Tomáš Erban a kol.
Hodnocení vlivu xenobiotik na včely v průběhu
ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a
genomické analýzy
CERTIFIKOVANÁ METODIKA
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i.
2016
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
Hodnocení vlivu xenobiotik na včely v průběhu
ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a
genomické analýzy
Tomáš Erban a kolektiv
Autorský tým:
Tomáš Erbanф,
Martin Kamlerƚ
Klára Šulcováф,Ѳ
Dalibor Titěraƚ
Marcela SeifrtováѠ
Kateřina RiddellováѠ
Jan Hubertф
Bronislava Hortováф
Taťána HalešováѠ
фVýzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Drnovská 507/73, Praha 6-Ruzyně, 161 06
ƚVýzkumný ústav včelařský, s. r. o., Máslovice-Dol 94, p. Libčice nad Vltavou, 525 66
ѠALS Czech Republic, s. r. o., Na Harfě 336/9, Praha 9-Vysočany, 190 00
ѲČeská zemědělská univerzita v Praze, Katedra ochrany rostlin, Kamýcká 129, Praha 6-Suchdol, 165 21
RNDr. Tomáš Erban, Ph.D, [email protected]; [email protected]
Oponenti:
Mgr. Hana Kubátová-Hiršová, Ph.D. – specialista POR, Sekce zemědělských vstupů, Odbor přípravků
na ochranu rostlin, Oddělení rizik a účinnosti POR, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Brno
Ing. Michal Bednář – aktivní včelař a bývalý pracovník ve výzkumu včel; přírodovědní analytik-
diagnostik, Pracoviště chromatografických metod, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Brno
Vydal:
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Praha, 2016
ISBN 978-80-7427-210-3
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
Financování:
Tato certifikovaná metodika je výsledkem projetu TA ČR č. TA04020267
s názvem „Minimalizace rizik spojených s dopadem výskytu chemických látek
v životním prostředí na užitečné organismy: Metodiky hodnocení znečištění
životního prostředí pesticidy zejména ve vztahu k opylovatelům, především včele
medonosné“ řešeného v období 2014–2017.
Určení pro využití v praxi:
Metodika je určena pro státní správu s využitím pro laboratoře zabývající se zdravím včel a
ekotoxikologií. Metodika bude po překladu do anglického jazyka využita také mezinárodními
organizacemi jako EEA (European Environment Agency; Evropská agentura pro životní prostředí),
EPA (United States Environmental Protection Agency; Agentura pro ochranu životního prostředí
USA) či EFSA (European Food Safety Authority; Evropský úřad pro bezpečnost potravin) řešícími
hodnocení rizik na včely a jiné opylovače. Předkládaná metodika má souvislosti s nařízeními komise
ES týkající se hodnocení a povolování přípravků na ochranu rostlin. Využití této metodiky je i pro
výrobce pesticidních látek a jiných agrochemikálií, kterým umožní exaktně vyloučit negativní vliv
pesticidních látek na včely.
Metodika má význam pro světovou včelařskou komunitu, neboť umožňuje exaktní hodnocení vlivu
xenobiotik na včelu medonosnou.
Certifikace:
Metodice bylo uděleno osvědčení MZe ČR č. 67510/2016-MZE-17221.
O uplatnění metodiky byla dne 07. 11. 2016 uzavřena smlouva č. TA04020267/Nmet1 podle podle
ustanovení § 1746 odst. 2 zákona č. 89/2012 Sb., občanský zákoník.
Oponentní posudky vypracovali Mgr. Hana Kubátová-Hiršová, Ph.D., a Ing. Michal Bednář.
Prohlášení:
Předkladatel metodiky prohlašuje, že zpracovaná metodika nezasahuje do práv jiných osob z průmyslového
nebo jiného duševního vlastnictví.
Poděkování: Autoři děkují včelmistru Ing. Peteru Kérimu za přípravu oddělků včel po dobu prováděných
experimentů souvisejících s touto metodikou. Za analýzu LC-MS/MS dat v proteomických studích
děkujeme Mgr. Karlu Harantovi. Poděkování dále patří Martinu Markovičovi, Mgr. Julii Chalupníkové,
Veronice Souralové a Ing. Janu Tylovi za technickou pomoc. V neposlední řadě děkuje autorský tým také
recenzentům metodiky za podnětné a cenné připomínky.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
Anotace
Včela medonosná je využívána jako jeden z klíčových modelových organismů pro hodnocení rizik
přípravků na ochranu rostlin na necílové organismy. V posledních letech je významná mezinárodní priorita
získat exaktní metody pro hodnocení rizik agrochemikálií a jiných xenobiotik na opylovače, zejména včelu
medonosnou, ale i čmeláky a samotářské včely. Tato metodika umožňuje kombinací proteomické,
metabolomické a genomické analýzy různých typů vzorků včel získaných z jednoho expozičního
experimentu prokázat exaktně negativní vliv xenobiotik včetně jejich metabolitů na vývoj včelího plodu,
dospělé dělnice, matky, či trubce a predikovat tak další osud včelí kolonie v případě kontaminace
xenobiotikem. Důležitým prvkem metodiky je umožnění hodnocení více faktorů v rámci jedné biologické
expozice ve včelstvu najednou. Klíčové typy vzorků v metodice představují stádia zavíčkovaná v buňce
plástu, která již nepřijímají potravu s případným xenobiotikem dodávaným larvám včelami krmičkami.
Právě na těchto vzorcích, ve kterých zároveň probíhá metamorfóza v dospělce jsou proteomickým přístupem
nejlépe kvantifikovatelné negativní vlivy reziduálního působení xenobiotik. V metodice lze včelu
medonosnou vnímat především jako modelový organismus, na kterém se demonstrují environmentální
rizika testovaných xenobiotik z komplexního pohledu. Ačkoliv se uvedený metodický postup týká pouze
včely medonosné, obdobné postupy lze s jistými modifikacemi aplikovat i na jiné opylovače zejména
z čeledi Apidae a případně i na jiné necílové organismy. Metodika je využitelná v oblastech státní správy,
v soukromých laboratořích i ve výzkumné činnosti při hodnocení environmentálních rizik xenobiotik na
necílové organismy. Aplikací metodického postupu lze do jisté míry vyloučit budoucí environmentální
rizika při registraci nových přípravků a tudíž má tato metodika potenciál být využívána při testování nových
látek určených na ochranu rostlin před jejich registrací.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
Title
Assessing influence of xenobiotics to honeybees during ontogenesis using proteomic, metabolomic and
genomic analysis
Annotation
Honeybee (Apis mellifera) is used as one of the key model species for the risk assessment of plant protection
products to non-target organisms. Currently, the priority international task is the development of methods
for the risk assessment of agrochemicals and other xenobiotics to pollinators particularly honeybees, and
bumblebees and solitary bees, too. This methodology combines proteomic, metabolomics and genomic
analysis of different kinds of samples obtained during the single exposure experiment and gives the evidence
of negative impact of xenobiotics and their metabolites to the development of all members of hive such as
honeybee brood, adult workers, queens and drones; thereby the future destiny of the honeybee colony can
be predicted. The major advantage of this methodology is the possibility to measure many factors during
the sole biological exposition of the hive to harmful compounds at once. The key sample type for the
quantification of detrimental residual effect of pesticides using proteomic approach is the honeybee
developmental stage capped in the cell but being no longer fed by nurse bees with xenobiotic-containing
diet just on the verge of metamorphosis of juvenile form into the adulthood stage. In the presented
methodology the complex environmental risk of xenobiotics is demonstrated using honeybee as a model
organism but it is applicable with some slight modifications to other pollinators from Apidae family or even
to other species of non-target organisms, therefore it is beneficial for government institutions, private
laboratories as well as further research organizations. The methodology can be then used for environmental
hazard of xenobiotics evaluation and examination as a constituent part of new plant protection products
registration procedure to better assess and prevent the future environmental risks.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
Obsah
1. Cíl ...................................................................................................................................................... - 1 -
2. Úvod .................................................................................................................................................. - 1 -
2.1 Kauzalita některých environmentálně nebezpečných pesticidů ................................................ - 1 -
2.2 Hodnocení vlivu pesticidů na necílové organismy .................................................................... - 4 -
2.2.1 Úskalí nových látek ........................................................................................................... - 4 -
2.2.2 Platná legislativa Evropské unie – Úřední věstník EU ...................................................... - 4 -
3. Vlastní popis metodiky ...................................................................................................................... - 5 -
3.1 Metodický postup ...................................................................................................................... - 8 -
3.1.1 Příprava včelstev ............................................................................................................... - 8 -
3.1.2 Průběh experimentu s xenobiotikem ................................................................................. - 9 -
3.1.3 Periodické dávkování xenobiotika a zaručení produkce plodu ....................................... - 10 -
3.1.4 Odběr vzorků ................................................................................................................... - 10 -
3.1.5 Laboratorní zpracování vzorků ........................................................................................ - 13 -
3.1.5.1 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro homogenizaci, proteomické a
metabolomické analýzy ................................................................................................................... - 13 -
3.1.5.2 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro analýzu mikrobiomu ....................... - 15 -
3.1.6 Typy analýz a informace, které nám analýza jednotlivých vzorků poskytne .................. - 16 -
4. Srovnání novosti postupů ................................................................................................................ - 21 -
5. Uplatnění metodiky ......................................................................................................................... - 22 -
6. Ekonomické zhodnocení metodiky ................................................................................................. - 22 -
7. Publikace, které předcházely metodice ........................................................................................... - 24 -
9. Schematické uspořádání metodického postupu ............................................................................... - 25 -
10. Seznam literatury ............................................................................................................................. - 26 -
11. Obrazová příloha ............................................................................................................................. - 33 -
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 1 -
1. Cíl
Cílem této metodiky bylo vyvinout metodický postup pro spolehlivou analýzu vlivu pesticidů a jiných
xenobiotik na včelu medonosnou (Apis mellifera). Cílem vyvinuté metodiky bylo také usnadnit přístup a
předložit exaktní hodnocení environmentálních rizik pesticidů a jiných xenobiotik na necílové organismy.
Důležitým prvkem při tvorbě metodiky bylo předložit takový postup, který umožní hodnotit více faktorů
v rámci jedné biologické expozice ve včelstvu najednou. Zvláštní pozornost byla věnována sledování vlivu
cizorodých látek na včely v průběhu metamorfózy pomocí proteomických metod. Metodický postup
využívá i kvantitativní analýzy metabolomických metod ke zjištění zastoupení sledované látky a jejích
vybraných metabolitů. Dále je v postupu využito metod sekvenace nové generace jako genomické metody
pro zjištění, zda má testované xenobiotikum vliv na mikrobiom úlových včel představující významnou
charakteristiku imunity včelstva. Uvedený metodický přístup je s modifikacemi aplikovatelný i na jiné
necílové organismy zejména z čeledi Apidae. Aplikace tohoto metodického postupu do praxe by měla vést
k objasnění, ale i předejití problemů se stávajícími nebo novými xenobiotiky. Tento metodický postup má
zvláštní využití při odhalení xenobiotik představující skryté nebezpečí pro životní prostředí. Prezentovaný
metodický postup povede k jednoznačnějšímu určení environmentálních rizik látek a jejich metabolitů a
bude tak eliminována kontroverznost výsledků z jiných, méně sofistikovaných postupů.
2. Úvod
Uvádí se, že pro optimální opylení více než 70 % plodin je zapotřebí hmyzu. V Evropě je zhruba 80 %
volně rostoucích rostlin odkázaných na opylování hmyzem a tyto rostliny navíc slouží jako potrava pro řadu
organismů. Opylení zpostředkované hmyzem má významný vliv na biodiverzitu přírody (COST 2013). Na
výskyt organismů a jejich diverzitu v prostředí má vliv lidská činnost a jedním z hlavních faktorů je
intenzifikace zemědělství, která je od 50. let 20. století spojena s užíváním řady pesticidních látek (Wheeler
2002). Používání pesticidních látek přináší na jednu stranu výhody, ale může přinášet a přináší i nevýhody
zejména v podobě environmentálních rizik, jako vlivu na necílové organismy včetně člověka.
2.1 Kauzalita některých environmentálně nebezpečných pesticidů
V této kapitole jsou uvedeny kauzality některých pesticidních přípravků, které byly po řadě studií
zahrnující různé experimentální přístupy zakázány, nebo jejichž používání bylo omezeno. Studie prováděné
v různý čas, různou instrumentací a různými vědeckými týmy nejsou zcela srovnatelné, a proto je velkou
výhodou možnost provedení více typů analýz z jednoho expozičního experimentu, jak umožňuje tato
metodika.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 2 -
Přes často dlouholetou enormní oblibu byly později některé z přípravků na ochranu rostlin pro jejich
environmentální a zdravotní rizika v řadě zemí zakázány, nebo se zvažuje regulace jejich používání.
V některých případech jsou skutečná rizika odhalena až po intenzivním studiu metabolismu látek, kdy
vzniklé metabolity mohou být nebezpečnější než původní látky mateřské. Exemplárním příkladem je
insekticid DDT, dnes klasifikovaný Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících
látkách jako jeden z perzistentních organických polutantů (UNEP 2001). Bylo zjištěno, že DDT funguje
jako endokrinní disruptor (Kelce et al. 1995; Sierra-Santoyo et al. 2000), je mu přisuzován negativní vliv
na reprodukci živočichů (Ware 1975; Ottoboni et al. 1977) a DDT je také skrze vliv na hormony přisuzován
podíl na rakovině prsu (Cohn et al. 2015). Ukázalo se, že nebezpečí nespočívá jen v samotné mateřské
molekule DDT, ale i v jejích metabolitech. Konkrétně bylo zjištěno, že p,p′-DDE, který je metabolitem
DDT, funguje jako antagonista androgenního receptoru (Kelce et al. 1995).
Další případ prokázaného negativního vlivu na živočichy a životní prostředí představují např.
chloracetanilidové herbicidy, z nichž alachlor a acetochlor jsou nyní zakázané v Evropské unii (EU) pro
teratogenní a karcinogenní účinek, a protože fungují jako endokrinní disruptory (Ashby et al. 1996; Heydens
et al. 1999; Crump et al. 2002; Li et al. 2009). Podobně jako v případě DDT i případ acetochloru dokládá,
že mateřská látka nemusí být tak nebezpečná, jako její metabolity. Bylo totiž prokázáno, že mnohakrokovou
přeměnou vzniká v mikrosomech u lidí a potkanů DNA-reaktivní, karcinogenní, metabolit 2-methyl-6-
ethylbenzoquinon imin (Jefferies et al. 1998; Coleman et al. 2000).
V současnosti je vzhledem k environmentálním a zdravotním rizikům prověřován širokospektrý
herbicid glyfosát, který si získal enormní popularitu nejen u profesionálních zemědělců, ale i u běžných
spotřebitelů. Několik let od svého uvedení na trh, což bylo v roce 1974 (Franz et al. 1997), se stal glyfosát
celosvětově nejužívanějším herbicidem (Duke & Powles 2008). Ačkoliv mechanismus účinku glyfosátu na
rostliny je skrze šikimátovou metabolickou dráhu, která není známa u živočichů (Amrhein et al. 1980),
pozdější výsledky vědeckého bádání značily, že glyfosát má na živočichy neblahý vliv. Například byl
prokázán negativní vliv glyfosátu na navigaci (Balbuena et al. 2015) a potravní chování (Herbert et al. 2014)
včel, vývoj sladkovodního plže Pseudosuccinea columella (Tate et al. 1997), žížaly Aporrectoden caliginom
(Springett & Gray 1992) nebo mšice Metopolophium dirhodum (Saska et al. 2016). Na druhou stranu ve
studii Thompson et al. (2014) nebyl pozorován vliv glyfosátu na vývoj včelího plodu a ve studii Lindsay &
French (2004) byl kontroversně popřen vliv aplikace glyfosátu na abundanci nebo složení komunity
necílových půdních bezobratlých organismů (Lindsay & French 2004). Několik studií na myších a
potkanech indikovalo karcinogenní potenciál glyfosátu (např. George et al. 2010; Séralini et al. 2012, 2014;
George & Shukla 2013). Hlavní metabolit glyfosátu AMPA navíc zřejmě přispívá ke genotoxickému
potenciálu glyfosátu, jak bylo ukázáno na rybě Anguilla anguilla (Guilherme et al. 2014) nebo myších
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 3 -
(Mañas et al. 2009). Nicméně Li et al. (2013) ve své práci kuriózně zjistili inhibici růstu rakovinových buněk
působením glyfosátu a AMPA, indikovali tak inhibici proliferace a podpoření apoptózy, čímž látky glyfosát
a AMPA mohou principielně fungovat jako protirakovinné látky (Li et al. 2013). Uvádíme však, že zmíněný
vliv na proliferaci a apoptózu značí pravděpodobný vliv na vývoj. Jedno je jisté, ať už má glyfosát
karcinogenní nebo kuriozně protikarcinogenní potenciál, je evidentní jeho vliv na živočišný metabolismus,
což nebylo v době jeho povolení k uvedení na trh vzhledem k cílení účinku na šikimátovou cestu rostlin
předpokládáno. Glyfosát byl Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC; anglicky International
Agency for Research on Cancer) nyní zařazen mezi látky s endokrinně disruptivními vlastnostmi (IARC
2016) a zákaz či omezení jeho užívání se zvažuje nejen pro běžné spotřebitele, ale v budoucnu i pro
profesionální zemědělce.
Vzhledem k opylovačům jsou v posledních letech velmi intenzivně skloňovány neonikotinové
insekticidy. Výhoda těchto pesticidů je v jejich systémovém použití, díky němuž chrání rostliny proti
bezobratlým, hlavně hmyzím, škůdcům nepřetržitě (Elbert et al. 1991). Používání této skupiny pesticidů se
však dostalo do problémů pro jejich velmi vysokou toxicitu vzhledem k opylovačům. Samotná výhoda
systémového účinku neonikotinoidů se navíc otočila proti této skupině látek a to z důvodu, že se dostávají
nejen z rostlin, ale později i z kontaminované půdy opět skrze rostliny do nektaru a pylu, čímž negativně
ovlivňují opylovače (Rortais et al. 2005; Halm et al. 2006; Krischik et al. 2007; Aliouane et al. 2009; Dively
& Kamel 2012). Evropská komise (EK) kvůli environmentálním rizikům a vzhledem ke vědecké zprávě
Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA; anglicky European Food Safety Authority) (EFSA
2013b) omezila používání třech neonikotinoidů (imidaklopridu, klothianidinu a thiamethoxamu) po dobu
dvou let od 1. prosince 2013 (EK 2013). Poté, co EFSA prověřila nebezpečí pro včely, přibyl k těmto třem
neonikotinoidům také fipronil (EFSA 2013a). Podobně jako v případech dříve uvedených pesticidů bylo i
v případě neonikotinoidů zjištěno, že nebezpečí nespočívá pouze v mateřské látce, ale také v metabolitech.
Nejnebezpečnějším neonikotinoidem je, zdá se imidacloprid, který je nejtoxičtější ze všech těchto látek
(Blacquière et al. 2012; Seifrtova et al. 2016). Zřejmě vlivem různé detoxikační kapacity se akutní LD50
imidaklopridu na včely může pohybovat v rozmezí 5 až 500 ng na včelu (Suchail et al. 2001b). Navíc bylo
ukázáno, že imidacloprid má vůči včelám vyšší toxicitu po orálním, než po kontaktním podání (Suchail et
al. 2000, 2001b). V případě imidaklopridu bylo zjištěno, že jeden z jeho metabolitů, imidaklorpid-olefin je
až desetkrát toxičtější vůči hmyzu než imidakloprid (Nauen et al. 1998, 1999; Suchail et al. 2001c). Navíc
bylo zjištěno, že imidakloprid-olefin vznikající v rostlinách (Seifrtova et al. 2016) je jeden z metabolitů,
který poměrně rychle vzniká také ve včelách (Suchail et al. 2001a, 2004a, b). Nutno podotknout, že i další
metabolity imidaklopridu ukázaly vůči včelám toxický efekt, i když byl nižší než v případě imidacloprid-
olefinu (Suchail et al. 2001b). A konečně v případě imidaclopridu byly pozorovány neobvyklé toxické
efekty v závislosti na dávce (Suchail et al. 2001b).
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 4 -
Existují další v současnosti environmentálně nepřijatelné nebo těžko přijatelné pesticidy, kupř.
atraziny či organofosfáty. Navíc obdobná environmentální rizika představují nebo mohou představovat
vedle pesticidů i jiná xenobiotika.
2.2 Hodnocení vlivu pesticidů na necílové organismy
2.2.1 Úskalí nových látek
Z příkladů uvedených v předchozí kapitole je patrno, že ačkoliv se může účinná látka přípravku na
ochranu rostlin při uvádění na trh jevit jako relativně nebo málo nebezpečná pro životní prostředí, necílové
organismy, či dokonce člověka a její (unikátní) mechanismus účinku je vítán nejprve s nadšením, další
studium osudu této látky a vznik potenciálně nebezpečných metabolitů však může prokázat opak. Je velmi
důležité zvažovat vliv pesticidních látek nejen na cílové, ale i na necílové organismy. Správné kritické
hodnocení environmentálních rizik je samozřejmě lepší provést před uvedením účinné látky na trh, než
později zkoumat a srovnávat příčiny již nastalého negativního vlivu na životní prostředí, na necílové
organismy, popřípadě člověka. Je zřejmé, že takové toxikologické studie jsou velmi náročné nejen na čas
ale i na finance. Pozdější prokázání nežádoucích účinků může také souviset s technologickým pokrokem a
aktuálním poznáním v dané oblasti. Jedno je jisté, že pokud jsou na trh uváděny farmaceutické přípravky,
musí projít velmi složitými mnohaletými klinickými testy. Ještě složitější je situace v případě pesticidních
látek, se kterými se člověk, ale i jiné organismy dostávají do kontaktu skrze rezidua v potravinách, vodě,
vzduchu či prachu. Hodnocení rizik v konkrétních organismech v přírodě, ve kterých by mohl daný
přípravek eventuelně způsobit vážnější škody není snadné, a proto je využíváno pro hodnocení rizik
modelových organismů. Každý pesticid anebo pesticidní přípravek (tj. pesticid ve formulaci) však před
uvedením na trh projde řadou testů vlivu na životní prostředí i člověka, přičemž je zvažována i smysluplnost
jeho použití. Legislativně je určeno maximální povolené množství konkrétních pesticidů v potravinách.
Avšak jak historie i přítomnost ukazují, negativní vedlejší vliv látek je zjištěn většinou až po mnoha letech.
Látky jsou již často v prostoru a trvá někdy až dekády, než se životní prostředí přirozeně detoxikuje.
2.2.2 Platná legislativa Evropské unie – Úřední věstník EU
V úředním věstníku EU v nařízení komise EU č. 546/2011 (EK 2011c) se praví, že existují jednotné
zásady pro hodnocení a povolování přípravků na ochranu rostlin. Podle nařízení Evropského parlamentu a
Rady (ES) č. 1107/2009 (EP & Rada ES 2009) musí jednotné zásady pro hodnocení a povolování přípravků
na ochranu rostlin zahrnovat požadavky podle přílohy VI směrnice 91/414/EHS ze dne 15. července 1991
o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh (Rada EHS 1991). Jednotné zásady pro hodnocení a
povolování přípravků na ochranu rostlin podle čl. 29 odst. 6 nařízení (ES) č. 1107/2009 platné od 14. 6.
2011 jsou stanoveny v příloze tohoto nařízení (EP & Rada ES 2009). Ve zkratce lze říci, že se hodnotí:
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 5 -
i) účinnost
ii) absence nepřijatelných účinků na rostliny nebo rostlinné produkty
iii) dopad na zdraví lidí nebo zvířat zahrnující dopad na zdraví lidí nebo zvířat plynoucí z
přípravku na ochranu rostlin a dopad na zdraví lidí nebo zvířat plynoucí z reziduí
iv) vliv na životní prostředí zahrnující osud (relevantní metabolity, produkty odbourávání, reakční
produkty) a distribuci (biokoncentrace účinné látky a případných metabolitů) v životním
prostředí včetně dopadu na necílové druhy, přičemž se dle nařízení komise (EU) č. 546/2011
(EK 2011c) bere při hodnocení v úvahu především toxicita pro nejcitlivější relevantní
testovaný organismus
v) analytické metody navržené pro účely kontroly a sledování po registraci
vi) fyzikální a chemické vlastnosti přípravku zahrnující např. stabilitu a obsah účinné látky
Z hlediska tematického zaměření této metodiky je nejpodstatnější oblast hodnocení vlivu pesticidních
látek na necílové druhy, konkrétně včelu medonosnou. Celkově se při hodnocení přihlíží ke všem
relevantním informacím o přípravku na ochranu rostlin podle přílohy nařízení (EU) č. 545/2011 (EK
2011b). Také se přihlíží ke specifickým informacím, které se týkají toxikologických studií na různé
organismy podle přílohy nařízení (EU) č. 544/2011 (EK 2011a) a výsledkům jejich hodnocení. Při
navržených podmínkách použití se hodnotí možnost expozice a pokud tato možnost existuje, hodnotí
se rozsah krátkodobého i dlouhodobého rizika pro ptáky a ostatní suchozemské obratlovce, vodní
organismy, včelu medonosnou a jiné necílové členovce, žížaly a další necílové půdní makroorganismy,
necílové rostliny a mikrobiální aktivitu půdy. Pro některé organismy, zvláště ptáky a suchozemské
obratlovce, ryby, vodní bezobratlé a žížaly je hodnoceno riziko pro reprodukci, případně chování či
vývoj a reprodukci.
3. Vlastní popis metodiky
Vlastní metodika se týká inovativního metodického přístupu pro zjištění vlivu pesticidních látek
(účinných látek včetně metabolitů) na plod včel zejména v průběhu metamorfózy, ale i v dospělci pomocí
proteomických metod, přičemž jsou pro tvorbu doprovodných výsledků využity metabolomické a
genomické analýzy. V metodice lze včelu medonosnou vnímat především jako modelový organismus, na
kterém se demonstrují environmentální rizika testovaných xenobiotik z komplexního pohledu.
Včely jsou ještě více než svými produkty významné opylováním, neboť touto činností zvyšují
produkci komerčních plodin a přispívají k diverzitě rostlin. Zdraví včel je díky tomu celosvětově
významným problémem, přičemž jsou každoročně řešeny úhyny včelstev, které mohou mít různé příčiny.
Včely jsou vystaveny mnoha vlivům, které mají negativní vliv na jejich zdraví. Celkem bylo rozpoznáno 61
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 6 -
faktorů ovlivňujících zdraví včely medonosné a přispívajících ke kolapsu včelstev (CCD; anglicky Colony
Collapse Disorder) (vanEngelsdorp et al. 2009). Jeden z hlavních faktorů ovlivňujících zdraví včely
medonosné je environmentální zatížení množstvím pesticidů, jejich metabolitů a jinými xenobiotiky,
zejména agrochemikáliemi. Tyto látky ovlivňují zdraví včel buď přímo z fyziologického hlediska, nebo i
nepřímo zvýšeným výskytem patogenů (vanEngelsdorp et al. 2009; Pettis et al. 2013). Výskyt pesticidů a
jejich metabolitů v prostředí však má vliv také na další opylovače, konkrétně čmeláky či samotářské včely
(Whitehorn et al. 2012; Sandrock et al. 2014; Moffat et al. 2015). Analýzy působení těchto xenobiotik na
opylovače se v současné době provádí mezinárodně uznávanými metodami. Vliv pesticidů na včely se
sleduje pomocí laboratorních a klíckových testů, pokusů v polních podmínkách a tunelových testů. Další
metody pak zahrnují také inhalační testy či dlouhodobou expozici (EPPO 1992).
Každý přípravek na ochranu rostlin musí před uvedením na trh v členské zemi EU projít
schvalovacím procesem dle Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA; anglicky European Food
Safety Authority) (EFSA 2013c). Při tomto procesu se hodnotí akutní orální a kontaktní toxicita daného
xenobiotika na dospělce a také chronická toxicita tohoto xenobiotika na dospělce a na larvy. Kromě toho
dokument EFSA také doporučuje testování vlivu pesticidů na hltanové žlázy včel. Ve Spojených
státech (USA) se pak dle nově navržené metodiky provádí hodnocení především u včely medonosné, ale
jsou známé i postupy používané při testování jiných opylovačů, přičemž se hodnotí akutní a chronická orální
a kontaktní toxicita a také vliv daného pesticidu obsaženého v potravě na larvy (US EPA et al. 2012, 2014).
Některé vědecké práce pak také poukazují na nepříznivý vliv pesticidů na včelí matky a kladení vajíček
(Williams et al. 2015). Klasické sledování toxicity však podléhá značnému rozptylu v závislosti na
detoxifikační kapacitě včelstev (Suchail et al. 2001b). Kromě výše popsaných metod je možné k hodnocení
vlivu pesticidů na včely využít také sledování srdeční aktivity (Papaefthimiou et al. 2013), případně i další
faktory, jako např. životaschopnost spermií (Chaimanee et al. 2016; Pettis et al. 2016). Dále se u dospělých
včel (1 a 7 dní po vylíhnutí) pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) sledují změny
v expresi vybraných genů jako ribosomal protein S5, cytochrome P450 (306A1, 4G11, 6AS14) catalase,
superoxide dismutase, hymenoptaecin, hexamerin 70b, apidaecin type 22, NimC1 easter-like, thireodoxin
peroxidase1, leucine-rich repeat-containing protein 16A-like, vitellogenin, nebo také výskyt včelího
patogena viru deformovaných křídel (Chaimanee et al. 2016).
V případech úhynu včel se provádí identifikace pesticidů ve včelách, pylu anebo medu pomocí
analýzy instrumentací LC-MS/MS. Tento přístup je využitelný zejména pro monitoring reziduí pesticidů ve
včelách (Kasiotis et al. 2014). Kromě toho však lze pro detekci patogenů v uhynulých včelách použít také
proteomickou analýzu také za použití LC-MS/MS (Bromenshenk et al. 2010), ačkoliv tato citovaná studie
obsahovala chybné proteomické vyhodnocení (Foster 2011). Proteomické analýzy využívající
instrumentace LC-MS/MS nebo dvourozměrné elektroforézy v kombinaci s detekcí hmotnostní
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 7 -
spektrometrií MS/MS se používají také pro analýzu patogenních virů a proteinů pocházejících ze včel
v parazitickém roztoči Varroa destructor (Erban et al. 2015).
Vysokokapacitní LC-MS/MS (shotgun) proteomická analýza dokáže poskytnout až tisíce
identifikovaných proteinů, avšak pro vyhodnocení takové analýzy je zapotřebí proteinové databáze
vycházející většinou z celých anotovaných genomů organismů – pokud jsou však anotované genomy
k dispozici. Alternativně je možno při vyhodnocování využít databáze na úrovni RNA, kterou poskytuje
transkriptom organismu (Erban et al. 2017). Ačkoliv je vyhodnocování proteomických dat na základě
transkriptomické databáze dosti náročné na čas a intelekt, v některých případech se vyplatí, neboť poskytuje
ještě vyšší úroveň výsledků, než klasické vyhodnocení z DNA genomové databáze (Erban et al. 2017).
Databáze pro vyhodnocování proteomických dat bývají dosti obsáhlé, u eukaryotických organismů obsahují
řádově desetitisíce záznamů (např. konkrétně pro Apis mellifera bylo k datu 17. 9. 2016 v proteinové
databázi NCBInr 28799 záznamů), a proto je následné vyhodnocení časově poměrně náročné a interpretace
výsledků není jednoduchá. Určité zjednodušení vyhodnocení umožňuje cílená analýza, kdy jsou sledovány
nebo vyhodnocovány pouze vybrané proteinové markery, u nichž je předpoklad kvantitativních změn
v xenobiotiky stresovaných jedincích oproti kontrolním nebo jinak stresovaným jedincům. Takové
proteinové markery, u nichž je předpoklad kvantitativních změn, pak tvoří jednodušší databázi pro metodu
monitorování vybraných reakcí (SRM, anglicky selected reaction monitoring nebo MRM, anglicky multiple
reaction monitoring). SRM nabízí oproti klasické shotgun LC-MS/MS proteomické analýze vyšší citlivost
a selektivitu v komplexních vzorcích (Doerr 2011, 2013; Boja & Rodriguez 2012). Vhodné markery pro
cílenou proteomickou analýzu metamorfujícího plodu včel jsou uvedeny v patentové přihlášce PV 2016-
654 (Erban et al. 2016a).
Pro sledování metamorfózy včel v dospělce zahrnující fyziologické změny jsou nejvhodnější stádia
mladuška (právě vylíhlá včela) a kukla ve stádiu červené oči, a to pro jednotnost těchto stádií v proteinové
skladbě a snadnému rozpoznání těchto stádií v čase (Erban et al. 2014, 2016b). Předložená metodika
využívá těchto stádií, tedy právě se líhnoucí včelí dělnice (mladušky) a kukly ve stádiu červené oči jako
klíčových vzorků pro odhalení negativního vlivu xenobiotik včetně pesticidů na plod. Tyto vzorky v době
odběru vzorků již nepřijímají potravu a byly de facto kontaminovány z prostředí úlu skrze potravu včelami
krmičkami a xenobiotikum se v takových vzorcích vyskytuje pouze reziduálně. Nedetekování xenobiotika
v takovýchto vzorcích nutně neznamená, že vzorek není na molekulární úrovni ovlivněn. Ve vzorcích, které
jsou analyzované na zmíněné změny v expresi proteinů odhalující defekty ve vývoji, je taktéž ověřován
obsah sledovaných látek včetně metabolitů. Dále je pro přesné určení koloběhu látek v úlu, které mohou mít
na vývoj plodu skrze potravu vliv, prováděno testování úlových včel na obsah sledovaných látek a také
ověřování dalších případných cizorodých látek, které by mohly mít na testování skrytý vliv. Vzorky úlových
včel buď celí jedinci nebo jejich části jako hlavy, mozky, tykadla, hltanové žlázy, střeva či části střev, jsou
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 8 -
dle metodiky využívány pro sledování vlivu testovaných látek na včelstvo. Konkrétně analýzou tykadel na
zastoupení proteinů je možné zjistit vliv testované látky na orientaci včel, analýzou včelích hlav či dokonce
vypreparovaných mozků je možno sledovat cíleně vliv na nervovou funkci, analýzou trávicího traktu/střev
či jeho jednotlivých částí je možno zjistit vliv na trávicí funkci, ale také na produkci proteinů ze symbiontů,
analýzou hltanových žláz je možno sledovat změny expresi proteinů v tomto kompartmentu. Obecně nám
analýzy poskytnou také informaci o detoxikaci xenobiotik skrze změny v expresi detoxikačních enzymů a
přítomnost metabolitů. Jako základní parametr toxicity xenobiotika v dané dávce nám poslouží údaj o počtu
uhynulých včel v izolátoru, zároveň je z takového vzorku vhodné zjišťovat perzistenci xenobiotika a
případných metabolitů. A konečně jsou úlové včely dle této metodiky vyšetřovány na složení symbiotických
bakterií, čímž je získána informace o vlivu testovaných látek na symbiotické organismy včel představující
významnou složku imunity včelstva. Jako další možnost se naskýtá odběr matek, které mohou být
analyzovány na změny v expresi proteinů obdobně jako vzorky kukel, mladušek či úlových včel, je však
zapotřebí mít v paměti, že odběrem matek se vzdáváme dalšího odběru vzorků a pokračování
v experimentu, např. sledování, zda konkrétním xenobiotikem kontaminované úly přežijí zimu.
V následujícím textu je podrobně a v bodech uveden postup přípravy a odběr vzorků, účel daných vzorků
pro analýzy a také jsou uvedeny metody, kterými jsou dané vzorky pro daný účel analyzovány. Celkový
metodický postup je pro přehlednost zobrazen ve schématickém uspořádání, viz Obr. 1. Je nezbytné uvést,
že analytické postupy včetně instrumentace se mohou mezi jednotlivými laboratořemi značně lišit, ačkoliv
získaný výsledek je obdobný. Pro účely této metodiky uvádíme odkazy na typické používané postupy, které
využívá vědecká komunita.
3.1 Metodický postup
3.1.1 Příprava včelstev
1. Pro testování vlivu xenobiotik na včelstvo připravíme dostatečný počet oddělků zahrnující jak
kontrolní, tak testované varianty.
POZN.: Je nezbytné, aby matky testovaných včelstev v rámci jednoho experimentu byly sestry.
2. Včelstva o obdobném počtu jedinců, ideálně o síle cca 5000 jedinců jsou umístěna do izolátorů se
síťovinovou kapucí (Obr. 2A,B).
3. Včelstva jsou po dobu 1 měsíce krmena cukerným roztokem cukr/voda 1:1 (Obr. 2C).
4. Pro zajištění kontinuální produkce plodu je včelstvům po dobu držení v izolátorech dodáván
mražený rozemletý rouskovaný pyl.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 9 -
3.1.2 Průběh experimentu s xenobiotikem
5. Experiment začíná aplikací testované látky do cukerného roztoku, anebo v případě kontroly je
použit čistý cukerný roztok.
6. Koncentrace aplikované látky se řídí dvěma základními pravidly:
a) vychází ze známých hodnot chronického a akutního účinku, přičemž je upřednostňována
dávka chronického účinku
b) je určen realistický výskyt pesticidu ve včelstvu při dodržení maximální povolené polní
dávky
c) celková dávka xenobiotika aplikovaná do včelstva je rozpočítána na celkový počet jedinců
d) zohledňujeme rozpustnost účinné látky ve vodě, přičemž u přípravků může být tato
vlastnost odlišná
Jako příklad dávkování xenobiotik do včelstva lze uvést testování následujících látek ze známých
faktů, při kterých však zohledňujeme, že podstatná část zásob je ukládána a včelstvo pracuje
také se zásobami z předešlého období:
(i) Imidakloprid: orální LD50 pro imidacloprid se dle literatury pohybuje v rozmezí
3,7–40 ng na včelu, pro testování volíme pravidelnou kalkulovanou dávku o
koncentraci 5 ng na včelu.
(ii) Deltamethrin: orální LD50 pro deltamethrin se dle literatury pohybuje v rozmezí 50–
79 ng na včelu a podle jiného zdroje 280 ng na včelu – pro testování volíme dávku
na spodní hranici tohoto rozsahu, a v pravidelných dávkách je včelstvu dodáváno
v cukerném roztoku 50 ng deltamethrinu na včelu.
(iii) Kresoxim-methyl: orální LD50 se uvádí v hodnotě 14 μg na včelu – takováto dávka
na včelu by byla příliš veliká, a proto pro testování volíme maximální pravidelnou
dávku 5 μg na včelu, takováto dávka zároveň představuje dle našeho doporučení
maximální doporučenou dávku pro jakýkoliv pesticid v obdobném experimentu.
7. Všechny přípravky na ochranu rostlin nebo čisté účinné látky se ředí do vodného roztoku pro
vyloučení vlivu rozpouštědel v experimentu a posléze se dávkují do cukerného vodného roztoku.
Pro pravidelné dávky je připraven zásobní roztok s přesně definovanou koncentrací xenobiotika,
ten se pak v menších dávkách zamrazí, a to v objemech potřebných pro jednotlivé aplikace, např.
připravíme 20 x 10 ml dávky, pokud každá jednotlivá dávka obsahujícící požadovaný obsah aktivní
látky je 10 ml a menší (např. 7,8 ml obsahuje 5μg kresoxim-methylu = 1 dávka). Pokud aplikovaná
látka tvoří v zásobním roztoku suspenzi, tak před aplikací zásobní roztok řádně protřepeme a do
cukerného roztoku pipetujeme po rozvíření pipetou se špičkou.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 10 -
3.1.3 Periodické dávkování xenobiotika a zaručení produkce plodu
1. Experiment začíná první dávkou xenobiotika v cukerném roztoku.
2. Cukerný roztok obsahující definovanou dávku xenobiotika nebo kontrolní cukerný roztok jsou
aplikovány do včelstva v intervalu 3x až 4x týdně minimálně po dobu čtyř týdnů, kdy je zahájen
první odběr plodu.
POZN.: Jednotlivé dávkování xenobiotik (ať už analytických standardů nebo ve formulaci) do
včelstev probíhá ideálně z předem připravených dávek, které jsou před samotným použitím
převedeny do vodného roztoku a zmraženy. Z těchto vodných roztoků (výjimečně suspenzí) je
xenobiotikum dávkováno do cukerného roztoku, kterým je pak včelstvo v experimentu krmeno.
POZN.: Je důležité chránit cukerný roztok před slunečním zářením (Obr. 2D).
3. Spotřebovaný cukerný roztok mezi jednotlivými dávkami pro každé včelstvo je zaznamenáván.
4. Je kontrolován obsah pylu ve včelstvech pro zachování plodování a v případě potřeby je pyl doplněn
formou mraženého rozemletého rouskovaného pylu.
3.1.4 Odběr vzorků
Ideálně 4 týdny po zahájení experimentu jsou odebírány vzorky včel, které poskytnou potřebné
informace. Pro získání odpovědi na konkrétní otázky je možno odebírat pouze některé typy vzorků, ale
také všechny uvedené typy vzorků pro získání uceleného komplexního obrazu o vlivu xenobiotika na
včelstvo. Metodický způsob žádným způsobem ještě další rozšíření o typy vzorků neomezuje.
Potřebné vybavení:
Pinzety pro odběr vzorků – vyšší počet pinzet (např. 10) usnadňuje, urychluje odběr vzorků.
Čistý etanol a kahan nebo zapalovač – pro sterilizaci pinzet.
Dřevěná párátka – pro otevírání buněk plástu.
Vzorkovnice typu Eppendorf – pro odběr jednotlivých včel a případně odběr částí včel.
Vzorkovnice cca 50 ml – pro odběr většího počtu včel.
Pořadač na vzorky – pro přehledné uchovávání vzorků.
Tužka a předpřipravený formulář – pro evidenci odběru vzorků.
Nesmyvatelné fixy – pro popis vzorkovnic.
Jednorázové rukavice – pro minimalizaci kontaminace materiálu.
Polyetylenové sáčky ideálně 30 x 40 cm – pro odběr úlových včel.
Polystyrenové krabice se suchým ledem – pro usmrcení, uchovávání a převoz vzorků.
Jemné chirurgické nůžky – pro disekci vzorků.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 11 -
Ochranné včelařské pomůcky.
Klíčové vzorky a jejich odběr:
1. Kukla ve stádiu červené oči: Je vyhledán plodový plást. Z plodového plástu jsou oklepem
odstraněny včely zpět do včelstva, pokud nejsou tyto vzorky také odebírány na analýzy. Plodový
plást je umístěn na podložku v šikmé poloze a je proveden průzkum plodu na výskyt požadovaných
vzorků, tj. kukel ve stádiu červené oči (Obr. 3). Víčko buňky je odstraněno nejlépe krouživým
pohybem ostřejším předmětem, např. párátkem. Kukla se správnou pigmentací očí je vyjmuta
sterilní pinzetou a umístěna do předem popsané sterilní vzorkovnice, typicky zkumavky typu
Eppendorf, a vzorek je umístěn na suchý led, čímž je biologický materiál usmrcen a zároveň
zamražen.
Pokud analyzujeme změny v expresi proteinů na úrovni jedince, odebereme alespoň 12 jedinců
z každého včelstva a v následné analýze použijeme minimálně 6 jedinců a zbylých 6 jedinců
uchováme pro případ potřeby opakování analýzy experimentu.
Pokud analyzujeme rezidua xenobiotik a z téhož biologického vzorku, analyzujeme také změny
v expresi proteinů, odebereme minimálně 3 x 12 jedinců z každého včelstva.
POZN.: Při odběru vzorků je velmi důležité dbát na to, aby vzorky vykazovaly identický stupeň
pigmentace očí, aby byl co nejvíce eliminován vliv stupně vývoje na výsledek následujících analýz.
POZN.: Jako pomocné vodítko při odběru vzorků lze sledovat kromě pigmentace očí i pigmentaci
ocelli, ty by měly vykazovat minimální stupeň pigmentace.
2. Mladuška – líhnoucí se včelí dělnice: Je vyhledán plodový plást, ze kterého jsou oklepem
odstraněny včely, pokud je pozorováno, že se mladuška prokousává víčkem nebo opuští buňku
(Obr. 4), je takovýto jedinec opatrně sterilní pinzetou odebrán do předem popsané sterilní
vzorkovnice, typicky zkumavky typu Eppendorf, a vzorek je umístěn na suchý led, čímž je
biologický materiál usmrcen a zároveň zamražen.
Pokud analyzujeme změny v expresi proteinů na úrovni jedince, odebereme alespoň 12 jedinců
z každého včelstva a v následné analýze použijeme minimálně 6 jedinců a zbylých 6 jedinců
uchováme pro případ potřeby opakování experimentu.
Pokud analyzujeme rezidua xenobiotik a z téhož biologického vzorku, analyzujeme také změny
v expresi proteinů, odebereme minimálně 3 x 12 jedinců z každého včelstva.
POZN.: Mladušku je nezbytné odebrat před tím, než jí jiná včela poskytne potravu nebo než se
sama nakrmí z prostředí úlu. Proto je ideální odebrat mladušku, která se právě prokousává skrze
víčko, takové mladušce je možno pomoci tak, že se odhalí víčko například párátkem.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 12 -
POZN.: Plodový plást pro odběry vzorků by neměl zůstat mimo včelstvo déle než 20 minut, aby
bylo eliminováno poškození plodu pro další odběry. Proto před dalším odběrem umístíme plást zpět
do úlu a průzkum pro další odběr vzorků opakujeme s časovým odstupem v řádu desítek minut a
více.
3. Včely z plodového plástu: Z plodového plástu jsou do připraveného plastového pytle sklepnuty
včely (Obr. 5). Pytel je poté umístěn na suchý led, čímž jsou jedinci usmrceni a zároveň zamraženi.
Rozebírání vzorků dle plánovaných analýz probíhá později v laboratoři na suchém ledu. Počet
odebraných včel se odvíjí od potřeb konkrétní analýzy. Pro potřeby metodického postupu, kdy
analyzujeme mikrobiom včel a obsah xenobiotika v nich, je zapotřebí 6 x 30 jedinců, tj. celkem 180
jedinců. Pro analýzu vlivu xenobiotika na proteiny v tykadlech je zapotřebí 3 x 100 včel, po ustřižení
tykadel z jedinců je tedy získáno 3 x 200 tykadel. V případě analýzy vlivu xenobiotika na proteiny
v hlavách úlových včel se použije 3 x 30 hlav, které v ideálním případě tvoří pozůstatek po odběru
tykadel.
V případě vyšetřování vlivu xenobiotika na proteiny v trávicím traktu a případné interagující
proteiny ze symbiontů odebereme minimálně 5 x 10 střev nebo jejich jednotlivých částí na každé
včelstvo. Tento typ vzorků je nezbytné odebrat z ještě živých včel, a proto odběr probíhá
bezprostředně po nasbírání včel. Odběr střev provedeme tak, že zafixujeme včelu v oblasti hrudi a
pinzetou uchopíme poslední článek zadečku a pomalu vytáhneme trávicí trakt, poté ostrými
nůžkami odstřihneme potřebnou část střeva, např. žaludek, a vzorek umístíme do zkumavky typu
Eppendorf v suchém ledu. Do každé vzorkovnice odebereme po 10 kusech střev nebo jejich
jednotlivých částí.
POZN.: Při odběru včel, tedy sklepávání z plástu je velmi důležité vyvarovat se kontaminace
biologických vzorků zásobami. Zásobami kontaminovaný vzorek by zkresloval výsledky, zvláště
pokud by obsahoval testované xenobiotikum.
POZN.: Vzorky včel před zpracováním zvážíme, čímž získáme jeden parametr pro vyhodnocení
dat. Pro co největší vypovídající hodnotu tohoto výsledku přebíráme a vážíme vzorky bezprostředně
po převozu do laboratoře.
POZN.: Nástroje, kterými odebíráme vzorky mezi jednotlivými odběry, čistíme opláchnutím
v čistém etanolu a následně opálením nad kahanem.
POZN.: Dáváme pozor, aby se peletka suchého ledu nedostala do vzorkovnice, aby nedošlo
k explozi po jejím uzavření.
POZN.: Se vzorky včel usmrcenými v polyetylenovém pytli na suchém ledu manipulujeme
opatrně, aby nedošlo k poškození křehkých vzorků, jako např. ulomení jednotlivých částí včel.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 13 -
Případně použijeme do analýzy pouze vzorky kompletní. Z důvodu možného poškození vzorků
odebíráme vždy větší počet včel, než je teoretický.
4. Včely nalézající se mimo úl/oddělek: 2 dny před odběrem vzorků jsou izolátory vyčištěny od
veškerých mrtvých včel nacházejících se mimo úl. V den odběru, tedy 4 týdny po počátku aplikace,
jsou pinzetou do vzorkovnice sbírány a zároveň počítány mrtvé včely (Obr. 6). Navíc jsou odebrány
vzorky živých včel nalézajících se v izolátoru mimo úl (Obr. 7) a to v minimálním počtu 30 jedinců.
Vzorky ve vzorkovnicích jsou uloženy na suchý led.
3.1.5 Laboratorní zpracování vzorků
3.1.5.1 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro homogenizaci, proteomické a
metabolomické analýzy
Potřebné vybavení bude nutně vycházet z vybavení konkrétních analytických laboratoří, zároveň je
možno využít libovolného vhodného protokolu používaného jak pro proteomickou analýzu, tak pro
detekci xenobiotika či případných metabolitů.
1. Homogenizace pro proteomickou analýzu
H2O čistoty LC-MS / reagent grade– pro homogenizaci a přípravu pufrů.
Pufr obsahující detergent – pro homogenizaci/dohomogenizování vzorku pro proteomickou
analýzu; vhodný pufr je např. triethylamonium bikarbonátový nebo Tris-HCl, vhodný detergent
je např. sodium deoxycholát (SDC) nebo sodium dodecyl sulfát (SDS).
POZN.: Detergentů je nezbytné se následně zbavit vhodnou metodou, v případě SDS viz
protokol dostupný online na adrese: http://www.biochem.mpg.de/226356/FASP, a v případě
SDC se provádí acidifikace (Lin et al. 2010).
Vzorkovnice typu Eppendorf – pro sběr homogenátů a jejich centrifugaci.
Nesmyvatelné fixy – pro popis vzorkovnic.
Jednorázové rukavice – pro minimalizaci kontaminace materiálu.
Krabička anebo stojánek na uskladnění vzorků v mrazicím boxu – pro přehledné uchovávání
vzorků.
Pipety o objemu 2 μl, 10 μl, 100 μl, 1 ml a 10 ml – pro přesné dávkování.
Homogenizéry – pro homogenizaci vzorků jsou vhodné např. skleněné Potter-Elvehjem
homogenizéry s teflonovým pístem, pro jednotlivce o objemu 2 ml, 5 ml a pro více včel o
objemu 30 ml.
Chlazená centrifuga – pro centrifugaci homogenizovaných vzorků.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 14 -
2. Proteomická analýza
Redukční a alkylační činidla – pro usnadnění štěpení proteinů, způsobí rozrušení
třídimenzionální struktury proteinů fixované disulfidickými můstky; vhodné redukční činidlo
je dithiothreitol (DTT), methyl methanethiosulfonát (MMTS) nebo tris (2-
carboxyethyl)phosphine (TCEP), a vhodné alkylační činidlo je iodocetamid (IAA).
Kit pro stanovení koncentrace proteinů – ve vzorcích určených pro proteomickou analýzu je
nezbytné kvantifikovat proteiny, na výběr je řada kitů fungujících na různém principu, např.
Bradford či Lowry.
Enzym pro štěpení proteinů na peptidy – typicky se využívá štěpení prasečím trypsinem, ale je
možné využít i jiných enzymů, jako chymotrypsin, atd.
Mobilní fáze pro proteomickou separaci – typicky se skládá z kyseliny mravenčí, acetonitrilu,
trifluoroctové kyseliny a H2O, vše čistoty LC-MS.
Kolony pro nanoLC separaci peptidů – kolony lze volit různé dle výrobce a použitého systému
nanoLC.
NanoLC kapalinový chromatograf – pro proteomickou separaci.
Hmotnostní detektor pro proteomickou analýzu – využije se vysoce rozlišovacího hmotnostního
spektrometru, přičemž je typicky využita technologie Orbitrap či QTOF.
Vyhodnocovací proteomický software – existuje celá řada komerčních software pro
vyhodnocení dat, nicméně kvantitativní LC-MS/MS data je v současné době nevhodnější
vyhodnocovat freeware softwarem MaxQuant (Cox et al. 2014).
3. Analýza xenobiotika a případných metabolitů
Rozpouštědla – pro extrakci sledovaných látek
QuEChERS (Anastassiades et al. 2003) – pro přípravu vzorků před UHPLC separací.
Mobilní fáze pro separaci pomocí UHPLC – volí se dle povahy analyzovaných látek.
Centrifugační zkumavky 50 ml – pro lyofylizaci vzorků určených pro analýzu
Kolony pro UHPLC separaci xenobiotik a případných metabolitů – kolony lze volit různé dle
metody, výrobce a použitého systému UHPLC.
Lyofylizátor – pro lyofylizaci vodného homogenitu před extrakcí ve zvoleném rozpouštědle/
QuEChERS
UHPLC kapalinový chromatograf – pro separaci.
Hmotnostní detektor pro metabolomickou analýzu – lze využít jak instrumentace trojitý
kvadrupól, tak vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometr obdobný jako u proteomické analýzy
(viz výše), nicméně cílená analýza pomocí trojitého kvadrupólu poskytuje vyšší citlivost.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 15 -
Software pro vyhodnocení metabolomické analýzy – je odvislý od výrobce LC-MS systému,
který byl při analýze použit.
3.1.5.2 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro analýzu mikrobiomu
Potřebné vybavení bude nutně vycházet z vybavení konkrétních analytických laboratoří. Je možné
využít řady protokolů pro extrakci a také různých kitů, avšak výhodou chloroform-fenolové extrakce
DNA je její možnost využití na velké objemy vzorků odpovídající např. 10 včelám, jako je
doporučeno v této metodice.
Na chlorform-fenolovou extrakci je zapotřebí 3-molární octan sodný, etanol,
fenol/chloroform/isopropanol (1:1:1), kit na čištění DNA, směs chloroform/isopropanol (24:1),
KH2PO4 (dihydrogenfosforečnan draselný), KCl (chlorid draselný), Na2HPO4
(hydrogenfosforečnan disodný), detergent tween® 20.
Chloroform-fenolová extrakce probíhá dle postupu uvedeného např. v publikacích Hubert et al.
(2016a, b), při práci s hrubým homogenátem předzpracovaným v H2O 0,5 ml/ 1 včelu je potřeba
s tímto krokem kalkulovat.
Fluorescenční barvivo, např. SYBR green – pro vizualizaci PCR produktů.
Eubakteriální primery – k ověření přítomnosti bakteriální DNA ve vzorcích po izolaci DNA se
použijí eubakteriální primery 27F (5´- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG – 3´) 1492R (5´-
CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3´) podle studie Weisburg et al. (1991).
Chemikálie použité při sekvenačním postupu budou odvislé od zvolené instrumentace –
v zásadě je zapotřebí komerčního mixu pro PCR, vybavení pro přečištění PCR produktů,
komerční kit pro sekvenaci vzorků a kit pro tvorbu DNA knihovny.
Nesmyvatelné fixy – pro popis vzorkovnic.
Centrifugační zkumavky 50 ml – pro práci s materiálem a odstředění materiálu.
Vzorkovnice typu Eppendorf 1,5 ml – pro sběr homogenátů a jejich centrifugaci.
Pipety o objemu 1 a 10 ml – pro přesné dávkování.
Speedvac – na vysušení vzorků.
Centrifuga s otáčkami minimálně 10 000 xg – pro odstředění materiálu.
Homogenizér, polypropylenové homogenizační flakony, rozbíjecí skleněné a granátové kuličky
o velikosti 0,1–1 mm – pro homogenizaci či dohomogenizování vzorků.
Termocykler – pro provedení amplifikační reakce.
Horizontální elektroforéza se zdrojem napětí – pro separaci PCR produktů.
Dokumentační systém – pro dokumentaci výsledku PCR.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 16 -
Sekvenátor nové generace – lze využít jedné z několika běžně užívaných platform v současnosti
– Illumina, Solid, Ion Torrent a 454 Life Technologies, přičemž nejužívanější je instrumentace
výrobce Illumina.
Postup sekvenace na jedné z instrumentací – Illumina MiSeq popisuje např. Chiodini et al.
(2015).
Software pro vyhodnocení dat ze sekvenace nové generace – výsledky se mohou zpracovat
jakýmkoliv uznávaným softwarem. V současnosti jsou nejvíce používané volně přístupné
programy MOTHUR (Schloss et al. 2009), UPARSE (Edgar 2013), případně jejich kombinace.
Podrobný návod k použití programu MOTHUR je uveden na webových stránkách
http://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP a v práci Kozich et al. (2013). Postup zpracování
sekvencí pomocí programu UPARSE je popsán v publikaci Edgar (2013) a postup je uveden na
webových stránkách http://drive5.com/usearch/manual/upp_ill_pe.html. Před vlastní analýzou
je nutné získat aktuální referenční list z databáze SILVA (Quast et al. 2013), který je dostupný
na webových stránkách programu MOTHUR a aktuální databázi RDP (Cole et al. 2014), která
je dostupná na webových stránkách UPARSE.
3.1.6 Typy analýz a informace, které nám analýza jednotlivých vzorků poskytne
Typy analýz volíme podle informací, které nás zajímají. V zásadě můžeme analyzovat celou řadu
různých vzorků a dokonce můžeme volit metodické přístupy, kterými tyto vzorky analyzujeme.
Uvedený postup v této metodice nabízí také unikátní přístup založený na analýze jednoho biologického
vzorku více metodami.
1. Vzorky typu kukla ve stádiu červené oči a mladuška jsou analyzovány kvantitativním LC-MS/MS
proteomickým přístupem na změny v expresi proteinů. Tyto vzorky mohou být zároveň
analyzovány LC-MS/MS instrumentací na rezidua testovaných xenobiotik včetně jejich metabolitů.
a) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza na úrovni jedinců
Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány a analyzovány jako jedinci, výsledek nám
poskytne informaci o případných rozdílech na individuální úrovni.
Analýza poskytne informace o tom, zda testované xenobiotikum způsobuje v daném
dávkování změny v metamorfóze dělnice včely medonosné, tedy kdy jedinci nepřijímají
potravu.
Vzorky jsou v tomto experimentálním uspořádání homogenizovány libovolným
proteomickým protokolem optimalizovaným v laboratoři, kde je analýza prováděna.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 17 -
b) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza a kvantitativní LC-MS/MS analýza na
rezidua testovaných látek a jejich případných metabolitů z jednoho biologického vzorku
Velkou výhodou tohoto postupu je, že jeden a týž biologický vzorek je analyzován nejen na
změny v hladinách proteinů, ale také na rezidua sledovaných látek. Výsledky jsou pak lépe
srovnatelné, než kdybychom vzorky homogenizovali a dvěma přístupy analyzovali separátně.
Analýza poskytne informace o tom, zda testované xenobiotikum způsobuje v daném
dávkování změny v metamorfóze dělnic včely medonosné, zároveň jsou však získány
informace o výskytu reziduí xenobiotika a jeho případných metabolitů ve stádiích, která
nepřijímají potravu.
Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány po 12 jedincích a takový vzorek
představuje jeden biologický vzorek.
Každý biologický vzorek je homogenizován ve vodném roztoku, poměr je kalkulovaný jako
0,5 ml H2O na 1 včelu.
Po iniciální homogenizaci v H2O je vzorek, který představuje celkem 12 včelích jedinců,
rozdělen na díly odpovídající 2 a 10 včelám. Díl odpovídající 2 jedincům se použije dále na
proteomickou kvantitativní LC-MS/MS analýzu, zatímco díl odpovídající 10 včelám se použije
na metabolomickou analýzu.
Pro proteomickou analýzu jsou do iniciálního vodného homogenátu přidány chemikálie
jako detergent, pufr, apod. pro docílení požadované koncentrace látek dle zvoleného protokolu
a vzorek je dohomogenizován.
POZN.: Pro docílení finální koncentrace je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn
H2O v poměru 0,5 ml H2O na kuklu nebo mladušku.
Pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu na rezidua testovaných látek a jejich případných
metabolitů je iniciální homogenát lyofylizován v centrifugační zkumavce, a pak je takový
vzorek extrahován a dále zpracován dle libovolného protokolu, který je rutinně používán v
analytické laboratoři.
2. Vzorky typu včely z plodového plástu jsou analyzovány LC-MS/MS instrumentací na koloběh
testovaných xenobiotik včetně jejich metabolitů ve včelí kolonii. Tyto vzorky mohou být
analyzovány po oddělení příslušného dílu homogenátu zároveň na změny v proteinech, ale dokonce
také na změny v symbiotických organismech. Proteomické změny jsou vyšetřovány buď v celých
jedincích, nebo v jednotlivých kompartmentech úlových včel. Velmi vhodné kompartmenty
úlových včel pro zjišťování konkrétních změn jsou tykadla, hlavy či části střeva.
POZN.: Dospělé včely není vhodné analyzovat na úrovni jedince, neboť mezi jedinci dospělých
včel existují značné rozdíly v proteinové skladbě, a to dokonce pokud jsou včely obdobného stáří.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 18 -
Jednou z možností je označit včely při jejich vylíhnutí a pak s odstupem času odebírat včely
stejného stáří, takto však lze odebrat pouze omezený počet včel.
POZN.: U včel odebíraných z plodového plástu je předpokládáno, že většina plní obdobnou funkci,
tj. jedná se především o včely krmičky. Odběrem dostatečného množství jedinců na jeden
biologický vzorek a dostatečným počtem biologického opakování je zajištěn co nejsprávnější
výsledek.
a) Kvantitativní LC-MS/MS analýza na rezidua testovaných látek a jejich případných
metabolitů, analýza mikrobiomu a případně také proteomická analýza z jednoho
biologického vzorku
Velkou výhodou tohoto postupu je, že jeden a týž biologický vzorek je analyzován nejen na
koloběh/rezidua testovaných látek včetně metabolitů ve včelstvu, ale navíc je ze stejného vzorku
zjištěn vliv na mikrobiom úlových včel a dokonce je možno v rámci jednoho a téhož
biologického vzorku získat informaci o změnách proteomu včel. Výsledky různého charakteru
jsou pak lépe srovnatelné, než kdybychom vzorky homogenizovali a různými přístupy
analyzovali separátně.
Analýza poskytne informace o tom, v jakých koncentracích se testované xenobiotikum a
jeho případné metabolity vyskytují ve včelstvu, což indikuje i riziko přenosu těchto látek na
plod a ovlivnění jeho vývoje včetně metamorfózy, zároveň jsou získány informace o vlivu
xenobiotika a jeho případných metabolitů na mikrobiom včel, který je významnou složkou
imunitního systému a konečně při analýze další díly homogenátu proteomickými metodami jsou
získány informace o vlivu xenobiotik na proteom úlových včel.
Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány po 30 jedincích na jeden biologický
vzorek.
Každý biologický vzorek je homogenizován ve vodném roztoku, poměr je kalkulovaný jako
0,5 ml H2O na 1 včelu.
Po iniciální homogenizaci v H2O je každý biologický vzorek, který představuje celkem 30
včelích jedinců, rozdělen na 3 díly, každý odpovídající určitému počtu včel. Každý ze třech dílů
se použije na jeden typ analýzy, tj. metabolomickou LC-MS/MS analýzu, analýzu mikrobiomu
metodou sekvenace nové generace, anebo na kvantitativní LC-MS/MS proteomickou analýzu.
Ideálně se použije díl odpovídající 15 včelám na metabolomickou analýzu, díl o 10 včelách se
použije na analýzu mikrobiomu a nejmenší díl, odpovídající 5 včelím jedincům se použije na
proteomickou analýzu.
Pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu na rezidua testovaných látek a jejich případných
metabolitů je iniciální homogenát lyofylizován v centrifugační zkumavce a pak je takový
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 19 -
vzorek extrahován a dále zpracován dle libovolného protokolu, který je rutinně používán v
analytické laboratoři.
Pro analýzu mikrobiomu metodou nové generace sekvenování je příslušná část homogenátu
odpovídající 10 včelám dále zpracována chloroform-fenolovou extrakcí DNA.
POZN.: Je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn H2O v poměru 0,5 ml H2O na
vzorek úlové včely.
Pro proteomickou analýzu jsou do iniciálního vodného homogenátu přidány chemikálie
jako detergent, pufr, apod. pro docílení požadované koncentrace látek dle zvoleného protokolu
a vzorek je dohomogenizován.
POZN.: Pro docílení finální koncentrace je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn
H2O v poměru 0,5 ml H2O na vzorek úlové včely.
b) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza jednotlivých kompartmentů úlových včel
Výhodou analýzy jednotlivých kompartmentů včel je lokalizace výsledků na konkrétní
kompartmenty a také dosažení citlivější analýzy pro konkrétní markery v daných
kompartmentech.
Analýza poskytne informace o tom, zda testované xenobiotikum způsobuje v daném
dávkování změny v kvantitativním či kvalitativním zastoupení proteinů v určitém
kompartmentu včel.
Vzorky jsou v tomto experimentálním uspořádání homogenizovány libovolným
proteomickým protokolem optimalizovaným v laboratoři, kde je analýza prováděna. Extrakce
se může pro jednotlivé kompartmenty lišit.
Každý vzorek tvoří kompartmenty z většího počtu jedinců. Pro jeden biologický vzorek je
vhodných např. 200 tykadel, 30 hlav nebo 10 střev či jejich částí.
POZN.: Jsou-li sbírány vzorky tykadel, je vhodné část hlav použít na další typ analýzy, tedy
při sběru 200 tykadel je použito 100 hlav, z nichž se náhodným výběrem 30 použije na další
homogenizaci.
Proteomická analýza tykadel poskytne informace cílené na změny v komunikaci včel
vlivem testovaného xenobiotika.
Proteomická analýza hlav poskytne informace cílené na vliv testovaného xenobiotika na
nervovou soustavu.
POZN.: Je možno provést disekci mozku a analyzovat tento kompartment samostatně, avšak
taková příprava vzorku je poměrně náročná a neposkytne krom cílenější analýzy více informací,
než analýza celé hlavy.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 20 -
Proteomická analýza střev poskytne informace cílené na změny v trávicích proteinech a
také jak na proteinové úrovni reagují na xenobiotika symbiotické bakterie.
3. Vzorky typu včely nalézající se mimo úl – živé a mrtvé – jsou analyzovány LC-MS/MS
instrumentací na přítomnost xenobiotik a případných metabolitů. Navíc je vyšetřován počet
mrtvých včel mimo včelstvo poté, co byl 2 dny před odběrem vzorků izolátor vyčištěn.
POZN.: Pro analýzy tohoto typu vzorků je nezbytné pracovat s biologickými vzorky zahrnující
alespoň 30 jedinců pro jednu analýzu.
Vzorky mrtvých a živých včel jsou analyzovány kvantitativní metodou LC-MS/MS na
obsah xenobiotika a jeho případné metabolity, čímž je získána informace o přetrvávání látek
v mrtvých včelách oproti včelám živým nalézajícím se mimo úl. Takovýto výsledek je také
důležitý pro pochopení, zda množství zemřelých včel souvisí/nesouvisí s vyšší dávkou
xenobiotika na tyto včely.
Důležité je také porovnání kvantity testovaného xenobiotika a případných metabolitů mezi
včelami nalézajícími se mimo úl a úlovými včelami.
Počet mrtvých včel mimo úl poskytuje základní informaci o akutním toxickém vlivu
xenobiotika na včelstvo, což je velmi důležitý parametr pro vyhodnocení dat. Pokud je mortalita
nízká, potvrzujeme tím, že účinek xenobiotika v experimentu byl chronický.
4. Další možné typy vzorků pro proteomickou analýzu
Vzhledem k dalším otázkám, na které chceme nalézt odpověď vzhledem k testovanému xenobiotiku,
odebereme ze včelstva další libovolné typy vzorků, např. různá další vývojová stádia – kromě kukel
a líhnoucích se včel také vajíčka, larvy nebo kasty – kromě včelích dělnic také trubce či matky.
Analýza matek napoví hodně o tom, jakým způsobem xenobiotikum ovlivňuje
nejdůležitější součást včelstva. Matka má specifikum, že je krmena po celou dobu svého života
mateří kašičkou, která je vyráběna hltanovými žlázami včel.
POZN.: Při analýze tohoto typu vzorku je nutno si uvědomit, že jeho odběrem celý experiment
končí, a další sledování včelstva pozbývá smyslu. Dále je nezbytné provést dostatečný počet
opakování úlů, aby byl zajištěn dostatečný počet matek pro analýzu, analýza na úrovni jedné
nebo i dvou matek je ze statistického hlediska nesmyslná.
Trubci mají některé proteiny odlišné od dělnic, a i délka jejich vývoje je odlišná, a proto
analýza různých stádií vývoje trubců obdobně jako u dělnic může být pro hodnocení vlivu
xenobiotika na včelstvo důležitá. Pokud existuje podezření, že by xenobiotikum mohlo
ovlivňovat specificky trubce, záskává analýza tohoto typu vzorků smysl. Příprava trubčích
vzorků způsobem obdobným jako je uvedeno v této metodice u dělnic, je však podstatně
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 21 -
náročnější, neboť včelstvo produkuje trubce pouze v omezeném množství a v určitém stupni
vývoje včelího společenství.
Dalším vhodným vzorkem pro zjištění vlivu xenobiotika na včely jsou vajíčka. Proteomické
analýza vajíček může mít značný význam při prokazování teratogenity xenobiotika.
Larvální stádia mohou také poskytnout významnou informaci o vlivu xenobiotika na vývoj
včel, u tohoto typu vzorku je však obtížnější než v případě kukly ve stádiu červené oči a právě
líhnoucích se včel, zachytit přesně identické stádium tak, aby nebyly výsledky ovlivněny
změnami ve vývoji.
4. Srovnání novosti postupů
Tato metodika jako první svého druhu zahrnuje sledování vlivu xenobiotik na vývoj včely
medonosné včetně analýzy dalších klíčových typů vzorků. Četné studie využívají různých metodických
přístupů a experimenty jsou prováděny na vzorcích připravených v různý čas a z různých genetických linií
biologického materiálu, a proto mohou být výsledky odlišné a navzájem nesrovnatelné. Využitím postupu
v této metodice lze provést sérii analýz na včelích koloniích obdobného genetického materiálu a v tentýž
časový okamžik, a tak je získaný výsledek srovnatelný a je tak zajištěna jejich exaktnost. Kombinací
proteomické, metabolomické a genomické analýzy různých vzorků lze prokazatelně dokázat negativní vliv
xenobiotika včetně jeho metabolitů na vývoj včelího plodu, matek, dělnic či trubců a predikovat tak další
osud včelstev v případě kontaminace. Hlavní a unikátní zaměření metodiky je na metamorfózu včely
medonosné, kterou představuje stádium kukly až líhnoucí se včely – mladušky. Sledování vlivu xenobiotik
na tato stádia, která po zavíčkování do buňky od posledního larválního stádia skrz kuklu až do prokousání
buňkou nepřijímají potravu, poskytují uníkátní vhled na problematiku vlivu xenobiotik na včelu
medonosnou. Vliv xenobiotika a případných metabolitů na metamorfózu je vyhodnocován kvantitativním
proteomickým přístupem, který poskytuje exaktní hodnocení vlivu testovaných látek na metamorfózu včel.
Jako doprovodné výsledky je dále sledován výskyt reziduí xenobiotika a případných metabolitů ve stádiu
kukly a líhnoucího se dospělce. Metabolomická analýza včel z plodového plástu poskytuje informace o
koloběhu xenobiotika a případných metabolitů ve včelstvu, zároveň je tak získána informace o možném
transferu těchto látek včelami krmičkami na plod a na matku. V souvislosti s vlivem xenobiotik je navíc
cíleně sledován vliv xenobiotika na mikrobiom včel představující významnou složku imunitního systému.
Metodika navíc umožňuje sledování změn v proteinech úlových včel jako celku, ale i v jednotlivých
kompartmentech, jako např. tykadlech, hlavách/mozcích, či trávicím traktu. Je tedy možno získat dále
informace o vlivu testovaného xenobiotika na komunikaci včel, nervovou funkci, ale také interakci
s trávicím traktem včel včetně symbiotických bakterií. V rámci jednoho experimentu je z mrtvých včel
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 22 -
mimo úl zároveň získána informace o míře akutního účinku dané dávky xenobiotika a srovnáním těchto
hodnot se živými jedinci mimo úl je potvrzena informace, zda za úmrtím včel stojí konkrétní xenobiotikum.
5. Uplatnění metodiky
Metodika je určena pro státní správu s využitím pro laboratoře zabývající se zdravím včel, a
ekotoxikologií. Metodika bude po překladu do anglického jazyka využita také mezinárodními organizacemi
jako EEA (European Environment Agency; Evropská agentura pro životní prostředí), EPA (United States
Environmental Protection Agency; Agentura pro ochranu životního prostředí USA) či EFSA (European
Food Safety Authority; Evropský úřad pro bezpečnost potravin) řešícími hodnocení rizik na včely a jiné
opylovače. Předkládaná metodika má souvislosti vzhledem k nařízením komise ES týkající se hodnocení a
povolování přípravků na ochranu rostlin. Využití této metodiky je i pro výrobce pesticidních látek, kteří
díky této metodice mohou exaktně vyloučit nebo prokázat negativní vliv pesticidních látek na včely.
Význam metodického postupu je pro světovou včelařskou komunitu, neboť tato metodika umožňuje exaktní
hodnocení vlivu xenobiotik na včelu medonosnou. Vzhledem k tomu, že metodický přístup je přenositelný
i na jiné necílové organismy má tato metodika uplatnění i mimo včelařskou obec.
6. Ekonomické zhodnocení metodiky
Cenové nároky na experimenty provedené v metodice jsou poměrně vysoké vzhledem
k přístrojovému vybavení potřebnému k analýzám. Cenu takového komplexního experimentu však
vyvažuje váha výsledků a obrovské penzum exaktních informací, které jsou takovou analýzou
získány. Jen obtížně jsou vyčíslitelné úspory na životním prostředí, v případě, kdy by bylo díky
aplikaci metodiky předejito kontaminaci životního prostředí nebezpečným xenobiotikem se
skrytými negativními účinky na dlouhé roky. Proto je srovnání nákladové ceny metodického
postupu této metodiky a v minulosti nebo v současnosti užívaných postupů, které nehodnotí účinky
na necílové organismy zdaleka tak exaktně, jen těžce srovnatelné. Do kalkulace nákladů na
experiment je nezbytné zahrnout vstupní cenu chemikálií, testovaných látek, cenu oddělků a
krmiva, 2 měsíce práce včelaře, cenu 2 dnů práce 4 pracovníků při odběru vzorků, zpracování
vzorků pro různé typy analýz (cca 500 Kč/vzorek), zpracování vzorků pro sekvenaci nové
generace, proteomickou nebo metabolomickou analýzu (na každý typ analýzy 100 až 200
Kč/vzorek), proteomická LC-MS/MS analýza (cca 5 000 až 10 000 Kč/vzorek), sekvenace DNA
nové generace (600 až 2 200 Kč/ vzorek, dle zvoleného typu analýzy), metabolomická analýza na
sledovanou látku a screening látek dalších (3 000 až 4 000 Kč/vzorek). Do celkové ceny je vhodné
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 23 -
započítat také setup experimentu a vyhodnocení proteomických, metabolomických dat ze
sekvenace nové generace včetně celkové interpretace dat. Cena této práce by se mohla pro
experiment standartního rozsahu uvedeného níže pohybovat v ceně 100 000 Kč.
Jako příklad kalkulace ceny komplexního experimentu o 4 včelstvech, která budou komplexně
analyzována na 3 xenobiotika včetně 1 kontrolního experimentu bez xenobiotika, uvádíme: 1)
proteomický experiment: kukly, mladušky a tykadla a hlavy úlových včel = 4 (včelstva) x 4 (typy
vzorků) x 3 (biologická opakování na vzorek) x 5 000 Kč až 10 000 Kč = 240 000 Kč až 480 000
Kč; 2) metabolomická analýza na koloběh sledované látky v úlových včelách = 4 (včelstva) x 6
(biologické opakování) x 3 000 Kč (až 4 000 Kč) = 72 000 Kč až 96 000 Kč; 3) ověření existence
reziduí xenobiotika a případných metabolitů v kuklách a mladuškách = 4 (včelstva) x 2 (typy
vzorků) x 3 (biologická opakování na vzorek) x 3 000 Kč až 4 000 Kč = 24 000 Kč až 32 000 Kč;
4) Analýza mrtvých a živých včel mimo úl = 4 (včelstva) x 2 (typy vzorků) x 3 (biologická
opakování na vzorek) x 3 000 Kč až 4 000 Kč = 24 000 Kč až 32 000 Kč; 5) analýza mikrobiomu
v úlových včelách = 4 (včelstva) x 6 (biologické opakování) x 600 až 2 200 Kč = 14 400 až 52 800
Kč; 6) 4 oddělky = 4 x 3 000 Kč = 12 000 Kč; 7) práce včelaře a pracovníků sbírajících vzorky =
50 000 Kč; 8) zpracování všech vzorků = 27 000 Kč 9) setup experimentu, bioinformatické
vyhodnocení a interpretace celkových dat = 100 000 Kč. Celková cena takového komplexního
experimentu, pokud by byl zadán jako služba se tedy může pohybovat v ceně cca 600 000 Kč až
900 000 Kč, a to dle zvoleného typu analytických přístrojů a specifikace analýz.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 24 -
7. Publikace, které předcházely metodice
Erban T., Halešová T., Seifrtová M., Kamler M., Titěra D. 2016a. Způsob určení vlivu
xenobiotika/xenobiotik na plod včely, zejména včely medonosné, v průběhu její metamorfózy.
Přihláška patentu číslo PV 2016-654 podaného dne 19. 10. 2016, č. j. E274567. Úřad průmyslového
vlastnictví, Praha, Česko.
Erban T., Harant K., Hubalek M., Vitamvas P., Kamler M., Poltronieri P., Tyl J., Markovic M., Titera D.
2015. In-depth proteomic analysis of Varroa destructor: detection of DWV-complex, ABPV,
VdMLV and honeybee proteins in the mite. Sci. Rep. 5: 13907. DOI: 10.1038/srep13907.
Erban T., Harant K., Chalupnikova J., Kocourek F., Stara J. 2017. Beyond the survival and death of the
deltamethrin-threatened pollen beetle Meligethes aeneus: an in-depth proteomic study employing a
transcriptome database. J. Proteomics 150: 281–289. DOI: 10.1016/j.jprot.2016.09.016.
Erban T., Harant K., Kamler M., Markovic M., Titera D. 2016b. Detailed proteome mapping of newly
emerged honeybee worker hemolymph and comparison with the red-eye pupal stage. Apidologie
47 (6):805–817. DOI: 10.1007/s13592-016-0437-7.
Erban T., Petrova D., Harant K., Jedelsky P. L., Titera D. 2014. Two-dimensional gel proteome analysis of
honeybee, Apis mellifera, worker red-eye pupa hemolymph. Apidologie 45 (1): 53–72.
Hubert J., Bicianova M., Ledvinka O., Kamler M., Lester P. J., Nesvorna M., Kopecky J., Erban T. 2016a.
Changes in the bacteriome of honey bees associated with the parasite Varroa destructor, and
pathogens Nosema and Lotmaria passim. Microb. Ecol. (in press). DOI: 10.1007/s00248-016-0869-
7.
Hubert J., Kamler M., Nesvorna M., Ledvinka O., Kopecky J., Erban T. 2016b. Comparison of Varroa
destructor and worker honeybee microbiota within hives indicates shared bacteria. Microb. Ecol.
72 (2): 448–459.
Seifrtova M., Halesova T., Sulcova K., Riddellova K., Erban T. 2016. Distributions of imidacloprid,
imidacloprid-olefin and imidacloprid-urea in green plant tissues and roots of rapeseed (Brassica
napus) from artificially contaminated potting soil. Pest Manag. Sci. (in press). DOI:
10.1002/ps.4418.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 25 -
9. Schematické uspořádání metodického postupu
Obrázek 1. Schematické znázornění experimentu, odebíraných vzorků, analýz a výsledků.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 26 -
10. Seznam literatury
Aliouane Y., El Hassani A. K., Gary V., Armengaud C., Lambin M., Gauthier M. 2009. Subchronic
exposure of honeybees to sublethal doses of pesticides: effects on behavior. Environ. Toxicol.
Chem. 28 (1): 113–122.
Amrhein N., Deus B., Gehrke P., Steinrücken H. C. 1980. The site of the inhibition of the shikimate pathway
by glyphosate: II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant
Physiol. 66 (5): 830–834.
Anastassiades M., Lehotay S. J., Štajnbaher D., Schenck F. J. 2003. Fast and easy multiresidue method
employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the
determination of pesticide residues in produce. J. AOAC Int. 86 (2): 412–431.
Ashby J., Kier L., Wilson A. G., Green T., Lefevre P. A., Tinwell H., Willis G. A., Heydens W. F., Clapp
M. J. 1996. Evaluation of the potential carcinogenicity and genetic toxicity to humans of the
herbicide acetochlor. Hum. Exp. Toxicol. 15 (9): 702–735.
Balbuena M. S., Tison L., Hahn M.-L., Greggers U., Menzel R., Farina W. M. 2015. Effects of sublethal
doses of glyphosate on honeybee navigation. J. Exp. Biol. 218 (17): 2799–2805.
Blacquière T., Smagghe G., van Gestel C. A., Mommaerts V. 2012. Neonicotinoids in bees: a review on
concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology 21 (4): 973–992.
Boja E. S., Rodriguez H. 2012. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving
sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics 12 (8): 1093–1110.
Bromenshenk J. J., Henderson C. B., Wick C. H., Stanford M. F., Zulich A. W., Jabbour R. E., Deshpande
S. V., McCubbin P. E., Seccomb R. A., Welch P. M., Williams T., Firth D. R., Skowronski E.,
Lehmann M. M., Bilimoria S. L., Gress J., Wanner K. W., Cramer R. A. Jr. 2010. Iridovirus and
microsporidian linked to honey bee colony decline. PLoS One 5 (10): e13181. DOI:
10.1371/journal.pone.0013181.
Cohn B. A., La Merrill M., Krigbaum N. Y., Yeh G., Park J. S., Zimmermann L., Cirillo P. M. 2015. DDT
exposure in utero and breast cancer. J. Clin. Endocrinol. Metab. 100 (8): 2865–2872.
Cole J. R., Wang Q., Fish J. A., Chai B., McGarrell D. M., Sun Y., Brown C. T., Porras-Alfaro A., Kuske
C. R., Tiedje J. M. 2014. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA
analysis. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue): D633–D642.
Coleman S., Linderman R., Hodgson E., Rose R. L. 2000. Comparative metabolism of chloroacetamide
herbicides and selected metabolites in human and rat liver microsomes. Environ. Health Perspect.
108 (12): 1151–1157.
COST. 2013. Memorandum of Understanding for the implementation of a European Concerted Research
Action designated as COST Action FA1307: SUPER-B: SUstainable Pollination in Europe: joint
Research on Bees and other pollinators. COST 060/13, 22 November 2013. European Cooperation
in the field of Scientific and Technical Research (COST). Brussels, Belgium. URL:
http://w3.cost.eu/fileadmin/domain_files/FA/Action_FA1307/mou/FA1307-e.pdf
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 27 -
Cox J., Hein M. Y., Luber C. A., Paron I., Nagaraj N., Mann M. 2014. Accurate proteome-wide label-free
quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.
Mol. Cell. Proteomics. 13 (9): 2513–2526.
Crump D., Werry K., Veldhoen N., Van Aggelen G., Helbing C. C. 2002. Exposure to the herbicide
acetochlor alters thyroid hormone-dependent gene expression and metamorphosis in Xenopus
laevis. Environ. Health Perspect. 110 (12): 1199–1205.
Dively G. P., Kamel A. 2012. Insecticide residues in pollen and nectar of a cucurbit crop and their potential
exposure to pollinators. J. Agric. Food Chem. 60 (18): 4449–4456.
Doerr A. 2011. Targeted proteomics. Nat. Methods 8 (1): 43–43.
Doerr A. 2013. Mass spectrometry–based targeted proteomics. Nat. Methods 10 (1): 23–23.
Duke S. O., Powles S. B. 2008. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Manag. Sci. 64 (4): 319–
325.
Edgar R. C. 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat. Methods
10 (10): 996–998.
EFSA. 2013a. EFSA assesses risks to bees from fipronil. Press Release, 27 May 2013. European Food
Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. URL: http://www.efsa.europa.eu/en/press/news/130527
EFSA. 2013b. EFSA identifies risks to bees from neonicotinoids. Press Release, 16 January 2013. European
Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. URL:
http://www.efsa.europa.eu/en/press/news/130116
EFSA. 2013c. Guidance on the risk assessment of plant protection products on bees (Apis mellifera, Bombus
spp. and solitary bees). EFSA J. 11 (7): 3295. DOI: 10.2903/j.efsa.2013.3295.
EK. 2011a. Nařízení Komise (EU) č. 544/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení
Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o požadavky na údaje o účinných
látkách, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie, L 155/1, 11. 6. 2011. URL:
http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/544/oj
EK. 2011b. Nařízení Komise (EU) č. 545/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení
Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o požadavky na údaje o přípravcích
na ochranu rostlin, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie, L 155/67, 11. 6. 2011.
URL: http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/545/oj
EK. 2011c. Nařízení Komise (EU) č. 546/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení
Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o jednotné zásady pro hodnocení a
povolování přípravků na ochranu rostlin, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie,
L 155/127, 11. 6. 2011. URL: http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/546/oj
EK. 2013. Prováděcí nařízení Komise (EU) č. 485/2013 ze dne 24. května 2013, kterým se mění prováděcí
nařízení (EU) č. 540/2011, pokud jde o podmínky schválení účinných látek klothianidin,
thiamethoxam a imidakloprid, a kterým se zakazuje použití a prodej osiva ošetřeného přípravky na
ochranu rostlin obsahujícími uvedené účinné látky, text s významem pro EHP. Úřední věstník
Evropské unie, L 139/12, 25. 5. 2013. URL: http://eur-lex.europa.eu/legal-
content/CS/TXT/?qid=1484755697880&uri=CELEX:32013R0485.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 28 -
Elbert A., Becker B., Hartwig J., Erdelen C. 1991. Imidacloprid – ein neues systemisches Insektizid.
Pflanzenschutz-Nachr. Bayer 44 (2): 113−136.
EP, Rada ES. 2009. Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009 ze dne 21. října 2009 o
uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh a o zrušení směrnic Rady 79/117/EHS a 91/414/EHS.
Úřední věstník Evropské unie, L 309/1, 24. 11. 2009. URL: http://eur-
lex.europa.eu/eli/reg/2009/1107/oj
EPPO. 1992. Guideline on test methods for evaluating the side-effects of plant protection products on
honeybees; EPPO Bull. 22 (2):203–215.
Erban T., Harant K., Chalupnikova J., Kocourek F., Stara J. 2017. Beyond the survival and death of the
deltamethrin-threatened pollen beetle Meligethes aeneus: an in-depth proteomic study employing a
transcriptome database. J. Proteomics 150: 281–289. DOI: 10.1016/j.jprot.2016.09.016.
Erban T., Halešová T., Seifrtová M., Kamler M., Titěra D. 2016a. Způsob určení vlivu
xenobiotika/xenobiotik na plod včely, zejména včely medonosné, v průběhu její metamorfózy.
Přihláška patentu číslo PV 2016-654 podaného dne 19. 10. 2016, č. j. E274567. Úřad průmyslového
vlastnictví, Praha, Česko.
Erban T., Harant K., Hubalek M., Vitamvas P., Kamler M., Poltronieri P., Tyl J., Markovic M., Titera D.
2015. In-depth proteomic analysis of Varroa destructor: detection of DWV-complex, ABPV,
VdMLV and honeybee proteins in the mite. Sci. Rep. 5: 13907. DOI: 10.1038/srep13907.
Erban T., Harant K., Kamler M., Markovic M., Titera D. 2016b. Detailed proteome mapping of newly
emerged honeybee worker hemolymph and comparison with the red-eye pupal stage. Apidologie
47 (6):805–817. DOI: 10.1007/s13592-016-0437-7.
Erban T., Petrova D., Harant K., Jedelsky P. L., Titera D. 2014. Two-dimensional gel proteome analysis of
honeybee, Apis mellifera, worker red-eye pupa hemolymph. Apidologie 45 (1): 53–72.
Foster L. J. 2011. Interpretation of data underlying the link between colony collapse disorder (CCD) and an
invertebrate iridescent virus. Mol. Cell. Proteomics 10 (3): M110.006387. DOI:
10.1074/mcp.M110.006387.
Franz J. E., Mao M. K., Sikorski J. A. 1997. Glyphosate: a unique global herbicide. ACS monograph 189.
American Chemical Society, Washington, DC, USA.
George J., Prasad S., Mahmood Z., Shukla Y. 2010. Studies on glyphosate-induced carcinogenicity in mouse
skin: a proteomic approach. J. Proteomics. 73 (5): 951–964.
George J., Shukla Y. 2013. Emptying of intracellular calcium pool and oxidative stress imbalance are
associated with the glyphosate-induced proliferation in human skin keratinocytes HaCaT cells.
ISRN Dermatol. 2013: 825180. DOI: 10.1155/2013/825180
Guilherme S., Santos M. A., Gaivão I., Pacheco M. 2014. DNA and chromosomal damage induced in fish
(Anguilla anguilla L.) by aminomethylphosphonic acid (AMPA)—the major environmental
breakdown product of glyphosate. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (14): 8730–8739.
Halm M. P., Rortais A., Arnold G., Taséi J. N., Rault S. 2006. New risk assessment approach for systemic
insecticides: the case of honey bees and imidacloprid (Gaucho). Environ. Sci. Technol. 40 (7):
2448−2454.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 29 -
Herbert L. T., Vázquez D. E., Arenas A., Farina W. M. 2014. Effects of field-realistic doses of glyphosate
on honeybee appetitive behaviour. J. Exp. Biol. 217 (19): 3457–3464.
Heydens W. F., Wilson A. G., Kier L. D., Lau H., Thake D. C., Martens M. A. 1999. An evaluation of the
carcinogenic potential of the herbicide alachlor to man. Hum. Exp. Toxicol. 18 (6): 363–391.
Hubert J., Bicianova M., Ledvinka O., Kamler M., Lester P. J., Nesvorna M., Kopecky J., Erban T. 2016a.
Changes in the bacteriome of honey bees associated with the parasite Varroa destructor, and
pathogens Nosema and Lotmaria passim. Microb. Ecol. (in press). DOI: 10.1007/s00248-016-0869-
7.
Hubert J., Kamler M., Nesvorna M., Ledvinka O., Kopecky J., Erban T. 2016b. Comparison of Varroa
destructor and worker honeybee microbiota within hives indicates shared bacteria. Microb. Ecol.
72 (2): 448–459.
Chaimanee V., Evans J. D., Chen Y., Jackson C., Pettis J. S. 2016. Sperm viability and gene expression in
honey bee queens (Apis mellifera) following exposure to the neonicotinoid insecticide imidacloprid
and the organophosphate acaricide coumaphos. J. Insect Physiol. 89: 1–8.
Chiodini R. J., Dowd S. E., Chamberlin W. M., Galandiuk S., Davis B., Glassing A. 2015. Microbial
population differentials between mucosal and submucosal intestinal tissues in advanced Crohn's
disease of the ileum. PLoS One 10 (7): e0134382. DOI: 10.1371/journal.pone.0134382.
IARC. 2016. Glyphosate. In: IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Volume
112: Some organophosphate insecticides and herbicides: diazinon, glyphosate, malathion,
parathion, and tetrachlorvinphos. Lyon, France: 3–10 March 2015. International Agency for
Research on Cancer (IARC), Lyon, France. URL:
http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol112/mono112-09.pdf
Jefferies P. R., Quistad G. B., Casida J. E. 1998. Dialkylquinonimines validated as in vivo metabolites of
alachlor, acetochlor, and metolachlor herbicides in rats. Chem. Res. Toxicol. 11 (4): 353–359.
Kasiotis K. M., Anagnostopoulos C., Anastasiadou P., Machera K. 2014. Pesticide residues in honeybees,
honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: reported death incidents in honeybees. Sci. Total
Environ. 485–486: 633–642.
Kelce W. R., Stone C. R., Laws S. C., Gray L. E., Kemppainen J. A., Wilson E. M. 1995. Persistent DDT
metabolite p,p'–DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature 375 (6532): 581–585.
Kozich J. J., Westcott S. L., Baxter N. T., Highlander S. K., Schloss P. D. 2013. Development of a dual-
index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq
Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17): 5112–5120.
Krischik V. A., Landmark A. L., Heimpel G. E. 2007. Soil-applied imidacloprid is translocated to nectar
and kills nectar-feeding Anagyrus pseudococci (Girault) (Hymenoptera: Encyrtidae). Environ.
Entomol. 36 (5): 1238−1245.
Li Q., Lambrechts M. J., Zhang Q., Liu S., Ge D., Yin R., Xi M., You Z. 2013. Glyphosate and AMPA
inhibit cancer cell growth through inhibiting intracellular glycine synthesis. Drug Des. Devel. Ther.
7: 635–643.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 30 -
Li W., Zha J., Li Z., Yang L., Wang Z. 2009. Effects of exposure to acetochlor on the expression of thyroid
hormone related genes in larval and adult rare minnow (Gobiocypris rarus). Aquat. Toxicol. 94 (2):
87–93.
Lin Y., Liu Y., Li J., Zhao Y., He Q., Han W., Chen P., Wang X., Liang S. 2010. Evaluation and optimization
of removal of an acid-insoluble surfactant for shotgun analysis of membrane proteome.
Electrophoresis 31 (16): 2705–2713.
Lindsay E. A., French K. 2004. The impact of the herbicide glyphosate on leaf litter invertebrates within
Bitou bush, Chrysanthemoides monilifera ssp rotundata, infestations. Pest Manag. Sci. 60 (12):
1205–1212.
Mañas F., Peralta L., Raviolo J., García Ovando H., Weyers A., Ugnia L., Gonzalez Cid M., Larripa I.,
Gorla N. 2009. Genotoxicity of AMPA, the environmental metabolite of glyphosate, assessed by
the Comet assay and cytogenetic tests. Ecotoxicol. Environ. Saf. 72 (3): 834–837.
Moffat C., Pacheco J. G., Sharp S., Samson A. J., Bollan K. A., Huang J., Buckland S. T., Connolly C. N.
2015. Chronic exposure to neonicotinoids increases neuronal vulnerability to mitochondrial
dysfunction in the bumblebee (Bombus terrestris). FASEB J. 29 (5): 2112–2119.
Nauen R., Reckmann U., Armborst S., Stupp H.-P., Elbert A. 1999. Whitefly-active metabolites of
imidacloprid: biological efficacy and translocation in cotton plants. Pestic. Sci. 55 (3): 265−271.
Nauen R., Tietjen K., Wagner K., Elbert A. 1998. Efficacy of plant metabolites of imidacloprid against
Myzus persicae and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). Pestic. Sci. 52 (1): 53−57.
Ottoboni A., Bissell G.D., Hexter A. C. 1977. Effects of DDT on reproduction in multiple generations of
beagle dogs. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 6 (1): 83–101.
Papaefthimiou C., Papachristoforou A., Theophilidis G. 2013. Biphasic responses of the honeybee heart to
nanomolar concentrations of amitraz. Pestic. Biochem. Physiol. 107 (1): 132–137.
Pettis J. S., Lichtenberg E. M., Andree M., Stitzinger J., Rose R., vanEngelsdorp D. 2013. Crop pollination
exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema
ceranae. PLoS One 8 (7): e70182. DOI: 10.1371/journal.pone.0070182.
Pettis J. S., Rice N., Joselow K., vanEngelsdorp D., Chaimanee V. 2016. Colony failure linked to low sperm
viability in honey bee (Apis mellifera) queens and an exploration of potential causative factors.
PLoS One 11 (2): e0147220. DOI: 10.1371/journal.pone.0147220.
Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Peplies J., Glöckner F. O. 2013. The
SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.
Nucleic Acids Res. 41 (Database issue): D590–D596.
Rada EHS. 1991. Směrnice Rady 91/414/EHS ze dne 15. července 1991 o uvádění přípravků na ochranu
rostlin na trh. Úřední věstník Evropských společenství L 230, 19. 8. 1991. URL: http://eur-
lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?uri=OJ:L:1991:230:TOC
Rortais A., Arnold G., Halm M.-P., Touffet-Briens F. 2005. Modes of honeybees exposure to systemic
insecticides: estimated amounts of contaminated pollen and nectar consumed by different categories
of bees. Apidologie 36 (1): 71−83.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 31 -
Sandrock C., Tanadini L. G., Pettis J. S., Biesmeijer J. C., Potts S. G., Neumann P. 2014. Sublethal
neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agric. Forest
Entomol. 16 (2): 119–128.
Saska P., Skuhrovec J., Lukáš J., Chi H., Tuan S.-J., Honěk A. 2016. Treatment by glyphosate-based
herbicide alters life history parameters of the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum. Sci. Rep.
6: 27801. DOI: 10.1038/srep27801.
Seifrtova M., Halesova T., Sulcova K., Riddellova K., Erban T. 2016. Distributions of imidacloprid,
imidacloprid-olefin and imidacloprid-urea in green plant tissues and roots of rapeseed (Brassica
napus) from artificially contaminated potting soil. Pest Manag. Sci. (in press). DOI:
10.1002/ps.4418.
Séralini G.-E., Clair E., Mesnage R., Gress S., Defarge N., Malatesta M., Hennequin D., de Vendômois J.
S. 2012. Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modified
maize. Food Chem. Toxicol. 50 (11): 4221–4231.
Séralini G.-E., Clair E., Mesnage R., Gress S., Defarge N., Malatesta M., Hennequin D., de Vendômois J.
S. 2014. Republished study: Long-term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant
genetically modified maize. Environ. Sci. Eur. 26: 14. DOI: 10.1186/s12302-014-0014-5
Schloss P. D., Westcott S. L., Ryabin T., Hall J. R., Hartmann M., Hollister E. B., Lesniewski R. A., Oakley
B. B., Parks D. H., Robinson C. J., Sahl J. W., Stres B., Thallinger G. G., Van Horn D. J., Weber
C. F. 2009. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported
software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23):
7537–7541.
Sierra-Santoyo A., Hernández M., Albores A., Cebrián M. E. 2000. Sex-dependent regulation of hepatic
cytochrome P-450 by DDT. Toxicol. Sci. 54 (1): 81–87.
Springett J. A., Gray R. A. J. 1992. Effect of repeated low doses of biocides on the earthworm Aporrectodea
caliginosa in laboratory culture. Soil Biol. Biochem. 24 (12): 1739–1744.
Suchail S., Debrauwer L., Belzunces L. P. 2004a. Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera. Pest Manag.
Sci. 60 (3): 291−296.
Suchail S., De Sousa G., Rahmani R., Belzunces L. P. 2004b. In vivo distribution and metabolisation of 14C-
imidacloprid in different compartments of Apis mellifera L. Pest Manag. Sci. 60 (11): 1056−1062.
Suchail S., Guez D. Belzunces L. P. 2000. Characteristics of imidacloprid toxicity in two Apis mellifera
subspecies. Environ. Toxicol. Chem. 19 (7): 1901−1905.
Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001a. Degradation of imidacloprid in Apis mellifera. In: Belzunces
L. P., Pélissier C., Lewis G. B. (eds.) Hazards of pesticides to bees: Avignon (France), September
07−09, 1999. 7th International Symposium of the ICP-BR Bee Protection Group co-organised by
INRA and ACTA. Institut national de la recherche agronomique, Paris, France, pp. 298−299.
Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001b. Discrepancy between acute and chronic toxicity induced by
imidacloprid and its metabolites in Apis mellifera. Environ. Toxicol. Chem. 20 (11): 2482−2486.
Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001c. Toxicity of imidacloprid and its metabolites in Apis mellifera.
In: Belzunces L. P., Pélissier C., Lewis G. B. (eds.) Hazards of pesticides to bees: Avignon (France),
September 07−09, 1999. 7th International Symposium of the ICP-BR Bee Protection Group co-
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 32 -
organised by INRA and ACTA. Institut national de la recherche agronomique, Paris, France, pp.
121−126.
Tate T. M., Spurlock J. O., Christian F. A. 1997. Effect of glyphosate on the development of Pseudosuccinea
columella snails. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 33 (3): 286–289.
Thompson H. M., Levine S. L., Doering J., Norman S., Manson P., Sutton P., von Mérey G. 2014.
Evaluating exposure and potential effects on honeybee brood (Apis mellifera) development using
glyphosate as an example. Integr. Environ. Assess. Manag. 10 (3): 463–470.
UNEP. 2001. Stockholm convention on persistent organic pollutants. Secretariat of the Stockholm
Convention. United Nations Environmental Programme (UNEP) chemicals. Geneva , Switzerland.
URL: http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_en.pdf
US EPA, et al. 2012. White paper in support of the propřed risk assessment process for bees. Submitted to
the FIFRA Scientific Advisory Panel for review and cement, September 11 – 14, 2012. Office of
Chemical Safety and Pollution Prevention, Office of Pesticide Programs, Environmental Fate and
Effects Division, Environmental Protection Agency, Washington DC, USA; Environmental
Assessment Directorate, Pest Management Regulatory Agency, Health Canada, Ottawa, ON,
Canada; California Department of Pesticide Regulation, Sacramento, CA, USA. URL:
http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/surfwtr/presentations/epa_whitepaper.pdf
US EPA, et al. 2014. Guidance for assessing pesticide risks to bees. Office of Pesticide Programs, United
States Environmental Protection Agency, Washington, DC, USA; Health Canada, Pest Management
Regulatory Agency, Ottawa, ON, Canada; California Department of Pesticide Regulation,
Sacramento, CA, USA. URL: https://www.epa.gov/sites/production/files/2014-
06/documents/pollinator_risk_assessment_guidance_06_19_14.pdf
vanEngelsdorp D., Evans J. D., Saegerman C., Mullin C., Haubruge E., Nguyen B. K., Frazier M., Frazier
J., Cox-Foster D., Chen Y., Underwood R., Tarpy D. R., Pettis J. S. 2009. Colony collapse disorder:
a descriptive study. PLoS One 4 (8): e6481. DOI: 10.1371/journal.pone.0006481.
Ware G. W. 1975. Effects of DDT on reproduction in higher animals. Residue Rev. 59: 119–140.
Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D. J. (1991) 16S ribosomal DNA amplification for
phylogenetic study. J. Bacteriol. 173 (2): 697–703.
Wheeler W. B. 2002. Role of research and regulation in 50 years of pest management in agriculture.
Prepared for the 50th anniversary of the Journal of Agricultural and Food Chemistry. J. Agric. Food
Chem. 50 (15): 4151–4155.
Whitehorn P. R., O'Connor S., Wackers F. L., Goulson D. 2012. Neonicotinoid pesticide reduces bumble
bee colony growth and queen production. Science 336 (6079): 351–352.
Williams G. R., Troxler A., Retschnig G., Roth K., Yañez O., Shutler D., Neumann P., Gauthier L. 2015.
Neonicotinoid pesticides severely affect honey bee queens. Sci. Rep. 5: 14621. DOI:
10.1038/srep14621.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 33 -
11. Obrazová příloha
Obrázek 2. Izolátory se síťovinovou kapucí s experimentálními včelstvy o obdobném počtu jedinců,
ideálně o síle cca 5 000 jedinců.
(Foto: Martin Kamler)
Legenda: A) celkový pohled na izolátory s experimentálními včelstvy; B) pohled do izolátoru zvenčí;
C) dávkování cukerného roztoku s aplikovaným xenobiotikem; D) testované xenobiotikum je chráněno před
slunečním zářením.
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 34 -
Obrázek 3. Kukly ve stádiu červené oči. Při odběru tohoto typu vzorku je nezbytné dbát na stejnost
červenosti očí a ocelli u všech typů vzorků, které budou analyzovány. Protože jsou kukly umístěny v buňce
plástu, může se v závislosti na sklonu světla zdát, že jsou oči světlejší nebo tmavší. Proto odebíráme pouze
ty vzorky, o kterých jsme předvědčeni, že po vytažení z buňky mají správnou pigmentaci očí a ocelli.
(Foto: Veronika Souralová) (Foto: Veronika Souralová)
Obrázek 4. Líhnoucí se včely – mladušky.
(Foto: Julie Chalupníková) (Foto: Veronika Souralová)
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 35 -
Obrázek 5. Včely z plodového plástu jsou sklepnuty do plastového pytle.
(Foto: Tomáš Erban)
Obrázek 6. Odběr mrtvých včel nalézajících se mimo úl do vzorkovnice.
(Foto: Julie Chalupníková)
Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©
- 36 -
Obrázek 7. Živé včely nalézající se mimo úl.
(Foto: Julie Chalupníková)
Hodnocení vlivu xenobiotik na včely