Transcript

Transformarea la Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces Cerevisiae este un organism valoros pentru domeniul biotehnologiei, este eucariot si totusi el poate fi cultivat ca un organism procariot datorita caractristicilor sale microbiene. Deoarece Saccharomyces cerevisiae are un genom mic, timpul de dublare relativ scurt si poate fi analizata genetic, multe dintre progresele facute in biologia moleculara au folosit aceast drojdie ca mijloc de cercetare

Transformarea levurilor este realizata in mod normal prin una din urmatoarele doua cai : - fie prin formarea sferoplastilor incluzand indepartarea peretelui celular

Sferoplasti de la Saccharomyces cerevisiae obtinuti prin tratament enzimatic al celulelor

-

sau prin tratamentul celulelor intacte cu cationi alcalini.

O alta metoda folosita pentru transformarea drojdiilor este electroporarea, tehnica ce ofera avantajul de a folosi mici cantitati de ADN pentru a obtine transformarea dar este necesara in schimb folosirea de aparate costisitoare.

Echipament pentru electroporare

Prin imbunatatirile aduse metodei cu cationi alcalini aceasta metoda a devenit simpla si eficienta si totodata este preferata pentru cercetarea in teren. Prin expunerea celulelor de drojdii (care au fost culese pe durata fazei logaritmice de crestere) la cationi alcalini (acetat de litiu,clorura de rubidiu), socuri de temperatura si tratament cu polialcool, pot fi induse schimbari in anvelopa ceea ce faciliteaza asimilarea plasmidului.

Efectele LiAc, socului de temperatura si a PEG asupra transformarii celulelor intacte si a sferoplastilorCelule intacteImbunatateste frecventa si eficienta transformarii Creste permeabilitatea celulelor intacte Imbunatateste frecventa si eficienta transformarii Creste permeabilitatea celulelor intacte Imbunatateste frecventa si eficienta transformarii in etapa de pre-incubare Creste permeabilitatea celulelor intacte Indispensabil pentru atasarea ADN-ului Indispensabil pentru atasarea ADNului Nu este indispensabil pentru cresterea eficientei si frecventei transformarii Nu are nici un efect asupra transformarii

SferoplastiNu are nici un efect asupra transformarii

LiAc

Socul de temperatura

PEG

Posibil mecanism de transformare la Saccharomyces cerevisiae

Transformarea la Saccharomyces cerevisiae cu plasmidul pRY121Plasmidul pRY121 este un vector nava ce codifica o proteina expresibila, -galactoza, detectabila prin teste simple.

Harta plasmidului pRY121

Eficienta transformarii depinde de urmatorii factori: - marimea plasmidului; - configuratia ADN-ului; - calitatea ADN-ului; - tulpina gazda; - procedurile selectiei.

Reactivi/echipament Hemocitometru Micropipetor Parafilm Peg , autoclavat Plasmidul ADN pRY121, purificat prin coloane cromatografica sau cu CsCl Tulpina YNN281 de Saccharomyces cerevisiae AND monocatenar din sperma de somon, 10 mg/ml Apa sterila Solutie tamponTE, pH 8.0, sterilizata prin autoclavare LiAc -10 mM Tris-Cl, 1mM EDTA, 100mM acetat de litiu Bullion YEPD Placi de agar pentru selectarea transformantilor Incubator la 30 grade C Microcentrifuga Baie de apa

Protocol de lucru1.

2.

3.

Dupa ce s-a ajuns la o densitate a celulelelor adecvata se imparte aseptic cultura in doua tuburi si se centrifugheaza la 2000 rpm timp de 5 min la temperatura camerei; Se arunca supernatantul se spala celulele pentru a indeparta urmele de bullion YEPD .Se realizeaza o suspensie a natantului in 25-30 ml apa sterila si centrifugarea la 2000 rpm timp de 5 min la temperature camerei Se arunca supernatantul. Se adauga 1 ml de apa sterila peste un natant apoi se agita. Se transfera suspensia rezultata peste celalalt natant din tubul de centrifugare . Folosinduse un micropipetor se transfera suspensia combinata intr-un tub steril de microcentrifuga de 1,5 ml

4. Urmeaza centrifugarea suspensiei intr-o microcentrifuga pentru 20 de secunde la viteza mare la temperature camerei. Se aspira aseptic supernatantul si se adauga 1 ml de TE/LiAc peste celule. Urmeaza pipetare repetata si determinarea concentratiei de cellule prin numarare cu ajutorul hemocitometrului; 5. Se pune la microcentrifuga timp de 20 sec la viteza maxima si temperature camerei. Se decanteaza sau se aspira aseptic supernatantul . Se omogennizeaza celulele in TE/LiAc. 6. Pentru ca fiecare proba sa fie transformata se pipeteaza 100 microlitri din suspensia de celule intr-un tub de microcentrifuga de 1,5ml. Experimental trebuie sa cuprinda destule tuburi pentru a se realiza transformarea macar unei probe de pRY121 ADN si a unui control. 7. la fiecare proba se adauga 50 micrograme de carrier de ADN monocatenar. De asemenea se adauga si 1- 10 micrograme de plasmid Adn pRY121 intr.un volum maxim de de 10 microlitri. Se aduga 10 microlitri de apa sterila si 50 mimcrograme de carrier Adn la proba de control (nu contine plasmid)

8. Se adauga 240 microlitri de Peg 50% si 60 microlitri de TE/LiAc la fiecare proba si se amesteca bine prin pipetare repetata. Se incubeaza probele la 30 grade C in baie de apa pentru 30 minute in timp ce se agita la 200 rotatii pe minut. 9. Se aplica soc termic asupra asupra probelor la temperatura de 42 de grade C in baie de apa (stationar) pentru exact 15 minute. Crescand sau scazand timpul de expunere la soc termic reduce eficienta transformarii. 10. Se separa celulele prin centrifugare intr-o microcentrifuga timp de 5 secunde la viteza maxima la temperature camerei. Se inlatura supernatantul prin aspirare apoi se omogenizeaza celulele intr-un mililitru de solutie tampon TE prin pipetare repetata 11. se centrifugheaza din nou celulele timp de 5 secunde la temperature camerei la viteza maxima. Se inlatura supernatantul prin aspirare si se omogenizeaza celulele intr-un ml de bulion YEPD prin pipetare repetata. Se incubeaza probele la 30 de grade C pentru 45 minute intr.o baie de apa in timp ce se agita la 200 rpm

12. Se inlatura bulionul YEPD de celule prin repatarea pasului 10 13. Se dispun 100 si 300 microlitri din celule pe vase cu agar separate ce sunt selective pentru transformanti (agar fara aminoacizi dar cu toate suplimentele pentru cresterea tulpinii inafara de uracil). In plus, se intend celulele de control netransformate (la care nu sa adaugat plasmid Adn) pe aceleasi placi de selectie cu agar si deasemenea in placi ce contin uracil 14. Se lasa placile la uscat apoi se introduc intr-un incubator in pozitie inversata la 30 de grade pentru 3-5 zile. Transformantii vor apare in colonii distincte, in timp ce fundalul celulelor nedezvoltate de drojdie apare ca un strat neclar pe agar. Se invelesc placile cu parafilm si se depoziteaza la 4 C.

Va multumesc pentru atentie !!!


Top Related