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Vecteurs synthétVecteurs synthétiiques : ques : SyntheGeneTransfer et MégSyntheGeneTransfer et Mégaanucléanucléasseses
Applications à la thérapie géniqueApplications à la thérapie génique
Tours le 23 oct 2008Tours le 23 oct 2008
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Gene Therapy
La thérapie génique est une stratégie thérapeutique qui consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou
les tissus d'un individu pour traiter une maladie.
La thérapie génique vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectif par un allèle fonctionnel ou à
surexprimer une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique.
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Différentes Approaches pour la Thérapie Génique
1. Addition = Insertion du Gène dans un autre locus
2. Remplacement = Correction du Gène sur son locus
Intégration aléatoire
Intégration ciblée
Intégration ciblée
Complémentation
* Mutation
insertionnelle
* Activation
d’oncogènes
* Extinction du
transgène
* Extinction du
transgène choix du locus, du tissu
*
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HR & TG
Qq 100 pb d’homologie entre la séquence cible et le locus
Des extrémités d’ADN libres = ADN db coupure
=> stimulation du processus
ADN db coupure = signal pour la machinerie HR
HR et TG = échange d’informations génétiques entre une séquence endogène sur un chromosome et une séquence exogène d’ADN (plasmide).
TG Gene targetting
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Undamaged DNA (Allele S)
DSB Created (spontaneous or induced, e.g. by ZFN )
Strand Invasion into Undamaged Homologous DNA (Allele A)
In gene targeting exogenous DNA serves as homologous DNA donor.
Repairing of original strands of DNA. Gaps filled by DNA polymerase and nicks sealed
by DNA ligase.
Conversion of White Allele(“S”) into Red Allele (“A”) in region of DSB
S
A
A
Homologous RecombinaisonRéparation de l’ADN : coupure d’ADN double brin (DSB)
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Homologous Recombinaison
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transposition
3’ Néo 3’
HSV-TK
GcvR
GcvS
recombinaison
Homologous Recombinaison
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Homologous Recombinaison
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Réparation de l’ADN
Homologous Recombinaison
Réparation sans erreurs
NHEJ
Non Homologous End Joining
Réparation avec petites erreurs
van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765
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HR & TG
Dans les autres cellules : HR est inefficace 10-7 à 10-5
- Murine Embryonic Stem Cells 1/100 à 1/1000
100 % efficacité
- Saccharomyces cerevisiae
- Trypanosoma brucei
- Phycomitrella patens
- Chicken DT40 lymphoid cell line
- Qq souches E. coli
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Développement d’alternatives
1 - Correction par de petits oligonucléotides : mutation ponctuelleTFO triplex forming oligonucleotides
RDO RNA-DNA oligonucleotide Kolb Trends Biotechnol 2005
SFHD short fragment homologous replacement
2 - Sequence-specific endonucleases = MEGANUCLEASE
Correction ou insertion
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MEGANUCLEASE story
1980 découverte de HO et I-SceIEndonucléases de levureInitie HR à un locus spécifique
I-SceI codée par un intron mitochondrialCopie l’élément dans un seul locus : HOMING18 pb
18 pb parfait pour créer une seule coupure dans le génome (418)
46 pour les enzymes de restriction
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MEGANUCLEASE story
Elles sont codées par des éléments génétiques mobiles comme les introns de classe I ou les intéines, qui promeuvent leur propre dissémination par leur activité d'endonucléase.
Domaine de liaison à l’ADN = domaine de coupure
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MEGANUCLEASE story
Méganucléase = endonucléase site >12pb
Méganucléase naturelle = Homming endonuclease
Méganucléase artificielle = Zing finger.
Familles de protéines eucaryotes, bactéries et archébactéries, végétaux
Pas chez les métazoaires animaux pluricellulaires
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GFP Gene Targeting System
CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8PGK-Neo
37GFP-IRES-CD8
37GFP-IRES-CD8
Stop-Sce Site
327
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Spontaneous Gene Targeting
CMV/CBA-GFP-IRES-CD8PGK-Neo
Rate= 7.1 x 10-7
(Approximately 1 per million)
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DSB-Mediated Gene Targeting
CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8PGK-Neo
37GFP-IRES-CD8CMV-Sce
Stop-Sce Site
37GFP-IRES-CD8
Stop-Sce Site
Cellules de mammifères
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DSB-Induced Gene Targeting
CMV/CBA-GFP-IRES-CD8PGK-Neo
Optimized Rate of DSB Mediated Gene Targeting= 3-5 x 10-5 à-2
(3-5%) (or 30-50,000 per million)
Problèmes : Insertion aléatoireRéparation des jonctions efficace d’un seul côtéLocalisation DSB et correction (< 500pb) Pas de site I-SceI naturel chez les mammifères
Les méganucléases fonctionnent chez les mammifères
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Méganucléase & CO
+ 100 candidats
Mais le répertoire des séquences cibles ne rend pas compte de la complexité des génomes
Engineering des protéines mais extrêmement complexeManque informations structurales et de méthodes
DAGLIDADG His-Cys box
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How to create that DSB?
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Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break
1. Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .)
2. DNA cleaving ribozyme?
3. Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid
4. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
5. Modified homing endonuclease.
Not the purpose
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Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
- 30 AA organisés en une structure stabilisée par un ion Zn2+
Grand sillon de l’ADN
- Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides
- Motifs les plus répandus dans les domaines de liaison à l’ADN (TFs)
![Page 23: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/23.jpg)
Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
Les ZF Cys2His2: de nombreux avantages
-Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides
-Fonctionnement modulaire de la protéine
- Les ZF sont assemblables entre eux pour former des protéines polydactiles avec de nouvelles spécificité de reconnaissance.
![Page 24: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/24.jpg)
Nous avons la spécificité comment créer la coupure?
Les ZFPs peuvent être fusionnées à un domaine effecteur
![Page 25: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/25.jpg)
Création d’une Zinc Finger Nucleases
Initially developed by labs of Srinivasan Chandrasegaran (Johns Hopkins) and Dana Carroll (Univ. Utah)
FokI nucleasedomain (Fn)
FokI nucleasedomain (Fn)
= le domaine de coupure de FokI + domaine de reconnaissance de l’ADN de ZF
![Page 26: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/26.jpg)
SANGAMO
![Page 27: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/27.jpg)
SANGAMO
![Page 28: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/28.jpg)
“Sure, but how to create that gene specific DSB?”
![Page 29: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/29.jpg)
Zinc Fingers Seem to Bind DNA in a Modular Fashion
FokI nucleasedomain (Fn)
FokI nucleasedomain (Fn)
![Page 30: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/30.jpg)
CMV/CBA GFP* IRES WRECD8
ZFN Full Site/Sce Site
tGFP
IRES WRECD8
tGFP
CMV/CBA GFP IRES WRECD8
Sce or ZFNExpression
PlasmidGFP Donor
G FPCMV/CBA
Témoin le donneur GFP seul
Le donneur GFP + le plasmide ZFN
Preuve de concept
(G2/M)
3% of asynchronously cells
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Hah, reporter genes are fine, but show me an endogenous
target.
![Page 32: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/32.jpg)
Mutations in IL2RG Gene that Cause SCID
24 pb; 4 ZFP de part et d’autre du hotspot
Urnov et al. (2005)
Stratégie ZFP
Stratégie IL2R
![Page 33: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/33.jpg)
Experimental Design to Detect Targeting at Endogenous IL2RG Locus
1. Transfect K562 cells with IL2RG ZFNs with repair substrate that contains BsrBI polymorphism.
2. Isolate individual clones (no selection).
3. Expand individual clones (no selection).
4. Harvest genomic DNA from individual clones.
5. Analyze genomic DNA for BsrBI polymorphism.
![Page 34: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/34.jpg)
Single-step Homozygous Gene Targeting in Somatic Cells
(K562)
Urnov et al. (2005)
Correction monoallèlique
Correction biallèlique
20% Correction
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Next
1. Essais dans d’autres types cellulaires
2. Essais pour d’autres gènes
3. Sécurité.
• Existence de DSB à d’autres loci =>instabilité génomique?
• Immunogénicité des ZFN
• Toxicité
• Méthode de délivrance
• Moins de problèmes
• Cellules autologues
In vivo
Ex vivo
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Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break
1. Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .)
2. DNA cleaving ribozyme?
3. Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid
4. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
5. Modified homing endonuclease. Fin des années 90
Not the purpose
![Page 37: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/37.jpg)
Modified homing endonuclease.
Spécifité et coupure
![Page 38: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/38.jpg)
Modified homing endonuclease. Fin des années 90
Boost après la cristallisation des premières protéines
DAGLIDADG dans la 1ere hélice de His-Cys box
I-CreI, I-MsoI, PI-SceI dans le gros sillonLes + compactes, les + connues
I-PpoI dans le gros sillonCourbure de l’ADN cible
Interaction directe de qq AA et Ac nuc
Les plus intéressantes
Spécifité et coupure
![Page 39: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/39.jpg)
Engineering HE DAGLIDADG
Smith et al NAR 2006
I-CreIInterface de
contact protéine/ADN
symétrie
AA cibles
![Page 40: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/40.jpg)
Engineering HE DAGLIDADG
Modification de certains AA de
I-CreI mais conserver
64 cibles
palindrome
Smith et al NAR 2006
![Page 41: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/41.jpg)
Engineering HE DAGLIDADGScreening de nouvelles cibles ADN palindromiques
Test de fonctionnalité en levure, coupure de lacZ-, HR, restauration lacZ+
ConclusionConclusion
Folding OK
Stabilité OK
Coupure OK
Mais9 AA contactent Ac Nucl
209 variantsImposible à cribler
X Levure bleue
site cible potentiel
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Engineering HE DAGLIDADG
Découverte d’un fonctionnement en
4 sous modules
Analyse combinatoire en
petits sous problèmes
= même approche ZFP
Cible=patchwork
des mutants parentaux
Essai ciblage du gène RAG1
Recombinaison VDJMaturation des Ig
SCID phenotype
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Engineering HE DAGLIDADG
- HE redessinée pour couper une séquence naturelle
- Efficacité (aussi efficace que I-SceI GT)
- Toxicité (peu ou pas toxique)
Résultats :- loci artificiels - lignées immortalisées
Et dans des cellules primaires et des gènes
endogènes ?
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CELLECTIS
![Page 45: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/45.jpg)
2007
http://www.oseo.fr/a_la_une/paroles_d_entrepreneurs/sur_lci/cellectis
![Page 46: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/46.jpg)
PerspectivesRecombinaison et cycle de division (S/G2)
Recombinaison et accesibilité de la chromatine
Quels types de vecteurs?
Toxicité due à la perte de spécificité* tolérence de dégénérescence dans le site cible
=> coupure cryptique = génotoxicité (ZFN+++)
* HE ou ZFN fonctionnent sous la forme hétérodimèredans la cellule => formation d’homo et hétérodimère
=> homo => perte de spécificité solution dans la nature HE homodimere = un polypeptide
Engineering ZFN et HE grande avancée pour des applications en thérapie génique…
DEMAIN
![Page 47: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/47.jpg)
I want to stay as close to the edge as I can without going over. Out on the edge you can see all kinds of things you can’t see from the center.http://www.vonnegut.com/
-Kurt Vonnegut
![Page 48: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/48.jpg)
Réparation de l’ADN
van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765
![Page 49: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/49.jpg)
Lieber et al., 2004 DNA repair;
2 voies de réparation
Sans homologie
Avec homologie
Protéines ubiquitaires (MRN est partagé par les deux systèmes Lisby et al 2005 Biochimie)
6 protéines
Ku70/86, XRCCA, DNA ligase IV sont conservés de la levure à l’homme
MRN sont conservés de la levure à l’homme
![Page 50: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/50.jpg)
Ma et al., 2005 Cell Cycle; Lieber et al., 2004 DNA repair;
Sur chaque extrémité
Nucléase reconnaît les jonctions ss et ds de l’ADN
Phosphorylation d’Artémis par ATM et PKc
Coupure
Libération du site
Ligase
Famille polymérase X
L’intervention séquentielle des 3 types de protéines est variable
La structure des extrémités reconnues est variable (5’ ou 3’ débordante, bout franc)
La nature des réparations est variable
L’hétérodimer Ku70/Ku86 très abondante--> dès l’apparition d’un DSB, Ku se fixe.
Nucléase (5’-> 3’) Sérine/Thréonine kinase une fois fixé sur l’ADN, s’autophophoryle et P Artémis
ATM active les protéines de contrôle du cycle cellulaire S et G2/M, indépendantes de la p53
PKc et Ku active l’apoptose via p53
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Toutes les protéines ne sont pas toujours nécessaires
![Page 52: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/52.jpg)
Ku/PKc n’existe pas en solution
Rapprochement des extrémités Ku? ou Pkc
Pour faire la réparation, il faut que l’ADN de la chromatine soit accessible à ces protéines.
![Page 53: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/53.jpg)
Pour rendre ADN/nucléosome accessible
La modification la plus étudiée est le phosphorylation de l’histone H2AX sur Ser139 par les PIKK (ATM, ATR, PKc).
-H2AX recrute les enz de réparation et les enz de contrôle
H2AX est incorporée de manière aléatoire dans l’ADN.
Modification de la queue des histones acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination
Incorporation de variants d’histones
Remodelage de la chromatine par des complexes protéiques ATP dépendant appartenant à la famille swi2/snf2
SWI2
ISWI
CHD (hélicase)
INO80
Recrutés sur les DSB
Des cellules dépourvues de H2AX ne réparent pas l’ADN et ne maintiennent pas l’intégrité du génome
Park et al 2006 EMBO J
Des cellules dépourvues des complexes SWI/SNF ne réparent pas l’ADN DSB et la survie cellulaire est affectée.
SWI/SNF complexes facilitent la réparation DSB en permettant la phosphorylation de H2AX.
![Page 54: Tours le 23 oct 2008](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062217/56815895550346895dc5f5e8/html5/thumbnails/54.jpg)
H2AX phosphorylée par ATM génère des loci -H2AX qui serait le point de nucléation des protéines de réparation NHEJ et HR.
-H2AX aurait une fonction d’ancrage des extrémités DSB au travers de ces multiples intéractions afin d’éviter la séparation des extrémités.
MRN recrute ATM ATM
-H2AX
Se lient et rapprochent les extrémités DSB dans NHEJ et HR
H2AX
Bassing et al., DNA repair 2004
Evite les translocations et les délétions