnalări (mai ales date epidemiologice) care sugerează că administrarea
regulată de suplimente nutritive poate induce efecte dăunătoare, contrare
celor aşteptate.
17
PARTE PERSONALĂ
Capitolul II
ESTIMAREA APORTULUI DE SELENIU PRIN CONSUM DE
ALIMENTE
II.1. Introducere
Valoarea ştiinţifică a rezultatelor analizei unei anumite componente
dintr-o probă complexă depinde nu numai de sensibilitatea şi specificitatea
metodei de analiză ci şi de modul în care sunt parcurse etapele anterioare
determinării propriu-zise, de la recoltarea probei, separarea, analitului de
interes la stabilirea condiţiilor optime de aplicare a metodei. Literatura de
specialitate prezintă numeroase metode pentru determinarea seleniului din
numeroase categorii de probe: apă potabilă, apă reziduală, produse
alimentare, sol, suplimente nutritive, medicamente, lichide biologice etc.
Obiective
Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit:
adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de
determinare a seleniului din produse alimentare prin stabilirea condiţiilor de
aplicare a metodei şi determinarea parametrilor de validare ai metodei;
aplicarea metodei validate la determinarea seleniului din probe
de produse alimentare de natură vegetală şi animală;
estimarea aportului zilnic de seleniu pe baza conţinutului de
seleniu determinat pentru cele trei modele de alimentaţie: convenţională,
vegetariană şi vegetaliană;
determinarea seleniului din unele suplimente nutritive care
conţin seleniu.
II.2.2. Stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei
spectrofotometrice de determinare a seleniului din produse alimentare
Principiul metodei
Pentru determinarea spectrofotometrică a seleniului din produse
alimentare s-a adaptat şi validat metoda spectrofotometrică realizată de
Revanasiddappa et al. (2001), o metodă indirectă bazată pe reacţia
seleniului (IV) cu iodura de potasiu în mediu acid. Iodul eliberat
reacţionează cu albastru variamin, formând un compus colorat în roz-violet
(Fig. II.1.), cu absorbanta maximă la 545 nm.
18
12
I2 + CH3O NH NH2 CH3O N NH2 + I
-+
SeO3
2-+ 4I
- + 6H
+ Se
0 + 2I2 + 3H2O
Fig. II.1. Reacţiile de determinare a seleniului prin metoda indirectă
seleniu (IV)- albastru variamin
Metoda este uşor de aplicat, sensibilă şi selectivă şi a fost adaptată
la determinarea cantitativă a seleniului (IV) din apă, sol, produse alimentare
de origine vegetală şi animală, suplimente alimentare conţinând seleniu.
Pentru îndepărtarea influenţei ionilor interferenţi asupra intensităţii
culorii s-a utilizat EDTA, ca agent de complexare.
Metoda analitică
În vederea stabilirii condiţiilor de aplicare a metodei
spectrofotometrice de determinare a seleniului din probe de produse
alimentare s-a urmărit:
• Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă;
• Stabilirea volumului soluţiei de acid clorhidric necesar sistemului
seleniu (IV)- iodură de potasiu - albastru variamin;
• Stabilirea volumului soluţiei albastru variamin necesar sistemului
seleniu (IV)- iodură de potasiu- albastru variamin;
• Stabilirea volumului soluţiei de iodură de potasiu necesar
sistemului seleniu (IV)- iodură de potasiu-albastru variamin;
• Stabilirea volumului soluţiei de acetat de sodiu necesar sistemului
seleniu (IV)- iodură de potasiu - albastru variamin;
• Stabilirea volumului soluţiei de EDTA necesar sistemului seleniu
(IV) - iodură de potasiu- albastru variamin pentru complexarea ionilor
interferenţi;
• Studiul stabilităţii produsului de reacţie.
II.2.2.1. Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este
maximă
Volume de soluţie etalon de lucru conţinând 25, 50 respectiv 100
µg Se4+ se tratează cu câte 1 mL soluţie iodură de potasiu 2% şi 1 mL
soluţie acid clorhidric 2M şi se agită uşor. Se adaugă succesiv 0,5 mL
soluţie albastru variamin şi 2 ml soluţie acetat de sodiu şi, 1 mL soluţie
EDTA 0,2M, se completează volumul la 20 mL cu apă distilată.
19
Spectrele de absorbţie pentru sistemul Se (IV)-iodură de potasiu -
albastru Variamin s-au înregistrat faţă de martorul corespunzător, iar al
martorului faţă de apă distilată, la spectrofotometrul UV-VIS T 80 PG
Instruments LTD.
Tabel II.1
Stabilirea lungimii de undă cu absorbanţă maximă
Nr.
crt
Lungimea de
undă (nm)
Absorbanţa
25 µg Se4+
50 µg Se4+
100 µg Se4+
1. 400 - 0,032 0,083
2. 420 - 0,054 0,112
3. 440 0,036 0,076 0,139
4. 460 0,049 0,083 0,162
5. 480 0,534 0,101 0,215
6. 500 0,060 0,115 0,252
7. 520 0,069 0,143 0,302
8. 530 0,086 0,169 0,341
9. 540 0,102 0,205 0,425
10. 545 0,106 0,218 0,420
11. 550 0,105 0,215 0,418
12. 560 0,088 0,183 0,368
13. 580 0,064 0,154 0,312
14. 600 0,051 0,121 0,256
15. 620 0,032 0,098 0,218
16. 640 - 0,067 0,134
Din analiza spectrelor de absorbţie ale produsului reacţiei
sistemului Se (IV)-iodură de potasiu - albastru Variamin se constată un
maxim de absorbţie la lungimea de undă 545 nm. La acestă lungime de
undă, absorbanţa martorului este neglijabilă.
În urma stabilirii parametrilor optimi de desfăşurare a reacţiei a
rezultat modul de lucru pentru determinarea seleniului tetravalent din probele
de analizat: volume de soluţie etalon de seleniu conţinând 5-100 µg Se4+ se
tratează cu cu 1 ml soluţie de iodură de potasiu, 2 mL acid clorhidric şi se
agită lent. Se adaugă 1 ml soluţie albastru variamin, 1mL soluţie EDTA
0,2M şi 2 mL soluţie acetat de sodiu, se completează volumul la 20 ml cu
apă distilată şi se măsoară absorbanţele la 545 nm, cuva de 1 cm, faţă de un
martor preparat în aceleaşi condiţii.
20
II.2.3. Raportul de validare a metodei de analiză a seleniului
Metoda de validare şi procedura de analiză a probelor s-a realizat în
conformitate cu normele de validare pentru metodele analitice prezentate în
protocolul de validare.
Validarea metodei a fost realizată pe baza verificării următorilor
parametri: liniaritate/domeniu de concentraţie, precizie, acurateţe, stabilitate,
randament de recuperare, limită de detecţie, limită de cuantificare.
II.2.3.1. Liniaritatea
Pentru studiul liniarităţii metodei au fost preparate soluţii de lucru
prin diluarea unei soluţii stoc care conţine 100 µg Se4+/mL cu apă distilată
la concentraţii în ioni seleniu cuprine între 5 şi 100 µg Se4+/probă, respectiv
0,5 – 5,0 µg Se4+/mL, care se prelucrează conform modului de lucru stabilit
anterior.
Răspunsul ionului de seleniu este liniar pentru un interval de
concentraţie de 0,5-5 µg Se4+/mL având un coeficient de corelaţie (R2) de
0,9977. Valorile absorbanţelor reprezintă media a 3 determinări şi sunt
redate în tabelul II.9.
Tabel II.9.
Liniaritatea funcţiei de răspuns
Nr. crt Concentraţie Absorbanţa
(µg/mL) µg/probă I II II IV Medie
1. 0,5 10 0,0399 0,0411 0,0420 0,0414 0,0411
2. 1,0 20 0,0800 0,0790 0,0786 0,0783 0,0789
3. 1,5 30 0,1549 0,1505 0,1489 0,1503 0,1511
4. 2,0 40 0,1706 0,1720 0,1698 0,1721 0,1711
5. 2,5 50 0,2135 0,2202 0,2181 0,2106 0,2156
6. 3,0 60 0,2605 0,2597 0,2561 0,2543 0,2576
7. 3,5 70 0,3108 0,3200 0,3115 O,3102 0,3131
8. 4,0 80 0,3412 0,3409 0,3398 0,3429 0,3412
9. 4,5 90 0,3800 0,3901 0,3814 0,3827 0,3835
10. 5,0 100 0,4209 0,4261 0,4303 0,4265 0,4259
Se reprezintă grafic variaţia absorbanţei medii în funcţie de
concentraţie şi se determină intervalul de concentraţie pentru care această
variaţie este liniară.
Se trasează dreapta de regresie pentru acest interval, iar datele
obţinute se evaluează statistic, determinându-se coeficientul de corelaţie (r),
deviaţia standard a pantei dreptei de regresie (s), eroarea standard a dreptei
de regresie (SD) şi ecuaţia dreptei, Absorbanţa = f(c):
21
Absorbanta = p x C + b,
în care: p = panta; C = concentraţia; b = interceptul
Reprezentarea grafică a variaţiei concentraţiilor calculate funcţie de
concentraţia teoretică este prezentată în fig. II.2.
Fig. II.2. Curba de calibrare pentru validarea liniarităţii metodei
Curba de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de
determinare a seleniului în sistemul seleniu-iodură de potasiu-albastru
variamin.
Ecuaţia dreptei de calibrare, calculată prin regresie matematică, este:
Absorbanţa = 0,00425 x Concentraţia (g/probă) +0,0041
Tabel II.10.
Datele evaluării statistice
Nr. crt. Parametrul Valoarea
1. Coeficient de corelaţie (r) 0,9954
2. Coeficient de regresie (r2) 0,9977
3. Eroare standard a dreptei de regresie (SD) 0,00927
4. Interceptul (b) + 0,00411
5. Panta (p) 0,00425
Evaluarea liniarităţii rezultatelor se realizează prin calcularea
concentraţiei regăsită utilizând ecuaţia dreptei de calibrare. Între
concentraţia introdusă teoretic şi cea calculată folosind ecuaţia dreptei calibrare
există o corelaţie liniară, panta acestei drepte fiind egală cu +0,00425;
interceptul este +0,00411. Coeficientul de corelaţie a acestei drepte are
valoarea r2 = 0,9954. În concluzie, între concentraţia teoretică şi cea calculată
utilizând ecuaţia dreptei de calibrare, corelaţia este optimă.
22
În urma prelucrării statistice a datelor experimentale privind
liniaritatea metodei de determinare spectrofotometrică a ionului de seleniu
tetravalent se desprind următoarele concluzii. Metoda este liniară în domeniul
de concentraţie ales (0,5-5µgSe 4+/mL) (10 – 100 µg Se 4+/probă).
Ecuaţia dreptei este:
Absorbanţa = 0,00425c + 0,00411
Datele experimentale obţinute în urma cercetărilor confirmă
validitatea metodei spectrofotometrice de determinare a seleniului în
intervalul 10 -100 µg Se4+; coeficientul de corelaţie are valoarea 0,9954.
II.2.3.4. Randament de recuperare
Randamentul de recuperare a fost determinat pe trei tipuri de
probe: pâine integrală şi usturoi. Probele de produs alimentar au fost
prelucrate în vederea separării seleniului, şi anume, cantităţi de 5-10 g
probă de analizat au fost tratate cu volume de soluţie de selenit de sodiu
etalon, corespunzătoare concentraţiilor de 50 şi 100 µg/kg produs
alimentar. Separarea seleniului s-a realizat prin două variante: calcinare la
450ºC şi mineralizare umedă nitro-sulfurică.
Tabel II.16.
Randamentul de recuperare determinat pe probe de pâine integrală
Seleniu
adăugat
(µg/kg)
Concentraţie
teoretică
(µg/kg)
Concentraţie determinată
(µg/kg)
Randament de recuperare
(%)
Mineralizare
uscată
Mineralizare
umedă
Mineralizare
uscată
Mineralizare
umedă
- 253,45 258, 34
50 303,45 204,17 256,20 67,28 84,43
- 234,12 237,09
50 284,12 196,38 236,35 69,12 83,19
- 264,32 270,14
50 314,32 224,51 264,53 71,43 84,16
- 253,45 258, 34
100 353,45 313,72 342,10 88,76 96,79
- 209,74 252,44
100 309,74 273,68 300,88 88,36 97,14
- 216,75 255,38
100 316,75 276,64 307,43 87,34 97,06
Rezultatele obţinute au evidenţiat diferenţe ale randamentului de
recuperare atât în funcţie de metoda de separare a seleniului din probele de
analizat, cât şi de concentraţia de seleniu adaugată (Tabel II.16).
Astfel, pentru probele de pâine integrală, la care separarea
seleniului s-a realizat prin calcinare randamentul de recuperare a avut valori
de 67,28 % pentru concentraţia adăugată de 50 µg/kg şi 84,43% la
23
adăugarea selenitului de sodiu în concentraţie de 100 µg/kg. Separarea
seleniului prin mineralizare umedă a condus la procente mai mari ale
randamentului de recuperare, de 88,36% şi, respectiv 97,14%.
II.2.3.5. Limita de detecţie (LD) şi limita de cuantificare (LC)
Limita de detecţie se poate aprecia prin cantitatea sau concentraţia
minimă de analit, care se poate detecta faţă de blanc, cu un anumit nivel de
încredere ales şi care poate fi distinsă de zero.
Pentru determinarea limitei de detecţie am utilizat relaţia:
Limita de cuantificare (cea mai mică concentraţie de analit care
poate fi determinată cu un nivel acceptabil al repetabilităţii şi exactităţii) se
calculează după formula:
II.2.4. Determinarea seleniului din produse alimentare
II.2.4.1. Probe de analizat
În cercetările noastre am analizat 45 de probe de produse
alimentare de origine vegetală procurate din reţeaua comercială şi de la
producători individuali de pe teritoriul oraşelor Iaşi şi Buhuşi.
II.2.4.2. Separarea seleniului din probele de analizat (material
vegetal, pâine, seminţe) (JAOAC, 2000)
Mineralizarea umedă nitro - sulfurică
În jur de 5g probă (produs vegetal proaspăt, pâine, seminţe)
mărunţită se aduc în baloane Kjehdahl de 250 mL; se adaugă 10-15 mL
amestec 1:1 (v/v) de acid sulfuric şi acid azotic concentrat (d= 1,27) şi se
menţine pe baia de nisip până la obţinerea unei soluţii limpezi şi incolore.
Soluţia a fost diluată cu apă deionizată, filtrată şi adusă cantitativ la
volumul de 50 mL. Soluţia mineralizată obţinută serveşte la determinarea
cantitativă a seleniului tetravalent din probe.
Mineralizarea uscată (calcinare)
Cantităţi de probă de analizat în jur de 5g se aduc în capsule de
platină cu masa cunoscută (probele de produs vegetal se menţin în etuvă la
temperatura de 105 - 110ºC pentru îndepărtarea apei) şi se introduc în
cuptorul de calcinare (Nabertherm). Mineralizarea uscată se realizează la
temperatura de 450ºC. Cenuşa se reia cu 5mL soluţie de acid azotic 5% se
diluează cu apă deionizată se filtrază şi se aduce cantitativ la volumul de 50
(g/mL) = 0,36 g/mL
(g/mL) = 1,09 g/mL LC
24
mL. Soluţia mineralizată obţinută serveşte la determinarea cantitativă a
seleniului tetravalent din probe.
II.2.4.3.Determinarea seleniului din probele de produse alimentare
Determinarea seleniului sub formă de seleniu tetravalent (Se4+) s-a
realizat prin metoda spectrofotometrică bazată pe oxidarea ionului iodură la
iod elementar şi reacţia acestuia cu albastru variamin, adaptată şi validată
de noi după metoda Revanasiddappa et al., (2001), (validată de noi).
Modul de lucru pentru determinarea seleniului din probele de
produse alimentare
Volume de 1-10 mL de soluţie mineralizată se prelucrează în
modul indicat la trasarea curbei de calibrare. Cu ajutorul curbei etalon se
determină conţinutul de seleniu din probă, iar rezultatul se exprimă în mg
Se4+/ 100 g produs alimentar.
Rezultatele şi discuţii
Rezultatele obţinute la determinarea seleniului din cele 46 probe de
produse alimentare sunt consemnate în tabelele II.19 – 21.
Tabel II.19.
Conţinutul în seleniu al produselor alimentare studiate
Nr.
crt Denumirea probei Masa probei
Concentraţia în seleniu
µg/probă µg/kg
1. Arahide prăjite cu sare 4,2132 0,4220 10,02
2. Franzelă albă 4,7853 0,1510 3,17
3. Pâine neagră coaptă vatră 4,2092 0,1772 4,21
4. Paine albă feliată la vatră Afer 2,0704 0,0797 3,85
5. Pâine integrală Vita Star 2,3839 0,0967 4,03
6. Ridiche neagră - România 5,3416 0,0357 0,67
7. Sfeclă roşie - România 5,3854 0,0096 0,18
8. Kiwi – Grecia 9,6449 0,0617 0,64
9. Pătrunjel - România 6,3395 0,0312 0,49
10. Mărar - România 6,2740 0,0263 0,42
11. Măsline - Grecia 5,1635 0,0294 0,57
12. Hrean - Buhuşi 2,3865 0.0334 1,40
13. Ţelină - Buhuşi 2,4105 0,0127 0,52
14. Morcov - Buhuşi 5,2987 0,1166 2,20
15. Varză roşie 6,0548 0,1290 2,13
16. Varză albă România vrac 5,2881 0,1090 2,06
25
Tabel II.20.
Conţinutul în seleniu al produselor alimentare studiate
Nr.
crt Denumirea probei
Masa
probei
Concentraţia în seleniu
µg/probă µg/kg
17. Banane 5,1492 0,0324 0,63
18. Portocale - Grecia 6,9798 0,0865 1,24
19. Lamai - Turcia 6,8381 0,0500 0,74
20. Porumb dulce "Aro" - Ungaria 4,8750 0,0234 0,48
21. Fasole - bob alb „Deroni"Polonia 2,4889 0,0154 0,62
22. Linte verde "Deroni" - Canada 2,1090 0,0099 0,47
23. Texturat din soia - vrac 2,2223 0,0246 1,11
24. Orez 1,4800 0,0316 2,14
25. Spaghete "Pambac" 1,3713 0,1151 8,40
26. Biscuiti obisnuiti vrac 2,3611 0,1444 6,12
27. Malai extra "Pan Group" 1,9005 0,0203 1,07
28. Faina alba 000 "Pambac" 1,3900 0,1932 13,90
29. Ciuperci 3,4222 0,9281 27,12
Concentraţiile în seleniu determinate în cele 46 de probe de
produse alimentare studiate variază în limite foarte largi; astfel, pentru
acelaşi tip de aliment – mere, concentraţiile de seleniu sunt cuprinse întrte
0,23 µg/100g şi 0,43 µg/100g. Pentru probele de ardei gras, concentraţiile
determinate variază de la 0,18 µg/100g la 0,32 µg/100g. Conţinutul în
seleniu al probelor de pâine analizate variază între 3,17 şi 4,21 µg/100g.
Cele mai mari concentraţii de seleniu s-au determinat în probele de ciuperci
(27,12 µg/100g) usturoi (14,54 µg/100g), arahide prăjite (10,02 µg/100g) şi
făină albă 000 (13,90 µg/100g). Aceste rezultate sunt destul de apropiate de
cele publicate în literatura de specialitate. Astfel, Barclay et al., (1992) au
raportat pentru făina albă o concentraţie medie de seleniu cuprinsă între 7,9
şi 23,4 µg/100g de produs. Diferenţele sunt explicate prin conţinutul diferit
în proteine al făinii; făina cu cel mai ridicat nivel al seleniului are un
conţinut ridicat în proteine (mai mult de 150g/kg) comparativ cu cea cu un
conţinut proteic de 130g/kg care are cel mai coborât nivel de seleniu. Alţi
autori (Barkley et al., 1995) au determinat în probe de făină „de referinţă”
concentraţii de seleniu de 14 µg/100g de produs.
26
Tabel II.21.
Conţinutul în seleniu al produselor alimentare studiate
Nr.crt Denumirea probei Masa
probei
Concentraţia în seleniu
µg/probă µg/100g
30. Morcovi vrac Olanda 5,0965 0,0571 1,1223
31. Roşii vrac Turcia 5,9737 0,0262 0,4397
32. Ardei iuţi vrac Turcia 6,1944 0,0076 0,1243
33. Ardei capia roşu 5,4450 0,0125 0,2313
34. Ardei gras verde Turcia 5,6883 0,0102 0,1800
35. Ardei gras Bianca vrac Turcia 5,8901 0,0188 0,3208
36. Ardei gras portocaliu Spania 6,2447 0,0147 0,2354
37. Cartofi România - Buhuşi 5,4525 0,0163 0,3007
38. Cartofi albi - România 5,4209 0,0195 0,3607
10. Usturoi – China 5,3079 0,7718 14,5422
39. Ceapă roşie - România - Buhuşi 5,6904 0,0359 0,6322
40. Ceapă albă - România - Buhuşi 5,4776 0,0280 0,5123
41. Mere Golden delicious - Austria 5,6883 0,0134 0,2356
42. Mere - România - Buhuşi 5,8021 0,0248 0,4276
43. Mere Starkinson vrac Grecia 5,4548 0,0106 0,1954
44. Mere Yonagold – Belgia 5,6633 0,0246 0.4378
45. Grapefruit alb vrac Turcia 8,6108 0,0448 0,5208
Concentraţia seleniului în pâine, raportată de Barcley et al. (1995)
variază între 3,5 şi 4,8 µg/100g de produs. Autorii egipteni (Hussein et al.,
1999) au raportat pentru făina albă concentraţii de seleniu de 19,3 µg/100g
de produs. Analizate comparativ, datele obţinute de noi şi cele prezente în
literatura dev specialitate, evidenţiază valori suficient de apropiate pentru
aceleaşi tipuri de produse alimentare. Pe această bază se poate estima
aportul zilnic de seleniu prin consumul de produse alimentare de origine
vegetală. Valorile mai mici pentru unele produse recoltate din România ar
putea fi explicate prin nivelul scăzut al seleniului în sol (Lăcătuşu et al.,
2010; Lăcătuşu et al., 2002; Lăcătuşu et al., 1992).
Concluzii
Cercetările experimentale incluse în acest capitol au condus la
adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de determinare a
seleniului din produse alimentare prin stabilirea condiţiilor de aplicare a
metodei şi determinarea parametrilor de validare ai metodei Astfel, după
stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă s-au stabilit
volumele optime ale tuturor reactivilor utilizaţi la aplicarea metodei.
27
Raportul de validare a confirmat valori optime pentru parametrii
impuşi metodelor spectrofotometrice de analiză. Astfel, liniaritatea metodei
este corespunzătoare pentru intervalul de concentraţii 0,5-5 μg/mL (10-100
g/probă), coeficient de regresie (r2) are valoarea 0,9954, coeficientul de
corelaţie (r) = 0,9977; panta = 0,00425, iar interceptul = 0,00411.
Precizia metodei, indică pentru deviaţia relativă standard (RSD %)
valori de 0,9493% pentru repetabilitatea detecţiei, 1,2900% pentru
repetabilitatea metodei şi 1,8302% pentru precizia intermediare. Valoarea
limită admisă pentru deviaţia standard relativă este de 5%; cerinţa este
îndeplinită, ceea ce dovedeşte o bună repetabilitate a metodei.
În ceea ce priveşte exactitatea metodei, regăsirea medie este de 100,19% pe
intervalul 97,97 – 103,60%. Valorile experimentale obţinute indică faptul
că metoda este exactă.
Rezultatele obţinute au evidenţiat diferenţe ale randamentului de
recuperare atât în funcţie de metoda de separare a seleniului din probele de
analizat, cât şi de concentraţia de seleniu adaugată. Astfel, pentru probele
de pâine integrală, la care separarea seleniului s-a realizat prin calcinare
randamentul de recuperare a avut valori de 67,28 % pentru concentraţia
adăugată de 50 µg/kg şi 84,43% la adăugarea selenitului de sodiu în
concentraţie de 100 µg/kg. Separarea seleniului prin mineralizare umedă a
condus la procente mai mari ale randamentului de recuperare, de 88,36% şi,
respectiv 97,14%. Pentru probele de usturoi, randamentele de recuperare
sunt apropiate de cele determinate pentru probele de pâine şi sunt cuprinse
între 76,16% şi 97,73%.
Calcularea limitei de detecţie (LD) şi a limitei de cuantificare (LC)
a condus la concentraţii de 0,36 µg/mL şi respectiv 1,07 µg/mL. Aceste
valori confirmă nivelul modest de sensibilitate a metodelor
spectrofotometrice de determinare a seleniului din probe a căror
concentraţie a acestui element este scăzută.
Determinarea seleniului din produsele alimentare de origine
vegetală a condus la rezultate comparabile cu cele raportate de alţi autori
pentru produse similare. Valorile mai mici pentru unele produse recoltate
din România ar putea fi explicate prin nivelul scăzut al seleniului în sol.
28
Capitolul III
ROLUL SUPLIMENTELOR NUTRITIVE ÎN ASIGURAREA
APORTULUI DE SELENIU PENTRU ORGANISM
III. 2. Suplimente nutritive cu seleniu
Doza zilnică de seleniu din dietă nu este întotdeauna de ajuns pentru
nevoile nutriţionale ale indivizilor, mai ales pentru cei care locuiesc în zone cu
soluri sărace în acest element. Numeroşi medici recomandă mărirea dozei de
seleniu din dietă şi folosirea de suplimente nutritive cu acest produs, mai ales
ca mijloc de a reduce riscul apariţiei unor forme de cancer. Acest lucru
presupune o grijă sporită pentru a găsi forma potrivită de seleniu din
suplimente, a supraveghea calitatea produselor de pe piaţă, siguranţa lor şi
modul în care sunt ele consumate.
Suplimentele cu seleniu necesită o mai atentă supraveghere, iar
populaţia trebuie informată mai corect referitor la conţinutul acestor
suplimente, la forma de seleniu din suplimente, la posibilele intercaţiuni cu
alte substanţe, la pericolele supradozării.
Obiectivele cercetării
Suplimentele alimentare care au seleniu în compoziţia lor sunt
recomandate şi administrate pentru completarea necesarului de seleniu
pentru organism. Deoarece, în general aceste suplimente nu se
administrează după evaluarea statusului nutriţional al organismului în
seleniu, se impun precauţii pentru a se evita aportul excesiv al acestui
microelement. Inregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare
nu este supusă aceloraşi reglementări ca şi în cazul medicamentelor şi de
aceea, în cazul seleniului, microelement la care balanţa deficit-exces este
atât de sensibilă este necesară respectarea concentraţiei microelementului
pe doza unitară administrată.
Cercetările experimentale incluse în acest capitol au urmărit:
Determinarea conţinutului în seleniu al unor suplimente
nutritive
Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive
conţinând seleniu.
29
III.2.1. Determinarea seleniului prin metoda spectrofotometrică
cu iodură de potasiu - albastru variamin.
Material şi metode
Probe de analizat
Probele de analizat - 12 suplimente alimentare conţinând seleniu au
fost achiziţionate din reţeua farmaceutică a oraşului Iaşi:
1. Taxofit (V) – comprimate cu eliberare retard
2. Se – spirulin – comprimate acoperite
3. Additiva superform (V) - comprimate acoperite
4. Additiva 50+ (V) - comprimate filmate
5. Diabetiker (V) - comprimate filmate
6. Bio – Seleniu – Zinc (V) - comprimate filmate
7. Additiva Okio-clar (V) - comprimate filmate
8. Complex de antioxidanţi (V) - capsule moi
9. Walmark Seleniu formula forte (VI) – comprimate
10. Walmark Antioxidant (V) – comprimate
11. Multivitamine şi minerale junior – pulbere oro – solubilă (2 g –
compoziţia)
12. Multivitamine şi minerale adulţi – pulbere oro – solubilă (2 g –
compoziţia)
III.2.2. Determinarea seleniului din probele de suplimente
alimentare
Separarea seleniului din probe
Separarea seleniului din probe s-a realizat prin mineralizare uscată,
la temperatura de 600ºC. Reziduul final reluat cu amestec acid sulfuric
concentrat - acid azotic concentrat (1:1), s-a neutralizat şi după filtrare s-a
adus cantitativ cu apă distilată la volumul de 50 ml – soluţia mineralizată.
Soluţia obţinută a fost utilizată pentru dozarea seleniului prin cele două
metode spectrofotometrice prezentate în capitolul anterior.
Cotă parte din soluţia mineralizată (1-3 mL) se prelucrează în
modul indicat la trasarea curbei de etalonare. După 20 de minute se
măsoară absorbanțele la 545 nm, cuva de 1 cm, faţă de un martor preparat
în aceleaşi condiţii,
Rezultate şi discuţii
Rezultatele obţinute la determinarea seleniului prin metoda
spectrofotometrică cu iodură de potasiu-albastru variamin sunt înserate în
tabelul III.2.
30
Tabel III.2.
Conţinutul în seleniu al probelor analizate
Nr.
probei
Conţinut în seleniu (µg/comprimat/ capsulă) Abatere
(%) Declarat Determinat
1. 15 15,45 +3,00
2. 50 53,23 +6,46
3. 40 37,12 -7,20
4. 30 30,07 +0,23
5. 100 101,15 +1,15
6. 17,5 18,32 +4,68
7. 15 16,06 +7,06
8. 100 98,14 -1,86
9. 50 49,05 -1,90
10. 50 51,14 +2,28
11. nedeclarat 24,45/2 g pulbere -
12 nedeclarat 44,14/2 g pulbere -
Din analiza rezultatelor obţinute la determinarea seleniului din
probele de suplimente alimentare luate în studiu se constată variaţii faţă de
concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de concentraţiile
declarate variază între – 7,2% şi +7,06%.
III.2.3. Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive
Testul de dizolvare este un test de studiu al cedării (eliberării) in
vitro a substanţei active dintr-o formă farmaceutică solidă.
Punerea la dispoziţia organismului a substanţei active din formele
farmaceutice orale este diferită de aceea a unei forme cu aplicare topică sau
pe mucoase (ovule, supozitoare).
Timpul de dizolvare stabileşte cantitatea de substanţă activă
dizolvată dintr-o formă farmaceutică solidă cu administrare orală, într-un
anumit timp, în mediul de dizolvare prevăzut.
Principiul determinării
Comprimatul se plasează într-un recipient în lichidul de dizolvare.
Cu un sistem de agitare, are loc o agitare lentă în jurul comprimatului, dar
suficientă pentru a asigura omogenitatea mediului, în vederea prelevării
probelor.
Agitarea mediului se realizează mecanic prin intermediul unei tije,
care la primul aparat se termină cu o paletă, iar la al doilea, cu un coşuleţ
31
confecţionat dintr-o sită. În primul aparat, comprimatul se introduce în mediul
de dizolvare, iar în al doilea aparat, comprimatul este plasat în coşuleţ şi se
roteşte o dată cu el.
Condiţii de calitate pentru comprimatele cu minerale
Tabletele cu minerale conţin două sau mai multe minerale derivate
din substanţe recunoscute general ca fiind sigure, furnizând două sau mai
multe din următoarele elemente sub formă ionizabilă: calciu, crom, cupru,
fluor, iod, fier, magneziu, mangan, molibden, fosfor, potasiu, seleniu şi
zinc. Tabletele conţin nu mai puţin de 90.0 la sută şi nu mai mult de 125.0
la sută din cantitatea etichetată de calciu (Ca), cupru (Cu), fier (Fe),
magneziu (Mg), mangan (Mn), fosfor (P), potasiu (K) şi zinc (Zn) şi nu mai
puţin de 90.0 la sută şi nu mai mult de 125.0 la sută din cantităţile etichetate
de crom (Cr), fluor (f), iod (I), molibden (Mo) şi seleniu (Se). Ele nu conţin
vitamine. Pot conţine alte substanţe adăugate, menţionate pe etichetate în
cantităţi care nu sunt subiectul obiecţiilor.
Rezultate
Testul de dizolvare in vitro (probele 1-9)
Pahar Proba
Masa (g)
3
comprimate
Conţinut Se
declarat
(µg)/cp
Observaţii
1 B 2,74 15
- după 60 min. toate cele trei
comprimate prezentau nucleu
palpabil
2 C 4,20 50 - 1 comprimat a prezentat nucleu
palpabil, după 60 min
3 D 3,70 40 - dizolvare totală
4 E 3,55 30
- după 60 min. toate cele trei
comprimate prezentau nucleu
palpabil (> 50% din masa
comprimatului)
5 F 1,32 100 dizolvare totală
6 G 3,51 17,5 dizolvare totală
7 I
(clasa VI) 1,01 100 - comp. au dezagregat după 10 min.
8 J
(clasa V) 1,69 50 - comp. au dezagregat după 10 min.
9 H
(clasa V) 2,53 50
- învelişul şi-a păstrat integritatea
pe parcursul celor 60 de min. (la
prox. 20 min. am observat o gonflare
evidentă a caps.).
32
Tabel III.7.
Estimarea capacităţii de dizolvare a suplimentelor nutritive, prin
determinarea seleniului cedat
Intervalul
de timp
(minute)
Concentraţiile de seleniu cedate {(µg/comprimat sau capsulă)/ %}
Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Proba
5 Proba 6
Proba
7 Proba 8 Proba 9
10 4,35/29 16/32 19,2/48 - 47/47 8,4/48 92/92 48,25/96,5 -
20 6,45/43 19/38 21,2/53 - 59/59 11,02/63 96/96 - -
30 8,53/57 27/54 25,6/64 3,6/12 61/61 13,82/79 = = 9,6/19,2
40 9,15/61 29,5/59 28,8/72 7,5/25 73/73 15,22/87 = = 13,25/26,5
50 10,20/68 35/70 31,6/79 8,7/29 84/84 16,1/92 = = 16/32
60 10,45/70 36,5/73 33,2/83 11,1/37 92/92 16,8/96 = = 23,4/46,2
Discuţii
Rezultatele obţinute la determinarea capacităţii de dizolvare a celor
9 probe de suplimente nutritive luate în studiu scot în evidenţă faptul că în
unele situaţii forma farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din
cantitatea de seleniu declarată. Două dintre probe (proba 7 şi proba 8) au
cedat seleniul după numai 10 sau 20 de minute de experiment. În schimb,
probele 1, 2, 4 şi 9 au prezentat o capacitate de cedare a seleniului de 70%,
73%, 37,5 şi, respectiv 46,2%.
Rezultatele obţinute de noi sugerează că nu toate suplimentele
alimentare condiţionate sub formă de comprimate sau capsule respectă
condiţiile impuse privind capacitatea de dizolvare in vitro. Această
concluzie susţine rezultatele unui studiu realizat în Franţa asupra calităţii
suplimentelor alimentare în care, pentru 382 de produse s-a determinat
conţinutul în principii nutritive (valoare nutritivă, vitamine, minerale),
conservanţi şi alţi aditivi, metale grele, pesticide, etichetare, s-a constatat că
75% dintre ele erau necorespunzătoare: prezentau substanţe neautorizate,
conţineau plante sau părţi din plante neautorizate în alimentaţia umană,
erau adăugate vitamine şi substanţe minerale sub formă neautorizată şi în
concentraţii mai mari decât dozele zilnice recomandate, prezentau pesticide
organoclorate în concentraţii care nu pot fi neglijate, prezentau etichetare
incompletă.
Concluzii
Rezultatele obţinute la determinarea seleniului din probele de
suplimente alimentare luate în studiu evidenţiază variaţii faţă de
concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de concentraţiile
declarate variază între – 7,2% şi +7,06%.
33
Pentru rezultatele obţinute de noi, concentraţiile de seleniu
determinate variază între 92,8% şi 107,06%, valori care se încadrează în
limitele impuse de legislaţia în vigoare (variaţii cuprinse între 90% şi 125%
faţă de concentraţia declarată).
Rezultatele obţinute la determinarea capacităţii de dizolvare a celor
9 probe de suplimente nutritive luate în studiu scot în evidenţă faptul că în
unele situaţii forma farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din
cantitatea de seleniu declarată. Două dintre probe au cedat seleniul după
numai 10 sau 20 de minute de experiment, în schimb, altele dintre probele
analizate au prezentat o capacitate de cedare a seleniului de 70%, 73%, 37,5
şi, respectiv 46,2%.
Rezultatele obţinute de noi sugerează că nu toate suplimentele
alimentare condiţionate sub formă de comprimate sau capsule respectă
condiţiile impuse privind capacitatea de dizolvare in vitro.
34
Capitolul IV
EVALUAREA ROLULUI PROTECTOR AL SELENIULUI ÎN
INTOXICAŢIA SUBACUTĂ CU ACRILAMIDĂ PE BAZA UNOR
PARAMETRI BIOCHIMICI, HEMATOLOGICI ŞI
HISTOPATOLOGICI
IV.1. Introducere
Pe lângă efectele favorabile pe care procesul culinar le produce
asupra alimentului în general, sau asupra anumitor principii nutritive din
componenţa acestuia, tratamentul termic poate avea şi consecinţe nedorite:
reducerea valorii biologice prin distrugerea unor principii nutritive
(aminoacizi, vitamine), modificarea unor proprietăţi senzoriale (culoare,
textură), apariţia unor compuşi de degradare nocivi (acroleină, compuşi
furanici, acrilamidă) (Cuciureanu, 2005).
Acrilamida (AA), compus chimic cunoscut încă de la sfârşitul
secolului XIX pentru efectele sale neurotoxice şi cancerigene, a fost
decelată în alimentele prelucrate termic prin prăjire sau coacere (produse pe
bază de cartofi, chips-uri, pâine) de către cercetătorii suedezi în aprilie 2002
(Mottram et al.,2002; SNFA, 2002 ). Se găseşte în fumul de ţigară şi, este
inclusă şi în categoria toxicilor “de mediu” (“environmental“) toxic pe baza
efectelor neurotoxice consecutive expunerii, la fumătorii activi sau pasivi.
După anul 2002, Organizaţia Mondială a Sănătăţii a lansat programe
de cercetare care abordează aspecte începând cu mecanismul de formare,
concentraţia în alimente, acţiunea toxică, până la elaborarea recomandărilor
privind prelucrarea termică a alimentelor în vederea reducerii formării AA.
Aceste cercetări (studii experimentale şi date epidemiologice) au confirmat
acţiunea cancerigenă a AA la animalele de laborator. În plus, au fost puse în
evidenţă efecte toxice asupra funcţiei de reproducere, a dezvoltării, în
general, precum şi efecte genotoxice (WHO 2002).
IV.2. Obiectivele cercetării
Prezentul capitol îşi propune ca obiective:
Studierea potenţialului protector al seleniului (administrat sub
formă de selenit de sodiu) şi a unor suplimente alimentare cu seleniu asupra
şobolanilor Wistar în intoxicaţia experimentală, pe cale orală, cu doze
crescute de acrilamidă prin:
35
Evaluarea modificărilor biochimice, hematologice şi
histopatologice la şobolani cu intoxicaţie subacută cu acrilamidă
(50mg/kgc/zi);
Evaluarea modificărilor biochimice, hematologice şi
histopatologice la şobolanii la care administrarea de acrilamidă (intoxicaţie
subacută) a fost asociată cu administrarea simultană de seleniu (selenit de
sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând seleniu (Celnium).
Material şi metode
Protocol experimental
Şobolani Wistar adulţi cu greutatea cuprinsă între 180-220g, au fost
constituiţi în 8 loturi de câte 3 animale cărora, timp de 12 zile, după 12 ore de
post, li s-a administrat prin gavaj gastric:
Lot I (Control) – ser fiziologic = Control;
Lot II – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kgc/zi) = AA;
Lot IV – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de
selenit de sodiu 1mg/kg/zi (echivalent cu 1 mg Se) = AA + Se 1;
Lot IV – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de
selenit de sodiu 0,2 mg/kgc/zi (echivalent cu 0,2 mg Se) = AA + Se 0,2;
Lot V - acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie Celnium
(supliment nutritiv cu seleniu, echivalent cu 0,2 mg Se/kgc/zi = AA + Ce.
La finalul experimentului, după 12 ore de post animalele au fost
sacrificate şi s-au recoltat probe de sânge în eprubete cu anticoagulant în
funcţie de tipul de analiză. Probele din ţesutul hepatic (pentru analizele pe
omogenat de ficat) au fost recoltate pe ser fiziologic la temperatura de 2-3
grade şi păstrate la - 35°C până la efectuarea determinărilor (GSH, GPx, TAS,
MDA).
Probele pentru examenul histopatologic (ficat, rinichi, creier,
testicul, pancreas) au fost recoltate şi păstrate în soluţie de formol 10 %.
IV.3. Investigaţii biochimice
După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor
biochimice au fost centrifugate pentru 15 minute, la 3000 rotaţii pe minut.
Plasma obţinută a fost supusă imediat determinărilor biochimice care s-au
realizat metode standardizate folosind kituri ELITech.
Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de
experimentul realizat s-au efectuat pe analizoarele semiautomate LITech,
Randox sau prin determinări spectrofotometrice clasice. Toate rezultatele
prezentate reprezintă media a 5 determinări (fiecare parametru a fost
determinat individual pe plasma recoltată de la 5 şobolani).
36
IV.3.1.1. Determinarea activităţii alanin-amino-transferazei (ALT)
Rezultate şi discuţii
Fig. IV. 3. Valorile plasmatice ale alanin-amino-transferazei
Rezultatele obţinute (figura IV.3.) evidenţiază creşterea valorilor
activităţii ALT la lotul AA comparativ cu lotul Control. Asocierea
administrării AA cu seleniu a avut ca efect creşterea valorilor ALT de la
51,1 U/L la lotul Control la 95,5 la loturile la care AA a fost asociată cu
seleniu sub formă de selenit de sodiu (0,2 mg/kg), respectiv Celnium.
Evoluţia alanil aminotransferazei, enzimă cu localizare strict citosolică,
evidenţiază creşteri semnificative ale activităţii, sugerând permeabilizarea
membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul intercelular.
IV.3.1.2. Determinarea aspartat-amino-transferazei (AST)
Rezultate şi discuţii
Rezultatele obţinute în urma investigaţiei activităţii primului
indicator de citoliză hepatică, aspartat aminotransferaza, sunt redate în
figura IV.4.
Studiul acestor rezultate evidenţiază variaţii majore, a căror
interpretare poate conduce la date importante privitoare la farmacocinetica
acrilamidei administrate oral.
Se observă o creştere a activităţii acestei enzime celulare de la
203,66 la 229,66 26 UI pentru lotul la care s-a administrat AA. Această
tendinţă de creştere a activităţii hepatice a AST este neconcordantă cu
rezultatele raportate de Yousef et al. (2005) care evidenţiază o scădere a
valorilor AST hepatic pentru toate dozele de acrilamidă administrate
37
(Fig.IV.5). Pentru lotul la care AA a fost administrată simultan cu selenitul
de sodiu în concentraţie de 1 mg/kg, valoarea plasmatică a aspartat-amino-
transferazei a scăzut la 145,51 U/L.
Fig. IV.4. Valorile plasmatice ale aspartat-amino-transferazei
Aceste valori sugerează că ar avea loc migrarea AST din
citoplasma hepatocitelor în spaţiul intercelular datorită creşterii
permeabilităţii membranare. Această permeabilizare a membranei
hepatocitului fi datorată lezării consecutive legării acrilamidei sau a unor
metaboliţi de proteinele membranare.
38
Fig.IV. 5. Evoluţia activităţii ALT, AST şi ALP în ficat după tratamentul cu
acrilamidă (Yousef et al. 2005)
IV.3.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei (GGT)
Rezultate şi discuţii
Aşa cum arată aceste date (Fig.IV.7.), activitatea y-glutamil
transpeptidazei pentru lotul de referinţă este de 8,1U/L; activitatea GGT
înregistrează o creştere semnificativă pentru lotul AA, tratat cu acrilamidă
la 11,6U/L. Această creştere se corelează cu evoluţia indicatorilor de
citoliză hepatică la acest lot. Pentru loturile de animale care au primit
acrilamidă în asociere cu seleniu valorile γ-glutamil transpeptidazei au
evoluat spre cele caracteristice lotului Control.
39
Fig. IV.7. Valorile plasmatice ale γ-glutamil transpeptidazei
IV.3.5. Determinarea creatin kinazei (Creatin-fosfokinaza, CK)
Rezultate şi discuţii
Fig. IV.10. Concentraţiile plasmatice ale creatin-fosfokina
Rezultatele obţinute la determinarea activităţii creatin-fosfokinazei
(figura IV.10.) evidenţiază valorile crescute pentru lotul intoxicat cu
acrilamidă, comparativ cu lotul control (1606,2 U/L, comparativ cu 1127,1
U/L). Din datele prezentate în figură reiese capacitatea seleniului administrat
simultan sub formă de selenit de sodiu sau de supliment alimentar (Celnium)
40
de a contracara acţiunea toxică a acrilamidei şi a normaliza leziunea
biochimică produsă de aceasta. Rezultatele obţinute de noi nu sunt corelate
cu cele raportate de alţi autori (Fig. IV.11.) (Yousef et al., 2005).
Fig. IV.11. Valorile plasmatice ale creatin kinazei în urma tratamentului cu
acrilamidă (Yousef et al., 2005).
IV.3.7. Determinarea proteinelor totale
Rezultate şi discuţii
Rezultatele concentraţiei proteinelor plasmatice (figura IV.13) pentru cele 5
loturi de şobolani luate în studiu evidenţiază concentraţii diminuate ale
proteinemiei la loturile intoxicate cu acrilamidă în concentraţie de 50
mg/kg corp. Asocierea seleniului normalizează evident valorile plasmatice
ale proteinelor totale în plasma sanguină. Valorile obţinute în acest
experiment sunt în concordanţă totală cu cele raportate de Yusef et al.
(2006) şi Odland (1994).
Fig. IV.13. Concentraţia plasmatică a proteinelor totale
41
Yusef et al. (2006) au obţinut pentru lotul de şobolani intoxicat cu
acrilamidă administrată oral (50 mg/kgc) o scădere a proteinemiei la 6,3
mg/dl, faţă de 6,8 pentru lotul control (figura IV.14).
Fig.IV.14.Valorile plasmatice ale unor proteine plasmatice în urma
tratamentului cu acrilamidă (Yousef et al., 2005)
IV.3.8.2. Determinarea bilirubinei directe
Principiul metodei – determinare
Determinarea bilirubinei conjugate (directe) se bazează pe
capacitatea bilirubinei directe de a reacţiona cu acidul sulfanilic şi reactivul
diazo (fără accelerator). Se formează un compus colorat în roşu, intensitatea
culorii fiind direct proporţională cu concentraţia bilirubinei directe în ser.
Rezultate şi discuţii
În ceea ce priveşte bilirubina directă (figura IV.16), situaţia este
asemănătoare; valoarea plasmatică a acestui parametru a crescut de 19 ori
pentru lotul intoxicat cu acrilamidă (0,38mg/dl) faţă de martor (0,02 mg/dl).
Şi în cazul bilirubinei directe se poate afirma, pe baza valorilor obţinute, că
42
administrarea de seleniu ar normaliza traseul bilirubinei totale la nivel
hepatobiliar.
Fig. IV. 16. Valorile plasmatice ale bilirubinei directe
IV.3.10. Determinarea LDL – colesterolului
Rezultate şi discuţii
Dinamica valorilor colesterolului total este în concordanţă cu datele
publicate de Khalil et al. (2005). Astfel, concentraţiile colesterolului total sunt
mai mari decât ale lotului control. Administrarea a 50 mg acrilamidă/kgc a
condus la o creştere a total colesterolului la 85,2 mg/dl (figura IV.17).
Fig. IV.17. Concentraţiile plasmatice ale colesterolului total
43
Fig. IV.18. Concentraţiile plasmatice ale LDL colesterolului
Şi pentru loturile la care administrarea acrilamidei a fost asociată cu
seleniu s-a obţinut o creştere a valorilor colesterolului, dar în măsură mult mai
redusă. Astfel, pentru lotul care a primit 1 mg selenit de sodiu/kgc valoarea
parametrului este de 55,8 mg/dl, comparativ cu 67,1 mg/dl pentru lotul care a
primit 0,2 mg selenit/kgc.
Aceeaşi dinamică a fost obţinută şi la determinarea valorilor LDL
colesterolului. Astfel, pentru lotul intoxicat cu acrilamidă, valoarea LDL
este de 10,33 mg/dl, comparativ cu martorul la care sau obţinut 8,66 mg
colesterol/dl. Şi pentru acest parametru, putem aprecia că seleniul a
manifestat acţiune protectoare. Astfel comparativ cu lotul care a primit
acrilamidă, la cel la care toxicul a fost asociat cu 1 mg selenit de sodiu/kg,
valoare LDL colesterol a scăzut la 9,23 mg/dl (figura IV.18).
IV.3.14. Determinarea ferului
Principiul metodei- determinare
Fierul se dozează; prin metoda colorimetrică cu ferozina. Ionul
feric din ser este disociat de pe proteina transportoare, transferina, în mediu
acid şi, simultan, redus la ionul feros. Acesta reacţionează cu ferozina din
reactivul cromogenic şi formează un compus colorat, care are maximum de
absorbanţă la 546 nm şi a cărei intensitate de culoare este direct
proporţională cu concentraţia de fier măsurată.
Reacţia este lineară până la concentraţia de 198 μmol/l, în caz de
rerun, liniaritatea merge până la 398 μmol/l.
44
Concentraţia minimă detectabilă de Fe cu această metodă este de
2.0 μmol/l.
Rezultate şi discuţii
Fig. IV.22. Concentraţiile ferului plasmatic
Concentraţiile ferului plasmatic au crescut semnificativ la lotul de
animale intoxicat cu acrilamidă, 223,1 mg/dL comparativ cu 107,1 mg/dl la
lotul martor. Loturile care au primit acrilamidă şi selenit de sodiu prezintă
concentraţii ale ferului de 133,8 mg/dL pentru lotul AA+Se 1, 141,1mg/dL
pentru lotul AA+se 0,2, respectiv 153,4 pentru lotul AA+Ce (figura IV.22).
Rezultate concordante cu cele obţinute de noi au fost raportate de
Allam et al. (2010) care au obţinut creşteri ale concentraţiilor plasmatice
ale ferului la şobolani alimentaţi cu hrană conţinând acrilamidă timp de 21
de zile.
Pe toată durata experimentului realizat de autorii citaţi, de 28 de
zile concentraţia plasmatică a ferului a scăzut uşor. Astfel, după 21 de zile
valoarea ferului a fost de 94,11 mg/dl, comparativ cu lotul martor, la care
valoarea a fost de 106,97 mg/dL.
După 28 de zile de experiment concentraţia ferului a scăzut de la
104, 46 mg/dL la maror la 95, 56 mg/dl la lotul intoxicat cu acrilamidă.
Perturbarea homeostaziei ferului se poate explica prin scăderea în greutate
a animalului în prima etapă a experimentului şi prin formarea unor aducţi
acrilamidă-hemoglobină, respectiv glicidamidă-hemoglobină (Ling et al.,
1996; Konings et al., 2003).
45
IV.3.16. Determinarea nivelului plasmatic al ureei
Fig. IV.25. Concentraţiile plasmatice ale ureei
Rezultatele obţinute la determinarea ureei în sânge confirmă
toxicitatea renală a acrilamidei (BIBL). Astfel, la animalele intoxicate cu
acrilamidă nivelul ureei a crescut de la 38,9 mg/dL la martor la 57,5 mg/dL
(figura IV.25).
Valorile obţinute pentru loturile la care acţiunea toxică a
acrilamidei ar putea fi protejată prin asocierea cu seleniu sub formă de
selenit de sodiu, respectiv sub formă de supliment alimentar, Celnium,
evidenţiază faptul că valorile plasmatice ale concentraţiei ureei au scăzut
până la valori mai apropiate de ale lotului martor.
IV.3.17. Determinarea creatininei
Rezultate şi discuţii
Creatinina, ca parametru al evaluării funcţiei renale a prezentat
valori crescute la lotul de animale intoxicat cu acrilamidă. La toate loturile
la care acrilamida a fost asociată cu seleniu, nivelurile plasmatice ale
creatininei sunt mai scăzute decât cele ale lotului martor (figura IV.26).
Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu cele publicate de Khalil et al.
(2007), care au obţinut creşteri ale valorilor creatininei de la 1,18 mg/dL la
grupul martor la 1,83 la lotul care a consumat cartofi prăjiţi şi la 2,20
mg/dL la animalele de laborator alimentate cu pâine prăjită cu un conţinut
ridicat de acrilamidă timp de 6 săptămâni.
46
Fig. IV.26. Concentraţiile creatininei din plasmă
IV.3.19. Determinarea triiod-tironinei (T3)
Rezultate şi discuţii
Rezultatele obţinute pentru valorile triiodtironinei sugerează
confirmarea ipotezei conform căreia seleniul intervine în metabolismul
tiroidian. Pentru lotul de animale intoxicat cu acrilamidă, concentraţia T3 a
scăzut de la 2,63 μg/ml la 2,53 μg/ml. Intervenţia seleniului s-a concretizat
prin modificări ale concentraţiilor T3 necorelate cu doza de seleniu
administrată (Fig. IV. 28).
Fig. IV.28. Valorile plasmatice ale triiod-tironinei
47
IV.3.20. Determinarea tiroxinei (T4)
Rezultate şi discuţii
Fig. IV.29. Valorile plasmatice ale tiroxinei
Valorile plasmatice ale tiroxinei au scăzut dramatic la animalele
tratate cu acrilamidă, comparativ cu lotul martor (fig. IV.29). Rezultatele
sunt concordante cu cele obţinute de Bowyer et al. (2008), (fig. IV.30).
Scăderea este mult mai redusă la asocierea seleniului în concentraţie de 1
mg/kg (de la 10,63 μg/ml la 10,3 μg/ml).
Prin urmare, în studiile de administrare de doze mari de seleniu la
animale, lipsa relaţiei între efectul asupra enzimelor care metabolizează
medicamentele şi metabolismul glutationului în ficat, funcţia neutrofilă şi
schimbările în activitatea GSHPx au necesitat ca investigaţiile să facă
asocierea între seleniu şi statusul tiroidei.
IV.3.23. Evaluarea potenţialului protector al seleniului asupra
stresului oxidativ provocat de intoxicaţia cu acrilamidă
Obiective
Ca parametri pentru cercetarea prezenţei perturbărilor biochimice
provocate de intoxicaţia cu acrilamidă şi evidenţierea rolului seleniului ca
antioxidant în normalizarea valorilor acestor parametri s-au determinat:
superoxid dismutaza (SOD),
glutathion peroxidaza (GPx),
glutationul redus (GSH),
malondialdehida (MDA),
48
statusul total antioxidant (TAS).
Material şi metode
Răspunsul sistemelor antioxidative împotriva nivelurilor ridicate de
acrilamidă administrate la sobolani ;ieventualul potential protector al
seleniului a fost evaluat ]n cadul unui experiment ]n care s-a lucrat pe
şobolani albi Wistar cu greutăţi cuprinse între 220-250 g. Animalele au fost
achiziţionate de la Institutul Cantacuzino şi au fost menţinute în condiţii
standard de laborator. Animalele au fost ţinute în cuşti de dimensiuni
corespunzătoare conform normelor în vigoare; de asemenea au fost
asigurate condiţiile de ventilaţie.
Şobolanii au fost repartizaţi aleator în 5 loturi (de câte 5 animale
fiecare) care au primit: Lot I (Control) – ser fiziologic = Control;
Lot II – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kgc/zi) = AA;
Lot III – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de
selenit de sodiu 1mg/kg/zi (echivalent cu 1 mg Se) = AA + Se 1;
Lot IV – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de
selenit de sodiu 0,2 mg/kgc/zi (echivalent cu 0,2 mg Se) = AA + Se 0,2;
Lot V - acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie Celnium
(supliment nutritiv cu seleniu, echivalent cu 0,2 mg Se/kgc/zi = AA + Ce. La
finalul experimentului, după 12 ore de post animalele au fost sacrificate şi s-
au recoltat probe de sânge în eprubete cu anticoagulant în funcţie de tipul de
analiză. Probele din ţesutul hepatic (pentru analizele pe omogenat de ficat) au
fost recoltate pe ser fiziologic la temperatura de 2-3 grade şi păstrate la -
35°C până la efectuarea determinărilor (GSH, GPx, TAS, MDA).
Cercetarile pe modele experimentale animale au respectat conditiile
impuse de ghidul Societatii Internationale de Studiu al Durerii (IASP) si al
Comitetului Consiliului European (86/609/EEC) cu privire la folosirea
animalelor de experienta si a preparatelor biologice.
S-au recoltat probe de sânge din plexul retroorbitar la 72h de la
administrare sub anestezia şobolanilor cu ketamină (75mg/kg i.p.), în
scopul efectuãrii analizelor biochimice.
Activităţile glutation peroxidazei din sânge şi a antioxidanţilor
totali din plasmă au fost măsuraţi folosind trusa Randox.
Analiza statistică a fost efectuat folosind o variantă a analizei
ANOVA). Testul Tukey a fost utilizat pentru comparaţii multiple (software
Statistici Direct versiunea 2.6). Rezultatele sunt prezentate ca medie a 5
determinări.
Rezultate şi discuţii
Rezultatele obţinute la determinarea superoxid dismutazei în
omogenatele de ficat sunt incluse în fig. IV.35.
49
Fig. IV. 35. Valorile activităţii SOD în omogenatele de ficat
Determinarea activităţii glutationperoxidazei în sânge, respectiv în
omogenatele de ficat a condus la valorile incluse în fig.IV. 36 şi IV.37.
1993,64
1770,72
1824,13
1803,021811,83
1650
1700
1750
1800
1850
1900
1950
2000
C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e
U/L
Fig. IV.36. Valorile glutation peroxidazei în sânge
50
35,42
30,24
41,6239,11 40,14
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e
μm
ol/
g t
iss
ue
s
Fig. IV.37. Valorile glutation peroxidazei din omogenatelede ficat
Concentraţiile glutationului redus şi ale dialdehidei malonice,
determinate in omogenatele de ficat sunt consemnate în fig. IV. 38 şi IV. 39.
35,42
30,24
41,6239,11 40,14
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e
μm
ol/
g t
iss
ue
s
Fig. IV.38. Valorile glutationului redus in omogenatele de ficat
Determinarea statusului total antioxidant, ca parametru global al
evaluarii intensitatii stresului oxidativ a condus la valorile inserate în fig.
IV.40.
Din analiza comparativă a valorilor privint influentarea de către
acrilamidă a statusului antioxidant şi capacitatea eventuală a seleniului de a
normaliza valorile parametrilor afectaţi rezultă că valorile activităţii
superoxid dismutazei au scăzut semnificativ la lotul la care s-a administrat
acrilamida. Valoarea medie determinată este de 133,2 U/mL la lotul AA,
51
comparativ cu 205,1 unităţi/ml la lotul martor. Pentru loturile la care s-a
asociat administrarea acrilamidei cu seleniu, valorile activităţii SOD au
crescut uşor. Astfel pentru lotul AA+Se 1 valoarea este de 185,1 U/mL, iar
pentru AA+Se 0,2 activitatea SOD este de 145,7 U/mL. Aceste date
sugerează existenţa unor diferenţe între capacitatea antioxidantă în funcţie
de concentraţia în seleniu şi forma sub care acesta este administrat.
Enzimele antioxidante (SOD, GPx) reprezintă suportul apărării
organismului faţă de RLO (Shigeoka et al., 1991; Tabatabaie et al., 1994;
Bandhopadhay et al., 1999).
55,42
92,14
84,36
68,81
57,83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e
nm
ol/
G t
iss
ue
s
Fig. IV.39. Valorile malondialdehidei (MDA) in omogenatele de ficat
11,48
6,31
8,6
7,12
8,02
0
2
4
6
8
10
12
C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e
mm
ol/
L0
Fig. IV.40. Valorile statusului total antioxidant din plasmă
52
Scăderea activităţii SOD şi GPx la lotul tratat cu acrilamidă poate fi
datorată creşterii peroxidării lipidice sau inactivării enzimelor prin "cross-
linking" cu malon- dialdehida. Consecinţa acestor procese este acumularea
radicalilor peroxid şi hidrogen peroxid cu consecinţe directe asupra
peroxidării lipidelor. Rezultatele obţinute în urma acestui studiu
experimental, în concordanţă cu cele raportate de Yousef et al., 2006; Allam
et al., 2010; Khalil et al., 2005) evidenţiază capacitatea seleniului de a inhiba
acumularea H2O2 şi a altor specii reactive de oxigen (Diplocke, 1994).
Cercetările experimentale realizate au condus la confirmarea
rolului acrilamidei în intensificarea stresului oxidativ, raportat de Yousef et
al., (2006), fig. IV. 41. Astfel, valorile GPx la lotul intoxicat cu acrilamidă
au scăzut de la 1993,64 U/L la lotul martor la 1770,72 U/L (fig. IV. 36).
Administrarea simultană a seleniului a contracarat în mică măsură acţiunea
nocivă a acrilamidei. Valorile de GPx au scăzut considerabil la loturile care
au fost tratate cu asocierea acrilamida - seleniu comparativ cu lotul control,
sugerând că acrilamida declanşează scăderea activităţii protectoare a
antioxidanţilor din celulă.
Valorile GPx prezintă o scadere semnificativă atunci când sunt
comparate cu probele AA sugerând că o cantitate semnificativă de reactanţi
ar consuma acest agent reducător. O creştere neaşteptată a fost observată
când au fost comparate toate probele de seleniu cu probele de control.
Aceste date ar putea sugera că seleniul are un rol antioxidant din cauza
aceasta a fost inclus în activitatea antioxidantă a GPx (fig. IV. 36; IV. 37).
Fig.IV.41. Modificări în activitatea superoxid dismutazei în ficat în urma
tratamentului cu acrilamidă (Yousef et al., 2005).
Analiza valorilor glutationului (Fig. IV. 38) susţin experimental
dublul rol al acestuia: cel de antioxidant şi de detoxifiant. Dacă pentru lotul
control valoarea GSH este de 35,42 μmol/g de ţesut hepatic, la lotul tratat cu
acrilamidă valoarea a scăzut la 30,24 μmol/g de ţesut.
53
Această scadere a valorilor glutationului sugereaza fie intervenţia
glutationului în combaterea supraîncărcării celulare cu radicali liberi ai
oxigenului, fie implicarea sa în mecanismele de metabolizare şi conjugare a
acrilamidei (Ohkawa et al., 1979, Jihen et al., 2009).
Pentru loturile tratate simultan cu acrilamidă şi cu seleniu se
constată o creştere a valorilor glutationului redus, proportională cu doza de
seleniu administrată. Astfel, pentru lotul AA + Se1 glutationul redus are
valorea 41,62 mmol/l, mai mare chiar decât a lotului martor; aceeaşi
tendinţă de normalizare s-a constatat la lotul AA + Se 0,2 şi la cel care a
primit seleniu sub forma unui supliment nutritiv, Celnium.
Fig. IV.42. Variaţia valorilor GSH după administrarea de acrilamidă
(Yousef et al., 2005)
Evoluţia valorilor obţinute la determinarea dialdehidei malonice
(Fig. IV. 39) evidenţiază în primul rând intervenţia severă a acrilamidei în
procesele de intensificare a stresului oxidativ; valorile parametrului cresc
de la 55,42 mmol/g de ţesut hepatic la 92,14 mmol/g de ţesut. Acţiunea
antioxidantă a seleniului se manifestă prin tendinţa de normalizare a acestor
parametri; valorile MDA au scăzut semnificativ faţă de cele ale lotului
tratat cu acrilamidă, dar rămân mai mari decât cele ale lotului Control.
Rezultatele obţinute sunt concordante cu ale altor autori care semnalează
normalizarea valorilor pentru parametrii de stres oxidativ la loturile de
animale intoxicate cu diferite xenobiotice (Newairy et al., 2007; Kesiket al.,
2008; Moghadaszadeh et al., 2006; Tong et al., 1999).
Statusul total antioxidant (Fig. IV. 40) prezintă o scădere semnificativă
la toate probele care conţin AA, respectiv acrilamidă şi seleniu faţă de probele
lotului Control. Aceste date sugerează că valorea scăzută a statusului total
antioxidant este o consecinţă a administrării acrilamidei. Cea mai mare scădere
a statusului total antioxidant este întâlnită în probele AA, în celelalte probe
scăderea a fost mai puţin severă. Este surprinzător faptul că, chiar dacă GSH a
înregistrat o creştere în proba AA + SE1, statusul total antioxidant a scăzut.
54
Valorile parametrilor care evaluează intensitatea stresului oxidativ
sunt în concordanţă cu concluziile la care au ajuns Yousef et al, (2000).
Radicalii liberi sunt produşi continuu in vivo şi există un număr de enzime
protectoare cu acţiune antioxidantă, unele dependente de statusul seleniului
din organism, care fac faţă agresiunii unor substanţe toxice.
IV.3.29. Evidenţierea modificărilor histopatologice
Examenul histopatologic a urmărit identificarea unor modificări
morfologice consecutive administrării de acrilamidă, respectiv acrilamidă
asociată cu seleniu şi suplimente nutritive pe bază de seleniu, la nivelul
creierului, ficatului, rinichiului, pancreasului şi splinei, considerate posibile
organe-ţintă.
Rezultate şi discuţii
Rezultatele obţinute la examenul histopatologic al probelor
recoltate în acest scop sunt prezentate în figurile următoare.
Analiza acestor imagini histopatologice evidenţiază:
Lotul martor: organele ţintă au prezentat o structură
histoarhitectonică normală, nefiind decelată nici o modificare morfologică
(figurile IV.43 - IV.46).
Lotul tratat cu acrilamidă, 50 mg/kgc, examenul histopatologic a
evidenţiat:
Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular, reacţie zonală
de proliferare glială în substanţa albă, rari neuroni apoptotici (figura IV.47).
Ficat: organizare lobulară păstrată, focare de degenerescenţă
granulo-vacuolară hepatocitară (subcapsular şi în jurul venei centro-
lobulare), inconstant zone cu capilare sinusoide dilatate şi congestive
(figura IV.48), rare focare de piecemeal necrosis (figura IV.49), moderată
proliferare a celulelor Kupffer, limfocite prezente în spaţiile porto-biliare.
Rinichi: corpusculi renali de dimensiuni inegale, majoritate având
dimensiuni mici; leziuni glomerulare de la proliferare mezangială moderată,
limitată la matricială, la proliferare mezangială importantă (matrice şi celule
mezangiale) (figura IV.50), în asociere cu lobulaţie schiţată sau evidentă,
focare izolate de scleroză intracorpusculară (figura IV. 51); predominant tubi
contorţi normali, rari tubi contorţi cu degenerescenţă granulo-vacuolară;
congestie la nivel cortical; medulară fără modificări.
Pancreas: insule Langerhans de dimensiuni foarte mari
(hipertrofiate), componenta acinară prezentând zone de acini mici alternând
cu zone de acini mari, dilataţi, plini de secreţie – cu localizare adiacentă
insulelor Langerhans (figura IV.52); mici focare de necroză acinară în
55
interiorul zonelor cu acini dilataţi (figura IV.52), sugerând posibilitatea ca
hipertrofia acinară să preceadă necroza.
Fig.IV.47.Creier–lot acrilamidă Fig.IV.53. Creier–lot acrilamidă–
protecţie Se 1
Fig. IV.48. Ficat–lot acrilamidă Fig.IV.49. Ficat – lot acrilamidă
Fig.IV.54. Ficat lot acrilamidă –
protecţie Se1
Fig.IV.56. Ficat – lot acrilamidă –
protecţie Se 0,2
56
Fig. IV.50. Rinichi–lot acrilamidă Fig.IV.51. Rinichi–lot acrilamidă
Fig.IV.55. Rinichi – lot acrilamidă –
protecţie Se1
Fig.IV.57. Rinichi – lot acrilamidă –
protecţie Se 0,2
Fig.IV.52.Pancreas–lot acrilamidă Fig.IV.58. Pancreas – lot acrilamidă –
protecţie Se 0,2
57
Splina: histoarhitectonică normală.
Pentru loturile tratate cu 1 mg/kgc selenit de sodiu şi acrilamidă, 50
mg/kgc, modificările histopatologice la nivelul creierului, ficatului şi
rinichilor sunt mai puţin severe:
Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular (fig.IV. 53).
Ficat: organizare lobulară păstrată, capilare sinusoide dilatate în
treimea internă a lobulilor, adiacent venelor centro-lobulare (figura IV.54),
foarte rare limfocite în spaţiile porto-biliare.
Rinichi: 50% din corpusculii renali prezintă ghemul glomerular fin,
fără încărcare mezangială; 50% din corpusculii renali prezintă proliferare
mezangială importantă (matricială) (figura IV.55).
Pancreas: histoarhitectonică normală.
Splină: histoarhitectonică normală.
Concentraţiile mai mici de seleniu (0,2 mg selenit de sodiu/kgc) şi
cele trei suplimente nutritive administrate în vederea evaluarii acţiunii
potenţial protectoare în intoxicaţia cu seleniu acţionează în sensul
normalizării structurilor histoarhitectonice ale organelor investigate.
Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular.
Ficat: organizare lobulară păstrată, infiltrat inflamator limfocitar
prezent în spaţiile porto-biliare (figura IV.56).
Rinichi: în jur de 50% din corpusculii renali prezintă ghemul
glomerular fin, fără încărcare mezangială; în plus, mai puţin de jumătate
din corpusculii renali prezintă proliferare mezangială importantă (celule
mezangiale) (figura IV.57).
Pancreas: histoarhitectonică normală (figura IV.58).
Splină: histoarhitectonică normală.
IV.4. Concluzii
Evaluarea modificărilor biochimice, hematologice şi
histopatologice la şobolanii la care administrarea de acrilamidă (intoxicaţie
subacută) a fost asociată cu administrarea simultană de seleniu (selenit de
sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând seleniu (Celnium) a
urmărit determinarea unor parametri specifici pentru:
- Testarea integrităţii celulare după administrarea de acrilamidă şi
seleniu, pentru evidenţierea modificării permeabilităţii membranei
hepatocitului,
- Controlul capacităţii de sinteză a ficatului prin evidenţierea
perturbării funcţiei proteosintetice;
- Evaluarea stresului oxidativ consecutiv intoxicaţiei cu
acrilamidă, respectiv după administrarea acrilamidei în asociere cu seleniu;
58
Examenul histopatologic a urmărit identificarea unor modificări
morfologice consecutive aportului de acrilamidă la nivelul creierului,
ficatului, rinichiului şi pancreasului, considerate posibile organe-ţintă şi
evidenţierea capacităţii potenţiale a seleniului de a diminua aceste modificări.
Evoluţia valorilor alanil aminotransferazei, enzimă cu localizare
strict citosolică, evidenţiază creşteri semnificative ale activităţii acesteia,
sugerând permeabilizarea membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul
intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugerează că ar
avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor în spaţiul intercelular
datorită creşterii permeabilităţii membranare. Această permeabilizare a
membranei hepatocitului fi datorată lezării consecutive legării acrilamidei
sau a unor metaboliţi de proteinele membranare.
Activitatea GGT înregistrează o creştere semnificativă pentru lotul
de animale tratat cu acrilamidă; această creştere se corelează cu evoluţia
indicatorilor de citoliză hepatică la acest lot. Pentru loturile de animale
care au primit acrilamidă în asociere cu seleniu valorile γ-glutamil
transpeptidazei au evoluat spre cele caracteristice lotului Control.
Rezultatele concentraţiei proteinelor plasmatice pentru cele 5 loturi
de şobolani luate în studiu evidenţiază concentraţii diminuate ale
proteinemiei la loturile intoxicate cu acrilamidă în concentraţie de 50
mg/kg corp. Asocierea seleniului normalizează evident valorile plasmatice
ale proteinelor totale în plasma sanguină.
Rezultatele obţinute în urma determinării concentraţiilor plasmatice
ale bilirubinei totale confirmă afectarea severă a funcţiei hepato-biliare în
intoxicaţia cu acrilamidă.
Situaţia este asemănătoare şi în ceea ce priveşte bilirubina directă;
valoarea plasmatică a acestui parametru a crescut de 19 ori pentru lotul
intoxicat cu acrilamidă faţă de martor. Şi în cazul bilirubinei directe se
poate afirma, pe baza valorilor obţinute, că administrarea de seleniu ar
normaliza traseul bilirubinei totale la nivel hepatobiliar.
Dinamica valorilor colesterolului total este în concordanţă cu datele
publicate de alţi autori. Astfel, concentraţiile colesterolului total sunt mai mari
decât ale lotului control după Administrarea a 50 mg acrilamidă/kgc. Şi pentru
loturile la care administrarea acrilamidei a fost asociată cu seleniu s-a obţinut o
creştere a valorilor colesterolului, dar în măsură mult mai redusă. Aceeaşi
dinamică a fost obţinută şi la determinarea valorilor LDL colesterolului.
Perturbarea homeostaziei ferului (creşterea concentraţiilor plasmatice
la loturile intoxicate cu acrilamidă şi tendinţa de normalizare la cele la care
aceasta a fost asociată cu seleniul) se poate explica prin scăderea în greutate a
59
animalului în prima etapă a experimentului şi prin formarea unor aducţi
acrilamidă-hemoglobină, respectiv glicidamidă-hemoglobină.
Rezultatele obţinute la determinarea sodiului şi a potasiului
plasmatic reflectă o uşoară perturbare a homeostaziei acestor minerale, ca
urmare a afecării funcţiei renale.
Determinarea parametrilor care evidenţiază afectarea renală
confirmă toxicitatea renală a acrilamidei; astfel, valorile plasmatice ale
ureei, creatininei şi acidului uric au crescut semnificativ la lotul tratat cu
acrilamidă, dar au manifestat tendinţă de normalizare la administrarea
simultană de seleniu.
Investigarea funcţiei tiroidiene prin determinarea T3 şi T4 şi
urmărirea raportului acestora a evidenţiat scăderea dramatică a valorilor
plasmatice ale tiroxinei la animalele tratate cu acrilamidă, comparativ cu
lotul martor. Scăderea este mult mai redusă la asocierea seleniului în
concentraţie mai crescută. Faptul că administrarea de seleniu a perturbat
raportul T3/T4 sugerează intervenţia seleniului în metabolismul tiroidian.
Concentraţiile plasmatice ale glucozei au crescut la toate loturile
comparativ cu martorul; s-a constatat şi o uşoară creşterea valorilor glucozei la
loturile la care acrilamida a fost asociată cu seleniul. Se poate presupune
intervenţia acrilamidei în metabolismul glucidic care conduce la creşterea
valorilor glicemiei. Această perturbare a metabolismului glucidic s-ar
suprapune peste intensificarea gluconeogenezei provocată de administrarea de
seleniu.
Răspunsul sistemelor antioxidative împotriva nivelurilor ridicate de
acrilamidă administrate la sobolani şi eventualul potential protector al
seleniului a fost investigat prin determinarea (în sânge total, plasmă sau
omogenate de ficat) parametrilor de stres oxidativ: superoxid dismutaza
(SOD), glutathion peroxidaza (GPx), glutationul redus (GSH),
malondialdehida (MDA) şi statusul total antioxidant (TAS). Din analiza
comparativă a valorilor privind influenţarea de către acrilamidă a statusului
antioxidant şi capacitatea eventuală a seleniului de a normaliza valorile
parametrilor afectaţi rezultă că valorile activităţii superoxid dismutazei au
scăzut semnificativ la lotul la care s-a administrat acrilamida şi existenţa unor
diferenţe între capacitatea antioxidantă în funcţie de concentraţia în seleniu şi
forma sub care acesta este administrat. Scăderea activităţii SOD şi GPx la
lotul tratat cu acrilamidă poate fi datorată creşterii peroxidării lipidice sau
inactivării enzimelor prin "cross-linking" cu malon- dialdehida. Analiza
valorilor glutationului susţine experimental dublul rol al acestuia: cel de
antioxidant şi de detoxifiant. Scăderea valorilor glutationului sugereaza fie
intervenţia glutationului în combaterea supraîncărcării celulare cu radicali
60
liberi ai oxigenului, fie implicarea sa în mecanismele de metabolizare şi
conjugare a acrilamidei.
Pentru loturile tratate simultan cu acrilamidă şi cu seleniu se
constată o creştere a valorilor glutationului redus, proportională cu doza de
seleniu administrată.
Statusul total antioxidant prezintă o scădere semnificativă la toate
probele care conţin AA, respectiv acrilamidă şi seleniu faţă de probele
lotului Control. Valorile parametrilor care evaluează intensitatea stresului
oxidativ sunt în concordanţă numeroase date din literatura de specialitate;
radicalii liberi sunt produşi continuu in vivo şi există un număr de enzime
protectoare, unele dependente de statusul seleniului din organism, cu
acţiune antioxidantă, care fac faţă agresiunii unor substanţe toxice.
Evaluarea histopatologică a fragmentelor de creier provenite de la
animalele lotului de Control prezintă o structură histoarhitectonică normală.
Pentru lotul tratat cu acrilamidă în concentraţie de 50 mg/kg corp, analiza
histopatologică a evidenţiat prezenţa unor edeme perineuronale şi
perivasculare moderate, reacţie zonală de proliferare glială în substanţa
albă, precum şi rari neuroni apoptotici.
Examenul histopatologic al ficatului pentru lotul Control a relevat o
histoarhitectonică normală. Imaginile obţinute în urma evaluării
histopatologice la animale din lotul AA reliefează focare de degenerescentă
granulo-vacuolară hepatocitară (subcapsular şi în jurul venei centro-
lobulare), inconstant zone cu capilare sinusoide dilatate şi congestive rare
focare de piecemeal necrosis (fig. moderată proliferare a celulelor Kupffer.
Asocierea AA + Ce, Se 1mg/kgc şi Se 0,2 mg/kgc protejează ficatul,
stimulând apărarea – fapt susţinut de exacerbarea infiltratului inflamator
limfocitar prezent în spaţiile porto-biliare; cel mai bine a protejat SE1,
numărul de limfocite prezente fiind foarte mic.
Spre deosebire de lotul de referinţă, unde analiza histopatologică a
fragmentelor de rinichi nu au evidenţiat nici o modificare morfologică
imaginile obţinute pentru lotul intoxicat cu acrilamidă au prezentat corpusculi
renali de dimensiuni inegale, majoritatea având dimensiuni mici. De asemenea,
s-au putut observa leziuni glomerulare de la proliferare mezangială moderată,
la proliferare mezangială importantă (matrice şi celule mezangiale).
Asocierea AA + Ce, Se 1mg/kgc şi Se 0,2 mg/kgc protejează rinichiul,
la nivelul căruia leziunile identificate mai sunt reduse faţă de cele prezente la
lotul tratat exclusiv cu AA: există o populaţie importantă de corpusculi renali
(aproximativ 50%) cu aspect normal, iar afectarea mezangială alternează între
proliferare matricială, respectiv matricială şi celulară.
61
CONCLUZII GENERALE
Finalizarea cercetărilor pentru realizarea tezei de doctorat au
condus la următoarele concluzii generale:
Stabilirea protocolului de lucru pentru metoda de determinare
spectrofotometrică a seleniului din probe de produse alimentare şi
suplimente nutritive (lungimea de undă, stabilitatea culorii, volumele
optime de reactivi etc) a stat la baza validării acesteia. Parametrii de
validare studiaţi (liniaritate, repetabilitate, exactitate, limită de detecţie,
limită de cuantificare, etc) s-au înscris în limitele acceptate pentru aplicarea
acestui tip de metode. Reproductibilitatea metodei a variat între 84, 43 şi
97,06% la determinarea pe probe de pâine integrală şi între 81,14 şi 96,52
la determinarea realizată pe probe de usturoi. Aceste valori se încadrează în
cerinţele impuse pentru validarea metodelor spectrofotometrice.
Metoda validată a fost aplicată pentru determinarea seleniului din
probe de produse alimentare. Separarea seleniului din probe s-a realizat
prin mineralizare umedă nitro-sulfurică. Rezultatele obţinute, exprimate în
μg Se/100g de produs alimentar sut în concordanţă cu valorile raportate de
alţi autori pentru acelaşi tip de produse.
Aceeaşi metodă spectrofotometrică a fost aplicată pentru
determinarea seleniului din suplimente nutritive cu seleniu, comercializate
în Romania. Abaterea procentuală calculată variază între (- 7,20%) şi
(+7,06%) şi se încadrează în reglementările în vigoare (Standarde de
referinţă USP).
Cercetarea capacităţii de cedare a seleniului din suplimentele
nutritive luate în studiu scoate în evidenţă faptul că în unele situaţii forma
farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din cantitatea de seleniu
declarată. Două dintre probe au cedat seleniul după numai 10 sau 20 de
minute de experiment. În schimb, alte 4 probe au prezentat o capacitate de
cedare a seleniului de 70%, 73%, 37,5 şi, respectiv 46,2%. Aceste rezultate
sugerează că nu toate suplimentele alimentare condiţionate sub formă de
comprimate sau capsule respectă condiţiile impuse privind capacitatea de
dizolvare in vitro.
62
Studierea potenţialului protector al seleniului (administrat sub formă
de selenit de sodiu) şi a unor suplimente alimentare cu seleniu asupra
şobolanilor Wistar în intoxicaţia experimentală, pe cale orală, cu doze
crescute de acrilamidă realizată prin evaluarea modificărilor biochimice,
hematologice şi histopatologice la şobolani cu intoxicaţie subacută cu
acrilamidă (50mg/kgc/zi), respectiv prin evaluarea modificărilor biochimice,
hematologice şi histopatologice la şobolanii la care administrarea de
acrilamidă (intoxicaţie subacută) a fost asociată cu administrarea simultană
de seleniu (selenit de sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând
seleniu (Celnium) a evidenţiat intervenţia benefică a seleniului prin tendinţa
de normalizare a u unor parametri biochimici.
Răspunsul sistemelor antioxidative împotriva nivelurilor ridicate de
acrilamidă administrate la sobolani şi eventualul potential protector al
seleniului a fost evaluat în cadrul unui experiment în care s-a lucrat pe
şobolani albi Wistar. Ca parametri pentru cercetarea prezenţei perturbărilor
biochimice provocate de intoxicaţia cu acrilamidă şi evidenţierea rolului
seleniului ca antioxidant în normalizarea valorilor acestor parametri s-au
determinat: superoxid dismutaza (SOD), malondialdehida (MDA),
glutationul redus (GSH), glutathion peroxidaza (GPx) şi statusul total
antioxidant (TAS).
Administrarea acrilamidei (AA grup) a fost asociată cu o creştere
semnificativă statistic a nivelurilor MDA în omogenatele din ficat
comparate cu probele control. Mai mult, comparat cu probele control,
acrilamida a cauzat descreşterea glutation peroxidazei din ficatul omogenat
şi a statusului total antioxidant din sânge şi, respectiv, plasmă. Co
administrarea selenitului de sodium şi a Celnium-lui cu acrilamidă a fost
asociată cu creşteri semnificative ale parametrilor de stress oxidativ în
ficatul omogenat prin comparaţie cu probele de acrilamidă. Nivelul de
MDA din ficatul omogenat a crescut puţin în probele care au primit
acrilamidă, selenit de sodiu şi Celnium, ca agenţi hepatoprotectori.
Nivelurile de GPx au scăzut considerabil când au fost comparate cu
probele care au primit acrilamidă şi probele de control, sugerând că
acrilamida declanşează scăderea activităţii protectoare a antioxidanţilor din
celulă. Cea mai mare degradre a fost observată în lotul AA care conţin
numai acrilamidă sau cu o doză diferită de selenium.
Statusul total antioxidant prezintă o scădere semnificativă la lotul
AA în comparaţie cu Lotul Control. Aceste date sugerează că activitatea
scăzută a antioxidanţilor totali este o consecinţă a administrării acrilamidei.
63
Este surprinzător faptul că, deşi GSH a înregistrat o creştere în proba AA +
SE1, capacitatea antioxidantă (TAS) a scăzut. Concentraţiile MDA din
probele AA au sunt semnificativ mai mari decât probele control. În probele
ce conţin diferite concentraţii de selenium, valorile MDA evidenţiază
refacerea parţială a activităţii antioxidante a ţesutului hepatic al animalului.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
Allam A. A, El-Ghareeb A. W, Abdul-Hamid M., Bakery A. E, Gad
M., Sabri M., Arch Toxicol. 2010; 84(2):129-41.
Arthur J. R., Nicol F., Becket GT. Selenium deficiency, thyroid
hormone metabolism and thyroid hormone deiodinases. Am.J.
Clin. Nutr., 1993; 57: 5236-5239.
Barclay M.N.I., MacPherson A., Dixon J., Selenium content of a
range of UK foods. Journal of Food Composition and Analysis,
1995; 8(4): 307-318.
Brown K. M., Arthur J. R. Selenium, selenoproteins and human
health: a review, Public Health Nutr. 2001 Apr; 4(2B):593-9.
Canter P. H., Wider B., Ernst E., The antioxidant vitamins A, C,E
and selenium in the treatment of arthritis: a systematic review
of randomized clinical trials, Rheumatology, 2007; 46(8):
1223-1323.
Cuciureanu R., Elemente de Igiena alimentaţiei, Ed. „Gr. T. Popa”,
Iaşi, 2005;
Diplocke A. T. Antioxidant and free radical scavengers. In: Catherine
Rice-Evans and R H Burdon, "Free Radical Damage and its
Control", 1994; (4) 113-130. Elsevier, New York.
Environmental Health Criteria 58, Selenium, Geneva: World Health
Organisation, 1987. Eurola M, Hietaniemi V (ed.) Report of the
Selenium Monitoring Programme 1997-1999. Publications of
Agricultural Research centre of Finland, series B24, 2000
Jokoinen, Finland: Agricultural Research Centre of Finland.
Ferretti R. J., Levander O.A., Effect of Milling and Processing on the
selenium content of grains and cereal products, J. Agric. Food
Chem, 1974; 22(6), 1049-1051.
64
Foster H. D. Selenium and Health: Insights from the People's
Republic of China. Journal of Orthomolecular Medicine, 1989;
4(3): 123-135.
Gärtner R., Gasnier B. C. H., Dietrich J. W. Selenium
Supplementation in Patients with Autoimmune Thyroiditis
Decreases Thyroid Peroxidase Antibodies Concentrations. The
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2002;
87(4):1687–1691.
Ge K., Yang, G. The epidemiology of selenium deficiency in the
etiological study of endemic diseases in China. Am. J. Clin.
Nutr., 1993; Supplement 57: 259S-263S.
Hussein L., Bruggemann J. Selenium analysis of selected Egyptian
foods and estimated daily intakes among a population group.
Food Chemistry 65, 1999; 527 – 532.
Hussein M. M., Yousif A. A., Saeed A. M. Serum Levels of
Selenium, Zinc, Copper and Magnesium in Asthmatic Patients:
a Case Control Study, Sudan Journal of Medical Science,
2008; 3 (1): 45-49.
Khalil1 F. A., Abd El Aziem B. H. Effect of Dietary acrylamide
formed in otato crisps and toasted bread on rats, Egyptian
Journal of Natural Toxins, 2005; Vol. 2, 57-70.
Koishi R. Production of functional human selenocysteine-containing
KDRF/ thioredoxin reductase in E-coli. Journal of
Biochemistry, 2000; 127(6): 977-983.
Lăcătuşu R., Ghelase I. Seleniul în solurile zonelor hematurigene din
Carpaţii Orientali, Bul. Inf. ASAS, 1992; 22, 35-50.
Lăcătuşu R., Tripăduş I., Lungu M., Cârstea S., Kovacsovics B.,
Crăciun I., Selenium abundance in some soils of Dobrogea
(Romania) and ovine myodistrophy incidence, Trans. of
Macro- and Trace Elem. Symp., Jena, Germqany, 2002; 114-
119.
Lăcătuşu R., Lungu M., Aldea M., Lăcătuşu A-R, Stroe V.M., Lazăr
D., et al., Selenium in the rock – soil system from south/eastern
part of Romania present environment and sustainable
development, , 2010 (4): 145-157.
65
Lobanov A. V., Hatfield D. L., Gladyshev V. N. Reduced reliance on
the trace element selenium during evolution of mammals,
Genome Biol. 2008; 9(3):R62.
McCoy K. E. M., Weswig P. H. Some selenium responses in the rat
not related to vitamin E. Journal of Nutrition, 1969; 98: 383-
389.
Meuillet E., Stratton S., Cherukuri D. P. Chemoprevention of
prostate cancer with selenium: An update on current clinical
trials and preclinical findings. Journal of Cellular
Biochemistry, 2004; 91(3): 443–458.
Mézes M., Balogh K., Prooxidant mechanism of selenium toxicity- a
review, Acta Biologica Szegediensis, 2009; 53 (1): 15-18.
Moghadaszadeh B., Beggs AH. Selenoproteins and their impact on
human health through diverse physiological pathways.
Physiology, 2006; 21: 307-15
Mottram D. S., Wedzicha B. L., Dodson A. T. Acrylamide is formed
in the Maillard reaction, Nature, 2002; 419: 448-449.
National Research Council (U.S), Subcommittee on Selenium,
Selenium in Nutrition, Washington D.C.: National Academy
Press, 1983.
Negro R. Selenium and thyroid autoimmunity. Biologics: Targets &
Therapy, 2008; 2(2): 265-273.
Newairy A. A., El-Sharaky A. S., Badreldeen M. M., Eweda S. M.,
Sheweita S. A. The hepatoprotective effects of selenium
against cadmium toxicity in rats. Toxicology 2007; 242: 23-30.
Odland I., Romert L., Clemedson C., Walum E. Glutathione content,
glutathione transferase activity and lipid peroxidation in
acrylamide-treated neuroblastoma NIE 115 cells. Toxicol. In
Vitro, 1994; 8, 263-267.
Oldfield J. E. A brief history of selenium research: From alkali
disease to prostate cancer (from poison to prevention).
Reilly C., Selenium in food and Health, Blackie Academic and
Professionals, Londra, 1996.
Reilly C. The Nutritional Trace Metals. Oxford, Blackwell
Publishers, 2004.
66
Revanasiddappa H. D. Kumar T. N. A facile spectrophotometric
method for the determination of selenium, Anal. Sci., 2001; 17
(11):1309-12.
Salonen J., Alfthan G., Huttunen J. Association between serum
selenium and the risk of cancer. Am. J. Epidemiol.1982; 120:
342-349.
Shigeoka S., Takeda T., Hanaoka T. Characterization and
immunological properties of selenium-containing glutathione
peroxidase induced by selenite in Chlamydomonas reinhardtii,
Biochem. J., 1991; 275: 623–627.
Shiobara Y., Yoshida T., Suzuki K. T. Effects of dietary selenium
species on Se concentrations in hair, blood, and urine., Toxicol
Appl Pharmacol., 1998; 152(2): 309-314.
Sunde R. A. Molecular biology of selenoproteins. Annu Rev. Nutr.,
1990; 10: 451-474.
Swedish National Food Agency, Press release, (2002),
http://www.slv.se/engdefault.asp;
Tabatabaie T., Floyd R. A. Susceptibility of glutathione peroxidase
and glutathione reductase to oxidative damage and the
protective effect of spin trapping agents, Biochemistry and
Biophysics, 1994; 314: 112-119.
Tarp U., Overvad K., Thorling E.B. Selenium treatment in
rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatology, 1985; 14: 364–
368.
Thomas C. D. Assessment of requirements for selenium and
adequacy of selenium status, A review, Eur J Clin Nutr, 2004;
58, 391-402.
Thompson C. D., Chisholm A., McLachlan S. K., Campbell J. M.,
Brazil nuts: an effective way to improve selenium status. Am.
J. Clin. Nutr., 2008; 87: 379-384.
Virtamo J. E., Valkeila G., Alfthan S., Punsar J. K., Huttunen,
Karvonen M. J. Serum selenium and the risk of coronary heart
disease and stroke. Am. J. Epidemiol., 1985; 122: 276-282.
World Health Organization and Food and Agriculture Organization
of the United Nations, Vitamin and mineral requirement in
human nutrition, 2nd ed., 2004.
67
World Health Organization. Acrylamide in Food (Update), Weekly
Epidemiological Record, 2002; 77(30): 253-254.
Yousef M. I., El-Demerdash F. M. Acrylamide-induced oxidative
stress and biochemical perturbations in rats. Toxicology, 2006;
219(1-3):133-141.
Yousef M. I., El-Demerdash F. M. Acrylamide-induced oxidative
stress and biochemical perturbations in rats. Toxicology, 2005;
219 (1-3): 231-239.
Zhong L., Holmgren A. Essential Role of Selenium in the Catalytic
Activities of Mammalian Thioredoxin Reductase Revealed by
Characterization of Recombinant Enzymes with Selenocysteine
Mutations. Journal of Biological Chemistry, 2000; 275(24):
18121-18128.
ARTICOLE PUBLICATE DIN TEZA DE DOCTORAT
1. Vlad-Ioan Teodor, Magdalena Cuciureanu, Cristiana
Filip, Nina Zamosteanu, Rodica Cuciureanu - Protective effects of
selenium N-acrylamide toxicity in rat’s liver. Effects on the oxidative
stress, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi 2011;115(2): 612-618;
2. Vlad-Ioan Teodor, Magdalena Cuciureanu, Bogdan
Şlencu, Nina Zamosteanu, Rodica Cuciureanu - Potential protective
role of selenium in acrylamide intoxication. A biochemical study,
Studia Universitatis “Vasile Goldiş”, Seria Şiinţele Vieţii 2011; 21
(2): 163-168.
3. Vlad-Ioan Teodor, Irina Vârlan, Nina Zamosteanu, D.
Chelărescu, Magdalena Cuciureanu, Rodica Cuciureanu -
Potential
protective role of selenium dietary supplements in experimental
acrylamide intoxication, European Journal of Drug Metabolism and
Pharmacokinetics (14th Pan-Hellenic Pharmaceutical Congress, 9-11
May, 2009), in extenso în CD-ul Congresului.