Download - UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1 ... · PDF file“UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS ... 1

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS

(Ananas comosus (L.) Merr.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Richard Andrison Sadeli

NIM : 128114120

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 128114120

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016


ii

Persetujuan Pembimbing




Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 128114120

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.) tanggal 23 Juni 2016


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul




Oleh:


NIM : 128114120

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal : 23 Agustus 2016

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

(Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D.)

Panitia Penguji : Tanda tangan

1. Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. ...................................

2. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. ...................................

3. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. ...................................


iv

Karya ilmiah ini

kupersembahkan untuk:

Tri Tunggal Mahakudus

dan

seluruh umat manusia yang

menganggap karya ini

bermanfaat.


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 20 Mei 2016

Penulis



vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Richard Andrison Sadeli

Nomor mahasiswa : 128114120

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

“UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-


(Ananas comosus (L.) Merr.)”

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama

saya sebagai penulis.

Dengan demikian penyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 20 Mei 2016

Yang menyatakan

(Richard Andrison Sadeli)


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, kasih, dan

penyertaany-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl) Ekstrak Bromelain Buah Nanas (Ananas comosus

(L.) Merr.)” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat

dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi, penulis mendapatkan

banyak bantuan, bimbingan, saran, kritik, dan dukungan dari banyak pihak, baik

secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini,

penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Farmasi


2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu dr. Fenty, M.Kes., Sp.PK., selaku Dosen Pembimbing Akademik penulis

atas bimbingan dan nasehat yang diberikan selama ini.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas

kesabaran dalam memberikan bimbingan, saran, kritik, dan dukungan hingga

terselesaikannya skripsi ini dengan baik.


viii

5. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi atas saran

dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam menguji skripsi

ini.

6. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi

atas saran dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam

menguji skripsi ini.

7. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

8. Mas Wagiran dan Pak Musrifin, selaku laboran di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Formulasi Teknologi Sediaan

Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas

bantuan yang telah banyak diberikan kepada penulis saat proses penelitian.

9. Yohanes Bintang Pambudi, sebagai teman seperjuangan dalam penelitian,

atas semangat, kerjasama, dan diskusi selama ini.

10. Maria Septi Iriana, atas semangat, dukungan, dan kasih sayang yang selalu

menyertai perjalanan penulis.

11. Sona Karisnata Inriano dan Adis Pranaya Yakin, sebagai tim At a Glance,

sahabat dan partner dalam menjalani perkuliahan, atas semangat, dukungan,

saran, kritik, dan hal-hal lainnya.

12. Teman-teman FKK B angkatan 2012 atas kebersamaan dan keceriaan selama

ini.

13. Mereka yang mengubah dunia dengan karyanya: penemu komputer yaitu

Charles Babbage, penemu Microsoft yaitu Bill Gates dan Paul Allen, penemu


ix

Internet yaitu Robert E. Kahn dan Vinton G. Cerf, penemu Google yaitu

Larry Page dan Sergey Brin, penemu alat cetak yaitu Johann Gutenberg, dan

penemu kertas yaitu Cai Lun. Tanpa keberadaan mereka maka skripsi ini pun

tidak akan pernah terwujud.

14. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, atas doa dan

dukungan yang telah diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis bersedia

menerima saran dan kritik dalam menyempurnakan skripsi ini. Penulis berharap

skripsi ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan pengembangan ilmu

pengetahuan, khususnya di bidang farmasi.

Yogyakarta, 20 Mei 2016

Penulis



x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .............................................................. iv

LEMBAR PENYATAAN KEASLIAN KARYA ................................... v

LEMBAR PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ...... vi

PRAKATA ............................................................................................... vii

DAFTAR ISI ............................................................................................ x

DAFTAR TABEL .................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xvii

INTISARI ................................................................................................ xviii

ABSTRACT ............................................................................................. xix

BAB I PENGANTAR .............................................................................. 1

A. Latar Belakang ................................................................................... 1

1. Permasalahan ............................................................................... 3

2. Keaslian penelitian ....................................................................... 3

3. Manfaat penelitian ....................................................................... 4

a. Manfaat teoritis ...................................................................... 4

b. Manfaat praktis ...................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian ............................................................................... 5


xi

1. Tujuan umum ................................................................................ 5

2. Tujuan khusus ............................................................................... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ...................................................... 6

A. Nanas .................................................................................................. 6

1. Taksonomi .................................................................................... 6

2. Morfologi ..................................................................................... 6

3. Kegunaan ..................................................................................... 8

4. Kandungan kimia ......................................................................... 8

B. Bromelain ........................................................................................... 8

1. Sifat fisika dan biokimia .............................................................. 8

2. Sifat farmakologi ......................................................................... 9

3. Bioavailabilitas dan toksisitas ...................................................... 10

4. Isolasi ........................................................................................... 10

C. Metode Ninhidrin ............................................................................... 11

D. Radikal Bebas .................................................................................... 12

E. Antioksidan ........................................................................................ 13

F. Metode DPPH .................................................................................... 14

G. Landasan Teori ................................................................................... 15

H. Hipotesis ............................................................................................ 17

BAB III METODE PENELITIAN .......................................................... 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................... 18

B. Variabel dan Definisi Operasional ..................................................... 18

1. Variabel utama ............................................................................ 18


xii

a. Variabel bebas ....................................................................... 18

b. Variabel tergantung ............................................................... 18

2. Variabel pengacau ....................................................................... 18

a. Variabel pengacau terkendali ................................................ 18

b. Variabel pengacau tidak terkendali ....................................... 18

3. Definisi operasional .................................................................... 19

a. Aktivitas antioksidan ............................................................. 19

b. Ekstrak bromelain .................................................................. 19

c. Kadar enzim .......................................................................... 19

d. Persen inhibition concetration (%IC) .................................... 19

e. Inhibition concetration 50 (IC50) ........................................... 19

C. Bahan Penelitian ................................................................................. 19

D. Alat Penelitian .................................................................................... 20

E. Tata Cara Penelitian ............................................................................ 20

1. Determinasi buah nanas .............................................................. 20

2. Pengumpulan buah nanas ............................................................ 21

3. Pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas ...................... 21

a. Ekstraksi buah nanas ............................................................. 21

b. Purifikasi ekstrak bromelain dengan teknik ethanol

precipitation .......................................................................... 21

4. Analisis kualitatif bromelain ....................................................... 22

a. Reaksi warna ......................................................................... 22

5. Penetapan kadar enzim bromelain .............................................. 22


xiii

a. Pembuatan larutan uji ............................................................ 22

b. Pembuatan larutan baku ........................................................ 23

c. Penentuan operating time (OT) ............................................. 23

d. Penetapan panjang gelombang maksimum ........................... 23

e. Pengukuran absorbansi larutan baku dan uji ......................... 23

f. Estimasi kadar enzim ............................................................. 24

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan ................................ 24

a. Pembuatan larutan DPPH....................................................... 24

b. Pembuatan larutan rutin ......................................................... 24

c. Pembuatan larutan uji ............................................................ 24

7. Uji aktivitas antioksidan .............................................................. 25

a. Uji pendahuluan ..................................................................... 25

b. Penentuan operating time (OT).............................................. 25

c. Penetapan panjang gelombang maksimum ............................ 25

d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH....................... 26

e. Pengukuran absorbansi larutan rutin dan uji .......................... 26

f. Estimasi aktivitas antioksidan ................................................ 26

F. Analisis Hasil ...................................................................................... 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 28

A. Hasil Determinasi Tanaman ............................................................... 28

B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................................. 28

C. Hasil Isolasi Bromelain ...................................................................... 29

D. Hasil Analisis Kualitatif Ekstrak Bromelain ...................................... 33


xiv

E. Hasil Optimasi Metode Penatapan Kadar Bromelain ........................ 36

1. Penentuan operating time (OT).................................................... 36

2. Penetapan panjang gelombang maksimum .................................. 37

F. Hasil Penetapan Kadar Bromelain ..................................................... 38

G. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH .... 42

1. Penentuan operating time (OT).................................................... 42

2. Penetapan panjang gelombang maksimum .................................. 44

H. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan ................................... 46

I. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ........... 47

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 56

A. Kesimpulan ........................................................................................ 56

B. Saran .................................................................................................. 56

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 57

LAMPIRAN .............................................................................................. 61

BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 88


xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

BSA ........................................................................................ 38

Tabel II. Hasil pengukuran seri baku BSA ........................................... 40

Tabel III. Kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas ........ 41

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

DPPH ...................................................................................... 45

Tabel V. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode

DPPH ...................................................................................... 51

Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak bromelain

daging buah nanas dengan metode DPPH.............................. 51

Tabel VII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas .... 52


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur ninhidrin .............................................................. 12

Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ....... 15

Gambar 3. Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain ................... 33

Gambar 4. Reaksi asam amino dengan ninhidrin ................................ 34

Gambar 5. Hasil uji ninhidrin dan perubahan warnanya ..................... 35

Gambar 6. Grafik penentuan OT BSA ............................................... 36

Gambar 7. Kurva baku BSA untuk penetapan kadar bromelain

ekstrak bromelain daging buah nanas ................................ 41

Gambar 8. Grafik penentuan OT Rutin ............................................... 43

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH ............... 44

Gambar 10. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan ...................... 47

Gambar 11. Perubahan warna larutan DPPH akibat reaksi dengan

antioksidan ......................................................................... 48

Gambar 12. Struktur rutin ..................................................................... 50


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman nanas ................ 61

Lampiran 2. Gambar buah nanas ......................................................... 62

Lampiran 3. Perhitungan rendemen ..................................................... 63

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif bromelain ..................... 64

Lampiran 5. Penimbangan penetapan kadar enzim bromelain ............ 64

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar bromelain .............................. 65

Lampiran 7. Penetapan kadar enzim bromelain .................................. 68

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan. ............... 72

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding,

dan larutan uji .................................................................. 73

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ...................... 75

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ... 80

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain

daging buah nanas ........................................................... 82

Lampiran 13. Uji statistik ...................................................................... 85


xviii

INTISARI

Buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki kandungan enzim

bromelain. Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang bisa digunakan

dalam perawatan luka yang berhubungan dengan radikal bebas. Antioksidan

merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh.

Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar enzim dan menguji aktivitas

antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas.

Identifikasi enzim ditentukan secara kualitatif dengan metode uji warna

ninhidrin yang memiliki prinsip pembentukan warna biru-ungu dari reaksi antara

ninhidrin dan asam amino, dan secara kuantitaif dengan metode spektrofotometri

ultraviolet dan baku standar berupa bovine serum albumine (BSA) yang memiliki

prinsip pengukuran absorbansi dari cincin aromatik yang dimiliki oleh enzim.

Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH yang memiliki prinsip

penurunan intensitas absorbansi DPPH yang sebanding dengan kenaikan

konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dalam IC50 (Inhibition

Concentration 50).

Penelitian menunjukan bahwa kadar enzim ekstrak bromelain buah nanas

sebesar 8,4967±0,0289 % b/b dan aktivitas antioksidan ekstrak bromelain buah

nanas dengan nilai IC50 sebesar 4,7221±0,0287 mg/mL.

Kata kunci: enzim, bromelain, Ananas comosus (L.) Merr., aktivitas antioksidan,

DPPH, IC50.


xix

ABSTRACT

Pineapple fruits (Ananas comosus (L.) Merr.) contain bromelain enzyme.

Bromelain is one of proteases that have been used for wound treatment which

associated with free radical. Antioxidant is a compound that can inhibit the

reaction of free radicals within the body. The aims of this study are to determine

enzyme content and antioxidant activity of bromelain extracted from pineapple

fruit.

Enzyme identification was determined qualitatively using ninhydrin, in

which it’s principle is a production of Ruhemann’s purple from the reaction

between ninhydrin and amino acids. UV spectrophotometric method was applied

to determine the enzyme content based on bovine serum albumine (BSA) as the

reference. The principle of this method is according to the aromatic ring of

enzyme’s absorbance measurement. Antioxidant activity was determined using

DPPH radical scavenging method based on the principle that the DPPH

absorbance intensity is decreasing proportionaly with the increasing of the

compound’s concentration. Antioxidant activity was expressed as IC50 (Inhibition

Concentration 50).

Research demonstrated that the enzyme content of the pineapple fruit

bromelain extract is 8,4967±0,0289 % b/b and it’s antioxidant activity with the

IC50 value is 4,7221±0,0287 mg/mL.

Keywords: enzyme, bromelain, Ananas comosus (L.) Merr., antioxidant activity,

DPPH, IC50, total protein content.


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Istilah antioksidan dan radikal bebas merupakan istilah yang cukup

populer di kalangan ahli gizi dan tenaga kesehatan profesional lainnya. Dalam

beberapa tahun ini, istilah tersebut semakin sering digunakan dan mulai menyita

perhatian publik, khususnya masyarakat yang memiliki kepedulian pada kesehatan

dan gaya hidup. Beberapa penelitian juga mengungkapkan peran dari stress

oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas dalam berbagai penyakit yang

berbahaya, seperti penyakit kanker, penyakit yang berhubungan dengan

kardiovaskular, dan penyakit degeneratif. Penelitian-penelitian tersebut juga

menyampaikan bahwa antioksidan memiliki nilai terapetik pada penyakit-penyakit

tersebut (Barhe dan Tchouya, 2014).

Radikal bebas adalah suatu atom atau molekul yang mempunyai elektron

tidak berpasangan. Elektron tidak berpasangan tersebut menyebabkan radikal

bebas sangat reaktif yang kemudian akan menangkap atau mengambil elektron

dari senyawa lain seperti protein, lipid, karbohidrat, dan DNA untuk menetralkan

diri. Radikal bebas dapat masuk ke dalam tubuh dan menyerang sel-sel yang sehat

dan menyebabkan sel-sel tersebut kehilangan fungsi dan strukturnya. Akumulasi

dari kerusakan tersebut berkontribusi terhadap beberapa penyakit dan

menyebabkan kondisi yang biasa disebut sebagai penuaan dini (Liochev, 2013).


2

Efek negatif radikal bebas terhadap tubuh dapat dicegah dengan senyawa

yang disebut antioksidan. Antioksidan memiliki kemampuan memberikan

elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi berantai radikal bebas (Halliwell, 2012).

Antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan alami dan

antioksidan sintetik. Antioksidan alami berasal dari hasil ekstraksi bahan alami

yang berpotensi menangkap radikal bebas, sedangkan antioksidan sintetik

diperoleh dari hasil sintesis secara kimia (Isfahlan, dkk., 2010). Namun, adanya

kekhawatiran terhadap efek samping penggunaan antioksidan sintetik

menyebabkan banyak penelitian tentang potensi antioksidan alami yang berasal

dari tanaman (Saleh, Clark, Woodard, dan Deolu, 2010).

Nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) adalah salah satu dari tiga buah

tropis yang paling penting setelah pisang dan jeruk. Nanas merupakan buah yang

mempunyai kandungan sangat kompleks, kaya akan mineral baik makro maupun

mikro, zat organik, air dan juga vitamin. Nanas mengandung gula, asam, asam

askorbat, senyawa fenolik, mineral, dan enzim bromelain (Yahia, 2011). Enzim

bromelain termasuk ke dalam golongan enzim protease yang mampu memecah

protein rantai panjang menjadi fragmen protein yang lebih kecil bahkan sampai ke

bentuk asam amino (Ali, Milala, dan Gulani 2015).

Enzim bromelain adalah salah satu enzim protease yang digunakan dalam

perawatan luka dan mempercepat proses regenerasi jaringan (Maurer, 2001).

Enzim protease yang digunakan secara luas dalam bidang kosmetik untuk

merawat kulit dan luka, regenerasi jaringan, dan mencegah timbulnya keloid

umumnya memiliki aktivitas antioksidan. Antioksidan diasosiasikan dengan


3

regenerasi jaringan karena pembentukan keloid disebabkan oleh adanya

akumulasi dari jaringan kolagen dan pembentukan jaringan pyridinoline yang

dihubungkankan dengan radikal bebas (Pendzhiev, 2002). Untuk melihat potensi

antioksidan dari bromelain yang telah digunakan untuk perawatan luka, dalam

penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) secara spektrofotometri. Metode DPPH dipilih

karena sederhana, mudah, cepat, dan peka serta hanya memerlukan sedikit

sampel. Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah

IC50 yaitu konsentrasi ekstrak atau fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap

radikal DPPH sebanyak 50% (Zou, Lu, dan Wei, 2004). Pengukuran kadar enzim

dari ekstrak bromelain daging buah nanas dilakukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri ultraviolet (uv) yang merupakan salah satu metode yang cepat

dan sederhana dalam menentukan kandungan enzim bromelain (Chaurasiya dan

Hebbar, 2013).

1. Permasalahan

a. Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas

yang dinyatakan dengan IC50?

b. Berapa kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas yang

dinyatakan dengan persen (% b/b)?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran peneliti, penelitian yang serupa pernah dilakukan

oleh Manosroi, Chankhampan, Pattamapun, Manosroi, dan Manosroi, 2014,

dengan judul “Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya


4

Latex and Bromelain from Pineapple Fruits”. Penelitian ini menggunakan buah

nanas yang diperoleh di Chiang Mai (Thailand), purifikasi menggunakan etanol

95% dengan perbandingan 1:1 selama 30 menit, uji kualitatif dan pengukuran

kadar enzim menggunakan HPLC (high performance liquid chromatography),

dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl).

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan

tersebut teletak pada letak pemanenan buah nanas, metode purifikasi, dan metode

uji kualitatif dan penetapan kadar enzim. Penelitian ini menggunakan buah nanas

yang diperoleh di pasar Stan (Yogyakarta), purifikasi menggunakan etanol 90%

dengan perbandingan 1:3 selama 24 jam, uji kualitatif menggunakan uji ninhidrin,

dan penetapan kadar enzim menggunakan metode spektrofotometri uv.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian tentang aktivitas antioksidan

ekstrak bromelain daging buah nanas.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat

tentang aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas sehingga

bisa dimanfaatkan untuk memelihara kesehatan.


5

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi kemanfaatan daging buah

nanas sebagai antioksidan.

2. Tujuan khusus

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui nilai aktivitas antioksidan

ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH yang dinyatakan

dengan IC50 dan kadarnya dengan baku standar BSA yang dinyatakan dengan

persen (% b/b).


6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Nanas

1. Taksonomi

Klasifikasi tanaman menurut Pullaiah (1998) sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Viridiplantae

Superdivision : Embryophyta

Division : Tracheophyta

Class : Magnoliopsida

Superorder : Lilianae

Order : Poales

Family : Bromeliaceae

Genus : Ananas Mill.

Species : Ananas comosus (L.) Merr.

2. Morfologi

Tanaman nanas berbentuk semak dan hidupnya bersifat tahunan

(parenial). Susunan tubuh tumbuhan nanas terdiri dari bagian utama meliputi:

akar, batang, daun, bunga, dan tunas-tunas. Biji nanas berkeping tunggal. Bentuk

batang nanas mirip gada, berukuran panjang antara 20-25 cm atau lebih, tebal

dengan diameter 2,0-3,5 cm, beruas-ruas (buku-buku) pendek. Tangkai bunga atau


7

buah merupakan perpanjangan batang. Daun nanas tumbuh memanjang sekitar

130-150 cm, lebar antara 3-5 cm atau lebih, pinggir daun ada yang berduri atau

tanpa duri, permukaan daun sebelah atas halus mengkilap berwarna hijau tua atau

merah tua bergaris atau coklat kemerah-merahan, sedangkan permukaan daun dan

bagian bawah berwarna keputih-putihan atau keperak-perakan. Daun mahkota

lepas bentuk garis memanjang, panjang lebih kurang 2 cm, putih dan ungu, dari

dalam dan pangkalnya dengan dua pinggiran menonjol, berkuku. Buah semu

berdaging, hijau sampai orange, biji kecil dan kerap kali tidak menonjol. Jumlah

daun tiap batang (tanaman) amat bervariasi antara 70-80 helai yang tata letaknya

seperti spiral, yakni mengelilingi batang mulai dari bawah ke arah atas kanan dan

kiri (Van Steenis, 1992).

Bunga atau buah nanas muncul pada ujung tanaman. Bunga nanas

tersusun dalam tangkai berukuran panjang antara 7-5 cm atau lebih. Tiap tangkai

bunga terdiri dari 100-200 kuntum bunga yang melekat saling berhimpitan

(berdempetan). Sifat pembungaan nanas termasuk menyerbuk silang, tanpa

melalui penyerbukan silang buah nanas tidak akan menghasilkan biji. Kumpulan

kuntuk buanga dengan adanya proses penyerbukan akan menghasilkan kumpulan

buah kecil berjumlah 100-200 buah. Buah-buahan kecil tersebut bergabung

menjadi satu dan dihubungkan oleh batang tengah yang disebut hati, sehingga

penampakan visual seolah-olah hanya ada satu buah berbentuk bulat dengan

bagian ujung kerucut (Rukmana, 1996).


8

3. Kegunaan

Cairan buah nanas berkhasiat sebagai obat rasa penuh di lambung,

sembelit, radang tenggorokan, menurunkan berat badan, beri-beri, keseleo,

bengkak terpukul, darah mudah menggumpal, penyempitan pembuluh darah,

menghambat pertumbuhan tumor, meningkatkan penyerapan obat, mempercepat

haid, dan cacingan. Hal yang menjadi catatan khusus adalah ibu hamil dilarang

meminum perasan buah nanas muda. Buah nanas dalam saluran cerna akan

difermentasi menjadi alkohol yang dapat menimbulkan kambuhnya rematik gout

(Pavan, Jain, Shraddha, dan Kumar, 2012).

4. Kandungan kimia

Buah, daun, dan akar nanas mengandung saponin, flavonoid, dan

polifenol, ergosterol, peroksida, asam annasat, asam sitrat, enzim bromelain,

vitamin (A dan C), kalsium, fosfor, magnesium, besi, natrium, kalium, kalsium

oksalat, dekstrosa, sukrosa, dan pectic substances. Buah nanas juga mengandung

selulosa, hemiselulosa dan karbohidrat lain (Bartholomew, Paull, dan Rohrbach,

2002).

B. Bromelain

1. Sifat fisika dan biokimia

Bromelain tergolong jenis enzim protease sulfhidril yang mampu

menghidrolisis ikatan pepetida pada protein atau polipeptida menjadi molekul

yang lebih kecil yaitu asam amino. Bromelain merupan campuran antara thiol

endopeptidase dan komponen lainnya seperti fosfatase, glukosidase, peroksidase,


9

selulase, glikoprotein, karbohidrat, dan protease inhibitor. Berdasarkan

sumbernya, bromelain dibagi menjadi stem bromelain dan fruit bromelain.

Terdapat perbedaan berat molekuler, titik isoelektrik, rantai asam amino, dan

aktivitas proteolitik antara kedua tipe bromelain tersebut. Bromelain ini berbentuk

serbuk amorf dengan warna putih bening sampai kekuning-kuningan, berbau khas,

larut sebagian dalam: aseton, eter, stabil pada pH: 5,0-7,0. Suhu optimum enzim

bromelain adalah 50˚C-60˚C (Maurer, 2001).

2. Sifat farmakologi

Bromelain memiliki beberapa sifat farmakologi yang disebabkan oleh

aktivitas proteolitiknya maupun non-proteolitiknya. Dari berbagai uji in vitro dan

in vivo, maupun dari uji klinik yang terkontrol dan tidak terkontrol, bromelain

memiliki kemampuan sebagai berikut:

Mencegah pembentukan edema dan mengurangi edema

Mengurangi kadar fibrinogen dalam darah

Membantu proses fibrinolisis

Mengaktifkan plasmin

Memperpanjang waktu protrombin dan parsial tromboplastin

Mencegah agregasi platelet darah dan adesi dari platelet ke sel endotelial

pembuluh darah

Mengurangi kadar plasmakinin dalam darah

Mengurangi kadar prostaglandin E2 dan tromboksan A2 pada inflamasi

akut dan berperan sebagai agen antiinflamasi


10

Menginduksi sekresi dari interleukin (Il)-1, Il-6, Il-8, dan tumor necrosis

factor (TNF)-α dari monosit dan granulosit

Meningkatkan permeabilitas jaringan dari antibiotik

Mencegah metastasis

Membantu proses debridemen kulit pada luka bakar (Bhattacharyya,

2008).

3. Bioavailabilitas dan toksisitas

Bromelain diabsorbsi di saluran cerna dan masuk ke dalam peredaran

darah sebanyak 40% setelah penggunaan oral pada tikus. Konsentrasi tertinggi

bromelain dalam darah didapatkan setelah 1 jam dengan waktu paruh selama 6-9

jam. Penelitian melaporkan bahwa tidak ada efek toksik pada mencit, tikus, dan

kelinci bila diberikan dosis sebesar 10 mg/kgBB. Pada pemberian secara

intravena diperoleh LD50 pada mencit 30 mg/kgBB dan kelinci 20 mg/kgBB,

sedangkan pada pemberian secara intraperitonial diperoleh LD50 pada mencit 37

mg/kgBB dan tikus 85 mg/kgBB. Penelitian toksistas kronis pada tikus pada satu

periode selama 3 bulan memperlihatkan tidak adanya perubahan patologi pada

organ-organ vital (Moss, Frazier, dan Martin, 1963).

4. Isolasi

Bromelain terdapat pada tangkai, kulit, daun, buah, maupun batang

dalam jumlah yang berbeda. Kandungan enzim bromelain lebih banyak pada

batang namun selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelain pada nanas

tidak merata dan tergantung pada umur tanaman. Kandungan bromelain pada

jaringan yang umurnya belum tua terutama yang bergetah sangat sedikit sekali


11

bahkan kadang-kadang tidak ada sama sekali, sedangkan bagian tengah batang

mengandung bromelain lebih banyak dibandingkan bagian tepinya. Pada buah

nanas, kandungan bromelain lebih banyak pada buah nanas yang masih hijau atau

belum matang dibandingkan buah nanas segar yang sudah matang (Harrach,

Schulze, Nuck, Grunow, dan Maurer, 1995).

Salah satu metode yang digunakan untuk mengisolasi bromelain adalah

penambahan pelarut organik. Bromelain diisolasi dari bagian tanaman nanas yang

sudah berupa sari buah atau perasannya dengan menambahkan pelarut organik

sebagai bahan pengendap, biasa yang digunakan adalah alkohol, aseton, dan

ammonium sulfat. Cara pengendapannya berbeda-beda, ada beberapa peneliti

yang melakukan pengendapan dengan menambahkan larutan pada pH tertentu dan

ada yang melakukan pengendapan dengan membuat kondisi pada suhu tertentu.

Hasil isolasi dengan metode ini disebut dengan crude bromelain extract

(Nadzirah, Zainal, Noriham, dan Normah, 2013).

C. Metode Ninhidrin

Uji kualitatif dari protein dilakukan dengan menggunakan senyawa

ninhidrin. Prinsip dari metode ini adalah ninhidrin yang mula-mula berwarna

kuning akan bereaksi dengan asam amino dan berubah warna menjadi biru-ungu.

Warna biru-ungu yang terbentuk kepekatannya setara dengan konsentrasi asam

amino, artinya semakin besar konsentrasi asam amino, maka semakin banyak

ninhidrin yang bereaksi dengan asam amino menjadi senyawa kompleks


12

Ruhemman yang berwarna ungu, sehingga warna biru yang dihasilkan semakin

pekat (Boyer, 2011).

Ninhidrin bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam semua

asam amino, peptida, dan protein. Uji ini merupakan uji yang cepat dan sensitif

dalam mendeteksi asam amino, namun uji ini tidak selektif sehingga tidak bisa

digunakan dalam menentukan asam amino dalam tingkat individu apabila

digunakan dalam larutan yang berisi campuran asam amino. Struktur ninhidrin

ditunjukan dalam gambar di bawah ini.

Gambar 1. Struktur ninhidrin (Bettelheim dan Landesberg, 2009)

D. Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron

bebas yang tak berpasangan (unpaired electron). Hal ini dapat dilihat misalnya

pada air (H2O). Ikatan atom oksigen dengan hidrogen pada air merupakan ikatan

kovalen, yaitu ikatan kimia yang timbul karena sepasang elektron dimiliki

bersama oleh dua atom. Elektron yang tidak memiliki pasangan cenderung akan

menarik eletron dari senyawa lainnya, sehingga elektron tersebut akan dimiliki

bersama oleh dua atom atau senyawa dan terbentuk suatu senyawa radikal bebas

baru yang lebih reaktif. Reaktivitas yang meningkat tersebut menyebabkan


13

senyawa radikal bebas menjadi lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam

tubuh. Jika pertahanan tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak

(Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi, 2010).

Radikal bebas tersebut memiliki 2 sifat yaitu:

1. Reaktivitasnya yang tinggi karena akan cenderung menarik elektron dari

senyawa yang lainnya lagi.

2. Memiliki kemampuan untuk mengubah suatu molekul, atom, atau senyawa

untuk menjadi suatu radikal baru (Morello, Shahidi, Ho, 2002).

Target utama radikal bebas adalah protein, karbohidrat, asam lemak tak

jenuh dan lipoprotein, serta unsur-unsur DNA. Dari molekul-molekul target

tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak

tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak

jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa

DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel

kanker. Radikal bebas akan terus mencari elektron dari molekul-molekul di

sekitarnya dan apabila tidak dikendalikan reaksi berantai ini dapat berlangsung

secara terus menerus (Halliwell dan Gutteridge, 2000).

E. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau

reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi,

dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga dapat didefinisikan

sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat


14

yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa

tersebut (Sunardi, 2007).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan diklasifikasikan menjadi

dua kategori, yaitu antioksidan pencegah dan antioksidan pemutus rantai.

Antioksidan pencegah bekerja dengan menghambat pembentukan reactive oxygen

species (ROS), seperti enzim katalase, peroksidase, superoksida dismutase, dan

transferin. Antioksidan pemutus rantai merupakan senyawa yang menangkap

radikal oksigen kemudian memutus rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya

vitamin C, vitamin E, asam urat, bilirubin, polifenol, dan sebagainya. Antioksidan

pemutus rantai memiliki dua jaul reaksi. Jalur pertama merupakan jalur transfer

atom hidrogen dengan mekanisme radikal oksigen menangkap hidrogen dari

antioksidan sehingga terbentuk kompleks antioksidan radikal yang bersifat stabil.

Jalur kedua, antioksidan mendeaktivasi radikal bebas dengan transfer elektron

tunggal. Transfer elektron tunggal sangat dipengaruhi oleh kestablilan pelarut

pada muatan tertentu (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).

F. Metode DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak

membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan

menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini

sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical

scavengers atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidannya, serta

mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal-antioksidan yang terbentuk. Metode


15

DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan

(Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).

Gugus kromofor dan auksokrom pada radikal bebas DPPH memberikan

absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga menimbulkan

warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning seiring

penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan

dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara

dengan jumlah elektron yang tertangkap. Mekanisme penangkapan radikal

ditunjukan pada reaksi di bawah ini.

Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (AH=Antioksidan,

ox=Oksidasi, red=Reduksi) (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009)

G. Landasan Teori

Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memicu

terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang

memiliki elektron tidak berpasangan, sehingga tidak stabil. Untuk mencapai

kestabilan, elektron tidak berpasangan akan mencari pasangan elektron di

sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, DNA,


16

dan dapat memicu penyakit degeneratif (Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi,

2010). Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi

oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat dicegah (Ou, Huang,

Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).

Nanas merupakan tanaman yang mudah ditemukan di daerah tropis.

Kandungan buah nanas yang sudah banyak diteliti dan dipublikasikan salah

satunya adalah bromelain (Bartholomew, Paull, dan Rohrbach, 2002). Bromelain

merupakan salah satu enzim protease yang umum digunakan dalam perawatan

luka. Enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka untuk regenerasi

jaringan dan mencegah timbulnya keloid berpotensi memiliki aktivitas

antioksidan (Bhattacharyya, 2008).

Kandungan enzim dalam suatu sampel dapat dianalisis secara kualitatif

dengan menggunakan metode uji ninhidrin dan kuantitatif dengan menggunakan

metode spektrofotometri uv. Prinsip uji ninhidrin yaitu pembentukan warna biru-

ungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Boyer, 2011). Prinsip

spektrofotometri yaitu protein yang memiliki cincin aromatik seperti fenilalanin,

triptofan, histidin, dan tirosin memiliki serapan yang kuat pada panjang

gelombang 280 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut

sebanding dengan jumlah enzim dalam sampel (Walker, 2002).

Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang

sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk

menguji suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Gugus

kromofor dan auksokrom DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang


17

gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi

kuning ketika terdapat senyawa antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH

(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

H. Hipotesis

1. Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki

aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50.

2. Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki

kadar enzim yang dinyatakan dengan persen (% b/b).


18

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan

rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

Variabel – variabel yang digunakan pada penelitian ini adalah:

1. Variabel utama

a. Variabel bebas

Variasi konsentrasi ekstrak bromelain daging buah nanas.

b. Variabel tergantung

Aktivitas antioksidan (%IC) dan kadar enzim ekstrak bromelain daging buah

nanas.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali

Jenis tanaman, tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang

dipanen, cara panen, jumlah (g) buah yang digunakan, suhu evaporasi, waktu

pengendapan, dan lama penyimpanan ekstrak bromelain.

b. Variabel pengacau tidak terkendali

Suhu blender, suhu sentrifugasi.


19

3. Definisi operasional

a. Aktivitas antioksidan

Aktivitas antoksidan adalah kemampuan ekstrak bromelain untuk

menangkap radikal DPPH dibandingkan dengan kontrol negatif.

b. Ekstrak bromelain

Ekstrak bromelain adalah crude bromelain extract yang diperoleh dari

presipitasi dan pengeringan ekstrak daging buah nanas.

c. Kadar enzim

Kadar enzim adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persen yang

menyatakan kadar enzim bromelain dalam ekstrak bromelain.

d. Persen inhibition concetration (%IC)

Persen inhibition concetration adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam

bentuk persentase yang menyatakan kemampuan ekstrak bromelain dalam

menangkap radikal DPPH.

e. Inhibition concetration 50 (IC50)

Inhibition concetration 50 adalah nilai dosis ekstrak bromelain yang dapat

menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

C. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan adalah daging buah nanas yang dibeli pada

bulan Februari - Maret 2016 dan diperoleh dari pasar Stan, kabupaten Sleman,

Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis yang digunakan dalam penelitian ini

yaitu aquadest; bahan kimia kualitas teknis (CV. General Labora) berupa ethanol


20

dan deionized water; bahan kimia kualitas pro analitik (E. Merck) berupa metanol

dan ninhidrin; bahan kimia kualitas pro analitik (Sigma Chem. Co.) berupa rutin

dan DPPH; bahan kimia kualitas pro analitik (DiaSys) berupa bovine serum

albumine (BSA).

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: blender (Maspion),

corong Buchner (Desaga), mikropipet 50-200 µL (Socorex), vortex (Stuart

Scientific), sentrifuge (Hettich), magnetic stirrer (Thermo Scientific), vacuum

rotary evaporator (Butchi), waterbath (Memmert), spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer), neraca analitik ketelitian

0,1 mg (Mettler Toledo), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di

laboratorium (Pyrex-Germany).

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi buah nanas

Determinasi buah nanas dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman

Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan

Backer dan Bakhuizen van Den Brink (1963) dengan mencocokan karakteristik

buah nanas yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok

tumbuhan.


21

2. Pengumpulan buah nanas

Buah nanas diperoleh dari desa pasar Stan, kabupaten Sleman,

Yogyakarta, dan buah yang diambil memiliki jenis dan tingkat kematangan yang

sama.

3. Pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Soares, Vaz,

Correia, Pessoa, dan Carneiro-da-Cunha (2012) dengan beberapa modifikasi.

a. Ekstraksi buah nanas

Buah nanas dicuci dengan air mengalir, dikeringkan, dan dikupas.

Daging buah sebanyak 70,0 g dipotong kecil-kecil kemudian dicampur

dengan deionized water 4°C (1:1 w/w) dan dihaluskan menggunakan

blender. Larutan jus disaring dengan menggunakan kain katun tipis lalu

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan

dikumpulkan dalam gelas beker sebagai ekstrak daging buah nanas.

b. Purifikasi dengan teknik ethanol precipitation

Ekstrak daging buah nanas sebanyak 100,0 mL didinginkan sampai

suhunya 4°C lalu ditambahkan dengan etanol (90%;4°C) dengan

perbandingan 1:3 sebanyak 300,0 mL. Campuran diaduk menggunakan

magnetic stirrer selama 5 menit dan didiamkan selama 24 jam pada suhu

4°C sehingga didapatkan endapan koloidal putih hingga kuning muda.

Setelah terjadi pengendapan, campuran diuapkan menggunakan vacuum

rotary evaporator dengan suhu 50°C selama 30 menit. Endapan

dikumpulkan dalam cawan petri dan diuapkan kembali menggunakan


22

waterbath dengan suhu 50°C selama 3 jam. Cairan kental berwarna

kekuningan dikumpulkan sebagai ekstrak bromelain.

4. Analisis kualitatif bromelain

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Panda (2000)

dengan beberapa modifikasi.

a. Reaksi Warna

Senyawa BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL

dilarutkan ke dalam 10,0 mL deionized water, ekstrak bromelain

sebanyak 250,0 mg dilarutkan ke dalam 50,0 mL deionized water, dan

ninhidrin sebanyak 350,0 mg dilarutkan ke dalam 100,0 mL etanol 90%.

Larutan BSA diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukan ke dalam tabung

reaksi dan ditambah dengan larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran

dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga muncul warna

biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino dengan

ninhidrin. Analisis yang sama juga dilakukan untuk larutan bromelain

dan air deionisasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

5. Penetapan kadar enzim bromelain

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Ahmed (2005)


a. Pembuatan larutan uji

Ekstrak bromelain sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke

dalam 25,0 mL aquadest (5°C) sehingga diperoleh kosentrasi larutan uji

sebesar 10000 µg/mL.


23

b. Pembuatan larutan baku

Senyawa BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL

dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C). Larutan tersebut diambil

sebanyak 4,0; 5,5; 7,0; 8,5 dan 10,0 mL lalu ditambah dengan aquadest

(5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku

bromelain sebesar 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL.

c. Penentuan operating time (OT)

Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL

divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan

spektrofotometer uv pada panjang gelombang 280 nm tiap 5 menit

selama 30 menit. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

d. Penetapan panjang gelombang maksimum

Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL

dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu

didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang

gelombang 200-400 nm.

e. Pengukuran absorbansi larutan baku dan uji

Larutan BSA dengan konsentrasi 400, 550, 700, 850 dan 1000

µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap

blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3

kali. Kemudian, larutan uji dengan konsentrasi 10000 µg/mL diukur

serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang

terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.


24

f. Estimasi kadar enzim

Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak

bromelain kemudian dihitung nilai % kadar enzim.

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016)


a. Pembuatan larutan DPPH

Senyawa DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke

dalam metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh kosentrasi

larutan DPPH sebesar 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan

alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan rutin

Senyawa rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a

hingga 100,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0

dan 6,0 mL lalu ditambah dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30

µg/mL.

c. Pembuatan larutan uji

Ekstrak bromelain sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke

dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0;

3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga

10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku bromelain sebesar

3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mg/mL.


25

7. Uji aktivitas antioksidan

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016)


a. Uji pendahuluan

Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan

larutan DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µg/mL, dan larutan

bromelain 5 mg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan

metanol p.a sebanyak 3 mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama

30 detik dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, warna larutan

diamati. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

b. Penentuan operating time (OT)

Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan

larutan DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µg/mL sebanyak 1,0 mL

kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan

divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan

spektrofotometes visibel pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit

selama 1 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Penetapan panjang gelombang maksimum

Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah

dengan larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah

dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi

DPPH sebesar 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam


26

tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT.

Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-600 nm.

d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH

Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10

mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT,

larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel

pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3

kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan

pembanding dan uji.

e. Pengukuran absorbansi larutan rutin dan uji

Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10

mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada

berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan

metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu

didiamkan selama OT. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan

menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

f. Estimasi aktivitas antioksidan

Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak

bromelain kemudian dihitung niai %IC dan IC50.


27

F. Analisis Hasil

Kadar enzim dalam ekstrak bromelain dinyatakan dalam persen. Nilai

absorbansi larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku

BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan sumbu y adalah

absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi enzim yang kemudian dikonversi

menjadi persen kadar enzim dalam ekstrak bromelain.

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung berdasarkan rumus:

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan

regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding,

sedangkan sumbu y adalah %IC.

Data lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidaknya

perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dan larutan uji. Analisis

statistik dilakukan dengan panduan Bolton dan Bon (2010) dan dengan software R

3.2.5. Nilai IC50 diuji dengan Shapiro-Wilk pada taraf kepercayaan 95% untuk

mengetahui distribusi data tiap kelompok. Hasil analisis berupa distribusi data

yang normal selanjutnya dianalisis dengan uji F pada taraf kepercayaan 95%

untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Hasil analisis berupa data yang

tidak homogen selanjutnya dianalisis dengan uji T-Independent unequal variances

(Welch’s T-test) pada taraf kepercayaan 95% untuk melihat perbedaan antar

kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (tidak signifikan)

(p>0,05).


28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi merupakan langkah awal yang dilakukan dalam suatu

penelitian dengan menggunakan tanaman. Determinasi tanaman ini bertujuan

untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan

digunakan dalam penelitian serta untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam

pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman nanas

dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal 20 Maret 2016 dengan acuan Backer dan

Bakhuizen van Den Brink (1963), yang membuktikan bahwa tanaman yang

digunakan untuk penelitian adalah tanaman nanas (Ananas comosus (L.) Merr.).

Pembuktian dipertegas dengan surat determinasi (lampiran 1) tanaman yang

dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi


B. Hasil Pengumpulan Bahan

Nanas yang digunakan sebagai bahan penelitian bentuknya kecil dan

diambil dari pasar Stan, kabupaten Sleman, Yogyakarta. Batang nanas tidak

dipilih karena ketersediaannya yang relatif tidak banyak dibandingkan dengan

buah nanas. Varietas tanaman nanas, umur buah nanas, dan tempat tumbuh

tanaman nanas merupakan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kandungan


29

bromelain buah nanas. Usaha yang dilakukan untuk meminimalkan variasi

kandungan bromelain dalam buah nanas adalah sampel diambil dari satu kios

buah sama sehingga sampel buah nanas tersebut memiliki varietas, umur, dan

berasal dari suplier yang sama. Buah nanas yang digunakan adalah buah nanas

yang kulitnya masih hijau dengan kondisi belum matang. Hal ini bertujuan untuk

mendapatkan kandungan bromelain yang masih tinggi. Berdasarkan penelitian

yang pernah dilakukan sebelumnya, buah nanas yang belum matang memiliki

kandungan bromelain yang lebih banyak dibandingkan dengan buah nanas yang

sudah matang (Chaurasiya dan Hebbar, 2013).

C. Hasil Isolasi Bromelain

Proses pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas dimulai dengan

proses pengupasan buah nanas dan pemotongan daging buah menjadi bentuk yang

lebih kecil yang bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas

pemukaan daging buah yang mengalami kontak dengan pelarut semakin besar.

Kontak dengan pelarut yang semakin besar dapat meningkatkan proses penarikan

senyawa kimia yang diinginkan sehingga hasil ekstraksi menjadi lebih optimal.

Pelarut yang digunakan adalah deionized water dengan suhu 4˚C.

Deionized water merupakan pelarut yang mampu digunakan dalam ekstraksi

bromelain karena sifat enzim bromelain yang hidrofilik, memiliki pH 6 yang

cenderung netral, dan dapat mencegah denaturasi bromelain selama proses

ekstraksi. Pelarut ini juga digunakan dalam beberapa penelitian terkait bromelain

oleh Soares, Vaz, Correia, Pessoa, dan Cameiro-da-cunha (2012), Ketnawa,


30

Rawdkuen, dan Chaiwut (2010), dan Devakate, Patil, Waje, dan Thorat (2008).

Suhu dingin yaitu 4˚C digunakan dengan tujuan mencegah proses denaturasi

bromelain, memperlambat terjadinya reaksi enzimatik yang dapat merusak

bromelain, dan meningkatkan kelarutan bromelain dalam proses ekstraksi.

Walaupun begitu, ada penelitian oleh Chaurasiya dan Hebbar (2013) yang

menyatakan bahwa efek dari suhu selama proses ekstraksi bromelain terhadap

perubahan kadar dan aktivitas enzimatik bromelain tidak signifikan sehingga

ekstraksi bisa dilakukan pada suhu ruangan (25˚C).

Daging buah yang sudah dipotong kecil kecil kemudian dicampur dengan

pelarutnya dan dihomogenkan dengan blender. Proses homogenisasi bertujuan

untuk mengeluarkan enzim dari sel-sel jaringan buah nanas. Enzim biasanya

terletak di dalam dinding sel sehingga proses perusakan dinding sel diperlukan

agar enzim bisa dilarutkan dan diekstraksi secara sempurna. Homogenisasi

menggunakan blender merupakan mechanical lysis yang dipilih karena prosesnya

yang ekonomis, cepat, mudah dilakukan, dan tidak memerlukan penambahan

senyawa kimia. Metode ini juga merupakan salah satu metode terbaik dalam

merusak sel jaringan tanaman (Tolldra dan Nollet, 2013). Kelemahan dari metode

ini adalah terjadinya peningkatan suhu dan munculnya busa dalam proses

ekstraksi yang dapat merusak enzim di permukaan cairan. Campuran yang sudah

dihomogenkan kemudian disaring menggunakan kain katun tipis dan corong

buchner dengan bantuan pompa vakum yang berguna untuk mempercepat proses

penyaringan. Penyaringan bertujuan untuk memisahkan cairan yang berisi enzim

dengan sisa jaringan tanaman yang tidak digunakan.


31

Campuran yang sudah didinginkan kembali kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sentrifugasi merupakan proses

fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan enzim bromelain dengan senyawa

lainnya dalam suatu campuran. Prinsip fraksinasi dari metode sentrifugasi adalah

perbedaan pergerakan senyawa dalam gaya sentrifugal yang disebabkan oleh

perbedaan berat molekul, ukuran, dan bentuk dari senyawa (Cutler, 2004). Metode

ini dipilih karena sentrifugasi adalah metode fraksinasi enzim dan protein yang

paling mudah dilakukan. Kelemahan dari metode ini adalah spesifisitasnya rendah

dibandingkan dengan metode lain seperti kromatografi dan elektroforesis.

Setelah proses sentrifugasi selesai, supernatan dikumpulkan dan

didinginkan kembali. Supernatan kemudian dicampur etanol 90% dengan

perbandingan 1: 3 dan diaduk secara konstan dengan bantuan magnetic stirrer.

Pengadukan yang konstan berfungsi untuk mencegah terkonsentrasinya etanol

pada bagian tertentu saja dan meratakan pencampuran antara etanol dengan

deionized water. Campuran kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C

hingga menghasilkan endapan koloidal yang mengandung enzim bromelain.

Proses ini merupakan proses purifikasi yang bertujuan untuk memurnikan enzim

bromelain dan memisahkannya dari senyawa lain yang tidak diperlukan. Metode

purifikasi yang digunakan adalah metode presipitasi dengan pelarut organik.

Prinsip dari metode ini perubahan kelarutan dari protein dengan penambahan

pelarut lainnya. Bromelain merupakan enzim yang hidrofil sehingga larut dalam

pelarut deionized water, apabila kepolaran pelarut berkurang karena deionized

water ditambahkan dengan pelarut organik lainnya maka kelarutan dari protein


32

akan berkurang. Ketika protein menjadi kurang larut, maka protein akan

cenderung untuk berkumpul dan mengendap (Hatti-Kaul dan Mattiasson, 2003).

Pelarut organik yang dipilih adalah etanol karena kepolaran etanol lebih rendah

dibandingan dengan deionized water, mampu bercampur dengan deionized water

secara sempurna, tidak bereaksi dengan enzim bromelain, dan memiliki efek

presipitasi yang cukup baik. Kelemahan dari metode ini adalah waktu pengerjaan

yang cukup lama (24 jam) sehingga tidak cocok untuk enzim yang tidak tahan

lama dalam penyimpanan, hasil presipitasi susah untuk dikumpulkan karena

berbentuk endapan koloidal, dan perlu dilakukan metode lanjutan untuk

mengisolasi enzim dan protein yang lebih spesifik (Dennison,2003).

Endapan koloidal kemudian dikeringkan dengan menggunakan vacuum

rotary evaporator dengan suhu dan tekanan rendah. Suhu dijaga pada 50 °C untuk

mencegah proses denaturasi enzim dan protein akibat suhu yang terlalu tinggi

(Chaurasiya dan Hebbar, 2013). Tekanan yang rendah akan mempercepat proses

penguapan karena pelarut yang digunakan yaitu campuran antara deionized water

dan etanol 90% akan menguap di bawah titik didihnya. Setelah sebagian besar

pelarut teruapkan, cairan koloidal berwana kuning ditaruh dalam cawan porselen

dan diletakan di atas waterbath agar pelarut yang tersisa dapat menguap.

Penguapan dilakukan hingga didapatkan bobot tetap ekstrak kental bromelain.

Bobot tetap menurut Farmakope Indonesia (1979) yaitu dua kali penimbangan

berturut-turut berbeda tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang.

Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dibungkus dengan alumunium foil dan

disimpan dalam desikator supaya tidak terpapar dengan lembab yang dapat


33

merusak enzim bromelain karena proses hidrolisis. Bobot ekstrak bromelain

daging buah nanas yang didapatkan yaitu 3,5567 gram. Rendemen yang didapat

yaitu 1,6937 % b/b. Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain dapat dilihat

pada gambar di bawah ini.

Gambar 3. Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain

(1=Daging buah nanas; 2=Hasil blender; 3=Supernatan; 4=Campuran supernatan

dan etanol; 5=Endapan koloidal; 6=Ekstrak kental bromelain)

D. Hasil Analisis Kualitatif Ekstrak Bromelain

Analisis kualitatif dimaksudkan untuk mengetahui secara kualitatif

keberadaan enzim bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas.

Pengujian secara kualitatif ini penting dilakukan sebelum melakukan pengujian

secara kuantitatif. Analisis kualitatif dengan ninhidrin dilakukan dengan prinsip

reaksi pembentukan senyawa kompleks Ruhemman yang berwarna ungu dari

ninhidrin dan asam amino. Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dan asam amino


34

bisa secara singkat bisa dijelaskan sebagai berikut: pertama, terjadi oksidasi

amino alfa oleh ninhidirin dan dihasilkan hidroksidiketohidrindin, aldehid,

amoniak, dan karbondioksida. Kedua, terjadi kondensasi antara amoniak,

ninhidrin, dan hidroksidiketohidrindin dan dihasilkan senyawa Ruhemman yang

berwarna biru-ungu. Reaksi yang terjadi ditunjukan pada gambar di bawah ini.

Gambar 4. Reaksi asam amino dengan ninhidrin (Bottom, Hanna, dan Siehr, 1978)

Uji ninhidrin dilakukan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif.

Kontrol positif yang digunakan yaitu larutan BSA yang dicampurkan dengan

larutan ninhidrin untuk menunjukan perubahan warna saat hasil uji positif. BSA

digunakan sebagai senyawa pembanding karena BSA merupakan protein yang

biasa digunakan untuk menganalisis kandungan protein dan enzim secara

kualitatif dan kuantitatif dan mampu digunakan dalam berbagai metode uji

(Murachi, 1970). Kontrol negatif yang digunakan yaitu pelarut deionized water

yang dicampurkan dengan larutan ninhidrin untuk menunjukan warna saat

hasilnya negatif dan memastikan tidak ada intervensi dari pelarut yang digunakan.

Pengujian dilakukan menggunakan tabung reaksi dengan replikasi 3 kali.

Masing-masing tabung reaksi ditambahkan dengan larutan uji sebanyak 1 mL dan


35

larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama

15 menit sehingga muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi

antara asam amino dengan ninhidrin. Pemanasan bertujuan untuk memecah

protein dan enzim menjadi asam amino sehingga dapat bereaksi dengan ninhidrin.

Pengujian yang dilakukan menunjukan hasil yang positif untuk sampel dan

kontrol positif yaitu terbentuknya warna biru ungu. Hal ini menunjukan bahwa

sampel hasil isolasi bromelain dari daging buah nanas mengandung enzim

bromelain. Hasil uji ninhidrin dan proses perubahan warnanya bisa dilihat pada

gambar di bawah ini.

Gambar 5. Hasil uji ninhidrin dan perubahan warnanya

(A=Larutan sebelum dipanaskan; B= Kontrol negatif deionized water; C=Kontrol

positif BSA; D=Bromelain)


36

E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kadar Bromelain

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan untuk

tepat habis bereaksi. Pengukuran pada saat OT ditujukan untuk meminimalkan

kesalahan dalam hal pengukuran BSA dan bromelain. Penentuan OT dilakukan

dengan cara mengukur absorbansi larutan baku BSA dengan tiga tingkat

konsentrasi yaitu rendah, sedang, dan tinggi menggunakan spektrofotometer uv

pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis sesuai dengan metode yang

digunakan (absorbsi ultraviolet) yaitu 280 nm (Layne, 1957). OT ditentukan

berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi

tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran absorbansi untuk penentuan OT ini

dilakukan tiap selang 5 menit selama 30 menit. Hasil pengukuran OT ditunjukan

pada grafik di bawah ini.

Gambar 6. Grafik penentuan OT BSA

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

5 10 15 20 25 30

Ab

sorb

ansi

Waktu (Menit)

400 µg/ml 700 µg/ml 1000 µg/ml


37

Dari penentuan OT pada larutan baku BSA pada tiga tingkat konsentrasi

yang tertera pada gambar 5, terlihat bahwa absorbansi stabil pada menit ke-5

hingga menit ke-30. Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa

pada menit ke-5 senyawa BSA sudah bereaksi dengan pelarutnya secara sempurna

sehingga OT untuk reaksi BSA dengan pelarutnya adalah 5 menit. Secara praktis,

dapat disimpulkan bahwa pengukuran larutan BSA akan memberikan hasil yang

reprodusibel bila diukur antara menit ke-5 hingga menit ke-30.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini bertujuan untuk

menentukan panjang gelombang pada saat senyawa yang ingin diukur

memberikan absorbansi yang paling optimum. Pada saat senyawa memberikan

absorbansi yang paling optimum, maka pengukuran akan memiliki sensitifitas

yang tinggi dan linear sehingga adanya sedikit perubahan pada konsentrasi

senyawa akan memberikan perubahan yang besar pada absorbansi yang

dihasilkan, dan perubahan konsentrasi senyawa sebanding dengan perubahan

absorbansi senyawa yang dihasilkan. Penentuan panjang gelombang serapan

maksimum ini menggunakan senyawa BSA karena BSA memiliki cincin aromatik

dengan jumlah yang cukup untuk menghasilkan pengukuran yang sensitif dan

linear pada metode yang digunakan.

Panjang gelombang serapan maksimum ditentukan menggunakan larutan

kontrol yaitu larutan baku BSA yang dilarutkan dalam deionized water dengan

tujuan untuk mendapatkan serapan BSA tanpa gangguan serapan dari senyawa-

senyawa lain dalam sampel. Pengukuran ditentukan melalui tiga konsentrasi


38

larutan baku BSA, yaitu konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL. Penggunaan tiga

konsentrasi tersebut diharapkan dapat merepresentasikan panjang gelombang

serapan maksimum dari konsentrasi yang berbeda. Scanning panjang gelombang

serapan maksimum larutan baku BSA dilakukan pada panjang gelombang

ultraviolet, yaitu rentang antara 200-400 nm.Hasil penentuan panjang gelombang

serapan maksimum ditunjukan pada tabel di bawah ini.

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum BSA

Konsentrasi larutan

BSA

λ maksimum hasil

scanning λ maksimum rata-rata λ maksimum teoritis

400 µg/mL 278,0 nm

278,0 nm 280,0 nm 700 µg/mL 278,0 nm

1000 µg/mL 278,0 nm

Hasil scanning tiga konsentrasi larutan baku BSA yang tertera pada tabel

I didapatkan hasil panjang gelombang serapan maksimum rata-rata adalah 278,0

nm. Panjang gelombang ini berbeda dengan panjang gelombang teoritis metode

ini, yaitu 280 nm. Hal ini diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum

dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995), yaitu batas pergeseran yang

diperkenankan adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang

gelombang maksimum yang digunakan pada penelitian ini adalah 278,0 nm.

F. Hasil Penetapan Kadar Bromelain

Penetapan kadar bromelain bertujuan untuk mengetahui kadar enzim

bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas yang diperkirakan

memiliki aktivitas antioksidan. Penetapan kadar bromelain dilakukan

menggunakan metode spektrofotometri uv. Prinsip metode spektrofotometri uv


39

dalam penelitian ini adalah pengukuran absorbansi dari cincin aromatik yaitu

tryptophan, tyrosine, phenylamine, dan histidine yang dimiliki oleh protein dan

enzim yang absorbansinya diukur menggunakan spektrofotometer uv pada OT dan

panjang gelombang serapan maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya

(Walker, 2002). Prinsip reaksi yang terjadi pada penetapan kadar bromelain ini

yaitu, protein memiliki dua panjang gelombang maksimum, yaitu 280 nm dan 200

nm. Elektron yang tereksitasi pada panjang gelombang 280 nm menyerap energi

yang lebih rendah dibandingkan pada panjang gelombang 200 nm karena cincin

aromatik yang dimiliki oleh protein dan enzim menstabilkan elektron yang

tereksitasi dengan cara resonansi (Stoscheck, 1990).

Metode ini memiliki kelemahan yaitu pengukuran yang sensitif dan

linear tergantung pada jumlah cincin aromatik yang dimiliki protein dan enzim.

Selain itu, metode ini membutuhkan konsentrasi sampel yang cukup besar, yaitu

0,2-2 mg/ml sehingga tidak bisa digunakan pada sampel protein dengan

konsentrasi kecil. Kelebihan dari metode ini yaitu, bisa langsung diaplikasikan

pada sampel tanpa memerlukan penambahan senyawa atau pereaksi lainnya, bisa

dikerjakan dengan sangat cepat karena tidak memerlukan OT yang lama, bersifat

non-destruktif sehingga senyawa yang akan kita ukur masih bisa disimpan dan

digunakan kembali, dan yang terakhir adalah memiliki hubungan yang linear

antara konsentrasi protein dan absorbansi yang dihasilkannya (Owusu-Apanten,

2002).

Kadar enzim bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas

ditetapkan berdasarkan regresi linear dari kurva baku BSA. Nilai absorbansi


40

larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku BSA dengan

sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan sumbu y adalah absorbansi

sehingga diperoleh konsentrasi enzim bromelain yang kemudian dikonversi

menjadi persentase kadar enzim dalam ekstrak bromelain daging buah nanas.

Hasil pengukuran seri baku BSA bisa dicermati pada tabel di bawah ini.

Tabel II. Hasil pengukuran seri baku BSA

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi Persamaan regresi linear

1

400 0,273

y = 0,0006833x –

0,000533

r = 0,9999

550 0,375

700 0,478

850 0,580

1000 0,683

2

400 0,251

y = 0,0006833x –

0,020933

r = 0,9999

550 0,358

700 0,455

850 0,561

1000 0,662

3

400 0,274

y = 0,0006893x –

0,004333

r = 0,9998

550 0,371

700 0,477

850 0,585

1000 0,684

Pengukuran seri baku BSA dilakukan dengan tiga kali replikasi. Hasil

pengukuran absorbansi pada pembuatan kurva baku BSA menunjukan bahwa

dengan adanya kenaikan konsentrasi BSA, nilai absorbansi yang dihasilkan pun

semakin meningkat. Dari hasil tiga replikasi tersebut, dipilih salah satu persamaan

regresi linear yang memiliki koefisien korelasi yang paling baik yaitu mendekati

1. Persamaan yang memiliki koefisien korelasi yang paling baik adalah replikasi

pertama. Persamaan yang diperoleh pada replikasi pertama, yaitu y = 0,0006833x

– 0,000533 dengan r = 0,9999.


41

Gambar 7. Kurva baku BSA untuk penetapan kadar bromelain ekstrak bromelain

daging buah nanas

Kadar bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas dihitung

berdasarkan persamaan regresi linear yang telah diperoleh. Hasil perhitungan dari

ketiga replikasi ekstrak bromelain daging buah nanas menunjukan bahwa kadar

bromelain rata-ratanya adalah 8,4967 % b/b(SD = 0,0289). Hal ini ditunjukan

dalam tabel di bawah ini.

Tabel III. Kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi Kadar Enzim (% b/b) X ± SD

1 8,52

8,4967 ± 0,0289 2 8,47

3 8,47

Hasil penetapan kadar bromelain tersebut menunjukan bahwa hasil

isolasi ekstrak bromelain daging buah nanas hanya mengandung 8,4967 % b/b

y = 0,0006833x - 0,000533 r = 0,9999

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 200 400 600 800 1000 1200

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi (µg/ml)

Kurva Baku BSA Linear (Kurva Baku BSA)


42

enzim bromelain atau dari 100 mg ekstrak bromelain daging buah nanas hanya

mengandung 8,4967 mg enzim bromelain. Hal ini bisa diartikan bahwa ekstrak

bromelain daging buah nanas yang dihasilkan tidak murni dan mengandung

berbagai senyawa lainnya selain enzim bromelain. Senyawa-senyawa lain tersebut

perlu diidentifikasi lebih lanjut dalam penelitian lainnya untuk mengetahui lebih

dalam tentang kandungan ekstrak bromelain daging buah nanas yang dihasilkan

dari metode isolasi penelitian ini.

G. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan baku

pembanding yaitu rutin dan radikal DPPH untuk tepat habis bereaksi. Pengukuran

pada saat OT ditujukan untuk meminimalkan kesalahan dalam hal pengukuran

aktivitas antioksidan dari rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas.

Penentuan OT dilakukan dengan cara mengukur absorbansi larutan DPPH yang

sudah direaksikan dengan larutan pembanding yaitu rutin pada tiga tingkat

konsentrasi yaitu rendah, sedang, dan tinggi menggunakan spektrofotometer

visibel pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis yaitu 517 nm (Kedare

dan Singh, 2011). OT ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai

stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran

absorbansi untuk penentuan OT ini dilakukan tiap selang 5 menit selama 60

menit. Hasil pengukuran OT ditunjukan pada grafik di bawah ini.


43

Gambar 8. Grafik penentuan OT Rutin

Dari penentuan OT pada larutan pembanding rutin pada tiga tingkat

konsentrasi yang tertera pada gambar 8, terlihat bahwa absorbansi stabil sejak

menit ke-30 hingga menit ke-60. Hal ini sesuai dengan teori dari Blois (1958) dan

penelitian Luis, Marcela, Salette, dan Lima (2006). Dengan demikian, secara

teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-30 seluruh senyawa yang

memiliki aktivitas antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji sudah

bereaksi dengan radikal DPPH secara sempurna sehingga OT untuk reaksi radikal

DPPH dengan larutan pembanding dan uji adalah 30 menit. Secara praktis, dapat

disimpulkan bahwa pengukuran larutan akan memberikan hasil yang reprodusibel

bila diukur antara menit ke-30 hingga menit ke-60.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Ab

sorb

ansi

Waktu (Menit)

5 µg/ml 15 µg/ml 25 µg/ml


44

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini bertujuan untuk

menentukan panjang gelombang pada saat senyawa yang ingin diukur

memberikan absorbansi yang paling optimum. Pada saat senyawa memberikan

absorbansi yang paling optimum, maka pengukuran akan memiliki sensitifitas

yang tinggi dan linear sehingga adanya sedikit perubahan pada konsentrasi

senyawa akan memberikan perubahan yang besar pada absorbansi yang

dihasilkan, dan perubahan konsentrasi senyawa sebanding dengan perubahan

absorbansi senyawa yang dihasilkan.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini menggunakan

senyawa DPPH. DPPH memiliki panjang gelombang serapan maksimum yaitu

517 nm dan memberikan warna violet. Warna ini muncul karena DPPH memiliki

gugus kromofor dan auksokrom.

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH

Gugus kromofor dan auksokrom dari radikal DPPH ditunjukan pada

gambar di atas. Kromofor merupakan semua gugus atau atom yang dapat

menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak, dimana merupakan gugus tak jenuh


45

yang dapat menjalani transisi π→π* dan n→π* dan auksokrom adalah gugus yang

tidak dapat menjalani transisi π→π* tetapi dapat menjalani transisi elektron n→π*

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Panjang gelombang serapan maksimum ditentukan menggunakan larutan

kontrol yaitu larutan DPPH yang dilarutkan dalam metanol dengan tujuan untuk

mendapatkan serapan DPPH tanpa gangguan serapan dari senyawa-senyawa lain

dalam sampel. Pengukuran ditentukan melalui tiga konsentrasi larutan DPPH,

yaitu konsentrasi 0,020; 0,040; dan 0,0600 mM. Penggunaan tiga konsentrasi

tersebut diharapkan dapat merepresentasikan panjang gelombang serapan

maksimum dari konsentrasi yang berbeda. Scanning panjang gelombang serapan

maksimum larutan DPPH dilakukan pada panjang gelombang visibel, yaitu

rentang antara 600-800 nm. Hasil penentuan panjang gelombang serapan

maksimum ditunjukan pada tabel di bawah ini.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH

Konsentrasi larutan

DPPH

λ maksimum hasil

scanning λ maksimum rata-rata λ maksimum teoritis

0,020 mM 515,5 nm

515,3 nm 517,0 nm 0,040 mM 515,0 nm

0,060 mM 515,5 nm

Hasil scanning tiga konsentrasi larutan dpph yang tertera pada tabel IV

didapatkan hasil panjang gelombang serapan maksimum rata-rata adalah 515,3

nm. Panjang gelombang ini berbeda dengan panjang gelombang teoritis, yaitu 517

nm. Hal ini diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum dalam

Farmakope Indonesia edisi IV (1995), yaitu batas pergeseran yang diperkenankan


46

adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum

yang digunakan pada penelitian ini adalah 515,3 nm.

H. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan

Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui secara

kualitatif keberadaan senyawa yang berperan sebagai senyawa antioksidan dalam

ekstrak bromelain daging buah nanas. Uji pendahuluan sebagai pengujian secara

kualitatif ini penting dilakukan sebagai dasar sebelum melakukan pengujian

secara kuantitatif. Uji pendahuluan dilakukan dengan prinsip reaksi antara radikal

DPPH dengan senyawa antioksidan di dalam ekstrak bromelain daging buah

nanas. Senyawa antioksidan akan mengubah warna radikal DPPH dari violet

menjadi kuning karena karena kemampuannya untuk mengikat elektron bebas

yang tidak berpasangan dari senyawa radikal.

Uji pendahuluan dilakukan menggunakan kontrol positif dan kontrol

negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu larutan rutin yang dicampurkan

dengan larutan DPPH untuk menunjukan perubahan warna saat hasil uji positif.

Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding karena rutin telah terbukti

memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH dan biasa digunakan untuk

determinasi aktivitas antioksidan secara kualitatif dan kuantitatif (Kedare dan

Singh, 2011). Kontrol negatif yang digunakan yaitu pelarut deionized water yang

dicampurkan dengan larutan DPPH untuk menunjukan warna saat hasilnya negatif

dan memastikan tidak ada intervensi dari pelarut yang digunakan. Pengujian yang

dilakukan menunjukan hasil yang positif untuk sampel dan kontrol positif yaitu


47

terjadi perubahan warna dari violet menjadi kuning. Hal ini menunjukan bahwa

sampel ekstrak bromelain dari daging buah nanas mengandung senyawa yang

memiliki aktivitas antioksidan. Hasil uji pendahuluan dan perubahan warnanya

bisa dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 10. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan

(A=Kontrol negatif deionized water; B=Kontrol positif rutin; C=Ekstrak bromelain)

I. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

Estimasi aktivitas antioksidan dengan radikal DPPH bertujuan untuk

mengetahui kemampuan ekstrak bromelain daging buah nanas dalam menangkap

senyawa radikal atau kemampuan sebagai senyawa antioksidan. Estimasi aktivitas

antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH. DPPH adalah radikal bebas

yang stabil dan digunakan untuk mengevaluasi peredaman radikal bebas pada

bahan alam. Prinsip reaksi metode ini adalah DPPH akan tereduksi oleh proses

donasi hidrogen atau elektron sehingga warnanya akan berubah dari violet ke

kuning dengan perubahan intensitas warna yang sebanding dengan jumlah donasi

elektron yang diikuti dengan penurunan absorbansi DPPH (Dris dan Jain, 2004).


48

Senyawa yang dapat menyebabkan hal tersebut dapat dipertimbangkan sebagai

antioksidan atau penangkap radikal. Semakin besar penurunan absorbansi DPPH

maka semakin kuat pula aktivitas antioksidan. Proses perubahan warna larutan

DPPH akibat reaksi dengan antioksidan dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 11. Perubahan warna larutan DPPH akibat reaksi dengan antioksidan

(Morales-Gonzalez, 2013)

Prinsip metode DPPH dalam penelitian ini adalah pengukuran absorbansi

dari radikal DPPH yang mengalami penurunan akibat adanya senyawa

antioksidan dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada OT dan panjang

gelombang serapan maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya (Thangaraj,

2016). Metode ini dipilih karena memiliki beberapa kelebihan, yaitu bisa langsung

diaplikasikan pada sampel tanpa memerlukan penambahan senyawa atau pereaksi

tambahan lainnya, bisa dikerjakan dengan sangat cepat karena tidak memerlukan

OT yang lama, biasa dilakukan untuk menguji aktivitas antioksidan dari sayuran,

tanaman, buah, dan makanan yang menggunakan pelarut etanol, metanol, dan air,

metode dilaksanakan pada temperatur yang tidak tinggi sehingga cocok untuk


49

sampel yang tidak tahan dengan panas, metode dilaksanakan dalam waktu yang

cukup untuk mengukur reaksi dari radikal DPPH dengan senyawa antioksidan

yang lemah, dan yang terakhir adalah memiliki hubungan yang linear antara

konsentrasi antioksidan dan penurunan absorbansi yang dihasilkannya. Metode ini

memiliki kelemahan yaitu radikal DPPH dapat bereaksi dengan senyawa radikal

lainnya, radikal DPPH hanya bisa larut dalam pelarut organik sehingga tidak bisa

direaksikan dengan senyawa yang tidak menggunakan pelarut organik, radikal

DPPH sensitif terhadap senyawa yang mengandung basa Lewis, dan absorbansi

DPPH dalam metanol dan aseton dapat berkurang apabila terkena cahaya (Kedare

dan Singh, 2011). Namun kelemahan metode DPPH yang dialami dalam

penelitian ini yaitu terkait dengan cahaya dapat diatasi dengan melakukan

pengukuran absorbansi DPPH dalam ru angan yang gelap.

Pada penelitian ini digunakan rutin sebagai pembanding dalam estimasi

aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas. Rutin digunakan

sebagai pembanding karena rutin termasuk senyawa yang telah diketahui

memiliki aktivitas antioksidan. Rutin dilarutkan ke dalam metanol karena metanol

tidak mengganggu reaksi DPPH dan pengukuran absorbansi (Molyneux, 2004).

Selain rutin, senyawa lain seperti katekol, karvakol, estagol, eugenol, pirokatekin,

dan kuersetin juga dektahui memiliki aktivitas antioksidan karena memiliki gugus

–OH fenolat dalam strukturnya yang bertanggung jawab terhadap aktivitas

antioksidan karena mampu menjadi donor hidrogen atau elektron. Struktur kimia

yang dimiliki oleh rutin menunjukan bahwa rutin mempunyai aktivitas


50

antioksidan karena adanya gugus fenolik dalam strukturnya. Struktur dari rutin

dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 12. Struktur rutin (Macikova, Halouzka, Hrbac, Bartak, dan Skopalova,

2012)

Parameter yang digunakan untuk mengetahui besarnya kemampuan

senyawa sebagai antioksidan yaitu IC50. Nilai IC50 merupakan konsentrasi

senyawa antioksidan yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar

50%. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan

hubungan antara konsentrasi ekstrak atau fraksi uji sebagai sumbu x dan %

penangkapan radikal sebagai sumbu y. Makin kecil nilai IC50 maka semakin aktif

ekstrak atau fraksi uji tersebut sebagai senyawa penangkap radikal DPPH atau

senyawa antioksidan. Nilai IC50 ekstrak bromelain daging buah nanas akan

dibandingkan dengan nilai IC50 pembanding rutin (Morales-Gonzalez, 2013).

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding rutin dan larutan uji

ekstrak bromelain daging buah nanas bisa dicermati pada tabel di bawah ini.


51

Tabel V. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC Persamaan

regresi linear

1

10

0,805

0,716 11,0559

y = 2,0646x –

9,7888

r = 0,9999

15 0,635 21,1180

20 0,554 31,1801

25 0,468 41,8633

30 0,384 52,2981

2

10

0,810

0,710 12,4221

y = 2,13x –

9,1082

r = 0,9997

15 0,631 22,2360

20 0,538 33,7888

25 0,450 44,4444

30 0,368 54,5679

3

9,8

0,798

0,705 11,6541

y = 2,1529x –

10,5263

r = 0,9995

14,7 0,630 21,0526

19,6 0,541 32,2055

24,5 0,451 43,4837

29,4 0,365 54,2606

Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah

nanas dengan metode DPPH


(mg/mL)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC Persamaan

regresi linear

1

3,0024

0,868

0,584 32,7189

y = 10,2995x

+ 1,5207

r = 0,9994

3,5028 0,543 37,4424

4,0032 0,501 42,2811

4,5036 0,452 47,9263

5,0040 0,406 53,2258

2

3,006

0,861

0,588 34,0301

y = 10,3136x

+ 0,9567

r = 0,9998

3,507 0,545 39,0243

4,008 0,499 44,3670

4,509 0,457 49,2451

5,010 0,410 54,7038

3

2,9976

0,874

0,594 32,0366

y = 10,5263x

+ 0,4805

r = 0,9996

3,4972 0,547 37,4141

3,9968 0,504 42,3341

4,4964 0,453 48,1693

4,9960 0,411 52,9748


52

Pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding rutin dan larutan uji

ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH dilakukan dengan

tiga kali replikasi. Hasil pengukuran menunjukan bahwa dengan adanya

peningkatan konsentrasi larutan, nilai absorbansi yang dihasilkan pun semakin

menurun. Semakin besar konsentrasi larutan maka akan semakin banyak senyawa

antioksidan yang menjadi donor hidrogen atau elektron pada radikal DPPH

sehingga terjadi perubahan warna DPPH yang menyebabkan absorbansi yang

dihasilkan semakin kecil. Semakin besar konsentrasi larutan maka nilai %IC yang

dihasilkan akan semakin besar. Hal ini menunjukan adanya hubungan yang

proporsional antara peningkatan konsentrasi dengan nilai %IC yang dihasilkan.

Dari hasil tiga replikasi larutan pembanding rutin dan larutan uji ekstrak

bromelain daging buah nanas tersebut, persamaan regresi linear yang dihasilkan

memiliki koefisien korelasi yang baik yaitu mendekati 1. Persamaan regresi linear

yang digunakan untuk perhitungan nilai IC50 adalah persamaan yang memiliki

koefisien korelasi paling baik yaitu y = 2,0646x – 9,7888 dengan r = 0,9999 untuk

rutin dan y = 10,3136x + 0,9567 dengan r = 0,9998 untuk ekstrak bromelain.

Tabel VII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas

Rutin

Replikasi IC50 (µg/mL) SD X (µg/mL) X ± SD

1 28,9591

0,6202 28,2744 28,2744 ± 0,6202 2 27,7503

3 28,1138

Ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi IC50 (mg/mL) SD X (mg/mL) X ± SD

1 4,7069

0,0287 4,7221 4,7221 ± 0,0287 2 4,7552

3 4,7043


53

Hasil rata-rata nilai IC50 rutin adalah 28,2744 µg/mL dengan SD = 0,6202.

Rata-rata nilai IC50 ekstrak bromelain daging buah nanas adalah 4,7221 mg/mL

dengan SD = 0,0287. Semakin kecil nilai IC50 suatu senyawa maka semakin kuat

pula aktivitas antioksidan senyawa tersebut karena dengan konsentrasi yang kecil

mampu menimbulkan efek. Penelitian ini menunjukan bahwa perbedaan nilai IC50

antara rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas cukup besar dan rutin

memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak

bromelain daging buah nanas. Hal ini diperkuat dengan perolehan nilai IC50

ekstrak bromelain daging buah nanas dalam penelitian Manosroi, Chankhampan,

Pattamapun, Manosroi, dan Manosroi (2014) yaitu sebesar 684, 27 mg/mL.

Penyebab perbedaan nilai IC50 yang besar tersebut belum mampu ditemukan dan

dipahami oleh peneliti.

Nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas menunjukan

adanya perbedaan yang besar di antara keduanya, namun untuk memastikan

adanya perbedaan tersebut dilakukan uji statistik dengan menggunakan software

R 3.2.5. Pengujian statistik yang pertama kali dilakukan adalah uji normalitas

data. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah data IC50 rutin dan

ekstrak bromelain daging buah nanas terdistribusi secara normal atau tidak. Uji

normalitas yang digunakan adalah uji Shapiro-Wilk. Hipotesis null-nya (H0)

adalah data terdistribusi normal, sedangkan hipotesis alternatifnya (H1) adalah

data tidak terdistribusi normal. Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan

H1 diterima dan jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0

diterima. Hasil pengujiannya adalah data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging


54

buah nanas terdistribusi normal karena p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak

bromelain daging buah nanas = 0,08664. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga

kesimpulannya adalah data terdistribusi normal (Lampiran 13).

Pengujian statistik yang kedua adalah uji varian data. Uji varian

dilakukan untuk mengetahui homogenitas data nilai IC50 rutin dan ekstrak

bromelain daging buah nanas. Uji varian yang digunakan adalah uji F. Hipotesis

null-nya (H0) adalah varian data tidak berbeda signifikan (homogen), sedangkan

hipotesis alternatifnya (H1) adalah varian data berbeda signifikan (tidak

homogen). Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima dan jika

p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima. Hasil

pengujiannya adalah varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah

nanas tidak homogen, karena p-value = 0,0009357. Jadi, H0 ditolak dan H1

diterima sehingga kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak

homogen (Lampiran 13).

Pengujian statistik yang ketiga setelah diketahui bahwa data terdistribusi

normal tetapi tidak homogen adalah uji T-Independent unequal variances

(Welch’s T-test). Uji T-Independent unequal variances digunakan untuk

membandingkan dua kelompok data yang diperoleh dari dua obyek yang berbeda

dan ketika data tersebut terdistribusi normal tetapi tidak homogen. Hipotesis null-

nya (H0) adalah data tidak berbeda signifikan, sedangkan hipotesis alternatifnya

(H1) adalah data berbeda signifikan. Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0

ditolak dan H1 diterima dan jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak

dan H0 diterima. Hasil pengujiannya adalah Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain


55

daging buah nanas berbeda secara signifikan, karena p-value = 1,232x10-5

. Jadi,

H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah data berbeda

signifikan (Lampiran 13).


56

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas yang

dinyatakan dengan IC50 sebesar 4,7221±0,0287 mg/mL.

2. Kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas yang dinyatakan dengan

persen (% b/b) sebesar 8,4967±0,0289 % b/b.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa lain dalam

ekstrak bromelain daging buah nanas yang dihasilkan dari metode isolasi

penelitian ini.

2. Perlu dilakukan dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan enzim

bromelain dari bagian batang nanas yang memiliki struktur bromelain yang

berbeda.


57

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, H., 2005, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification,

and Characterization, CRC Press, Florida, pp. 35-42.

Ali, A.A., Milala, M.A., and Gulani, I.A., 2015, Antimicrobial Effect of Crude

Bromelain Extracted from Pineapple Fruit (Ananas comosus (Linn.)

Merr.), Advances in Biochemistry, 3, 1-4.

Backer, C.A. and Bakhuizen van Den Brink, Jr.R.C., 1963, Flora of Java,

N.V.P.Noordhoff-Gromingen, Netherland, pp. 3-56.

Barhe, T.A. and Tchouya, G.R., 2014, Comparative Study of the Anti-oxidant

Activity of the Total Polyphenols Extracted from Hibiscus

Sabdariffa L., Glycine max L. Merr., Yellow Tea and Red Wine through

Reaction with DPPH Free Radical, Arabian Journal of Chemistry, 9, 1-8.

Bartholomew, D.P., Paull, R.E., and Rohrbach, K.G., 2002, The Pineapple:

Botany, Production and Uses, CABI Publishing, Wallingford, p. 113.

Bettelheim, F.A. and Landesberg, J.M., 2009, Laboratory Experiment for

Introduction to General, Organic and Biochemistry, Brooks Cole, New

York, pp. 256-257.

Bhattacharyya, B.K., 2008, Bromelain: An Overview, Natural Product Radiance,

7(4), 359-363.

Blois, M.S., 1958, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free

Radical, Nature, 181, 1199-1200.

Bolton, S. and Bon, C., 2010, Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical

Applications, Informa Healthcare, New York, pp. 82-106.

Bottom, C.B., Hanna, S.S., and Siehr, D.J., 1978, Mechanism of the Ninhydrin

Reaction, Biochemical Education, 6(1), 4-5.

Boyer, R.F., 2011, Biochemistry Laboratory: Modern Theory and Techniques,

Prentice Hall, New Jersey, p. 112.

Chaurasiya, R.S. and Hebbar, H.U., 2013, Extraction of Bromelain from

Pineapple Core and Purfication by RME and Precipitation Methods,

Separation and Purification Technology, 111, 90-97.

Cutler, P., 2004, Protein Purification Protocols, Humana Press, New York, pp.

47-52.

Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., and Mohammad, N.S., 2009,

Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its

Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412.

Dennison, C., 2003, A Guide to Protein Isolation, Springer International

Publishing, New York, pp. 84-88.

Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta, pp, 7, 1036, 1061.

Devakate, R.V., Patil, V.V., Waje, S.S., and Thorat, B.N., 2008, Purification and

Drying of Bromelain, Separation and Purification Technology, 64(2009),

259-264.


58

Dris, R. and Jain, S.M., 2004, Production Practices and Quality Assessment of

Food Crops: Quality Handling and Evaluation, Kluwer Academic

Publisher, New York, pp. 58-60.

Gandjar, I.G. and Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, pp. 229-234.

Halliwell, B., 2012, Free Radicals and Antioxidant: Updating a Personal View,

Nutrition Review, 70, 257-265.

Halliwell, B. and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and

Medicine, Oxford University Press, New York, p. 34.

Harrach, T., Schulze, F.K., Nuck, R., Grunow, D., and Maurer, H.R., 1995,

Isolation and Partial Characterization of Basic Proteinases from Stem

Bromelain, J Protein Chem, 14, 41-52.

Hatti-Kaul, R. and Mattiasson, B., 2003, Isolation and Purification od Proteins,

Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 231-235.

Isfahlan, Ahmad, Abdollah, Reza, and Rashid, 2010, Antioxidant and Antiradical

Activities of Phenolic Extracts from Iranian Almond (Prunus amygdalus

L.) Hulls and Shells, Turk J Biol, 34, 165-173.

Kedare, S.B. and Singh, R.P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method

of Antioxidant Assay, Journal of Food, Science, and Technology, 48(4),

412-422.

Ketnawa, S., Rawdkuen, S., and Chaiwut, P., 2010, Two Phase Partitioning and

Collagen Hydrolysis of Bromelain from Pineapple Peel Nang Lae

Cultivar, Biochemical Engineering Journal, 52(2010), 205-211.

Layne, E., 1957, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring

Proteins, Methods Enzymol., 3, 447-455.

Liochev, S.I., 2013, Reactive Oxygen Species and the Free Radical Theory of

Aging, Free Radical Biology and Medicine, 60, 1-4.

Luis, M.M., Marcela, A.S., Sallete, R., and Lima, J.L.F.C., 2006, Automatic

Method for Determination of Total Antioxidant Capacity Using 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl Assay, Anal Chim Acta, 558(3), 310-318.

Macikova, P., Halouzka, V., Hrbac, J., Bartak, P., and Skopalova, J., 2012,

Electrochemical Behaviour and Determination of Rutin on Modified

Carbon Paste Electrodes, The Scientific World Journal, 2012, 1-9.

Manosroi, A., Chankhampan, C., Pattamapun, K., Manosroi, W., and Manosroi,

J., 2014, Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya

Latex and Bromelain from Pineapple Fruits, Chiang Mai J. Sci., 41(3),

635-648.

Maurer, H.R., 2001, Bromelain: Biochemistry, Pharmacology, and Medical Use,

Cellular and Molecular Life Sciences, 58, 1234-1245.

Morales-Gonzalez, J.A., 2013, Oxidative Stress and Chronic Degenerative

Diseases: a Role for Antioxidants, Intech Publisher, Croatia, pp. 39-41.

Morello, M.J., Shahidi, F., and Ho, C.T., 2002, Free Radicals in Food: Chemistry,

Nutrition, and Health Effects, American Chemical Society, Washington

D.C., pp. 66-67.

Moss, J.N., Frazier, C.V., and Martin, G.J., 1963, Bromelain: The Pharmacology

of the Enzymes, Arch Int Pharmacodyn, 145, 166-189.


59

Murachi, T., 1970, Bromelain Enzymes, Methods in Enzymology, 19(18), 273-

284.

Nadzirah, K.Z., Zainal, S., Noriham, A., and Normah, I., 2013, Efficacy of

Selected Purification Techniques for Bromelain, International Food

Research Journal, 20(1), 43-46.

Ou, B., Huang, D.J., Woodill, M.H., Flanagan, J.A., and Deemer, E.K., 2002,

Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing

Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing

Antioxidant Power (FRAP) Assays: A Comparative Study, J. Agric.

Food Chem., 50, 3122-3128.

Owusu-Apenten, R.K., 2002, Food Protein Analysis: Quantitative Effects on

Processing, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-171.

Panda, H., 2000, Herbal Cosmetics Hand Book, Asia Pasific Business Press, New

Delhi, pp. 525-526

Pavan, R., Jain, S., Shraddha, and Kumar, A., 2012, Properties and Therapeutic

Applicattion of Bromelain: A Review, Biotechnology Research

International, 2012, 1-6.

Pendzhiev, A.M., 2002, Proteolytic Enzymes of Papaya: Medicinal Applications,

Pharmaceut. Chem. J., 36, 315-317.

Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E., 2001, Antioxidant Activity: Medallion

Laboratories, Analithycal Progress, 19(2), 1-4.

Pullaiah, T., 1998, Taxonomy of Angiosperms, Regency Publications, New Delhi,

pp. 243-245.

Rukmana, 1996, Nanas Budidaya dan Paskapanen, Penerbit Kanisius,

Yogyakarta, pp. 75-76.

Saleh, M.A., Clark, S., Woodard, B., and Deolu, S.A., 2010, Antioxidant and Free

Radical Scavenging Activities of Essential Oils, Ethnicity & Disease, 20,

78-82.

Soares, P.A.G., Vaz, A.F.M, Correia, M.T.S., Pessoa, A., and Carneiro-da-Cunha,

M.G., 2012, Purification of Bromelain from Pineapple Wastes by Ethanol

Precipitation, Separation and Purification Technology, 98, 389-395.

Stoscheck, C.M., 1990, General Methods for Handling Proteins and Enzymes,

Methods in Enzymology, 182(6), pp. 50-56.

Sunardi, K.I., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh

(Averrhoa blimbi, L.) terhadap 1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl (DPPH),

Seminar Nasional Teknologi, 1-9.

Thangaraj, P., 2016, Pharmacological Assays of Plant-Based Natural Products,

Springer International Publishing, Switzerland, pp. 58-61.

Toldra, F. and Nollet, L.M.L., 2013, Proteomics in Food: Principles and

Applications, Springer International Publishing, New York, pp. 23-35.

Uppu, R.M., Murthy, S.N., Pryor, W.A., and Parinandi, N.L., 2010, Free Radicals

and Antioxidant Protocols, Humana Press, New York, pp. 51-53.


60

Walker, J.M., 2002, The Protein Protocols Handbook, Humana Press, New York,

pp. 3-6.

Yahia, M.E., 2011, Postharvest Biology and Technology of Tropical and

Subtropical Fruits, Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 194-218.

Zou, Y., Lu, Y., and Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid-Rich

Extract of Hypericum perforatum L. in Vitro, J. Agric. Food Chem., 52,

5032-5039.


61

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman nanas



62

Lampiran 2. Gambar buah nanas


63

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Bobot masing-masing daging buah nanas yang digunakan adalah 70 gram,

sehingga total bobot daging buah nanas yang digunakan adalah 210 gram.

Cawan 1 (g) Cawan 2 (g) Cawan 3 (g)

Berat cawan 54,0656 29,1806 34,6945

Berat cawan + ekstrak 55,2464 30,4336 35,8174

Berat ekstrak 1,1808 1,2530 1,1229

Total berat ekstrak bromelain = 1,1808 g + 1,2530 g + 1,1229 g

= 3,5567 g

Rendemen ekstrak bromelain


64

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif bromelain

a. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat wadah 13,5735 13,5821 14,2743

Berat wadah + sampel 13,8300 13,8470 14,5295

Berat wadah + sisa 13,5820 13,5945 14,2881

Berat sampel 0,2480 0,2525 0,2414

b. Data penimbangan ninhidrin

Ninhidrin

Berat wadah 13,5739

Berat wadah + sampel 13,9238

Berat wadah + sisa 13,5744

Berat sampel 0,3494

Lampiran 5. Penimbangan penetapan kadar enzim bromelain

a. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas


Berat wadah 25,8160 14,2743 13,7527


Berat wadah + sisa 25,8511 14,3028 13,7835

Berat sampel 0,2505 0,2500 0,2500


65

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar enzim bromelain

a. Penentuan operating time (OT) bovine serum albumine pada λ = 280 nm

Waktu (Menit) Absorbansi konsentrasi 400 µg/mL

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

5 0,271 0,268 0,270

10 0,272 0,268 0,271

15 0,271 0,268 0,271

20 0,271 0,269 0,271

25 0,272 0,268 0,272

30 0,271 0,268 0,271

OT yang diperoleh 5 menit



5 0,475 0,477 0,478

10 0,475 0,478 0,478

15 0,475 0,478 0,478

20 0,475 0,477 0,477

25 0,476 0,477 0,478

30 0,475 0,477 0,478




5 0,680 0,683 0,681

10 0,681 0,684 0,681

15 0,680 0,685 0,681

20 0,680 0,684 0,681

25 0,680 0,684 0,681

30 0,681 0,684 0,682



66

b. Penentuan λ maksimum bovine serum albumine

1. Spektra bovine serum albumine 400 µg/mL



67



68

Lampiran 7. Penetapan kadar enzim bromelain

a. Konsentrasi bovine serum albumine

1. Konsentrasi larutan induk bovine serum albumine

Replikasi V1

(mL)

C1

(mg/mL)

V2

(mL)

C2

(mg/mL)

1 0,5 50 25 1

2 0,5 50 25 1

3 0,5 50 25 1

2. Konsentrasi seri larutan bovine serum albumine

Replikasi V1

(mL)

C1

(µg/mL)

V2

(mL)

C2

(µg/mL)

1

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000

2

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000

3

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000


69

b. Kurva baku bovine serum albumine

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi Persamaan regresi linear

1

400 0,273

y = 0,0006833x –

0,000533

r = 0,9999

550 0,375

700 0,478

850 0,580

1000 0,683

2

400 0,251

y = 0,0006833x –

0,020933

r = 0,9999

550 0,358

700 0,455

850 0,561

1000 0,662

3

400 0,274

y = 0,0006893x –

0,004333

r = 0,9998

550 0,371

700 0,477

850 0,585

1000 0,684

Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0006833x – 0,000533

c. Penetapan kadar enzim bromelain larutan uji

1. Absorbansi ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi Absorbansi

1 0,583

2 0,578

3 0,578


70

2. Konsentrasi dan bobot enzim ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi 1

Persamaan regresi linear

y = 0,0006833x – 0,000533

0,583 = 0,0006833x – 0,000533

x = 853,992 µg/mL

massa

Replikasi 2


y = 0,0006833x – 0,000533

0,578 = 0,0006833x – 0,000533

x = 846,674 µg/mL

massa

Replikasi 3


y = 0,0006833x – 0,000533

0,578 = 0,0006833x – 0,000533

x = 846,674 µg/mL


71

massa

3. Kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas

Persen enzim =

Replikasi 1

Persen enzim =

= 8,52 % b/b

Replikasi 2

Persen enzim =

= 8,47 % b/b

Replikasi 3

Persen enzim =

= 8,47 % b/b

Replikasi Bobot enzim

(mg)

Bobot ekstrak

(mg)

Kadar

Enzim

(% b/b)

x ± SD

1 21,35 250,5 8,52

8,4967 ± 0,0289 2 21,17 250 8,47

3 21,17 250 8,47


72

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan

a. Data penimbangan DPPH


Berat wadah 14,2743 13,5727 13,5835


Berat wadah + sisa 14,2744 13,5727 13,5837

Berat sampel 0,0158 0,0158 0,0159

b. Data penimbangan rutin


Berat wadah 14,2743 13,5727 13,5835


Berat wadah + sisa 14,2743 13,5729 13,5836

Berat sampel 0,0050 0,0050 0,0049

c. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas


Berat wadah 14,2743 25,8160 19,6945


Berat wadah + sisa 14,2811 25,8409 19,7134

Berat sampel 0,2502 0,2505 0,2498


73

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan

larutan uji

a. Konsentrasi DPPH

1. Replikasi 1

BM = 394,33

Mol

0,0401 mmol

M

0,4010 mM

2. Replikasi 2

BM = 394,33

Mol

0,0401 mmol

M

0,4010 mM

3. Replikasi 3

BM = 394,33

Mol

0,0403 mmol

M

0,4030 mM

b. Konsentrasi rutin

1. Konsentrasi larutan induk

Replikasi 1

50 µg/mL


74

Replikasi 2

50 µg/mL

Replikasi 3

49 µg/mL

2. Konsentrasi seri larutan baku rutin

Replikasi V1

(mL)

C1

(µg/mL)

V2

(mL)

C2

(µg/mL)

1

2 50 10 10

3 50 10 15

4 50 10 20

5 50 10 25

6 50 10 30

2

2 50 10 10

3 50 10 15

4 50 10 20

5 50 10 25

6 50 10 30

3

2 49 10 9,8

3 49 10 14,7

4 49 10 19,6

5 49 10 24,5

6 49 10 29,4

c. Konsentrasi ekstrak bromelain daging buah nanas

1. Konsentrasi larutan induk

Replikasi 1

10,008 mg/mL


75

Replikasi 2

10,02 mg/mL

Replikasi 3

9,992 mg/mL

2. Konsentrasi seri larutan uji

Replikasi V1

(mL)

C1

(mg/mL)

V2

(mL)

C2

(mg/mL)

1

3 10,008 10 3,0024

3,5 10,008 10 3,5028

4 10,008 10 4,0032

4,5 10,008 10 4,5036

5 10,008 10 5,0040

2

3 10,02 10 3,006

3,5 10,02 10 3,507

4 10,02 10 4,008

4,5 10,02 10 4,509

5 10,02 10 5,010

3

3 9,992 10 2,9976

3,5 9,992 10 3,4972

4 9,992 10 3,9968

4,5 9,992 10 4,4964

5 9,992 10 4,9960


76

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time (OT) rutin pada λ = 517 nm



5 0,812 0,811 0,816

10 0,793 0,903 0,797

15 0,787 0,796 0,790

20 0,782 0,791 0,785

25 0,780 0,787 0,783

30 0,780 0,783 0,781

35 0,780 0,783 0,781

40 0,781 0,782 0,779

45 0,781 0,782 0,780

50 0,782 0,783 0,781

55 0,783 0,785 0,782

60 0,785 0,788 0,785




5 0,681 0,689 0,680

10 0,641 0,662 0,651

15 0,619 0,638 0,628

20 0,607 0,620 0,609

25 0,599 0,605 0,596

30 0,593 0,605 0,584

35 0,593 0,605 0,584

40 0,590 0,600 0,581

45 0,585 0,595 0,574

50 0,581 0,587 0,570

55 0,579 0,582 0,568

60 0,578 0,577 0,568



77



5 0,518 0,503 0,510

10 0,501 0,511 0,499

15 0,493 0,483 0,463

20 0,453 0,451 0,438

25 0,429 0,426 0,409

30 0,398 0,408 0,410

35 0,397 0,394 0,399

40 0,397 0,381 0,394

45 0,393 0,381 0,389

50 0,389 0,375 0,386

55 0,386 0,372 0,382

60 0,380 0,369 0,375


b. Penentuan λ maksimum

1. Spektra DPPH 0,020 mM


78

2. Spektra DPPH 0,040 Mm


79

3. Spektra DPPH 0,060 mM


80

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

%IC

a. Rutin


(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC Persamaan

regresi linear

1

10

0,805

0,716 11,0559

y = 2,0646x –

9,7888

r = 0,9999

15 0,635 21,1180

20 0,554 31,1801

25 0,468 41,8633

30 0,384 52,2981

2

10

0,810

0,710 12,4221

y = 2,13x –

9,1082

r = 0,9997

15 0,631 22,2360

20 0,538 33,7888

25 0,450 44,4444

30 0,368 54,5679

3

9,8

0,798

0,705 11,6541

y = 2,1529x –

10,5263

r = 0,9995

14,7 0,630 21,0526

19,6 0,541 32,2055

24,5 0,451 43,4837

29,4 0,365 54,2606


81

b. Ekstrak bromelain daging buah nanas


(mg/mL)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC Persamaan

regresi linear

1

3,0024

0,868

0,584 32,7189

y = 10,2995x

+ 1,5207

r = 0,9994

3,5028 0,543 37,4424

4,0032 0,501 42,2811

4,5036 0,452 47,9263

5,0040 0,406 53,2258

2

3,006

0,861

0,588 34,0301

y = 10,3136x

+ 0,9567

r = 0,9998

3,507 0,545 39,0243

4,008 0,499 44,3670

4,509 0,457 49,2451

5,010 0,410 54,7038

3

2,9976

0,874

0,594 32,0366

y = 10,5263x

+ 0,4805

r = 0,9996

3,4972 0,547 37,4141

3,9968 0,504 42,3341

4,4964 0,453 48,1693

4,9960 0,411 52,9748


82

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging

buah nanas

a. Rutin

Replikasi 1


y = 2,0646x – 9,7888

50 = 2,0646x – 9,7888

x = 28,9591 µg/mL

Replikasi 2


y = 2,13x – 9,1082

50 = 2,13x – 9,1082

x = 27,7503 µg/mL

Replikasi 3


y = 2,1529x – 10,5263

50 = 2,1529x – 10,5263

x = 28,1138 µg/mL

Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 X (nilai IC50)

µg/mL

1 y = 2,0646x – 9,7888 50 28,9591

2 y = 2,13x – 9,1082 50 27,7503

3 y = 2,1529x – 10,5263 50 28,1138


83

Replikasi IC50 SD X (µg/mL) X ± SD

1 28,9591

0,6202 28,2744 28,2744 ± 0,6202 2 27,7503

3 28,1138

b. Ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi 1


y = 10,2995x + 1,5207

50 = 10,2995x + 1,5207

x = 4,7069 mg/mL

Replikasi 2


y = 10,3136x + 0,9567

50 = 10,3136x + 0,9567

x = 4,7552 mg/mL

Replikasi 3


y = 10,5263x + 0,4805

50 = 10,5263x + 0,4805

x = 4,7043 mg/mL


84

Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 X (nilai IC50)

mg/mL

1 y = 10,2995x + 1,5207 50 4,7069

2 y = 10,3136x + 0,9567 50 4,7552

3 y = 10,5263x + 0,4805 50 4,7043

Replikasi IC50 SD X (mg/mL) X ± SD

1 4,7069

0,0287 4,7221 4,7221 ± 0,0287 2 4,7552

3 4,7043


85

Lampiran 13. Uji statistik


86

a. Uji normalitas (Uji Shapiro-Wilk)

Hipotesis null (H0) = data terdistribusi normal

Hipotesis alternatif (H1) = data tidak terdistribusi normal

Taraf kepercayaan 95%

Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima

Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima

Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas terdistribusi normal

karena p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak bromelain daging buah

nanas = 0,08664. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya

adalah data terdistribusi normal.


87

b. Uji varian data

Hipotesis null (H0) = varian data tidak berbeda signifikan (homogen)

Hipotesis alternatif (H1) = varian data berbeda signifikan (tidak homogen)




Varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas tidak

homogen, karena p-value = 0,0009357. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima

sehingga kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak

homogen.

c. Uji t two-sample independent unequal variances (Welch’s t-test)

Hipotesis null (H0) = data tidak berbeda signifikan

Hipotesis alternatif (H1) = data berbeda signifikan




Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas berbeda secara

signifikan, karena p-value = 1,232x10-5

. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima

sehingga kesimpulannya adalah data berbeda signifikan.


88

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

dengan Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Ekstrak Bromelain Buah Nanas (Ananas comosus (L.)

Merr.)” memiliki nama lengkap Richard Andrison Sadeli.

Dilahirkan di kota Yogyakarta, 28 Desember 1994 dari

pasangan Wilson Budijanto Sadeli dan Yenty Widyastuti.

Penulis mengawali pendidikan di TK Sokanegara

Purwokerto (1998-2000), SD Santo Yosef Purwokerto

(2000-2006), SMP Negeri 1 Purwokerto (2006-2009),

dan SMA Kolese De Britto (2009-2012). Penulis

kemudian melanjutkan pendidikan Sarjana di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2012

hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten

Praktikum Kimia Dasar (2013, 2014, 2015) dan Praktikum Kimia Organik (2015).

Penulis juga juga cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan dan kepanitian

yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain

panitia Pharmacy Performance and Event Cup (2012), ketua panitia Kampanye

Informasi Obat (2014), dan koordinator Early Exposure (2015). Penulis juga

memiliki beberapa prestasi dari kejuaraan tingkat nasional antara lain juara 2

Pharmaceutical Industry Case Study di Institut Teknologi Bandung (2015),

peringkat 5 bidang farmasi klinis Olimpiade Farmasi Indonesia di Palembang

(2015), dan juara 1 Olimpiade Farmasi Klinis Indonesia di Batam (2015).


Download - UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1 ... · PDF file“UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS ... 1

Top Related