uo Huang, Karen A. McDonald ⁎

Departamento de Ingeniería y Química de Materiales Ciencias de la Universidad de California, Davis, Uno Escudos Avenue, Davis , CA 95616 , Estados Unidos

a r t i c i l e n f o un b s t r a c t

Disponible en línea 06 de agosto 2011

Palabras clave:

proteína heteróloga

Cultivo de células vegetales

biorreactor

Bioprocesos

Biomanufacturing

Las células vegetales se han demostrado para ser un huésped de expresión heterólogo atractiva ( el uso de plantas enteras y

cultivos in vitro de células vegetales) para la producción de proteínas extrañas en los últimos 20 años. en líquido vitro

cultivos de células vegetales en un biorreactor totalmente contenida se han convertido en una alternativa prometedora a los tradicionales

la fermentación microbiana y cultivos de células de mamíferos como una plataforma de expresión de la proteína extranjera , debido a la

características únicas de las células vegetales como anfitrión de producción, incluyendo la seguridad del producto , biomanufacturing rentable ,

y la capacidad para proteínas complejas modificaciones post -tradicionales. Proteínas heterólogas tales como

terapéuticas , anticuerpos , vacunas y enzimas para aplicaciones farmacéuticas e industriales han sido

expresado con éxito en los sistemas basados en el cultivo de células de plantas de biorreactores incluyendo desdiferenciado suspendida

células de las plantas, musgo y raíces peludas, etc. En este artículo, el estado actual y las tendencias emergentes de la célula de la planta

Cultura para la producción in vitro de proteínas extrañas se discutirá con énfasis en lo tecnológico

Progreso que se ha hecho en los sistemas de biorreactores de cultivo celular de plantas.

© 2011 Publicado por Elsevier Inc

1. IntroducciónBiomanufacturing de productos de proteína heteróloga se ha ganadocada vez más importancia debido a la demanda del mercado ampliado paraaplicaciones terapéuticas e industriales que conducen al desarrollode las plataformas de expresión seguras y rentables alternativas ytecnologías emergentes (Hacker et al, 2009 ; . Karg y Kallio, 2009).En la actualidad, varios sistemas de expresión de genes se han desarrollado paraproducción de proteínas extrañas. Cada sistema ofrece distintas característicasque consiste en la mejora expresión de la proteína, facilidad de genéticacalidad de la manipulación, y la proteína (Durocher y Butler, 2009). enla última década, la plataforma de expresión a base de células de plantas comosistema de biorreactor ( plantas enteras y in vitro de células vegetales , órganos ycultivos de tejidos ) se han investigado como una alternativa potencial parala producción a gran escala de proteínas extrañas incluyendo producidos por plantasproductos farmacéuticos ( PMP ) y productos industriales producidos por plantas ( PMIP )( Davies, 2010 ; Sharma y Sharma , 2009 ) . Biorreactores de células vegetalesproporcionar características atractivas sobre los sistemas de expresión tradicionales queutilizar microbiana y las células huésped de mamífero , incluyendo su intrínsecacélulas de seguridad ( de plantas no se propagan los virus de mamíferos ypatógenos y puede ser fácilmente crecido sin derivado animal de cualquiercomponentes que son consideraciones importantes para la terapéuticaaplicaciones ) , biomanufactura rentable que conduce a la disminucióncostos de producción ( Shadwick y Doran , 2005 ), y la capacidad paramodificaciones posteriores a la traducción ( capacidad para producir glicoproteínasy proteínas multiméricas complejos con similitud a su nativacontrapartes en términos de estructura -N glicanos en comparación con los mamíferoscélulas) ( Gomord et al. , 2010 ) . Las características de varios anfitrión cellbasedsistemas de expresión de proteínas se han discutido ampliamente( Demain y Vaishnav , 2009 ; . Yin et al, 2007) .En comparación con el uso de plantas enteras como una plataforma de producción , encultivos in vitro de células de plantas ( células vegetales en suspensión , tejido y órganoculturas, etc ) obtenidas en los sistemas de biorreactores controlables oferta adicionalcaracterísticas para la producción de proteínas extrañas sostenido económico( Hellwig et al . , 2004 ), tales como 1 ) los ciclos de producción más cortos en que elescala de tiempo para la producción de proteínas extrañas en cultivo de células vegetales requieredías o semanas en comparación con el mes en plantas transgénicas ; 2) másrendimiento de producto de consistencia en lote a lote , la calidad y la homogeneidaddel patrón de proteína diana -N glicanos debido a la cultura homogéneade células de plantas en condiciones controladas de bioreactor ( De Muynck et al. ,2010 ; Lienard et al, 2007) . ; 3 ) más barato y más simple aguas abajola recuperación y purificación particularmente para productos secretados en elmedio extracelular y el metabolito secundario inferior y de la célula huésped

concentración de proteínas ( Rawel et al, 2007 . ); 4 ) eliminación de la necesidadde mano de obra intensiva para el cultivo de invernadero o plantas cultivadas en el campo ;5 ) reducción de la contaminación de endotoxina y de micotoxinas ; 6 ) más seguroplataforma de producción en un sistema de biorreactor cerrado , evitando el flujo de genesen el medio ambiente y la contaminación de las cadenas alimentarias ( Franconiet al. , 2010 ) , y 7 ) la facilidad de cumplimiento de los requisitos de cGMP yproceso de registro del producto, etcEl notable avance para mejorar la producción de proteínas extrañasrendimiento y calidad a través de la ingeniería bio-reactor ( Huang yMcDonald, 2009 ) y de la ingeniería genética enfoques ( Desai et al. ,2010 ; Streatfield , 2007 ) , tales como una mayor transcripción del transgén ,estabilidad después de la transcripción y traducción de eficiencia , se ha demostradoque el cultivo de células de plantas in vitro se convierta en un entorno propiciotecnología para Biomanufacturing proteínas extrañas . En este artículo, elrecientes avances tecnológicos en los cultivos celulares de plantas a base de biorreactorespara la producción in vitro de proteínas extrañas se discutirá.2 . La producción de proteínas de Relaciones Exteriores en el uso de cultivo de células vegetales in vitroEn la actualidad, las proteínas extrañas que incluyen proteínas terapéuticas (anticuerpos ,antígenos , vacunas y proteínas de la sangre humana , etc ) , proteínas de la especialidad( por ejemplo, gelatina y colágeno para cápsulas de la droga ) , y enzimas industriales (talescomo celulasas y lipasas para aplicaciones de biocombustibles ) se pueden expresar en la plantacultivos de células , incluyendo células vegetales indiferenciadas (como suspendidocélulas de tabaco , arroz y zanahoria, etc ) y los tejidos de la planta y diferenciadacultivos de órganos (como root musgo y peludo , etc ) ( Holland et al. , 2010 ) .Un sistema ideal de plantas de células de cultivo del biorreactor para la proteína extranjera a gran escalala producción debe tener las siguientes características: 1 ) la facilidad de genéticamanipulación por cualquiera de transformación estable o la expresión transitoria , 2 )alto nivel de expresión de proteínas, 3 ) la actividad proteolítica endógena baja, 4 )alta estabilidad de producto en el medio ambiente expresión heteróloga(dentro y fuera de las células) , 5 ) baja concentración de secundariametabolitos (puede causar cambios en las proteínas estructurales y biológicaspropiedades y / o complicar los procesos downstreaming ) , 6 ) postraduccionalcapacidad de modificación, patrón de glicosilación uniforme yplegamiento de la proteína , y 7 ) dispersión homogénea en un biorreactor ,etc Tabla 1 muestra ejemplos de expresión de la proteína extranjera por establementetransforman los sistemas de cultivo de células vegetales . En esta sección, el estado actualy las características de diferentes tipos de célula de la planta basada en biorreactorSe discutirán las culturas para la producción de proteína extraña.2.1 . La producción de proteínas de Relaciones Exteriores en las células vegetales indiferenciadas suspendidos

Cultivos en suspensión de células vegetales indiferenciadas impulsados por una variedadde sistemas de expresión de genes , se utilizan comúnmente para la proteína extrañaproducción ( Huang y McDonald, 2009 ; . Lico et al, 2008 ) debido a lahecho de que son más susceptibles a las regulaciones cGMP y pueden sercultivada y optimizado fácilmente en biorreactores a gran escala ( Shih yDoran, 2009 ) . Cultivos en suspensión de células vegetales se derivan generalmente detransformado de manera estable los tejidos vegetales por transformación mediada por Agrobacterium .Células de callos iniciados a partir de explantes de plantas transgénicaspueden ser cultivadas en un medio definido químicamente para establecer transgénicocultivos en suspensión de células ( Rao et al. , 2009). Generalmente la adición dereguladores de crecimiento se requiere en el medio para promover la rápidacrecimiento de las células y mantener la morfología celular .Recientemente Protalix Biotherapeutics en Israel y Pfizer en los EE.UU.anunciado una colaboración para desarrollar y comercializar dicha planta de laglucocerebrosidasa recombinante ( prGCD ) usando una zanahoria transgénicasuspensión de cultivo celular plataforma biorreactor como un agente terapéutico biológicodrogas de proteína para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher en la UE y EE.UU.( Ratner, 2010 ) . Esto representa un hito emocionante para el reconocimiento decélula vegetal biomanufacturing basado en la cultura como un bio- equivalente yalternativa económica a la producción de productos biofarmacéuticos de mamíferos humanos,lo que sugiere además la posibilidad de productos bioequivalentes parafármacos de proteínas existentes. En otro acontecimiento prometedor, un recombinantevacuna animal contra la enfermedad de Newcastle (NDV ) produce encultivos celulares de tabaco transgénicas por Dow Agrosciences fue aprobado porUSDA en febrero de 2006 ( Travis, 2008 ) . Ambos representanavances para el desarrollo de cultivo de células vegetales como biomanufacturingplataforma para la producción a gran escala de productos de proteína extranjera.Protalix Biotherapeutics ha desarrollado una suspensión zanahoria transgénicaplataforma de cultivo de células (llamado ProCellEx ™ ) para la producción de prGCD parapacientes con enfermedad del trastorno genético de Gaucher , un lisosomal rarala enfermedad , que no son capaces de degradar glucosilceramidas en el cuerpo debidoal hecho de que GCD es ausente o no funcional ( Shaaltiel et al . , 2007 ) .Actualmente, los pacientes se tratan con ya sea el Ceredase ® por Genzyme , una

Tabla 1Selección de ejemplos de producciones de proteína extranjera por cultivo de células vegetales en diversos sistemas de biorreactores (Huang y McDonald , 2009 ).Especies de plantas Culturatipo

Condiciones de trabajo de nivel de sistema de biorreactor de localización sistema Promotor Producto proteico Producción Ref .NicotianabenthamianasuspensióncélulasAAT Humanos CaMV 35S ( constitutiva ) secretada,extracelularSTB , de tonoturbina de pala25 ° C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , B1 lote g - FAAT / L (sin control de pH ) ,100 mg - FAAT / L (control del pH)Huang et al .( 2009 )NicotianabenthamianasuspensióncélulasSistema XVE inducible AAT Estradiol Humano( inducible química )secretada ,extracelularSTB , de tonoturbina de pala25 ° C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , por lotes ,10 M estradiol (single inducción)b1 g - FAAT / L (sin control de pH ) ,60 mg - FAAT / L (control del pH)Huang et al .( 2009 )Suspensión N. benthamianacélulasVirus del mosaico del pepino AAT humanavector vírico inducible ( CMViva )secretada ,extracelularSTB , de tonoturbina de pala25 ° C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , por lotes ,10 M estradiol (single inducción)25 mg - FAAT / L ( sin control de pH) ,100 mg - FAAT / L (control del pH)

Huang et al .( 2009 )Suspensión N. benthamianacélulasVirus del mosaico del pepino AAT humanavector vírico inducible ( CMViva )secretada ,extracelularSTB , de tonoturbina de pala25 ° C , 50 a 100 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , SCC ,1 M de estradiol ( múltiple de inducción)600 g - FAAT / L ( control de pH ) Huang et al .( 2010 )Oryza sativa ( arroz) SuspensióncélulasAAT RAmy3D humano ( metabólica inducible ) secretada,extracelularSTB , de tonoturbina de pala75 rpm , 27 ° C , 70 % lo hacen , 0,1-0,2 vvm ,la cultura de dos etapas40-110 mg / l , 3-12 mg / ( L - día ) ,4-8 mg / ( g- DCW - día )Trexler et al .( 2005 )O. sativa ( arroz) SuspensióncélulasAAT humano RAmy3D secretada,extracelularbiorreactor de membrana( CELLine )25 ° C , 130 rpm , la cultura de dos etapas( inanición azúcar)100-247 mg / l , 4-10 % de TSP McDonald et al .( 2005 )N. tabacum L.cv. BY- 2suspensióncélulasASh CaMV 35S secretada,extracelular

STB , de tonoturbina de pala26 ° C , 200 rpm , 20 % DO, 0,1 vvm , lote 3.9 a 4.2 mg / L de Schmale et al .( 2006 )O. sativa ( arroz) SuspensióncélulasASh RAmy3D secretada,extracelularBurbuja columna de 27 ° C , pH 7 , 1,6 vvm , lote repetido 76,4 mg / L de Huang et al .( 2005 )N. tabacum L. SuspensióncélulasHGM - CSF CaMV 35S secretadas ,extracelularFrasco 110 rpm , 12 días , 25 ° C , lote 105 g / L de Hong et al .( 2002 )O. sativa ( arroz) SuspensióncélulashGM -CSF RAmy3D secretada,extracelularFrasco 110 rpm , 13 días , 27 ° C , lote 129 mg / l , 25 % de TSP Shin et al . ( 2003 )Glycine max(soja)suspensióncélulasHBsAg quiméricos (AO) 3MAS( constitutiva )Intracelular Frasco 120 rpm , 27 ° C , oscuro , lote 22 mg / L de Smith et al .( 2002 )G. max(soja)suspensióncélulasHBsAg Arabidopsis ubiquitina( constitutiva )Intracelular , ERretentionFrasco de 80 rpm , 16 h luz / 8 h oscuridad , lote 700 ng / ( g- FCW ) Ganapathi et al.( 2007 )patata( var. Kufri Bahar )Etileno raíces peludas HBsAg enzima formandopromotor del gen de plátano

Agitador intracelular Frasco giratoria , oscuridad durante 10 días. 97,1 ng / g- FCW Sunil Kumaret al . ( 2006 )N. tabacum cv NT- 1 raíces peludas ratón mAb IgG CaMV 35S ( pMON 530 ) secretada ,extracelularFrasco de 25 º C, 100 rpm 1,4 mg / L en 36 días, 1,1 mg / g- DCW Sharp y Doran( 2001b )N. tabacum cv NT- 1 Suspensión Mouse mAb IgG CaMV 35S ( pMON 530) secretadas ,extracelularFrasco de 25 º C, 100 rpm 3,6 mg / l en 5 días, 1,2 mg / g- DCW Sharp y Doran( 2001b )Suspensión de zanahoriacélulasHumano GCD CaMV 35S intracelular(señal vacuolar )burbuja desechablecontenedor de la columna25 ° C , 0,25 vvm No disponible Shaaltiel et al .( 2007 ) )N. tabacum L. cv.XanthiSuspensión antirrábico Humanosvirus mAbCadena pesada por CaMV 35S ;cadena ligera por Pin2pIntracelular Wave - mezclado ybiorreactor Undertow25 ° C 30 g / g - DCW , 0,5 mg / L de Girard et al .( 2006 )Hordeum vulgare suspensión de colágeno humano Ialfa 1 cadenaUbiquitina de Arabidopsis intracelular , ERretention( HDEL )Wave - mezcladobiorreactor , discontinuo alimentado22 ° C , 0,5 SLPM , 9 ° ángulo de balanceo ,10 oscilaciones por minuto.2 a 9 g / L de Ritala et al .( 2008 )N. tabacum cvXanthiRaíces peludas cadena sencillaIL-12 murina

35S - dobles mejoradapromotorIntracelular frasco ; air-lift ; nieblareactor25 ° C , 100 rpm ( matraz ) ; 25 ° C , 0,1vvm ( AR y Niebla )31 g / L- día ( frasco ) , 14 mg / L- día( AR ) , 22 mg / L- día ( Mist )Liu et al . , 2009El musgo PhyscomitrellapatensProtonemaltejidoVEGF CaMV 35S intracelular 28 m de longitud tubularfotorreactorpH 5,8 , 22 ° C , la perfusión por CFFcon D = 10 o 20 por día ;360 mg / g- DCW en 30 días ( Lucumí yPosten , 2006 )Musgo P. patens ProtonemaltejidoVEGF 35S de CaMV ; beta - tubulinapromotor de PhyscomitrellaIntracelular STB , impulsor marina ,500 rpmpH 4,5 a 7 , 25 ° C , semiinconsciente conD en 0.57/day3 - pliegues rendimiento superior al obtenidocon el promotor 35S de CaMVJost et al . ( 2005 )AR : air-lift ; BC: columna de burbujas ; HACER: oxígeno disuelto ; DCW : peso de célula seca ; FCW : peso de células frescas; ER : retículo endoplasmático ; D: tasa de dilución ( 1 por día ) .STB : biorreactor de tanque agitado ; CFF : filtración de flujo cruzado ; vvm : volumen de gas por volumen de cultivo por minuto ; SCC : cultura semicontinuo .TSP : proteína soluble total ; AAT : alfa- 1 - antitripsina ; FAAT : funcional alfa - 1 - antitripsina ; HSA: albúmina de suero humano ; HBsAg : antígeno de superficie de la hepatitis B

Forma de la GCD nativa purificada a partir de tejido de placenta humana, o

Cerezyme ® de Genzyme, una GCD humana recombinante producida en células CHO

Cultivo celular ( Ratner, 2010 ) . Sin embargo, la rGCD purificado a partir de células CHO

Cultura requiere adicional en reacciones enzimáticas in vitro para exponer la

Residuos de manosa terminales de sus cadenas -N glicanos para facilitar la absorción de

el MCD en macrófagos. Este complejo processingmakes GCD uno de

las terapias más costosas hasta la fecha con un costo anual del tratamiento

de cerca de 200.000 dólares EE.UU. por paciente (Kaiser , 2008 ) . El prGCD expresó

en cultivo de células de zanahoria transgénica a partir de Protalix se fusiona al extremo N - terminal de

péptido señal de Arabidopsis thaliana endoquitinasa básica y un C-terminal

vacuolar secuencia fromtobacco quitinasa A. Debido

prGCD se retiene en ER ( retículo endoplasmático ) durante la glicosilación

modificación y entonces dirigido a la vacuola , los N-glicanos se recortan

para exponer los residuos de manosa y la manosa glicosilación correcta

patrón puede bemade células vegetales dentrode . Por lo tanto , la in vitro recorte

de los glicanos se elimina en el procesamiento aguas abajo , dando como resultado

reducción significativa de costos para in vitro proteinmodification ( Shaaltiel et al. ,

2007 ) . Además , la vida media de prGCD era más larga que la de

Cerezyme ® de Genzyme . Actualmente , prGCD está experimentando una fase III

estudio de ensayo clínico para evaluar su seguridad y eficacia en pacientes de Gaucher .

2.2 . Producción de proteínas extranjera en órgano de la planta diferenciada y tejidos

cultura

La división celular de las plantas puede ocurrir ya sea en un patrón no organizado, como en

el crecimiento de callo , o en un patrón organizado con la formación de

centros meristemáticos directamente en los tejidos de explantes para el desarrollo de

en brotes, raíces o embriones somáticos. El tejido vegetal y cultivos de órganos ,

como culturas de raíces musgo y peludas , se utilizan comúnmente para la secundaria

metabolito ( Zhong , 2001 ) y la producción de proteína extraña ( Shih y

Doran, 2009 ) . Debido a que las células del órgano de la planta o tejido son totalmente

, la inestabilidad genética diferenciada observado en planta dediferenciado

no se ha informado de cultivos de células . Sin embargo , la morfología de la planta

cultivos de tejidos y órganos en una bioreactormay complican el biorreactor

operación y hacen que sea difícil lograr una cultura homogénea

medio ambiente.

2.2.1 . Moss y la lenteja de agua en el cultivo in vitro

El ciclo de vida de las patenas musgo Physomitrella , perteneciente a la

Bryophyta phylum , comienza con la germinación de las esporas , seguido por

el crecimiento de un filamento de células ramificado , el protonema ( Decker y

Reski , 2004 ) . Aunque el cultivo in vitro de todas las etapas del musgo

ciclo de vida se ha establecido , el protonema es el más vegetativo

escenario para la ingeniería genética y la operación del biorreactor a gran escala para

producción de proteínas extrañas . El musgo se puede cultivar en una chemicallydefined

medio compuesto por sales inorgánicas con la luz y el CO2 como el

fuentes de energía y de carbono en un sistema de biorreactor , proporcionando único

características que cumplan los requisitos para la producción de proteínas extrañas,

crecimiento celular tan rápido , facilidad de manipulación genética y transformación ,

alta estabilidad genética , la capacidad de la proteína glicosilada hechos a planta

la producción con los patrones de glicano humanizados no inmunogénicos

( Gomord et al, 2010 ; . Gorr andWagner , 2008 ) , y la proteína extraña seguro

producción sin la necesidad de compuestos derivados de animales .

Además de Protalix mediante el cultivo de células de zanahoria transgénica para prGCD

producción, Biolex Therapeutics es otra empresa que tiene una planta de

cultura - producido fármaco proteico ( interferón alfa - 2b para el tratamiento de

hepatitis C ) a finales de la Fase 2b ensayo clínico hasta la fecha. Biolex ha desarrollado

su LEX SystemSM , que utiliza la cultura acuática Lemna transgénico en un

biorreactor , por biomanufacturing de seguimiento de productos biológicos ( biosimilares ) ,

difíciles de producir proteínas terapéuticas y anticuerpos monoclonales que son

esperado para mejorar su eficacia y potencia en comparación con thosemade

en células de mamífero ( Ratner , 2010 ) .

2.2.2 . Hairy raíz en cultivos celulares in vitro

Raíces peludas transformadas de muchas especies de plantas han sido

investigado como un sistema de biorreactor célula vegetal alternativa a plantar

cultivo en suspensión de células de ambos metabolitos secundarios valiosos ( Giri

y Narasu , 2000 ) y la producción de proteínas extrañas ( Georgiev et al. ,

2007 ; Shadwick y Doran , 2007 ) . Raíces peludas son raíces neoplásicas

derivada de raíces de las plantas transformadas por la integración de los genes de

Ri plásmido de Agrobacterium rhizogenes en el genoma de la planta huésped ,

lo que resulta en la proliferación activa de raíces peludas ( Chilton et al . , 1982 ) .

Una ventaja única para el cultivo a gran escala es que las raíces peludas pueden ser

propaga indefinidamente en medio líquido y retener su morfológico

la integridad y la estabilidad en la ausencia de crecimiento de la planta exógena

reguladores. Los estudios han demostrado que el cultivo de la raíz peluda tiene significativamente

mejora genética a largo plazo y la estabilidad de biosíntesis en comparación con

las células vegetales en suspensión para la producción de proteínas extrañas ( agudos y

Doran, 2001b ) . Shadwick y Doran ( 2007 ) utilizaron tipo salvaje raíces peludas

como un sistema de cultivo in vitro para la propagación de virus de plantas ,

lo que sugiere la viabilidad de la expresión transitoria basados en virus vegetal en

raíces peludas .

2.3 . Características de los cultivos in vitro de células vegetales en

Las células vegetales presentan características atractivas para la producción de proteínas extrañas ;

sin embargo, su fisiología biológica , morfológica y celular

características, que son distintivos de microbios y mamíferos

cultivos de células , deben ser considerados para su escalabilidad en la producción .

La Tabla 2 resume las características de los cultivos in vitro de células vegetales en como

consideraciones prácticas en el desarrollo de una operación basada en biorreactor

para la producción de proteínas extrañas , incluyendo el crecimiento celular , el oxígeno

demanda , la morfología y la agregación , cultura de la propiedad reológica

y sensibilidad a la cizalladura de cultivos de células de plantas, etc El cultivo celular crítico

condiciones, que afectan la productividad de proteínas extrañas y calidad, y

acoger el crecimiento celular , que tenga que ser optimizada y controlada durante

operación de biorreactor .

3 . Sistemas de biorreactores para cultivos in vitro de células vegetales en

Diferentes diseños de biorreactores ofrecen características únicas para proporcionar una

ambiente óptimo para el crecimiento celular eficaz y proteína extraña

producción bajo diferentes circunstancias . Diseñar, seleccionar y operar

un biorreactor adecuado para la producción de proteínas extrañas , uno necesita

considerar las características de los cultivos in vitro de células vegetales (Tabla 2 ) y

propiedades de la proteína diana , incluyendo el vector de expresión génica ( constitutiva

o un sistema de promotor inducible ) , la localización del producto y la estabilidad innata ,

etc sistemas de biorreactores disponibles para la célula microbiana y de mamífero

la cultura y de las culturas de células vegetales para la producción de metabolitos medicinal

y micropropagations se pueden implementar para la producción de

proteínas extrañas en cultivos de células de plantas. Además , la escalabilidad y

condiciones sostenibles del biorreactor systemwhich proporcionar adecuada

mezclando andmass transferwhile minimizar la intensidad esfuerzo cortante

las células vegetales se deben considerar para la proteína extranjera a gran escala

producción . En esta sección, el progreso tecnológico en biorreactor

se discuten los sistemas in vitro para los cultivos de células de plantas en . Tabla 3

se resumen las características importantes de diversos sistemas de biorreactor in vitro

cultivos de células vegetales .

3.1 . Sistemas de biorreactores reutilizables

Sistemas de biorreactor reutilizables , en la que se hacen recipientes de cultivo

de acero inoxidable con una configuración estándar o modificado , que requiere

esterilización in situ (SIP) y sistemas (CIP) de limpieza en el lugar , son

comúnmente utilizado en la industria para la célula de mamífero gran escala

la cultura y la fermentación microbiana, con escalas que van desde

1000 L a 25.000 L en el volumen de trabajo .

3.1.1 . Biorreactores de tanque agitado

Biorreactores de tanque agitado (STB) equipado con impulsores adecuados puede

proporcionar altos coeficientes de transferencia de masa volumétricay una homogénea entorno propicio el crecimiento de células vegetales en suspensión y proteína extraña

Tabla 2Características importantes de cultivos in vitro de células vegetales para la selección y en el funcionamiento del sistema de biorreactor .Características Consideraciones prácticas para la selección y operación de biorreactorCrecimiento de las células de plantas • Espectáculos variados cinética de crecimiento celular en biorreactor (tiempo, td, de 12 a 96 h de duplicación ) . Tabaco células BY- 2 muestran una td más corto ( 12 h ) , N. benthamiana y células de arrozexpresando AAT en un STB tienen TD de 3 días (Huang et al. , 2010) y 2 días ( Trexler et al. , 2002 ), respectivamente. Potato raíz peluda expresar HBsAg exhibe td de2,5 días ( Sunil Kumar et al . , 2006 ) .La demanda de oxígeno celular Planta • Típico NUESTRO es aproximadamente 2-10 mmol -O2 / ( LH). Específico NUESTRA se reporta como 0,8 mmol -O2 / ( g- DCW -h ) para los cultivos de células de arroz que expresan AAT humana y 0,3-0,5 mmol -O2 / ( g- DCW -h ) para los cultivos de células NT- 1 que expresan GUS.• coeficiente de transferencia de masa volumétrica de oxígeno típica ( ELK) requerida es entre 10 y 50 h- 1 ( Curtis y Tuerk , 2006 ) , lo que sugiere un oxígeno disuelto críticaconcentración de 01.03 a 01.06 g/m3 ( es decir, 20 % de saturación de aire ) ( Doran , 1999 ) .• la transferencia de masa de oxígeno inadecuada puede inhibir el crecimiento celular y reducir la producción de proteínas extrañas ( Sharp y Doran, 2001a ) .Agregación y tamaño de celda de Plantasdistribución• Dependiendo de las especies de plantas , preparación del inóculo , la etapa de crecimiento , composición del medio , tipos de biorreactores y operaciones.• agregados celulares promueven la organización y diferenciación celular , lo que lleva a la falta de homogeneidad de oxígeno , nutrientes o inductores dentro de grandes agregados de células ydando lugar a efectos adversos en la producción de proteínas extrañas ( Kieran , 2001 ) .• agregados celulares complican la operación del biorreactor y hacer los agregados de células susceptibles a la tensión de corte , lo que resulta en daño a las células , que se atribuye a la superficie totaldeserción ( Kieran et al. , 2000 ) y la rotura total ( Namdev y Dunlop , 1995 ) .Propiedades reológicas • Afectados por tamaño del agregado celular y morfología, concentración de biomasa , la etapa de crecimiento celular y condiciones de cultivo .• Las células vegetales tienden a pasar de esférica a las formas alargadas cuando la división celular se termina ( Cosgrove, 1997 ) , lo que lleva a mayor PCV a una determinada exposición DCW ycomportamiento fluido no newtoniano durante el cultivo ( Su y Arias , 2003 ) .• Las células vegetales presentan un comportamiento reológico newtoniano y no se alargan ( células permanecieron casi de forma esférica ) cuando crecen en cultivo semicontinuo .Viscosidad aparente típica de caldo de cultivo de células es 4-150 cP .Sensibilidad al cizallamiento estrés • Susceptible a esfuerzo cortante cuando las células son de tamaño relativamente grande y contienen grandes vacuolas ( Dunlop et al . , 1994 ) .• Las respuestas celulares al estrés incluyen cambios en la viabilidad celular y el metabolismo ( OUR, actividad mitocondrial, nivel de ATP , la composición de la pared celular , los iones de calcio

encitoplasma ) y cambios en la morfología y agregados tamaños ( Kieran et al . , 2000 ) .• Reducir el estrés por la menor velocidad del impulsor conduce a una mala mezcla y suministro de oxígeno en el cultivo de células de alta viscosidad y mejora la agrupación de células en agregadosde diferentes tamaños . Estrés de cizallamiento crítica es entre 50 y 200 N/m2 ( Kieran et al . , 1997 ) .La formación de espuma y de crecimiento de la pared • Las células atrapadas en la espuma se somete a la deficiencia de nutrientes y oxígeno , lo que resulta en el crecimiento celular y la reducción de la productividad , y generar una capa gruesa quese adhiere a la pared del reactor , el eje impulsor y los sensores , lo que dificulta la mezcla a granel .• La reducción de la formación de espuma por 1 ) la reducción de la velocidad de agitación y la velocidad de aireación sin afectar la mezcla de transferencia de intensidad y de masas, 2 ) la adición de reactivos antiespumantes , 3 )la aplicación de aireación superficial o libre de burbujas - aireación , y 4 ) el uso de un interruptor de espuma .de pH para el crecimiento celular • pH del medio se ajusta a la gama de 5,0 a 5,9 antes de la esterilización y extremos de pH se evitan en cultivo celular .• Los efectos del pH sobre la estabilidad de proteína extraña secretada en el medio extracelular necesitan ser investigadas .Temperatura para el crecimiento celular • La temperatura se mantiene entre 20 y 28 ° C para la inducción de tejidos de callo y el crecimiento de las células vegetales .• Diferentes puntos de ajuste de temperatura durante el en el crecimiento celular y la producción de proteína de fase se puede aplicar para lograr mayores títulos de productos .• Temperatura y pH gradientes y variaciones debidas a la mezcla no homogénea en biorreactor pueden afectar la calidad del producto .

Tabla 3Las comparaciones de los sistemas de biorreactores para la producción de proteínas extrañas por cultivos de células vegetales (evaluación relativa entre los sistemas ).Biorreactor agitado -tankbiorreactor ( STB )burbujacolumnaAir-lift biorreactor Fix- cama o TIB solo uso STB Wave -mezcladobiorreactormembranabiorreactorMicrobioreactorCaracterísticaskLa ( OTR) Alta Baja Media Baja Baja-media Media Baja MediaEl daño celular por agitación Alto Bajo Bajo Bajo Medio Bajo Bajo BajoEl daño celular por aireación Medio Alto Bajo Medio Alto Bajo Bajo BajoTiempo de mezcla Corto Largo Medio Largo Medio Medio Medio Medio CortoOperación Medium Simple Simple Complejo simple Medio Medio MedioFlexibilidad Alto Alto Alto Bajo Medio Medio Bajo BajoCIP / SIP Sí Sí Sí Sí No No No NoTamaño de la escala Comercial Comercial Comercial piloto ( 2000 L ) Pilot ( 1000 L ) Piloto de Laboratorio .Complejo ampliación Medio Fácil Fácil Medio Complejo Complejo ComplejoConsumo de energía Alto Bajo Bajo Medio Medio Medio Bajo BajoTipo de Cultura Susension ;microsoporteSuspensión;microsoporteSuspensión;microsoporteinmovilizado;inmersiónSuspensión;microsoporteSuspensión;microsoporteinmovilizado;inmersiónsuspensiónLa densidad celular Bajo / Medio Medio Medio Alto Bajo / Medio Medio Alto MedioProductividad Media Baja Media Baja - Media Media Media Alta MediaSeguimiento y control directo , fácil,

múltipleDirecto , fácil,múltipleDirecto , fácil,múltipleIndirecta , complejo,limitadoDirecto , fácil,limitadoDirecto , medio ,limitadoIndirecta , complejo,limitadoDirecto , complejo,limitadoOperación costó Alto Medio Medio Medio Bajo Bajo Bajo BajoCosto de capital Alto Medio Medio Medio Bajo Bajo Bajo BajoFacilidad de cumplimiento GMP Sí Sí Sí Sí Sí Difícil Difícil No disponible

la producción a ser controlado constantemente . Aunque las turbinas Rushton( resultando en un patrón de flujo radial ) puede proporcionar células de plantas completas yde dispersión de gas , que también inducen la alta turbulencia alrededor del impulsorregión y presentan mayor entrada de energía específica que la otra impellerswithpatrones de flujo axiales ( tales como impulsores marinos , impulsores de cinta helicoidal ,impulsores de pádel, e impulsores de hoja aguda ) , lo que resulta en una mayorcizalla daño a las células vegetales . La hoja de tono o marinos impulsor conla hacia arriba - pumpingmode ofrece capacidades similares , en comparación con laRushton impulsor , para la dispersión agregado celular , mientras que la reducción de cizallaestrés a las células vegetales cuando se necesita la entrada de potencia a ser restringida debido aconsideraciones daño celular ( Doran , 1999 ) . Sin embargo , la masa de oxígenorendimiento de la transferencia de un impulsor de paso de pala - hacia arriba de bombeo fuepobres en cultivos altamente viscosos ( Kieran , 2001 ) , en comparación con la deel mismo impulsor operado en el modo de baja de bombeo ( Junkeret al . , 1998 ) . Generalmente, los sistemas de impulsor que muestra patrones de flujo axialescon una velocidad punta baja (hasta 2,5 m / s ) se consideran adecuados para la célula vegetalculturas ( Amanullah et al. , 2004 ) .Los recientes avances continúan reduciendo el daño celular de hidrodinámicaesfuerzo cortante por la agitación y de la ruptura de la burbuja fromgas cuando entrala cámara de aire a través de 1 ) el desarrollo de nuevos rodetes y modificarimpulsores existentes para providemore efficientmixing en la punta inferior de la bombavelocidades , 2 ) el diseño de nuevos sistemas de aireación (como sin burbujasaireación , cesta de gas, y la jaula - aireación ) para reducir el esfuerzo cortante causado porburbujas , y 3 ) la adición de agentes protectores adecuados , etc Nuevotipos de impulsores se han desarrollado para el cultivo de células sensibles al cizallamientoprocesos, incluyendo la turbina de disco curvado y paletas, de rotor hidroplano ,impulsores centrífugos y de células -lift ( Doran, 1999 ) . Una serie de baja potencia -impulsores de números como Intermig , Prochem Maxflow yScaba diseñado para el cultivo de células de mamíferos se puede implementar paracultivo de células vegetales ( Varley y Birch , 1999 ) . Además , el biorreactorespecificaciones geométricas tales como el diámetro del impulsor , el espaciamiento entreimpulsadores, impulsor despacho fuera de fondo , deflectores y su anchura ,Tipo de rociador y la posición , relación entre la altura y el diámetro del tanque de líquido , ynúmero impulsor también son críticos para el rendimiento bioreactor a gran escalapara proporcionar una mezcla suficiente y la transferencia de masa adecuada .Phyton Biotech en Alemania opera la mayor planta de cGMP de theworldinstalaciones de cultivo celular utilizando biorreactores de tanque agitado de acero inoxidable de hasta 75.000 Lpara producir los taxanos y paclitaxel (producción hasta 880.000 l / añocapacidad de taxanos ) y ha sido una API ( farmacéutico activoingrediente ) proveedor de Taxol oncología de Bristol- Myers Squibb ®producto . Phyton Biotech tiene un acuerdo con Insmed , Inc., en la que

Phyton Biotech utiliza sus instalaciones de cultivo de células vegetales cGMP afabricar el IPLEX ™ ( rinfabato mecasermina ), aprobado por la FDA enDiciembre de 2005 para el tratamiento del retraso del crecimiento en niños confactor de crecimiento de insulina - 1 deficiencia primaria o con la hormona del crecimientosupresión de genes . Phyton Biotech ha logrado avances prometedores haciala consecución de un rendimiento de producto de 2 g de proteína / ( caldo L ) ( Lukjan et al . , 2007 ) .3.1.2 . biorreactores neumáticasEl biorreactor neumático ( columna de burbujas y air-lift ) consiste en unrecipiente cilíndrico inwhich aire o gasmixture comprimido se introduce enla parte inferior del recipiente a través de un burbujeador para la aireación y el mezclado . lacaracterísticas de bajo capital y costos operativos , nomoving piezas mecánicasy elementos, y la facilidad de ampliación de sellado son ventajosas para las grandescultivos de células vegetales escala. La baja tensión de cizallamiento en biorreactores neumáticos esdeseable para las células vegetales sensibles al cizallamiento ( Eibl y Eibl , 2008 ) . burbujacolumnas se utilizan a menudo para micropropagations organogénicos , sin embargo ,no son capaces de proporcionar homogenousmixing y son menos aplicables a losculturas altos de biomasa debido a la menor área interfacial gas-líquidoresultante de coalescencia de las burbujas en los cultivos viscosos y la falta demecánica ruptura de las burbujas. El rendimiento de una columna de burbujas latamejorarse mediante la instalación de múltiples rociadores en diferentes segmentos dela entrega de oxígeno a las zonas de cultivos de raíces peludas alta densidad celular enla columna ( Mishra y Ranjan , 2008 ) .Air-lift o modificados biorreactores aire elevadoras contienen un tubo de aspiración (internoo bucle externo ) exhiben características mejoradas : Burbuja 1) prevenircoalescencia orientándolos en una dirección; 2 ) el aumento de oxígenola transferencia de masa al aumentar el número de burbujas y de gas - líquidoárea interfacial formass transferencia; 3 ) la distribución de stressmore cizalla uniformementey la reducción de la tensión de cizallamiento ( Mishra y Ranjan , 2008 ); y 4 ) la promoción

la cyclicalmovement de las células resultantes en themediumand de mezcla más cortosveces ( Huang et al , 2001b ; . . Wang et al , 2002 ) . Para alta densidad celularculturas, sin embargo , las cuestiones de la transferencia de masa de oxígeno insuficiente ypoormixing que conduce a la falta de homogeneidad en la biomasa , nutrientes , oxígeno yel pH y la extensa formación de espuma (que resulta frompolysaccharides , proteínas , grasasácidos y alta velocidad de gas superficial ) están siendo factores limitantes enoperación de biorreactor ( Tanaka , 2000 ) . Además , desigual distribución de loscultivos de células de alta densidad de células o tejidos de la raíz peludas en ciertas posiciones yexcesiva canalización en fase gaseosa debido a la alta velocidad de aireación puede causaraglutinación de tejido de la raíz y la obstrucción del flujo del líquido .3.1.3 . Biorreactores de lecho fijoDe lecho fijo (o de lecho empacado ) biorreactores se utilizan con frecuencia paracélula vegetal inmovilizada , sistemas de tejidos de plantas o de órganos diferenciados . parala aplicación de cultivos de células , las células se inmovilizan en apropiadamicrosoportes ( Gilleta et al , 2000 ; . Medina- Bolívar y Cramer , 2004 ) ,que se envasan en las zonas fijas y hay una gran líquido-sólidoáreas de contacto interfaciales específicas . Amediumreservoir se utiliza para hacer circularel medio nutritivo oxigenada a través de la cama y el gastadomedio que contiene el producto que devuelve al depósito puede sercosechado en modo discontinuo o continuo . Las principales desventajas de labiorreactores de lecho fijo son su relativamente pobre transferencia de masa y calordebido a la capacidad de bajas velocidades del líquido . Biorreactores de lecho fijo tienenaplicaciones que se muestran en cultivos de células animales de perfusión ( Meuwly et al. ,2007 ) , donde las células se inmovilizan dentro de microportadores y por lo tantoque son menos sensibles a la fuerza de cizallamiento que en cultivo en suspensión .Aunque el microambiente creado por las células inmovilizadasdentro de la matriz de soporte son diferentes de que en el líquido a granel , conla selección apropiada de soportes para la inmovilización de células , de células de altadensidad y alta productividad se puede lograr.3.1.4 . Biorreactores de tambor rotativoEl drumbioreactor rotatorio, superficie havingmoderate al volumenproporción en comparación con otros tipos de biorreactores , puede proporcionar una adecuadatransferencia de masa de oxígeno con menos consumo de energía y esfuerzo de corteen comparación con STB . Para cultivos de células vegetales , el biorreactor tambor rotativoha demostrado ventajas en términos de homogeneidad suspensión , bajo cizallamientocrecimiento medio ambiente y reducedwall , sobre cualquiera air-lift o STB ( Sajc et. al, 2000 ) . Sin embargo , la limitación es su comparativamente alta energíaconsumo en operaciones a gran escala y la dificultad de la ampliación.3.2 . Sistemas de biorreactores desechables ( de un solo uso de tecnología)Biorreactores desechables , en el que el recipiente de cultivo está hecho de unde un solo uso bolsa de plástico o contenedor , proporcionan características muy atractivas para los

la producción Biomanufacturing de proteínas extrañas especialmente para timeandel ahorro de costes de la flexibilidad para la pequeña y mediana escala de operación ,fácil manejo , que no requieren el CIP y SIP (pre- estéril desechablebolsas de biorreactores serán descartados después de la cosecha del producto), instalación sencilladiseño y puesta en marcha (diseño de fabricación modular) , la reducción de WFIrequisitos , la facilidad de la validación , menos inversión de capital para el acerorecipientes de acero , reducción del tiempo de rotación entre cada ejecución , y el potencialuso de procesos integrados para procesos más robustos con una menortiempo de desarrollo y un mayor rendimiento ( Eibl et al, 2009b ; . Eiblet al, 2010a . ; Hacker et al. , 2009 ) . La posibilidad de contaminación cruzadaentre cada ejecución proceso también puede ser minimizado mediante el uso de desechablessistemas de biorreactores , lo que sugiere la posibilidad de multi- productofabricación en una suite. La reciente comercialización de desechablebiorreactores , tales como la Sartorius Stedim Biostat CultiBag STR , XcellerexXDR , Hyclone SUB (Single -Use biorreactor ) , y GE WAVE biorreactor ,etc , ofrecen la posibilidad de reducir el uso de la banca y en escala pilotobiorreactores de acero inoxidable y se han aplicado con éxito eninstalaciones biomanufacturing preclínicos, clínicos y producción a escala( Eibl et al. , 2010b ) . Las limitaciones actuales sobre el uso de desechablesbiorreactores incluyen la fuerza plasticmaterial insuficiente en escalabilidady la disponibilidad de sensores fiables , desechables y periféricoelementos tales como válvulas y sistemas de muestreo , etc ( Eibl et al . , 2010b ) .Además , el más discutido preocupación por el uso de biorreactores desechablesen la producción de productos biofarmacéuticos son los extraíbles y lixiviableswhichmay interactwith o contaminar el producto para la terapia humana( Eibl et al. , 2010a ) .3.2.1 . Biorreactores desechables estándarHasta la fecha , desechables biorreactores de tanque agitado están disponibles a partir deempresas como Sartorius , HyClone , y Xcellerex que la fabricaciónde un solo uso de biorreactores con configuraciones de tanque agitado , aunque éstasbiorreactores son todavía limitados en volumen y en su mayoría utilizados para las semillasexpansión y la inoculación de grandes biorreactores convencionales . labolsa de biorreactor agitado desechable , hasta 2000 L , equipada con gasFiltro de aspiración y de escape y puertos para sensores de pH , DO, y la temperatura soncontenida dentro de una cubierta exterior de acero inoxidable con refrigeración y calefacciónchaqueta para proporcionar el control de la temperatura . El mezclado y la masacapacidad de transferencia se consigue mediante un impulsor estéril , desechable que esintegrado en cada buque bolsa de plástico. Sin embargo , la transferencia de masa de oxígeno, crecimiento de la pared de limitación y flotación celular se observan en células de altacultivos en suspensión de células vegetales densidad en biorreactores agitados desechables,en parte debido al aumento de la viscosidad caldo de cultivo , capas de espuma estables y

la microsparger utilizado para la aireación (Raven et al. , 2010 ) .Biorreactores neumáticos desechables, como columnas de burbujas , soncomúnmente utilizado para la propagación de la biomasa para la regeneración de la planta paratransferir al invernadero (Raven et al. , 2010 ) . Protalix utiliza undesechable , burbuja de tipo columna de biorreactor (volumen de trabajo L 400 ) ,que consiste en un polietileno esterilizable bagfilled con células de plantas ymedio , para la producción prGCD en cultivo de células de zanahoria transgénica( Shaaltiel et al. , 2008 ) . Además , el biorreactor Slug burbuja , diseñado paragenerar intermitentes grandes y largos burbujas individuales cilíndricos de lafondo de la bolsa mediante la variación de la presión de entrada de aire , la válvula de la hora de aperturay la frecuencia de la burbuja , se ha demostrado que exhiben kLa comparablesa valores en STB y se ha implementado para el cultivo de tabacoAP-2 o células en suspensión de soja ( Ducos et al, 2009 ; . Terrier et al, 2007 . ) .El biorreactor de un solo uso orbitalmente sacudido ( tales como el desechableBiorreactor Sacudido de Nalgene ) consiste en un recipiente cilíndricomontado en una plataforma de agitación en movimiento circular y un desechable , estérilbolsa de plástico con tubos de conexión apropiados para la siembra , la alimentación , el gasde suministro y la cosecha ( Micheletti et al . , 2006b ) . El diámetro de temblar,velocidad de agitación , el volumen de trabajo y la suavidad de los cultivosrecipiente se puede ajustar para lograr la transferencia de masa de oxígeno adecuada .Los estudios han demostrado que los biorreactores agitados desechable puedeproporcionar suficiente transferencia de masa de oxígeno , la formación de espuma insignificante e inferiortensión de cizallamiento ( debido a la distribución homogénea del consumo de energía )para el crecimiento de las células vegetales y animales ( Eibl et al . , 2010c ) .3.2.2 . Biorreactores Wave - mezcladoBiorreactores Wave - mezclado que poseen las ventajas de bajo costo ybaja tensión de cizallamiento utilizar una bolsa estéril impermeable al gas compuesto de unplasticfilmwhich contiene células huésped andmedium . Las bolsas arefilledwithy medio de suspensión celular hasta 50-60 % de su capacidad total ( Eiblet al. , 2009a ) . La transferencia de la mezcla , la masa y el calor en la onda mixtabiorreactor se caracterizan por bajos mecedora , meciéndose ángulo , tipo bolsa ysu geometría y cultureworking volume.Oxygen se suministra desde el aireo de la mezcla de gas continuamente a través de la aireación del espacio de cabeza . mientras que elbiorreactor de onda mezclada se mece , la superficie del líquido de themedium en elbolsa se renueva continuamente y la aireación de superficie sin burbujas tiene lugarlo que resulta en la oxigenación y la mezcla a granel con menos esfuerzo de cizallamiento acélulas cultivadas. Las ventajas adicionales incluyen la formación de espuma reducida , fáciloperación y bajo riesgo de contaminación . En particular , la tensión de corte esmás alta en el biorreactor de onda mezclada cuando la bolsa está sacudiendo con

nivel mínimo de llenado a la máxima velocidad de balanceo y ángulo de balanceo. labiorreactor de onda mixta puede funcionar en diferentes modos de cultivo ,incluyendo lotes , alimentación por lotes y la perfusión cuando se combina con diferentesdispositivos de retención celular - tales como filtros flotantes . Mediciones en línea depH , OD y otras tecnologías de detección ( Lea et al. , 2009 ) hacen thewave

biorreactor mixta y otras biorreactores desechables de gran atractivo para loscultivos de células vegetales ( Eibl et al. , 2009a ) . Tres de onda mezclada comercialbiorreactores se utilizan en la actualidad incluyendo WAVE biorreactor (GE Healthcare,hasta 1000 volumen total L ) , BIOSTAT CultiBag RM (Sartorius Stedim ,hasta un volumen de 100 Lworking ) y AppliFlex ( Applikon , hasta 25 Lworkingvolumen ) .Las investigaciones han demostrado la aplicación de la olabiorreactor para el cultivo de células de tabaco , uva y manzana de suspensión hasta500 volumen Lworking (Raven et al. , 2010 ) . Eibl et al . logrado planta altaproductividades celular ( V. vinifera) de biomasa de 40 g- FCW / ( L- día ) con untiempo de duplicación de 2 días para observar que no había significativacambio en la morfología celular en comparación con cultivos en STB ( Eibly Eibl , 2006 ) . Los biorreactores de onda mixta se han implementadopara la producción de colágeno humano ( Ritala et al . , 2008 ) y humanovirus antirrábico MAB ( Girard et al. , 2006 ) . Sin embargo , el aumento enviscosidad caldo de cultivo ( más de 70 veces) y de alta PCV ( N60 % )el cultivo de células vegetales en suspensión puede dar lugar a no homogéneamezcla en biorreactor de onda mezclada . Otros biorreactores onda - mezclado , talesasWave andUndertowbioreactor ( Terrier et al. , 2007 ) y el reflujo- andflowbiorreactor ( EFBR ) ( Mishra y Ranjan , 2008 ) , diseñado paramicropropagations y producción de metabolitos secundarios pueden seraplicados para la producción de proteínas extrañas . Además , una bolsa de cultivointegrado con matriz de soporte del tejido de la planta se ha usado paracultivo a base de raíces en cabellera ( Eibl y Eibl , 2006 ) .3.2.3 . biorreactores de inmersiónEl biorreactor de inmersión temporal ( TIB ) , que consiste en dos vasos(uno para la celebración de los cultivos de tejidos vegetales y otro para el líquidomedio), fue desarrollado para permitir el ciclismo de medio de cultivo porel uso de presión de aire o una bomba para empujar el recipiente de mediumfromone a laotra para sumergir los tejidos de las plantas y el uso de la gravedad para retirar lamedio , por lo tanto los tejidos vegetales o células vegetales inmovilizadas están expuestos ael medio de forma intermitente en lugar de continua . Un aire separado omezcla de gas se introduce a través de un burbujeador para airear la célula de la planta ocultivos de tejidos . TIB ofrece ventajas atractivas incluyendo adecuadatransferencia de oxígeno y el estrés lowshear a los tejidos vegetales (como la raíz pilosacultura ) debido a la falta de agitación mecánica , aunque algunoslimitaciones deben abordarse incluyendo el tamaño del buque en comercialescala , disponibilidad de acceso, y insufficientmixing que conduce a la acumulación dede inhibitorymetabolites que pueden afectar el crecimiento celular ( Ducos et al. , 2009 ) .Además , un TIB modificado , que consta de una caja rígida coloca dentro de unbolsa de plástico transparente , llamado TIB cuadro en bolsa proporciona la culturaespacio de cabeza entre los periodos de inmersión y permite horizontal

distribución de la biomasa para una mejor oxigenación y la iluminación queque en la TIB u otro tipo de biorreactor de inmersión ( Ducos et al. , 2009 ) .Puertos ubicados por encima de la bolsa se utilizan para la inoculación y la salida de gas ypuertos situados por debajo de la bolsa se utilizan para la entrada de aire y el mediocambio. El TIB cuadro en bolsa también ofrece el cultivo masivo de in vitrocultivo de células vegetales bajo condiciones photoautrophic . TIB se consideranun sistema de biorreactor adecuado para cultivos de raíces peludas gran escala.3.2.4 . biorreactores de membranaBiorreactores de membrana están diseñadas para retener las células huésped y extranjeraproductos de la proteína en un compartimento celular mediante la utilización de especializadamembranas con límite de peso molecular específico ( MWCO ) para ya seaen la aireación in situ , el suministro de nutrientes , o la separación del producto ( Qi et al . , 2003 ) .El medio de cultivo se hace circular en el biorreactor de membrana paracon lo que el oxígeno y los nutrientes a las células y la eliminación de los residuosmetabolitos . Las membranas pueden ser empacados en diferentes geometríasincluyendo placa y lámina , tubulares , en espiral y de fibra huecamódulos . Características de Themain utilizando biorreactores de membrana en la célula vegetallas culturas son de alta densidad celular y la proteína alta productividad volumétrica ,que resulta de la utilización de membranas que retienen el exterior secretadaproteína en el compartimento de la celda , concentrando el producto antescosecha. Otra característica es que el daño celular inducido por el estrés de cizallamientoencontrado en STB puede ser minimizada en un biorreactor de membrana debido a que ellas células son retenidas en una región relativamente quiescente en el que las células sonprotegido de daños mecánicos y no están en contacto directo conburbujas de gas . McDonald et al . ( 2005 ) aplicaron una biorreactor de membrana ,CELLine CL 350 , para la producción de alfa - 1 - antitripsina humana ( AAT )mediante el cultivo de células de arroz transgénico con un promotor de arroz alfa-amilasa ,Ramy3D , que se activa bajo condiciones de inanición de azúcar , lo que resultaen el título de producto extracelular de hasta 250 mg / L y 4-10 % de laproteína soluble total extracelular. Sin embargo , la operación a gran escala enproblemas de funcionamiento causa bioreactorsmay membrana resulta en pobresla viabilidad celular , la estabilidad pobre proceso , la heterogeneidad del producto , la membranaensuciamiento , y gradientes de difusión (calor y transferencia de masa ) . Por lo tanto labiorreactor de membrana se aplica principalmente a los procesos de pequeña escalay es difícil de escalar para aplicaciones a gran escala , aunque , pero puede estarútil para aplicaciones de menor escala como específica del pacientela terapéutica .3.2.5 . MicrobioreactorsThemicrobioreactor está diseñado como un alto rendimiento platformfor celularselección de la línea y la evaluación , caracterización de bioprocesos ( espacio de diseñodeterminación) , diseño y optimización de los medios de comunicación ( Betts y Baganz , 2006 ;

Diao et al. , 2008 ) , y como - downmodel escala para representar la producciónbiorreactor para fines de escalonamiento de bioprocesos ( Micheletti et al. , 2006a ) .Plataformas Microbioreactor incluyendo placas de microtitulación (6, 12 , 24 , 96 , conhasta 384 wellswith un fewmicroliter a mililitro volúmenes ) , tubos de centrifugado ( 5 -50 ml ), agitar matraces ( 25-1000 ml) , y miniatura paralelo agitó ysistemas de biorreactor de columna de burbujas ( Betts y Baganz , 2006 ) han sidoimplementado para el cultivo de muchas diferentes líneas de células huésped . La alimentación ,de muestreo , y la cosecha se puede automatizar mediante el uso de una manipulación de líquidossistema con un sistema de control de automatización que se puede programar .Recientemente, los sistemas de detección ópticos basados en el proceso no invasivola tecnología de análisis se han utilizado para mediciones en línea de pH ,oxígeno disuelto , y la densidad óptica en un microbioreactor ( Zhiyu et al . ,2007 ) . Applikon sistema de 24 micro-reactor es un tipo de placas de 24 pozos profundoscon pH en línea , DO y opciones de monitorización y control de temperatura.Sin embargo , la escala reducida no microbioreactormay ser capaz de precisiónimitar las condiciones del proceso de biorreactor a gran escala (como los gradientes deconcentración de oxígeno disuelto , temperatura, pH , nutrientes , y de cizallamientoestrés ) debido a las diferencias en heterogeneousmicroenvironments a travésbiorreactores de escala variadas . Las limitaciones de la transferencia de oxígeno y el proceso deel control de los parámetros de funcionamiento inherentes a la microbioreactornormalmente sólo se permitirá el desarrollo de procesos de escala pequeña o mediana .3.3 . Consideraciones especiales para los sistemas de biorreactores de musgoEl musgo puede crecer en un medio sencillo de sales inorgánicas en baja constantede luz o día - noche ciclos , por lo tanto , un fotobiorreactor es el másrecipiente común formoss cultivo in vitro. Cultivo de musgo pequeña escalase puede realizar en un matraz de vidrio o un fotobiorreactor controlable , ya seaen un biorreactor de tanque agitado de vidrio o biorreactor de vidrio , withworking tubularvolúmenes de hasta 30 L. Aunque vidrio agitado -tanque y aire elevadoras biorreactoresse han modificado formoss cultivo in vitro , que se han limitado apequeña escala de producción , debido a la limitación de luz debido a la celda mutuasombreado en la densidad celular moderado y alto , resultando en ampliacióncomplejidad . Actualmente, el modular 100 fotobiorreactor tubular Ly 200 L de sistemas de biorreactor de onda - mezclado desechables han sidoestablecido para la producción de proteínas extrañas por cultivo de células de musgo porGreenovation Biotech GmbH en Alemania ( Decker y Reski , 2007 ) .La estructura modular de biorreactores para el cultivo in vitro de musgo permitefácil de escala se muestra al utilizar varios biorreactores en paralelo. celular Musgola diferenciación y el crecimiento pueden ser estrechamente controlados por distintosparámetros en un fotobiorreactor para cultivos de alta densidad celular en lotes ,funcionamiento semicontinuo y continuo ( Lucumí y Posten , 2006 ) .Tensión mecánica adecuada a los filamentos celulares puede prevenir las plantasdesde el desarrollo de los tejidos adultos en un biorreactor . Aunque el simple

medio de crecimiento hace musgo cultivo in vitro una muy rentablebioprocesos en comparación con los cultivos celulares othermammalian , la escalabilidad de

fotobiorreactores y operación de biorreactor relativamente complejo (críticoconsideraciones que incluyen la intensidad de la luz , los ciclos de luz-oscuridad , la circulacióntasa de fotobiorreactor tubular , etc ) , son actualmente un desafío quelimita el uso de cultivos de musgo para la producción a gran escala de los extranjerosproteínas .3.4 . Consideraciones especiales para los sistemas de biorreactores raíz peludasLas características de la morfología y de la cultura de los cultivos de raíces peludascrecido en un biorreactor son muy diferentes fromthose de planta suspendidacélulas . El grosor de la raíz, longitud de la raíz , el número de pelos radiculares y raícesfrecuencia de ramificación se ven afectados por especies de plantas y el Agrobacteriumcepa utilizada para la inducción de raíces pilosas. Estas características han llevado a ladiseño de configuraciones de biorreactores alternativos . consideraciones especialesnecesitar ser tenido en cuenta para la selección de biorreactor para la raíz peludacultivo in vitro , tales como un entorno de estrés lowshear , oxígeno adecuadotransferencia de masa y la disponibilidad de nutrientes en la alta densidad de la raíz embaladoculturas. El crecimiento de las raíces peludas en liquidmediumresults en densa ylleno de biomasa de las raíces , la inducción de la formación de estancamiento yconvirtiéndose en un papel inhibitorio en la circulación del fluido y la limitación de oxígenodisponibilidad . Además , el crecimiento de células no - homogénea yla producción de productos de raíces peludas en un biorreactor puede complicar laoptimización de procesos. Georgiev et al . indicó que la tendencia a formargrumos formados por raíces primarias y puenteados es themain preocupación porraíces peludas cultivadas en un biorreactor ( Georgiev et al . , 2007 ) . La tradicionalSTB no es aplicable para la producción en masa de raíces peludas desde la escuelatensión de cizallamiento se genera por el impulsor , provocando la respuesta de la herida yla formación de callos . Neumática estándar y biorreactores líquido disperso(como lecho percolador y el reactor de niebla goteo ) se modifican parala mejora de cultivos de raíces peludas debido a la baja tensión de cizallamiento y lasimplicidad de su diseño y construcción ( Mishra y Ranjan , 2008 ) ,Aunque todavía se observan algunas limitaciones .Inmovilización de raíces peludas en matrices de anclaje ( tales como metalbandejas y mallas ) se han demostrado para promover el crecimiento de la raízen biorreactores STB , de columna de burbujas y de tambor rotatorio modificadas , dondelas raíces se sumergen en el medio de cultivo ( Shadwick et al . , 2005 ) .Para evitar daños a las raíces de la tensión de corte por el impulsor , elaislamiento de las raíces de los impulsores en STB es necesario . Sin embargo ,transferencia de masa insuficiente de oxígeno y nutrientes debido a la suavemezcla puede inhibir el crecimiento de la raíz . Para superar la masa de oxígenotransferir limitación, raíces peludas pueden ser cultivadas principalmente en aerosolo biorreactores de gotas y biorreactores niebla, donde las raíces son

inmovilizado sobre soporte de malla y se expone a aire húmedo o un gasmezcla y los nutrientes se suministran como pequeñas gotitas por boquilla de pulverización ,resultando en una alta tasa de crecimiento y la biomasa ( Gupta et al . , 2006 ) .Liu et al . ( Liu et al . , 2009 ) comparó el crecimiento de las raíces y murinointerleucina 12 ( mIL- 12 ) La producción de N. tabacum raíces peludas en tresdiferentes biorreactores incluyendo frascos de agitación , biorreactores de aire elevadoras, y la nieblabiorreactores , y encontraron que las raíces no se distribuyen homogéneamentey formó un denso anillo alrededor de la pared del reactor air-lift . Liu et al .indicó que la mIL- 12 la producción total en el biorreactor niebla eraalrededor del 50 % más que eso en el biorreactor de aire - ascensor. Sin embargo , lareto de carga uniforme de las matrices de anclaje raíz puede limitar laescalabilidad de la cultura de raíz pilosa en la niebla o biorreactores de pulverización. Las raíces puedenser picado y se bombea como una suspensión en el reactor para mecánicamenteeliminar la necesidad de mano de obra para el corte, la inoculación yhomogéneamente la carga en operaciones a gran escala . Gupta et al . introducidoun proceso de producción de ginsenósidos comercial usando raíces peludas en un20 000 L de tipo globo biorreactor como un modelo para el desarrollo de las raíces en cabelleraproceso de fabricación basado en la producción de proteínas extrañas (Guptaet al . , 2006 ) . Biorreactores desechables, como biorreactor de onda mezclada oTIB , también son adecuados para el cultivo de raíces peludas con morfológica establecaracterísticas de operación a gran escala. Además, los sistemas de biorreactorintegrado con los sistemas de cosecha de biomasa raíz peludas por seguirdeben tenerse en cuenta los procesos posteriores . Otros biorreactorsistemas de cultivos de raíces peludas en pequeña escala ( b10 L ) también fuerondiscutido previamente ( Mishra y Ranjan , 2008 ) .4 . Optimización de modo de operación de biorreactorLas operaciones de biorreactor avanzada desarrollada para mamíferos ysistemas microbianos pueden ser implementadas para cultivos de células vegetales . unoaspecto importante en el desarrollo de un proceso de cultivo de células vegetales es robusta aestablecer las condiciones de operación de biorreactor y los rangos de operación mientrasteniendo en cuenta las características de la planta de cultivo celular in vitro en . aunquelas condiciones óptimas y el modo de operación varían para diferentes plantasespecies y medios de cultivo , las consideraciones importantes se discuten enesta sesión.4.1 . La expresión constitutiva de proteínas extrañas en cultivo de células vegetalesbiorreactoresPara la producción de proteínas extrañas crecimiento asociado ( o secretadaproducto intracelular ) impulsado por un promotor constitutivo , objetivola productividad de proteínas puede ser mejorada mediante el aumento de la densidad celular enla cultura y la prolongación de la fase de crecimiento exponencial celda activa .

Culturas de alimentación por lotes se han aplicado para lograr una alta densidad celularcuando la utilización de una estrategia efectiva de alimentación de sustrato ( Suehara et al. ,1996 ) . Sin embargo , la acumulación de metabolitos tóxicos o inhibidorescultivos por lote alimentado durante podrían limitar la productividad proteína extraña.Por lo tanto , un cultivo en perfusión con un dispositivo de retención celular ( tal como unfiltro celular acústico, ATF (alternativa de flujo tangencial ) , y el filtro de la vuelta,etc ) puede ser una alternativa para obtener la cultura alta densidad de las células y pararetirar continuamente medio de cultivo ( De Dobbeleer et al, 2006 . ;Lucumí y Posten , 2006 ; Su y Arias , 2003 ) . Por otro lado , latasa de crecimiento de las células en un lote o lote alimentado de cultivo de células vegetales es generalmenteretardado cuando el PCV alcanza aproximadamente 60-70 % , lo que resulta en una reducciónde la actividad metabólica celular ( Maccarthy et al . , 1980 ) . Por lo tanto ,aunque de alimentación por lotes y la perfusión de cultivo se puede aplicar para aumentarla densidad celular, cultivo semi - continuo o cultivo de perfusión con una hemorragiacorriente se ha demostrado que es más adecuada para alta célulacultura densidad debido a la agregación célula de la planta , la adhesión superficial , yla alta viscosidad aparente observada a alta concentración de biomasa( De Dobbeleer et al . , 2006 ) .4.2 . Expresión inducible de proteínas extrañas en biorreactores de cultivos de células vegetalesPara la producción de proteína extraña impulsado por un promotor inducible , de dos etapasculturas se implementan normalmente para permitir el crecimiento celular yfases de producción de proteínas a ser optimizadas de forma independiente. El biorreactoroperaciones para la fase de inducción (fase de producción de proteínas ) son altamentedepende del tipo de promotor inducible utilizado ( Huang andMcDonald ,2009 ) . El sistema promotor Ramy3D azúcar inanición ( metabólicamenteregulados ) ha sido investigado para expresar proteínas extrañas incluyendoAAT humano ( Huang et al . , 2001a ) y hGM -CSF ( Shin et al . , 2003 ) encultivos de células de arroz transgénicas . En estos estudios, un intercambio de medios a un sin azúcarmedio o medio que contiene una fuente de carbono alternativa( Terashima et al. , 2001) para inducir la producción de proteína extraña eraaplicado en un momento apropiado en la fase de crecimiento . Durante la inducciónphasewithout suplementación fuente de carbono , sin embargo , la viabilidad celularse redujo significativamente , lo que resulta en aumento de la actividad de la proteasa . lacíclica proceso semi-continuo , que alterna entre el crecimiento yfases de producción , ha sido desarrollado para reutilizar las células transgénicas de arrozpara la operación a largo plazo ( Trexler et al. , 2005 ) .Para un sistema químicamente inducible , el tiempo de inducción yconcentración y modo de adición del inductor ( sencillos, retorcidos oinducción continua ) aplicada a plantar los cultivos celulares son importantes parala optimización de operación de cultivo celular de plantas biorreactor inducible . Esta voluntad

que sea necesario investigar sobre la base de la naturaleza del inductor ( inductorespecies de estabilidad y toxicidad ) y vegetales (tasa de crecimiento de las células y la agregacióntendencia ) para potenciar la expresión de proteínas extrañas . inductor Superior

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concentraciones y aplicaciones múltiples o continuas pueden beneficiarse altaoperationalmodes la densidad celular. Semi-continuous/continuous o perfusiónoperación de biorreactor a alta densidad celular con la tasa de crecimiento más lenta específicapara una fase de producción de proteínas prolongada puede ser beneficioso para induciblela producción de la proteína extraña y la proteína extraña secretada pueden sercosechado continuamente fromthe caldo de cultivo de células . Nuestros resultados sugierenque la tasa de consumo de oxígeno ( OUR) es un importante parámetro fisiológico quedeterminar el momento óptimo para la inducción ( TOI ) . En el caso de unpromotor químicamente inducible , el estrógeno basados en receptores sistema ( XVE ) encultivo de células de tabaco , la TOI óptima se produce en el máximo NUESTRA quese produce al final de la fase exponencial ( Huang et al . , 2010 ) . nosotrosdesarrollado aún más la producción de cultivo semicontinuo de AAT humanael uso de un vector viral vegetal químicamente inducible en células de tabaco transgénicola cultura , lo que lleva a un aumento de cinco veces en la productividad volumétrica deAAT biológicamente funcional en comparación con la operación por lotes ( Huang et. al, 2010 ) .4.3 . Estrategias para mejorar la estabilidad de la proteína extranjeraEstabilidad de la proteína de Relaciones Exteriores en un entorno heterogéneo de expresiónes una consideración crítica . Las proteínas extrañas expresadas en cultivos de células vegetalespuede ser secretada al medio de cultivo extracelular o retenido en uncompartimiento intracelular , como ER , citoplasma, o vacuola. Desde un rentablepunto de vista de bioprocesos , productos secretados ofrecen ventajassobre productos intracelulares . Sin embargo , las proteínas extrañas secretadas soncomúnmente degradado por las enzimas proteolíticas que se producen duranteel cultivo de células vegetales o los resultados de la muerte celular / lisis ( Doran, 2006a )y / o puede ser inestable en la célula de la planta culturemedium sencilla ( Tsoi yDoran , 2002 ) . Para mejorar la estabilidad de las proteínas extrañas secretadas enproceso de cultivo de células vegetales , las investigaciones ( Benchabane et al, 2008 ; . Doran,2006b ) han utilizado agentes de estabilización de proteínas o inhibidores de la proteasa , talescomo gelatina , BSA y otras proteínas de bajo valor (para a base de proteínasestabilización ) , manitol ( para regular la presión osmótica de themediumpara minimizar la lisis celular ) , PEG , Pluronic F - 68 y otros polímeros ( comoagentes para la protección del producto proteína estabilizante de desnaturalizaciónagentes liberados de las células vegetales en themedium ) . Estos enfoqueshan demostrado que disminuye la degradación o pérdida de la extranjeraproteína a través de differentmechanisms , sin embargo , los inhibidores de proteasa hantiempos de vida corta y son costosos para su aplicación a gran escala y el usode agentes estabilizantes podría presentar efectos negativos sobre el crecimiento celular y laaumentar los costos de procesamiento aguas abajo. Huang et al . ( Huang et al . , 2009 )propuesto una estrategia biorreactor que implica el control del pH para mejorar

producción de proteína extraña funcional en cultivo de células de tabaco transgénico,que puede mejorar la estabilidad de la proteína extranjera y minimizar la proteolisisefectos en cultivos de células , lo que demuestra como una alternativa eficaz a la adicióninhibidores de la proteasa o proteína agentes estabilizantes para plantar el cultivo de células .Otros enfoques para reducir los efectos proteolíticos en proteínas extrañasincluir 1 ) co-expresión de inhibidores de la proteasa endógeno que impidenactividades de la proteasa a lo largo de la vía secretora celular o se libera en lamedio de cultivo ( Komarnytsky et al . , 2006 ) , 2 ) la supresión de la proteasala expresión génica utilizando RNAi ( Kim et al . , 2008 ) , 3 ) el desarrollo decélulas huésped deficientes en proteasas específicas ( Schiermeyer et al . , 2005 ) , 4 ) in siturecuperación de proteínas ( añadiendo resinas en la cultura o la circulación delcultura a través de una columna de cromatografía externa al biorreactor )( James y otros , 2002 ; . Sharp y Doran , 2001a ) , y 5 ) la inmovilización decélulas de las plantas para facilitar la recuperación de la proteína secretada a partir del cultivocaldo ( Osuna et al. , 2008 ) . La capacidad de estrategias para minimizarla degradación de proteínas extrañas en cultivos de células de plantas tiene que ser evaluada enuna base de caso por caso .5 . Oportunidades para mejorar la producción de proteínas extrañas encultivo de células vegetalesCultivos de células vegetales como plataforma bioproduction proporcionan únicaventajas para la producción de proteínas extrañas . Orientaciones futuras paramejorar el rendimiento de proteína extraña y calidad en cultivo de células vegetalessistema de biorreactor incluyen: 1 ) la selección de los ejércitos de las plantas (especies de plantasy desdiferenciado o células vegetales diferenciadas ) , la expresión de genessistema ( promotor constitutivo , promotor inducible , amplicón viral oamplicón viral inducible ) y el gen de interés , 2 ) generación yselección de la líneas de células más productivos , 3 ) el diseño medio yoptimización, 4 ) mejorar la estabilidad de la proteína extranjera y prevenirla degradación proteolítica, 5 ) la selección de los sistemas de biorreactores y scale-upestrategias ( de acero inoxidable estándar o biorreactores desechables) de acuerdoa las interacciones entre las células huésped , la formación de producto y biorreactordiseño , consideraciones y económicos para satisfacer la demanda del mercado, 6 )optimización de las condiciones de biorreactores para crecimiento de células y proteínasproducción, 7 ) la incorporación de genes supresores de silenciamiento , 8 ) el desarrollola expresión transitoria de escalable en cultivo de células vegetales , 9 ) de adaptaciónde un solo uso de tecnología, 10 ) celular Formaster largo termcryopreservationy los bancos de células de trabajo de la línea de producción , y 11 ) Ingenieríaproteínas glicosiladas producidos por plantas humanizados .6 . ConclusionesEl progreso tecnológico en los sistemas de biorreactores y operacionespara la producción de proteína extraña en el uso de cultivos de células vegetales in vitro tieneha discutido . Los progresos prometedores de Protalix y Biolex tanto

proporcionar oportunidades de utilizar in vitro de plantas de células de cultivo del biorreactorsistemas para biomanufacturing de proteínas especializadas, medicamentos huérfanos para losenfermedades genéticas raras , y biosimilares o terapéutica biobetter , abajar el costo de los productos , manteniendo o mejorando la plantmadecalidad de las proteínas . Además , célula de la planta basado en biorreactorculturas presentan la ventaja de producir agentes terapéuticos producidos por plantasde una manera similar a las células microbianas y de mamíferos que se han reunidorequisitos reglamentarios establecidos por la FDA y la EMEA en el último20 años . Aunque los rendimientos de producción de proteínas inferior han sidoobservado en cultivos de células de plantas , lo que implica un aumento de 10-100 vecesrequerido para alcanzar los niveles comerciales , las estrategias para hacer que elcultivo de células vegetales a base de un biorreactor práctico y económicoplataforma no es realista teniendo en cuenta las mejoras impresionantesen la fermentación microbiana recombinante y el cultivo de células de mamíferosen los últimos 20 años .ReferenciasAmanullah A, BC Buckland , Nienow AW . Mezcla en la fermentación y cultivo celularindustrias . En : Pablo EL , Atiemo - Obeng VA, Kresta SM , editores. Manual demezclas industriales : Ciencia y Práctica. Hoboken , Nueva Jersey , EE.UU. : John Wiley & Sons,Inc. ; 2004 doi : . 10.1002/0471451452.ch18 .Benchabane M , Goulet C , D Rivard , Faye L , Gomord V , Michaud D. Prevenciónproteólisis no deseada en biofábricas de proteínas vegetales. Plant Biotechnol J 2008 ; 6 :633-48 .Betts JI , Baganz F. biorreactores en miniatura : prácticas actuales y futuras oportunidades.Hecho Microb Celular 2006 ; 5:21-34 .Chilton MD, Tepfer DA , Petit A, David C , Casse- Delbart F , Tempe J. Agrobacteriumrhizogenes inserta T - ADN en los genomas de las células de la raíz de la planta huésped . naturaleza1982 ; 295:432-4 .Cosgrove DJ. La relajación en un ambiente de alta tensión : Las bases moleculares deparedes celulares extensibles y alargamiento celular . Plant Cell 1997 ; 9:1031-41 .Curtis WR , Tuerk AL . El transporte de oxígeno en los sistemas de cultivo de tejidos vegetales. El tejido vegetal2006:173-86 ingeniería cultura.Davies HM . Reviewarticle : la comercialización de los sistemas de la planta entera para biomanufacturingde productos de proteína : evolución y perspectivas . Plant Biotechnol J 2010 ; 8:845-61 .De Dobbeleer C , M Cloutier , Fouilland M , Legros R, Jolicoeur M. Una perfusión de alta velocidadbiorreactor de células de la planta . BIOTECNOLO Bioeng 2006 ; 95:1126-37 .De Muynck B, C Navarra , Boutry M. La producción de anticuerpos en plantas : estado despuésVeinte años. Plant Biotechnol J 2010 ; 8:529-63 .Decker EL , Reski R. El biorreactor musgo . Curr Opin Plant Biology, 2004 ; 7:166-70 .

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