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TRABAJO PRÁCTICO N° 3: Identificación microbiana
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PARTE A: Identificación Fenotípica
• 1.-Pruebas Bioquímicas
• 2- Coloraciones
• 3. Uso del Manual Bergey
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Pruebas Bioquímicas
• Son una serie de pruebas que permiten evidenciar una características determinada (ej: Física, metabólica) permitiendo formar un patrón que ayude a la identificación y diferenciación de un microorganismos de otros relacionados con el mismo
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IMViC
IMViC: conjunto de pruebas bioquímicas que comprende: I = Prueba del Indol M = Prueba de Rojo de Metilo V = Prueba de Voges-Proskauer C = Prueba de utilización de Citrato
Permite la identificación por genero de entero bacterias (bacterias Gram negativas que provienen del intestino)
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Prueba del Indol
• La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el triptófano con producción de Indol y metabolitos indólicos.
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Prueba de Rojo de Metilo
• Detecta la fermentación ácido-mixta. • Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.),
relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.
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Voges-Proskauer
• Detecta la fermentación butanodiólica. • En esta fermentación se producen una gran cantidad
de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína).
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Prueba de utilización de Citrato
• Detecta la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de
• El medio es de color verde, si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, el medio vira al azul por liberación de NaOH.
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Coloraciones
Observación de los microorganismos
Teñidos con colorantes
Vivos sin teñir o en fresco
Ventajas del uso de colorantes:• Proporciona el contraste suficiente entre el microorganismo y el medio que los rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.
• Permite el estudio de estructuras de la célula bacteriana.
• Se puede obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del microscopio.
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¿Que es un colorante?
• Los colorantes son, generalmente, sales en las que uno de sus iones tiene color. Una sal es un compuesto formado por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente.
ClAM CL- + AM+
• Los colorantes se pueden dividir en 2 grupos: básicos y ácidos. Si el colorante reside en el ión positivo, se dice que es un
colorante básico. Si el color reside en el ión cargado negativamente, se dice
que es un colorante ácido.
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Pasos a seguir para realizar una coloración
Como realizar un extendido
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Coloración de Gram
Permite diferenciar microorganismos
en dos grandes grupos
Gram positivos
Gram Negativos
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Pared Celular
Gram positivos Gram Negativos
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Alcohol disuelve los lípidos de la pared bacteriana deshidratación del peptidoglicano
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¿Cómo se observan las bacterias y esporas según la coloración de Gram?
Levaduras Esporas
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COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
• Permite identificar micobaterías. • Por ejemplo: M. tuberculosis, agente causal de la tuberculosis y M.
leprae, agente de la lepra.• Se basa en la propiedad que tienen estas bacterias de resistir la
decoloración con alcohol-ácido después de teñirlas con fucsina fenicada concentrada y en caliente
• Requiere preparación previa del frotis
M. tuberculosis
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TINCIÓN DE BURRI para cápsula
• Permite poner en evidencia la cápsula Bacteriana
CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE FONDO OSCURO Y EL CUERPO BACTERIANO TEÑIDO DE VIOLETA
Klebsiella pneuminiae
Como realizar un extendido
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TÉCNICA DE MOELLLER para esporas
• Permite poner en visualizar la Espora Bacteriana
• La espora se observará de color rojo• El cuerpo vegetativo se observará azul
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IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA para flagelos
• Permite visualizar los flagelos• Los flagelos al ser tan finos (20 nm de diámetro), no pueden
observarse mediante coloraciones comunes, sino que hay que recurrir a tinciones específicas que aumentan su diámetro
Pandoraea spp
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MANUAL BERGEY
• Su objetivo es asistir a la identificación de bacterias e indicar la relación que existen entre los distintos grupos
• El primer Manual Bergey de Bacteriología Determinativa fue publicado en 1923, bajo el auspicio de la Sociedad Americana de Bacteriólogos
• El último manual publicado en el 2000, corresponde a la 2° edición y consta de 5 volúmenes, a diferencia de los anteriores que presentaban un solo
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A grandes rasgos los 5 subvolúmenes se dividen en:
• 1. Archaea, Cyanobacteria, Fotótrofos y Géneros ramificados.• 2. Proteobacteria.• 3. Bajo contenido en G+C. Gram positivas.• 4. Alto contenido en G+C. Gram positivas.• 5. Plantomicetes, Espiroquetales, Fibrobacter, Bacteroides y Fusobacteria.
Las claves para ingresar al manual Bergey eidentificar un microorganismo, son conocer :
•Tipo de metabolismo•Forma y disposición celular•Coloración de Gram
Esto conducirá a la acertada elección de uno deLos 5 volúmenes
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PARTE B: IDENTIFICACIÓN GENOTIPICA
Técnicas moleculares
• Han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos bacterianos.
• Se basan en las principales características que posee el ADN por ej: Homología de cadenas, replicación, polimorfismo, etc• Poseen las siguientes ventajas: rapidez, sensibilidad, especificidad no necesitan microorganismo vivos
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Técnicas moleculares
• Las mas utilizadas en microbiología son las siguientes:
• PCR- Reacción en cadena de la polimerasa• RFLP - Polimorfismo de largos fragmentos de restricción • Hibridación de ADN • PFGE- Electroforesis en gel de campo pulsado
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PCR- Reacción en cadena de la polimerasa
• La PCR amplifica de manera exponencial un fragmento especifico de ADN.
• Se utiliza para: Detección de enfermedades hereditarias, Análisis forense del ADN Detección de patógenos en el hombre Análisis de Paternidad
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La PCR utiliza una enzima ADN-Polimerasa, que se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra complementaria
Actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria termofílica que vive a temperaturas de 110°C La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas temperaturas
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• Para un ciclo de PCR se necesita:
• Enzima Taq polimerasa: amplifica el ADN• ADN blanco a amplificar• Primers: Fragmentos de ADN especificos a
amplificar• dNTP (desoxinucleotidos: dATP, dTTP, dGTP y
dCTP)• Buffer y sales de MgCl2
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Etapas de cada ciclo de PCR
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Análisis de PCR
• El producto obtenido se somete a electroforesis en gel de agarosa. Que permite separar los fragmentos por tamaños e identificarlos utilizando un patrón de ADN
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FIN