UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Caracterización patogénica, bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz,
Variedad iniap-103 mishqui sara
Tesis de grado previo a la obtención del título de Ingeniera agrónoma
AUTOR: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz
TUTOR: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.
Quito, Junio 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, ROSA BEATRIZ CAIZA IMBAQUINGO, en calidad de autora y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación: CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA
Y MOLECULAR DEL AGENTE CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ,
VARIEDAD INIAP-103 Mishqui sara modalidad presencial, de conformidad con el Art.
114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD
E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita,
intransferible y exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservamos a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos
en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación
de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de
la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y
no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación
que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
_________________________________
Rosa Beatriz Caiza Imbaquingo
C.C.: 172360593
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En calidad de tutor del trabajo de Titulación, presentado por la señorita ROSA BEATRIZ CAIZA IMBAQUINGO para optar por el Grado de Ingeniera Agronoma; cuyo título es: CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DEL AGENTE CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ, VARIEDAD INIAP-103 Mishqui sara, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe. En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes de junio de 2019 ____________________________________ Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc. CC. 1719050682
DOCENTE-TUTOR
iv
CARACTERIZACIÓN PATOGÉNICA, BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DEL AGENTE
CAUSAL DE LA PUDRICIÓN DE TALLO DEL MAÍZ, VARIEDAD INIAP-103 Mishqui
sara
APROBADO POR:
Ing. Agr. Jorge Caicedo., M. Sc.
DIRECTOR DE TESIS
Ing. Agr. Clara Iza M. Sc.
TRIBUNAL LECTOR / EVALUADOR
Ing. Agr. Manuel Pumisacho
TRIBUNAL LECTOR / EVALUADOR
2019
v
DEDICATORIA
A:
A Dios y a la Virgen Del Quinche como una forma espiritual guiaron
cada paso de mi vida, y así pude conseguir este logro de la mejor
manera.
Lo dedico a mis queridos padres Miguel y María que con mucho
esfuerzo y ahínco supieron regalarme la dicha de continuar mis estudios
superiores, a mis queridos hermanos José, Mari, Mary Presic, Luis, Rober
y Pame que día a día me acompañaron y animaron a seguir en mi carrera
y a mi cuñada Roció y mi sobrinita Gaby que nos llenó de alegría.
En especial a mi mami María y mi hermano Luis que en este momento
se encuentra en un lugar sin dolor alguno. Mi mami linda me enseñó a
valorar cada momento único de su presencia, y mi hermano Luis que
con anhelo esperaba que culminaran mis estudios. .
vi
AGRADECIMIENTO
Agradezco a la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario
especialmente a la Dirección De Diagnóstico Vegetal y por ende al
Laboratorio de Fitopatología, al Ing. Hernando Regalado como
responsable, al Ing. Alexander Toaza y al Ing. Jairo Guevara como
técnicos.
Agradezco a la Ing. Clara Iza y a la Ing. Nancy Nenger del Laboratorio
de Microbiología y Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas.
Al Ing. Jorge Caicedo M.Sc, como tutor de mi investigación supo
darme guía e impartir sus conocimientos en cada etapa.
Al Ing. Alexander Toaza como cotutor me abrió las puertas de las
instalaciones del Laboratorio y me supo ayudar y brindarme su
confianza como técnico y amigo.
A mis amig@s Diana, Doris, Gaby, Miguel, Luis, Francisco, Mauricio y
Edison que con su amistad supimos compartir muy buenos momentos.
A mi familia que siempre me acompañó y me tuvo paciencia en mi
fase como estudiante.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA ........................................................................................................ 4
2.1 Maíz ................................................................................................................................... 4
2.1.1. Importancia del cultivo de maíz en el Ecuador .......................................................... 4
2.1.2. Origen y distribución geográfica ................................................................................ 4
2.1.3. Descripción botánica ................................................................................................. 4
2.1.4. Descripción de la variedad INIAP 103-Mishqui sara .................................................. 4
2.2. Principales plagas del cultivo de maíz................................................................................ 5
2.2.1. Spodoptera frugiperda............................................................................................... 5
2.2.2. Helicoverpa zea ......................................................................................................... 6
2.2.3. Exserohilum turcicum Pass......................................................................................... 7
2.2.4. Pantoea agglomerans (sin. Erwinia herbicola) .......................................................... 8
2.3. Pruebas de patogenicidad (Postulados de Koch) ............................................................. 12
2.4. Escala de McFarland usada en pruebas de patogenicidad .............................................. 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 14
3.1. Características del sitio experimental .............................................................................. 14
3.1.1. Ubicación geográfica ............................................................................................... 14
3.1.2. Condiciones climáticas............................................................................................. 14
3.2. MATERIALES .................................................................................................................... 14
3.2.1. Materiales de campo ............................................................................................... 14
3.2.2. Materiales de laboratorio ........................................................................................ 14
3.2.3. Equipos de laboratorio ............................................................................................ 15
3.2.4. Materiales de invernadero ...................................................................................... 15
3.3. MÉTODOS........................................................................................................................ 15
3.3.1. Estudios preliminares .............................................................................................. 15
3.3.1.3. Conservación de la bacteria ................................................................................. 17
3.3.1.4. Reactivación de la bacteria .................................................................................. 17
3.3.2. Pruebas de patogenicidad ....................................................................................... 18
Realización de la escala McFarland: ........................................................................................ 19
3.3.3. Evaluación de plantas inoculadas ............................................................................ 21
3.3.4. Re-aislamiento bacteriano ....................................................................................... 22
3.3.5. Identificación con BIOLOG ....................................................................................... 22
3.3.6. Capacidad enzimática .............................................................................................. 23
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................................... 26
viii
4.1. Aislamiento primario y purificación ...................................................................................... 26
4.2. Identificación bioquímica de Pantoea agglomerans ....................................................... 26
4.2.1. Características bioquímicas ..................................................................................... 27
4.3. Identificación bioquímica en BIOLOG .............................................................................. 27
4.4. Identificación molecular de la bacteria............................................................................ 28
Análisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool) .................................................................. 29
Análisis filogenético ................................................................................................................. 29
4.5. Pruebas de patogenicidad ............................................................................................... 31
4.5.1. Germinación y viabilidad de las semillas de maíz .................................................... 31
4.3.4. Re-aislamiento bacteriano ....................................................................................... 34
4.3.5. Actividad enzimática ................................................................................................ 35
5. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 37
6. RECOMENDACIONES............................................................................................................... 38
7. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 39
8. ANEXOS ................................................................................................................................... 45
9. FOTOGRAFÍAS ......................................................................................................................... 64
ix
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXOS PAGS
1 Reacciones de las pruebas bioquímicas realizadas a la cepa Pantoea
agglomerans………………………………………………………………………………………….
45
2 Elaboración de la recta de calibración de la Escala Mcfarland……………….. 50
3 Gráfica de la recta de calibración de la Escala de Mcfarland usada para
cada inoculación…………………………………………………………………………………….
51
4 Turbidez para cada inoculación con los tubos 3 y 4……………………………….. 51
5 Concentración y pureza del ADN de las muestras Pantoea agglomerans. 52
6 Prueba bioquímica de identificación con Biolog para cepas originales de
Pantoea agglomerans 1…………………………………………………………………………
53
7 Prueba bioquímica de identificación con Biolog para cepas originales de
Pantoea agglomerans 2………………………………………………………………………….
54
8 Informe de análisis de semillas de la Variedad INIAP-103 Mishqui sara…. 55
9 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el
sistema Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla………….
56
10 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el
sistema Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla……………
57
11 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema
Biolog para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla………………………………..
58
12 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema
Biolog para cepas re aisladas de la inoculación II……………………………………………...
59
13 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema
Biolog para cepas re aisladas de la inoculación III………………………………………….
60
14 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema
Biolog para cepas re aisladas de la inoculación IV…………………………………………
61
15 Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema
Biolog para cepas re aisladas de la inoculación V………………………………………….
62
16 Pureza y calidad de ADN de la muestra en estudio (Pantoea
agglomerans)…………………………………………………………………………………………
63
x
ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO PAGS
1 Características agronómicas y morfológicas de la variedad INIAP 103-Mishqui sara…………………………………………………………………………………………
5
2 Concentración estimada de bacterias (células)/ml usadas como referencia en esta investigación……………………………………………………………
19
3 Primer usados para la identificación bacteriana en esta investigación…..
24
4 Pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de Pantoea agglomerans…………………………………………………………………………………………
27
5 Resultados del análisis de identificación mediante el sistema BIOLOG….
28
6 Porcentaje de semillas germinadas usadas para las pruebas de patogenicidad………………………………………………………………………………………
31
7 Porcentaje de semillas de maíz viables………………………………………………...
31
8 Probabilidad de acierto mediante el sistema de identificación bioquímica BIOLOG………………………………………………………………………………
35
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA PAGS 1 Síntomas en la hoja de maíz…………………………………………………………………………….. 7
2 Pudrición del tallo……………………………………………………………………………………………. 9
3 Marchitez del cogollo………………………………………………………………………………………. 9
4 Escala de Mcfarland para determinar densidad bacteriana……………………………… 13
5 A) Lesión temprana B) Cámara húmeda con avance de la pudrición………………… 16
6 A) Recolección de tallos en campo; B) Muestras de maíz llevadas al
laboratorio……………………………………………………………………………………………………….
16
7 Método de inoculación de la bacteria en la semilla…………………………………………. 20
8 Método de inoculación de la bacteria al tallo………………………………………………….. 21
9 A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas…………………………………….. 22
10 A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas…………………………………….. 22
11 Pasos para la identificación bioquímica con el sistema BIOLOG……………………….. 23
12 A) Marchitamiento de maíz observado en campo. B y C) Pudrición bacteriana
de tallo……………………………………………………………………………………………………………..
26
13 Colonias bacterianas con pigmentación amarilla en medio AN………………………… 26
14 Vista microscópica (100X) de Pantoea agglomerans........................................... 27
15 Perfil de amplificación de Pantoea agglomerans obtenidos de la secuencia
RNAr 16S; donde; 1 es el marcador de peso molecular, 2 es el control positivo,
3 es el aislamiento inicial FP-19-0071 AI, 4 es el aislamiento postulados FP-19-
0071 POST, y 5 es el control negativo del gel de agarosa (agua)……………………….
29
16 Árbol filogenético derivado de las secuencias del gen 16S-RNAr, construido
mediante el algoritmo “Maximun Likelihood” diseñado para la especie Pantoea
agglomerans. Los codones estuvieron basados en el alineamiento MUSCLE del
programa MEGA 10.0.5. Los valores de bootstrap con más de 50 % son fiables,
están mostrados frente a cada rama del árbol. Los números de accesiones de
referencia están indicadas entre paréntesis. Los puntos negros indican las
secuencias de los aislamientos estudiados en esta investigación……………………………
30
17 A) Plántula con sintomatología de pudrición bacteriana. B) Plántula extraída
para prueba de identificación BIOLOG; C) Testigos sin inoculación…………………..
32
18 Pudrición bacteriana en la panoja después de 60 días de inoculación……………… 32
19 A) Hojas con presencia de marchitamiento bacteriano; B) Tallo con presencia
de pudrición bacteriana; C) Manchas acuosas en plantas inoculadas……………….
33
20 Avance de la enfermedad manchas acuosas en 20 días después de la
inoculación……………………………………………………………………………………………………….
33
21 Colonias amarillas obtenidas en caja Petri de re aislamientos en AN……………….. 34
22 A) Testigo inoculado con agua (8 días después de la inoculación); B) Tubérculo
inoculado con P. agglomerans (8 días después de la inoculación)…………………….
35
23 A) y B) Segmentos de cebolla inoculada con P. agglomerans; C) Testigo absoluto
inoculado con agua destilada……………………………………………………………
36
xii
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA PAGS 1 Tallos obtenidos con la sintomatología de Pantoea agglomerans en diferentes
Parroquias………………………………………………………………………………………………………...
64
2 Microplaca de Biolog usada en la prueba bioquímica……………………………………….. 64
3 Semillas de maíz Variedad Iniap-103 Mishqui sara……………………………………………. 64
4 Prueba de germinación y desarrollo radicular a los 14 días………………………………. 65
5 Semillas dañadas en la pruebas de germinación………………………………………………. 65
6 A. Semilla teñida todo el embrión viable. B. Semilla no viable………………………….. 65
7 Semillas viables y no viables variedad INIAP-103 Mishqui sara…………………………. 66
8 Reactivos en la escala de Mcfarland…………………………………………………………………. 66
9 Espectrofotómetro…………………………………………………………………………………………… 66
10 Cepas para inoculación…………………………………………………………………………………….. 66
11 Remojo de las semillas de maíz previo a la siembra………………………………………….. 66
12 A. Plántulas germinadas e inoculadas……………………………………………………………… 67
13 A. Plantas de la II inoculación B. Tallo extraído de plantas inoculadas………………. 67
14 Microplacas de Biolog realizadas al tallo II inoculación…………………………………….. 67
15 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la III inoculación………………………. 68
16 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la IV inoculación………………………. 68
17 A. Plantas con síntomas, y B. Tallo extraído de la V inoculación……………………….. 69
18 Microplacas de Biolog, inoculación IV y V…………………………………………………………. 69
19 A) Muestras conservadas en tubos effendort B) Caja para conservación de
muestras C) Ultracongelador (-80°C)……………………………………………………………….
70
xiii
Caracterización patogénica, bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz, variedad Iniap-103 Mishqui sara
Autora: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz
Tutor: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.
RESUMEN
Los métodos de identificación de microrganismos fitopatógenos en cultivos de importancia
económica, constituyen una de las principales herramientas para solucionar problemas fitosanitarios
que afectan la producción de los mismos. Recientemente, el cultivo de maíz en el Ecuador se ha visto
afectado por microrganismos bacterianos que están mermando su producción y calidad; por lo que
esta investigación se planteó caracterizar patogénica, bioquímica y molecularmente al agente causal
de la pudrición de tallo del maíz, variedad INIAP-103 Mishqui sara en la provincia de Pichincha. En base
a los resultados bioquímicos (Biolog) y moleculares de los aislados bacterianos obtenidos de cuatro
localidades de la provincia de Pichincha, se identificó a Pantoea agglomerans como la bacteria
asociada a la pudrición de tallo y hojas del maíz. Adicionalmente, las pruebas de patogenicidad en maíz
bajo invernadero confirmaron que P. agglomerans es el agente causal de la enfermedad antes
mencionada; además, para nuestro conocimiento este es el primer reporte de P. agglomerans como
una bacteria fitopatógena de maíz en Pichincha-Ecuador.
PALABRAS CLAVE: PATOGENICIDAD, SISTEMA BIOLOG, 16S RNAr, Pantoea agglomerans, ARBOL
FILOGENÉTICO.
xiv
Pathogenic, biochemical and molecular characterization of the causal agent of the stalk rot of maize, variety Iniap-103 Mishqui sara
Autora: Caiza Imbaquingo Rosa Beatriz
Tutor: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David M.Sc.
ABSTRACT
The identification methods of phytopathogenic microorganisms in important economic crops,
constitute one of the main tools to solve phytosanitary problems that affect the production of these
crops. Recently, the corn in Ecuador has been affected by bacterial microorganisms that are
diminishing its production and quality; therefore, this research was proposed to characterize
biochemical, molecular and pathogenically, the causal agent of the stalk rot of maize, variety INIAP-
103 Mishqui sara, in the Pichincha province. Based on the biochemical (Biolog) and molecular results
of the bacterial isolates obtained from four localities in the Pichincha province, Pantoea agglomerans
was identified as the bacterium associated with stalk and leaf rot of maize of corn. Additionally,
pathogenicity tests in corn under greenhouse conditions confirmed that P. agglomerans is the causal
agent of the disease above mentioned; in addition, for our knowledge this is the first report of P.
agglomerans as a phytopathogenic bacteria of corn in Pichincha-Ecuador.
KEYWORDS: PATHOGENICITY, BIOLOGY SYSTEM, 16S RNAr, Pantoea agglomerans, PHILOGENETIC
TREE.
xv
CERTIFICACIÓN
En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es “Caracterización patogénica,
bioquímica y molecular del agente causal de la pudrición de tallo del maíz, variedad Iniap-103
Mishqui sara ”, presentado por la señorita Rosa Beatriz Caiza Imbaquingo, previo a la obtención del
Título de Ingeniero Agrónoma, certifico haber recibido y corregido el ABSTRACT para el trabajo de
grado, aprobado el mismo, después de realizadas las observaciones por los miembros del tribunal, por
lo que apruebo, para el empastado final.
____________________________________ Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc. CC. 1719050682 DOCENTE-TUTOR
1
1 INTRODUCCIÓN El maíz es el segundo cultivo más importante del mundo por su producción y demanda,
considerado como el primer cereal en rendimiento de grano por hectárea y en segundo lugar
después del trigo en la producción total. Los ambientes en los que se cultiva esta planta son
bastante amplios que van desde los 58° de latitud norte en Canadá y Rusia, y hasta los 40° de latitud
sur en Argentina y Chile. Su importancia económica se basa principalmente debido a los usos que
se le da como alimento humano, alimento para ganado en forraje o balanceado, siendo la base de
muchos productos industriales y materia prima para biocombustibles (FAO, 2009). El trigo junto al
maíz son los cereales más consumidos no solo en nuestro país sino en todo el mundo; además,
este cereal es rico en vitaminas del grupo B (B1 y B3), con minerales como fósforo y magnesio
(Pérez, 2018), y alto contenido de hidratos de carbono que están contenidos en el almidón del
grano considerado como alimento energético; sin embargo, el contenido de proteínas es limitado
y se encuentra en forma de zeína, pobre en lisina y triptófano (Ministerio Cultura y Patrimonio,
2016).
El cultivo de maíz en el Ecuador se encuentra distribuido en todo el país, por lo que en la sierra se
reconocen tres grandes zonas de producción: norte, que comprende las áreas maiceras de Carchi,
Imbabura, Pichincha; centro, conformada por las provincias de Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo
y Bolívar; y la zona sur que integra las provincias de Azuay, Cañar y Loja y en las provincias
costaneras de Manabí, Esmeraldas y Guayas principalmente y en la región amazónica la provincia
de Pastaza (Coral, 2017). El MAGAP (2017), afirma que desde el año 2000 al 2012, la producción
nacional de maíz en grano seco y limpio en el Ecuador, aumentó un 188 % debido principalmente
al uso de semillas de alto rendimiento, al incremento en los precios internacionales y a su alta
demanda por parte de la agroindustria.
De la misma forma, la generación de variedades mejoradas a partir de variedades nativas está a
cargo de entidades gubernamentales como INIAP1, o por entidades privadas como ECUAQUÍMICA,
AGRIPAC, PRONACA/INDIA, INTEROC, siendo estas generadoras de variedades que aumentan la
producción y el rendimiento de maíz en el país. Algunas de las variedades creadas para la región
costa por INIAP son H-551, H-601, H-553, H-602 con rendimientos de hasta 100 qq/ha en promedio
(Andrade, 2014), y para la región sierra variedades con granos blancos, blancos harinosos, y
variedades mejoradas como INIAP – 103 Mishqui sara entre otros (Yánez et al., 2013).
La variedad mejorada como INIAP-103 Mishqui sara fue liberada en Azuay y Loja, teniendo grandes
resultados en su adaptación y con excelentes características agronómicas, (INIAP Estación
Experimental del Austro, 2011). Esta variedad con alto rendimiento y alta calidad proteínica (ACP)
ofrece principalmente dos aminoácidos esenciales como lisina y triptófano en el que es deficiente
el maíz, siendo esto algo novedoso y creado con un fin para combatir la desnutrición humana
(Ministerio Cultura y Patrimonio, 2016). Adicionalmente, esta variedad muestra un grado de
resistencia para enfermedades como el tizón y la roya de la hoja.
En los últimos años, las plagas que afectan este cultivo se han incrementado considerablemente
debido a que las siembras se realizan en todo el año, además del uso intensivo de productos
químicos (insecticidas y fungicidas), que puede muchas veces causar problemas de resistencia
(Yánez et al., 2013). En Ecuador en el año 2000 se produjeron 423 mil toneladas y para el 2012 se
incrementó en 1.22 millones de toneladas, registrando una tasa de crecimiento promedio anual de
12.06 % (SINAGAP, 2013), existiendo una reducción de 54.697 hectáreas en el área sembrada.
1 Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias
2
Según los datos obtenidos, la principal causa de la reducción en el rendimiento del cultivo de maíz
fue entre otras, la presencia de plagas insectiles, donde las principales son el gusano cogollero
(Spodoptera frugiperda) y gusano elotero (Helicoverpa zea), y enfermedades como el tizón de la
hoja (Exserohilum turcicum), roya (Puccinia sorghi), y la pudrición de tallo (Pantoea agglomerans)
enfermedad recientemente identificada en México (Mezzalama, 2016).
Particularmente Pantoea agglomerans (sinónimo Erwinia herbicola), es una bacteria fitopatógena
del maíz reportada en todo el mundo, desde América del Norte hasta América del Sur, África, Asia
y Europa; sin embargo, los síntomas asociados a este tipo de pudrición están escasamente descritos
en la literatura. La presencia de esta enfermedad bacteriana se ha reportado en microambientes
significativamente diferentes en términos de temperatura y humedad con respecto a otras especies
de plantas; por este motivo existe una preocupación mundial por la pérdida de cultivos a causa de
esta bacteria fitopatógena que durante muchos años no fue considerada como tal (Ruíz et al.,
2018). La temperatura y humedad del suelo cumplen rol importante para la epidemiología de la
bacteria, haciendo que la misma sea persistente en varios cultivos, a pesar de que su ciclo de vida
es relativamente corto (Oyarzún et al., 2002).
El rango de hospedantes de P. agglomerans engloba una gran cantidad de cultivos como, banano
(Musa sp.), cebolla (Allium cepa), algodón (Gossypium herbaceum), arroz (Oriza sativa), piña
(Ananas comosus); palma aceitera (Elaeis guineensis) y maíz (Zea mays), además de algunas plantas
ornamentales como gloxinia (Gloxinia maculata) y gypsophila (Gypsophila paniculata) (plantwise,
2018). En Ecuador, este género bacteriano se ha reportado en palma aceitera (Elaeis guineensis)
asociado a la pudrición de cogollo observada en San Lorenzo, Esmeraldas (Vega, 2014),
presentándose como la segunda especie de bacterias con mayor cantidad de colonias a nivel in
vitro.
Los problemas con la identificación de agentes causales de enfermedades en plantas, han permitido
desarrollar métodos de identificación comunes, y así mismo formas de identificación más
específicas usando tecnologías de vanguardia, para hacer de esta una herramienta útil en la
creación de sistemas de control y manejo más eficientes. Con respecto a Pantoea agglomerans,
entre los métodos más específicos y comunes de identificación, están la tinción de Gram, y la
especificidad de género para la prueba del indol (Jiménez et al., 2007).
La prueba bioquímica de mayor precisión es el sistema de identificación BIOLOG, capaz de
identificar una bacteria hasta el nivel de género y especie; para ello, se utilizan 96 pocillos que
contienen una base de datos de más de 2900 especies de bacterias anaerobias, aerobias, levaduras
y hongos filamentosos. El sistema está basado en la utilización, oxidación, y la producción de
Nicotinamida Adenindinucleótido reducido (NADH), de sustratos de fuente de carbono cuya
utilización se mide por el colorante redox violeta de tetrazolio de bastante uso en la biología,
diseñado para identificación de bacterias ambientales y de alimentos pero menos relacionada con
problemas médicos y de gran utilidad en microbiología clínica (Gobernado & López-Hontangas,
2003).
Adicionalmente, la identificación genética de bacterias ofrece una alta especificidad en la
identificación de género y especie de cualquier bacteria cultivable, donde las herramientas más
usadas son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando la secuencia del gen 16S ARNr de
la bacteria usando para ello cebadores específicos que permiten la amplificación y la detección a
nivel de especie del microorganismo (Gobernado & López-Hontangas, 2003); dilucidando la
identidad de cualquier agente causal de enfermedades.
3
Con esta premisa, el presente estudio tuvo como objetivo caracterizar patogénica, bioquímica y
molecularmente la bacteria causante de pudrición del tallo del maíz en la variedad INIAP-103
Mishqui sara. Para el efecto, se usaron pruebas bioquímicas y del BIOLOG para comprobar la
presencia inicial de la bacteria Pantoea agglomerans en plantas afectadas con pudrición de tallo,
además se realizaron los postulados de Koch para comprobar su patogenicidad y virulencia, y por
último se caracterizó molecularmente mediante el uso de cebadores bacterianos específicos su
identidad genética. Para nuestro entendimiento, esta investigación sugiere por primera vez en
nuestro país, que Pantoea agglomerans es el agente causal de la pudrición de tallo del maíz.
4
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Maíz
2.1.1. Importancia del cultivo de maíz en el Ecuador
Para el año 2015, el cultivo de maíz representó un total de superficie sembrada de 7,086 ha
(MAGAP, 2017), donde los incrementos de la superficie cosechada se estimaron debido a su uso
para consumo humano, que representó el 14,2 % con una tasa promedio anual del 1,7 %. Además,
otro uso importante del maíz es para biocombustibles con un 15,2 %, mostrándose un incremento
del consumo en el país de 3,9 % en la demanda y en volumen alcanzaría 226 millones de toneladas
(FIRA, 2016).
El garantizar la soberanía alimentaria de la población hace posible la creación o mejoramiento de
variedades y así la adaptación en diferentes zonas como la variedad ECU-17-559 o actualmente
INIAP 103-Mishqui sara, es una variedad precoz que contiene altos niveles de proteína debido a la
presencia de un mayor contenido de triptófano y lisina (aminoácidos esenciales en la proteína), con
un cosecha estimada un mes antes de lo previsto en comparación de otras variedades (Jimbo,
2010).
2.1.2. Origen y distribución geográfica
El maíz apareció entre los años 8000 y 600 AC en Mesoamérica (México y Guatemala),
probablemente a lo largo del acantilado occidental de México Central o del Sur, a 500 Km de la
Ciudad de México, razón por la cual es el centro primario de diversidad genética y la zona Andina
el sector secundario, donde el cultivo ha tenido una rápida evolución (Acosta, 2009).
2.1.3. Descripción botánica
El maíz (Zea mays L.), es una gramínea anual, robusta, de crecimiento determinado, de 1 a 5 m de
altura, un solo tallo dominante, sus hojas alternas son pubescentes en la parte superior y glabra
(sin pelos o bellos, hojas lisas) en la parte inferior (INTA, 2010).
La constitución de la planta de maíz es por una raíz fibrosa, un tallo con entrenudos en forma de
caña, con hojas lanceoladas dispuestos y encajados al tallo, esta contiene una panoja que contiene
la flor masculina y la femenina, la flor femenina que se encuentra a un nivel inferior y la que da
origen a la mazorca (Eglenis, 2011).
2.1.4. Descripción de la variedad INIAP 103-Mishqui sara
En Ecuador, en el año 2006 se introdujo la variedad de maíz de grano blanco harinoso con alta
calidad de proteína (ACP) Aychazara 102, que es proveniente del Centro de Fitoecogenética
Pairumani de Bolivia (Eguez & Pintado , 2013). Para la creación de la variedad INIAP 103-Mishqui
sara, se realizó un ciclo de selección masal en el año 2006 y dos ciclos de selección familiar por
medios hermanos durante los años 2007 y 2008, las familias fueron seleccionadas para el programa
de Maíz de la Estación Experimental del Austro del INIAP por caracteres agronómicos como sanidad,
buena cobertura de mazorca y rendimiento sobre las 8 t/h (Egues & Yánez, 2008).
5
Cuadro 1. Características agronómicas y morfológicas de la variedad INIAP 103-Mishqui sara:
Características Rango Promedio
Días a floración femenina 64-80 72
Altura de la planta (m) 2,30-2,70 2,50
Altura de mazorca (m) 1,0-1,5 1,25
Porcentaje de mazorcas con mala cobertura 0-2 1
Días a la cosecha en choclo 100-120 110
Días a la cosecha en seco 230-270 250
Número de hileras de grano por mazorca 12-16 14
Rendimiento experimental en grano seco (t/ha) 4,5-10,9 7,7
Porcentaje de grano 76-80 78
Rendimiento comercial de choclos (sacos/ha) 300-400 350
Color de grano Blanco
Textura Harinoso
Fuente: Ficha técnica INIAP, 2013
El piso climático para esta variedad está mejor adaptado entre los 1700 a 2650 msnm, en zonas
como Guayas, Santa Elena, a 30 msnm hasta los 2650 msnm en Sigsig -Azuay (Eguez & Pintado ,
2013).
2.2. Principales plagas del cultivo de maíz
2.2.1. Spodoptera frugiperda
Importancia
La principal pérdida como plaga registrada en 2017 en el sector maicero del Ecuador, es causada
por el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) mostrándose una afectación de 82 281 hectáreas
(Reyes & Paucar , 2017).
Según Ángulo (2000), este insecto está clasificado taxonómicamente de la siguiente manera:
Reino Animalia Filo Arthropoda Clase Insecta Orden Lepidóptera Suborden Glossata Infraorden Heteroneura Familia Noctuidae Género Spodoptera Nombre científico Spodoptera frugiperda Nombre común Gusano cogollero
Descripción
Es una plaga clave en las gramíneas como masticador del tejido vegetal, donde la larva posee un
aparato bucal raspador-masticador durante los tres primeros estadios, alimentándose de la
epidermis de las hojas (Lezaun, 2014). Esta larva se introduce en el cogollo causando daños a las
hojas tiernas que luego resulta agujeros de diferentes tamaños y forma irregular. Su ciclo de vida
es de un mes y puede tener hasta 12 generaciones por año (Alvarez & Sánchez, 2003). El gusano
cogollero es la larva de la mariposa nocturna Spodoptera frugiperda que ataca principalmente al
maíz (Angulo, 2000).
6
Métodos de control: la forma de controlar es el uso de labranza cero, ayudando a reducir las
poblaciones. El riego por aspersión en maíz y frijol reduce las larvas de primero y segundo estadio
(Alvarez & Sánchez, 2003). Además, el uso de nucleopoliedrovirus (Baculovirus) compuesto por una
proteína insecticida que engloba a las partículas infecciosas denominadas virones. La larva come la
hoja contaminada, ingiere el virus que cuando llega al tubo digestivo del insecto, se disuelve la
proteína que rodea a viriones y estos quedan libres, se unen a las células epiteliales y entran al
núcleo de ellas mismas, donde se multiplican y en cuestión de 3 o 4 días quedan convertidas en un
charco y así se liberan partículas virales que contaminaran otras hojas (Santos, 2008). Además, la
bacteria Bacillus thuringiensis, cuando esporula sintetiza unos cristales proteicos llamados delta-
endotoxinas a los cuales debe su actividad insecticida (Royano, 2009).
2.2.2. Helicoverpa zea
Una plaga conocida es también el gusano elotero causando graves pérdidas en provincias de
Guayas, Los Ríos, Santa Elena, y cantones como Santa Ana, Pajan y Chone de Manabí, esta es
conocida como una polilla nocturna (Reyes & Paucar , 2017).
Según Boddie (1850), este insecto está clasificado taxonómicamente de la siguiente manera:
Reino Animalia Filo Arthropoda Clase Insecta Orden Lepidóptera Suborden Glossata Infraorden Heteroneura Familia Noctuidae Género Helicoverpa Nombre científico Helicoverpa zea Nombre común Polilla nocturna
Descripción
El gusano elotero es una especie polífaga, donde el adulto es como una palomilla de color amarillo
rojizo con una mancha circular cerca del centro de las alas anteriores (Koppert, 2018). La
emergencia de las larvas se estima alrededor de cuatro días, y se presentan seis instares larvales
con una duración de 2 a 3 semanas. El daño lo ocasiona durante su estado larvario especialmente
en los granos de maíz lechoso de la mazorca desde la punta hasta la base (INTAGRI, 2017).
Métodos de control: el uso de herramientas como el rastreo y barbecho del terreno para exponer
las pupas a la intemperie (Morales, 2017). Mediante aceite comestible que se coloca en la flor
femenina, se recomienda aplicar de 3 a 4 litros por hectárea, el aceite mata a la larva por asfixia
debido a que el aceite tapona los espiráculos de la larva, el tiempo en el que muere la larva es de
30 segundos aproximadamente (Peñaherrera , 2011). Trichogramma sp. es un himenóptero
parasitoide que actúa como controlador biológico; parasitando a los huevos de los adultos haciendo
liberaciones sucesivas (una semanal) para así favorecer el establecimiento del parasitoide en el
campo (Moreno & Peréz , 2002). El ciclo es de 8 días, después de parasitar al huevo esta nace en 24
horas, luego emerge una larva y que en 5 días se convertirá en pupa, tan solo en dos días se
convertirá en adulto y habría cumplido su ciclo (Bertorelli & Rengifo, 2008).
7
2.2.3. Exserohilum turcicum Pass
El tizón foliar del maíz es una de las enfermedades más importantes del cultivo, esta enfermedad
provoca pérdidas del 91 % (Ramirez , 2014).
Según Leonard & Suggs (1974), este hongo está clasificado taxonómicamente de la siguiente
manera:
Reino Fungi División Ascomycota Clase Dothideomycetes Sub-clase Pleosporomycetidae Orden Pleosporales Familia Pleosporaceae Género Exserohilum Nombre científico Exserohilum turcicum Nombre común Tizón foliar
Síntomas
Aparición de manchas pequeñas, de forma ovalada y acuosa que se producen en las hojas (Ver
figura 1), esto produce inmediatamente zonas necróticas alargadas. Se encuentra distribuido en
zonas con mucha humedad y temperaturas de 17 a 22 °C durante el periodo de crecimiento
(CIMMYT, 2004).
Figura 1: Síntomas en la hoja de maíz
Fuente: Panorama, 2018 http://panorama-agro.com/?p=801
Dispersión
Como este es un hongo, la forma de dispersión es mediante las esporas por el golpe de agua de
lluvia y el aire, en la que el viento lleva las esporas hacia grandes distancias. La presencia de mucho
roció, lloviznas fuertes, con alta humedad y temperaturas templadas son condiciones que
favorecen el desarrollo de la enfermedad (Pioneer, 2014).
Métodos de Control: La rotación de cultivos, la eliminación de residuos de cosechas previos a la
siembra, la remoción del terreno que ayuda a la descomposición (Pioneer, 2014). La selección de
híbridos resistentes, tipo de labranza en la presencia de la enfermedad. Además, sembrar en fechas
indicadas para evitar las épocas de lluvias ya que este es fuente de dispersión (Pioneer, 2014). Las
mezclas de triazoles + estrobilurinas son eficientes en el control llegando al punto de disminuir las
pérdidas de rendimiento causadas por tizón foliar (Couretot et al., 2013). El modo de acción actúa
inhibiendo la biosíntesis de ergosterol de la membrana celular, esto hace que evite el desarrollo del
patógeno (Reyes, 2016).
8
2.2.4. Pantoea agglomerans (sin. Erwinia herbicola)
El género Pantoea fue descrito recientemente dentro de la familia Enterobacteriaceae; su génesis
fue el resultado de problemas taxonómicos asociados con miembros del complejo Enterobacter
agglomerans que se compone de siete especies: P. agglomerans, P. dispersa, P. stewartii, P.
punctata, P.citrea, P. terrea y P. ananas (Pérez-Terrón., 2008). El género Pantoea cuenta con 2
genes de patogenicidad y virulencia, el cps es el requerido para la producción del exopolisacárido
(EPS) y el hrp de secreción tipo III útil para la patogenicidad y en las lesiones en las hojas (Cha et al.,
1998).
Origen y distribución
En el año 2004-2005 al Noreste de Sud África la afectación a cultivos comerciales de maíz (Zea mays)
fue de 10 al 70 % por el patógeno Pantoea agglomerans. En Brasil se incluyen reportes en el taro
chino en 2007, en Estados Unidos en cebolla en 2006, y Sudáfrica en 1981 y el mijo perla en
Zimbawe en 1997 (Morales-Valenzuela et al., 2007). El principal hospedero es el maíz (Zea mays),
sin embargo, el maíz dulce es más susceptible colonizando al tejido vascular, encontrándose
también en raíces, tallos, hojas, vainas, mazorcas, cáscaras y granos (Pérez-Terrón., 2008).
Según Ewing & Fife (1972), esta bacteria está clasificada taxonómicamente de la siguiente manera:
Síntomas
Los síntomas iniciales se presentan como manchas acuosas dispersas entre blanco y café claro en
las hojas en su interior, presentándose contracciones y ondulaciones del tejido en el área afectada
con estrías cloróticas (Ruíz et al., 2018). La lesión foliar tiende a fusionarse y provocando un
secamiento y marchitamiento, la infección avanza desde las hojas hasta el tallo de la planta
provocando una coloración amarillenta-café claro. Las infecciones secundarias pudren el tejido
(Figura 2) y generan un olor característico de la enfermedad.
La presencia de manchas marrones en el interior del tallo, la ruptura del primer nudo interno con
pardeamiento interno del tallo en dirección al ápice evitando el desarrollo de la fructificación
(Goszczynska et al., 2007). Por otro lado, la presencia de estrías cloróticas son algunos de los
síntomas que aparecen en la planta, en estados avanzados necrosis y aflojamiento de la hoja.
Reino Bacteria Filo Proteobacteria Clase Gammaproteobacteria Orden Enterobacteriales Familia Enterobacteriaceae Género Pantoea Especie Pantoea agglomerans Nombre común Pudrición del tallo
9
Figura 2: Pudrición del tallo de maíz
Fuente: Caiza R, 2019
Además, esta bacteria es considerada como fitopatógena, debido a que existen estudios donde se
ha determinado como una bacteria asociada a la formación de síntomas iniciales de pudrición de
las inflorescencias y del cogollo, seguido de un secado y muerte repentina (Gijón, 2009) (Figura 3).
Figura 3: Marchitez del cogollo de maíz
Fuente: Gijón, 2009
Epidemiología
Pantoea agglomerans requiere temperaturas aproximadas de 25 °C y con la humedad relativa de
95 % para que la bacteria pueda progresar y continuar. También la infección se beneficia por las
lluvias y por sistemas de riego por aspersión (Gijón, 2009).
Dispersión
Pantoea agglomerans se transmite desde semilla y sobrevive en diferentes cultivos hospederos
como maíz, algodón, melón, piña, arroz, azúcar y caña. Además, puede sobrevivir en la maleza y
restos de cosecha causando infecciones recurrentes en cultivos posteriores. Por otro lado, las
salpicaduras de agua son la principal fuente de dispersión hacia otros lotes, que muchas veces son
favorecidas por fuertes corrientes de viento (Seminis, 2018).
10
2.2.4.1. Manejo integrado de la pudrición del tallo del maíz
Control cultural y métodos sanitarios
Para controlar la dispersión de la bacteria se recomienda el uso de semilla sana, controlar la maleza,
para así evitar hospederos como los trips, que pueden diseminar la bacteria. Es vital el uso de riego
por goteo evitando trabajar cuando el follaje este mojado (Seminis, 2018), además, cultivar con una
profundidad considerada para que los restos se logren descomponer, también hacer rotación de
cultivos y evitar cultivos hospederos de la enfermedad.
Control biológico
El control se realiza por tres sistemas vivos: el patógeno, el agente de control biológico y el huésped
que interactúan mutuamente, consiste en utilizar microorganismos de bajo impacto ambiental
capaces de controlar el crecimiento del patógeno, con base a principios de competencia,
antagonismo y/ o inducción de resistencia. Existen dos cepas de Pseudomonas fluorecens PfA506 y
Erwinia herbicola EhC9-1s resistente a la estreptomicina, presentándose mejores resultados con la
combinación de las dos cepas (Ordax, 2008).
Control químico
Los tratamientos químicos encaminados principalmente a disminuir la supervivencia del inóculo
bacteriano o inhibir su multiplicación, son productos cúpricos del que se han realizado diversas
formulaciones químicas, que tienen como ingrediente activo el catión de cobre solubilizado. Los
exudados bacterianos contienen compuestos capaces de solubilizar el cobre, causando la muerte
celular o al menos la inhibición de algunas actividades biológicas en la bacteria, al momento de usar
este método hay riesgos de causar fitotoxicidad dañando partes de las plantas y crear resistencia a
dicho compuesto (Ordax, 2008).
Para la prevención de la enfermedad se podría evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados,
y el uso de bactericidas con base de cobre (Cu) aplicado cuando hay riesgo moderado de presencia
de la enfermedad.
2.2.4.2. Métodos comunes de caracterización de Pantoea agglomerans
Morfología de colonias
La identificación morfológica de colonias de Pantoea agglomerans permite reconocer a la bacteria
por la presencia de pigmentación amarilla, y mediante microscopía óptica por su forma de bastón
no encapsulado, que produce colonias lisas y convexas. Se desarrolla bien en agar nutriente,
produce turbidez en caldo nutritivo, son Gram negativas y pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae (Pérez-Terrón, Evaluación de la diversidad genética y bioquímica de Pantoea
sp. en maíz, 2008).
Caracterización fisiológica y bioquímica
La tinción de Gram es el primer paso para la identificación bacteriana, en 1884 fue creada por el
médico Hans Christian Gram, esta prueba permite separar a las bacterias en dos grupos, las Gram
positivas se tiñen de color violeta y las Gram negativas de color rosa (Microbitos, 2011). La tinción
de las bacterias Gram positivas se debe a la presencia de una capa gruesa de peptidoglicanos
responsable de la retención de los tintes violetas en la pared celular; pero en las bacterias Gram
negativas consta de tres estructuras y una de ella es una capa fina de peptidoglicano que es incapaz
de retener el color violeta por la decoloración con etanol durante la tinción, y además cuenta con
una capa externa de lipopolisacáridos confiriendo una carga negativa a la pared celular (Kunstmann,
2004).
11
La familia Enterobacteriaceae muestra características específicas: proliferan en medios aerobios y
anaerobios (son anaerobios facultativos) utiliza hidratos de carbono por dos vías como es la vía
oxidativa (presencia de oxígeno) o por la vía fermentativa (ausencia de oxígeno) utiliza una única
fuente de carbono como se usa en la prueba del citrato, al ser oxidativo la bacteria utiliza la enzima
catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno, este compuesto pertenece a la categoría de las
oxidorreductasas que catalizan la transferencia de electrones del peróxido de hidrógeno y a
menudo producen gas, estas características son necesarias para la identificación de P. agglomerans
debido a la familia a la que pertenece.
Las pruebas específicas para la identificación de P. agglomerans son la de oxidasa e indol, en la que
la prueba de oxidasa debe ser negativa (Kunstmann, 2004). Esta prueba busca la presencia de la
enzima citocromo C oxidasa, presentándose positiva (color púrpura) solo para organismos aerobios
(Coltran, 2014). La prueba del indol es específica para separar dos patovares de Erwinia herbicola
(pv. milletiae y pv. herbicola), dependiendo del resultado puede tratarse del primer o segundo
patovar (Jiménez et al., 2007). El resultado dará positivo si hay un halo de color rosado o violeta y
siendo específico para Pantoea ananatis, y el no cambio significa que es negativo y específico para
Pantoea agglomerans (Jiménez et al., 2007).
Caracterización mediante BIOLOG Gen III
Esta prueba bioquímica es un gran avance en la nueva química para óxido-reducción, que permite
la inspección de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en un mismo panel seco, mediante
microplacas de 96 pocillos, permitiendo un diagnóstico rápido y seguro (Biolink , 2011). En la
identificación de bacterias o de cualquier microorganismo se agrega una suspensión celular y el
patrón metabólico resultante o la huella dactilar generada por el microorganismo se registra y se
compara con cientos de perfiles de identificación en una base de datos de biología, la base de datos
se actualizan periódicamente para reflejar la taxonomía más reciente y las especies incorporadas
adicionales, y así ampliar las capacidades para satisfacer las crecientes necesidades al momento de
identificar agentes causales de enfermedades (Bou et al., 2011).
Caracterización mediante métodos moleculares
Los métodos moleculares están basados en la identificación o detección del genoma parcial o
completo de un organismo vivo, basándose en la interacción entre enzimas y ácidos nucleicos
(Arora, 2004). Las enzimas usadas son endonucleasas de restricción y ADN polimerasas, donde las
endonucleasas cortan secuencias especificas siendo empleadas en la técnica RFLP2 y las ADN
polimerasas catalizan la síntesis del ADN utilizadas para la amplificación de la PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa).
La técnica de PCR es una de las más empleadas, a partir de una muestra de ADN, que contiene las
regiones específicas de ADN a través un ADN polimerasa y de dos cebadores que reconocen y se
unen a una región de una cadena de ADN iniciando la replicación del material genético (Arora,
2004), usando una amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN. Una de las ventajas de
la PCR es en los resultados con una amplificación más pequeña, de allí su principal ventaja
(Navarrete et al., 2014).
2 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
12
La secuencia del gen ARNr3 16S cuenta con ~1400 a 1500 pb, que puede ser copiado usando primers
o cebadores universales, con un tamaño ideal para proporcionar polimorfismos interespecíficos
para el análisis y así establecer medidas estadísticas validas (Germán et al., 2011). Esta información
provee una identificación bacteriana hasta el nivel de género, especie y permite establecer
relaciones filogenéticas con bacterias asociadas (Rezzonico et al., 2009).
Los primers (iniciadores) o cebadores universales más comunes para la identificación bacteriana se
los conoce como 27F (Bacteria) y 1492R (Universal); la secuencia 27F es 5´-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´ y la secuencia 1492R es 5´- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3´, estas
son cadenas de ácidos nucleicos que ayudan como punto de partida para la replicación de ADN,
estos iniciadores contienen aproximadamente 20 bases de longitud generalmente secuencias
cortas y actuando como punto de partida con el fin de copiar la hebra molde (Miller et al., 2013).
2.3. Pruebas de patogenicidad (Postulados de Koch)
Los postulados tienen como primer eslabón recrear el ciclo de la enfermedad provocada por un
determinado patógeno. Para corroborar la presencia de una enfermedad y el agente causal en un
determinado cultivo, se debe correlacionar el brote de esta con un patógeno específico, por lo que
es preciso emplear los postulados de Koch y sus modificaciones, para determinar la etiología o
causa de la enfermedad. En esencia Koch postuló, que para comprobar que un patógeno causa
enfermedad debe demostrar que no solo están correlacionados, sino relacionados en cuanto la
causa verídica y directa de la enfermedad; esto depende de la separación del patógeno y su
reintroducción a un organismo, con la subsiguiente producción de síntomas, incluyendo la
reaparición del agente causal en el organismo enfermo (Cisneros, 2013).
El diagnóstico en caso de que sea probable que el patógeno represente la causa de la enfermedad,
pero que no existan registros anteriores que apoyen esa suposición, tendrán que considerarse los
siguientes puntos para comprobar la hipótesis de que el patógeno es la causa de esa enfermedad
(Peña & Páez, 2010).
Según Robert Koch, 1905 (Agrios, 2005):
1. El microorganismo debe encontrarse en todas las plantas con la enfermedad en cuestión y
su distribución debe corresponder a las lesiones observadas.
2. El microorganismo debe aislarse de las lesiones de la planta infectada y se debe obtener un
cultivo puro.
3. El cultivo puro inoculado en otras plantas inoculadas debe producir la enfermedad.
4. El microorganismo debe aislarse en un cultivo puro a partir de las plantas infectadas
intencionalmente.
2.4. Escala de McFarland usada en pruebas de patogenicidad
La escala de McFarland se trata de una serie numerada de 10 tubos, que se usa como patrones de
turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos, el patrón de 0,5 de McFarland
tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos de bacterianos (BD, 2005). Se mezclan
soluciones de cloruro de bario al 0,048 M con ácido sulfúrico al 0,36 M con la finalidad de obtener
13
una relación entre una precipitación química y una suspensión bacteriana (Ulloa, 2015), la escala
determina la proliferación o la multiplicación de bacterias, produciendo turbidez o la opacidad en
el tubo (Figura 4).
En la inoculación de bacterias, la escala recomendada que menciona Jiménez et al. (2007) usa una
concentración de 10-8 células ml-1 usando los tubos 3 y 4 de la escala de McFarland generando una
cantidad de bacterias capaz de causar enfermedad en plantas sanas. La forma de detectar la
correcta concentración de las diluciones bacterianas es mediante un turbidímetro que mide la
turbidez y evita una inadecuada preparación del inóculo (Ulloa, 2015).
Figura 4. Escala de McFarland para determinar densidad bacteriana
Fuente: Caiza R, 2019
0,5 1 2 3 4 5
14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Características del sitio experimental
3.1.1. Ubicación geográfica
La identificación y caracterización de las muestras aisladas se las realizaron en el Laboratorio de
Fitopatología de La Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD), ubicados
en:
Parroquia: Tumbaco
Cantón: Quito
Provincia: Pichincha
La realización de los postulados de Koch se llevó a cabo en el Invernadero de Microbiología y
Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador, ubicados
en:
Parroquia: Tumbaco
Cantón: Quito
Provincia: Pichincha
Sector: La Morita
Altitud: 2480 msnm
Latitud: 00°13’46’’S
Longitud: 78° 22”00” O (INAMHI, 2015) .
3.1.2. Condiciones climáticas
Temperatura promedio: 15.4 °C
Precipitación mensual: 86,5 mm
3.2. MATERIALES
3.2.1. Materiales de campo
Muestras de diferentes tallos de maíz enfermos
Fundas de polietileno de 10*14 cm.
Bisturí.
Navaja.
3.2.2. Materiales de laboratorio
Asa de platino
Sacabocados
Mechero de vidrio
Erlemeyer (125 - 250 - 2000ml)
Micropipeta (100 – 1000 µl)
(Calibrado) y puntas estériles.
Vasos de precipitación (100-600
ml)
Tubos de ensayo con tapa rosca
Fundas polifán
Papel aluminio
Gradilla
Bisturí
Alcohol (96 %)
Hipoclorito de sodio (2%)
Agua destilada y esterilizada
15
Agua Tipo A1
Jeringas 5 ml
Tubos de agua peptonada (9ml)
Tubos de caldo nutritivo (5ml)
Agar nutriente (AN)
Morteros
Mondadientes
Hisopos
Cloruro de bario (BaCl2 0.048 M)
Ácido sulfúrico (H2SO4 0.36 M)
Triptona
Reactivo de Kovacs
Asa de siembra
3.2.3. Equipos de laboratorio
Cámara de flujo laminar BIOBASE
Refrigeradora MABE
Autoclave ALL AMERICAN
Agitador vórtex D LAB
Incubadora 28 ° C MEMMERT
Microscopio óptico OLYMPUS
Balanza de precisión RADWAG
Cámara fotográfica SONY
Espectrofotómetro SPECTRONIC (Calibrado)
Turbidímetro BIOLOG (Calibrado)
Centrifugadora 5804 R
Ultracongeladora So Low U85-25
Computadora LG
3.2.4. Materiales de invernadero
10 macetas plásticas (8 litros)
20 semillas de maíz INIAP 103 - Mishqui sara
22,5 lb de compost esterilizado
12 fundas plásticas de polifán
3.3. MÉTODOS
3.3.1. Estudios preliminares
A continuación, se describe lo que se realizó para la obtención, aislamiento e identificación de
la bacteria obtenida de muestras infectadas de plantas de maíz que fueron recolectadas en
campo en Tumbaco (CADET). Una vez aisladas las bacterias fue probada la patogenicidad en
cañas de maíz sanas y con un sacabocados se hizo un hoyo y se inoculo con colonias puras de las
bacterias aisladas e inmediatamente se colocaron en cámara húmeda en fundas de polifán y
llevadas a la incubadora de bacterias a 28°C (Figura 5). De esta inoculación, se realizó re-
aislamiento de la bacteria presente en la pudrición.
16
Figura 5. A) Lesión temprana B) Cámara húmeda con avance de la pudrición Fuente: Caiza R, 2019
3.3.1.1. Recolección de las muestras
En Tumbaco (CADET), Pifo, Puembo, y Checa, se seleccionaron plantas con los síntomas de
pudrición del tallo de maíz, que presentaron un olor representativo de la presencia de la
bacteria. Se recolectaron tallos de plantas de maíz de aproximadamente dos meses de edad, y
estas se las colocaron en fundas plásticas e inmediatamente fueron llevadas al laboratorio para
el aislamiento y cultivo de la bacteria (Figura 6).
Figura 6. A) Recolección de tallos en camp o; B) Muestras de maíz llevadas al laboratorio Fuente: Caiza R, 2019
3.3.1.2. Aislamiento primario en laboratorio
1. Las muestras recolectadas de la base del tallo de maíz enfermos, se cortaron
pequeños trozos de 0,5 cm con una parte enferma y una parte sana.
2. Los segmentos fueron lavados en hipoclorito de sodio al 2 % durante 1 minuto.
3. Se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante un minuto cada uno.
4. En la cámara de flujo laminar se agregaron los segmentos de caña infectados en el
mortero con agua peptonada (9ml) y se maceraron hasta que se tornó un líquido
turbio.
5. Se tomaron del mortero con la micropipeta 1000 µl de la suspensión y se
procedieron a colocar en tubos de 5ml con caldo nutritivo y se agitó con el vórtex.
6. Se tomaron 1000 µl y se hicieron diluciones hasta 10-3 para bajar la concentración
del aislamiento inicial.
7. Se tomaron de la última dilución 100 µl con la micropipeta y se agregaron a la caja
Petri con el medio de agar nutriente (AN).
8. Se incubo la bacteria por 12 horas a 30 °C.
9. Se tomaron diferentes colonias de la bacteria y se procedió a purificarlas en cajas
Petri con medio (AN).
A B
A B
17
10. Las muestras obtenidas se las conservaron en refrigeración (-80 °C) con 1 ml de
glicerol (Tovar, 2012).
3.3.1.3. Conservación de la bacteria
1. De las cajas Petri con las colonias de las bacterias aisladas y purificadas se tomó una
colonia con un mondadientes y se agregó en un tubo con caldo nutritivo (5ml) e
inmediatamente se agitaron en el vórtex, luego se la guardaron en la incubadora de
bacterias con la tapa semiabierta por 12 horas hasta observar turbidez.
2. Se agregaron 1 ml de glicerol al 87 % en el tubo con turbidez.
3. Con la micropipeta se tomaron 1 ml y se colocaron en 6 tubos de microcentrífuga y
se la conservó en refrigeración a -80 °C. (Vega, 2014).
3.3.1.4. Reactivación de la bacteria
1. La bacteria conservada fue reactivada al ambiente y luego agregada en caldo
nutritivo (5ml), por cada tubo de microcentrífuga de 1ml se agregaron en 5 ml de
caldo nutritivo.
2. Al tubo con caldo nutritivo y la bacteria se le agitaron en el vórtex hasta lograr una
mezcla homogénea, e incubar durante 12 a 24 horas, dependiendo de su turbidez.
3. Posteriormente, se sembraron 100 ml de la bacteria en cajas Petri con medio AN.
4. Se la incubaron a 28 ° C durante 12 horas.
3.3.1.5. Prueba de tinción de Gram
Según Isenberg (1992):
1. En una placa se colocó una gota del aislamiento de la bacteria de 18 horas de edad.
2. Se realizaron extendidos de la muestra sobre la placa porta objetos.
3. Se fijaron el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama del mechero de
Bunsen.
4. Se agregó el cristal de violeta por un minuto y se lavaron con agua destilada.
5. Se cubrieron con Lugol por un minuto y se lavó nuevamente con agua destilada.
6. Se lavaron con etanol al 95 % y abundante agua.
7. Se usó la acetona como decolorante por 5 segundos.
8. Al final se agregaron la safranina por un minuto y se lavaron con agua destilada
9. Se colocó las placas al microscopio óptico en el lente de 100x con una gota de aceite
al lente y se observó la placa.
10. Se comprobó el color rosa para bacterias Gram (-).
3.3.1.6. Prueba del citrato
1. Se preparó el medio con citrato de sodio, cloruro de sodio, fosfato dipotásico,
fosfato monoamónico, sulfato de magnesio, agar y azul de bromotimol en agua
destilada ajustando un pH de 6,9 y se autoclavó a 121 °C por 15 minutos.
2. Los tubos se colocaron en forma horizontal hasta que se enfriaron.
3. Se tomó una colonia pura de 24 horas de edad.
4. Se sembraron en forma de estría se inocula en la superficie del agar inclinado con
una sola estría en forma ascendente desde el pico.
5. Se incubaron a 35 °C durante 24 a 48 horas.
18
6. La prueba será positiva si producen un color azul oscuro y negativo si no hay cambio
de color.
3.3.1.7. Prueba oxidativo-fermentativo medio HUGH & LEIFSON
1. Se preparó un medio con triptona, extracto de levadura, purpura de bromocresol,
agar y agua destilada y se autoclavó a 121 °C por 15 minutos.
2. Se tomó una colonia pura de 24 horas de incubación.
3. Se inoculó la colonia por punción en dos tubos en la superficie con un asa flameada.
4. A un tubo se le cubre con parafina estéril 2 ml (condiciones de anaerobiosis) y al
otro tubo sin la parafina.
5. Se incubaron los dos tubos a 24 °C, de 48 a 72 horas.
6. Los dos tubos cambian de color verde a amarillo si son oxido-fermentativo, caso
contrario se mantiene el color verde característico del medio.
3.3.1.8. Prueba con KOH 3%
1. Se colocó en el porta objetos flameado una o dos gotas de KOH al 3 %.
2. Con un asa flameada se tomó una colonia de 24 horas de incubación.
3. Se procedió a hacer una mezcla con la solución.
4. La reacción es positiva si al levantar el asa con la solución bacteriana se forma un
hilo y la reacción negativa si no forma el hilo.
3.3.1.9. Prueba de la catalasa
1. En un porta objeto se colocó una colonia bacteriana de 24 horas de incubación con
un asa flameada.
2. Se colocó una gota de agua oxigenada de 1 – 3%
3. La reacción es positiva si se observó efervescencia en 10 segundos y la reacción es
negativa si la efervescencia demora más de 10 segundos.
3.3.1.10. Prueba de la oxidasa
1. Se colocó en una caja Petri, una lámina de oxidasa y se agregó una colonia incubada
por 24 horas.
2. Se esperó el cambio de color a rosado como reacción positiva y sin cambio de color
como reacción negativa (Coltran, 2014).
3.3.1.11. Prueba del indol
1. Se sembraron a las bacterias en tubos (8ml) con caldo triptonado, en el que se
añadieron de dos o tres colonias/inóculos que provinieron de un cultivo puro
usando un asa de siembra.
2. Los tubos inoculados se incubaron a 37 °C por 40 a 48 horas.
3. Luego se añadieron dos a tres gotas del reactivo de Kovacs.
4. Se agitaron lentamente y se dejó reposar.
5. Se presentó un cambio de color rojo como anillo siendo un resultado positivo y como
un resultado negativo sin cambio de color (Rodriguez , 2018).
3.3.2. Pruebas de patogenicidad
Esta parte del estudio se realizó en macetas con compost esterilizado para probar la
patogenicidad del inóculo en diferentes edades de desarrollo de la planta, con la
finalidad de determinar la etapa en la que la bacteria puede afectar al cultivo de maíz,
y mediante pruebas de identificación bioquímicas y molecular, determinar el género y
especie de la bacteria causante de la pudrición del tallo en maíz.
19
3.3.2.1. Pruebas de germinación y viabilidad de semillas de maíz INIAP-103 Mishqui
sara
3.3.2.1.1. Prueba de germinación
1. Se tomaron 100 semillas de maíz.
2. Las semillas fueron envueltas en papel absorbente para promover la germinación. Se
repartieron 50 semillas en cada segmento de papel.
3. El papel humedecido con las semillas fue colocado en la incubadora durante 8 días.
4. Se calculó el porcentaje de germinación en base a las semillas germinadas. Las semillas
que no germinaron fueron eliminadas.
3.3.2.1.2. Viabilidad de la semilla
1. Se tomaron 100 semillas de maíz y se colocó en remojo durante 24 horas.
2. Se cortaron con bisturí a todas las semillas en dos partes para observar el embrión.
3. En un vaso de precipitación se colocaron las semillas cortadas con tetrazolio al 5%.
4. Se incubaron a 28 °C durante 4 horas. Durante este tiempo se tiñó todo el embrión.
5. Se consideró como viable a cada semilla, la que muestre un color violeta en toda la zona
de emergencia, y no viable las que muestren un color opaco en esta zona.
3.3.2.2. Inóculo con la escala de McFarland
Realización de la escala McFarland:
1. Se tomó agua estéril en un tubo con 10 ml para hacer el blanco en el
espectrofotómetro.
2. Se agregaron en los cuatro tubos restantes, primero ácido sulfúrico (H2SO4) a 0,36
M y luego cloruro de bario (BaCl2) a 0,046M.
Cuadro 2. Concentración estimada de bacterias (células)/ml usadas como referencia en
esta investigación.
N° tubo BaCl2 0,046M Ml
H2SO4 0,36 M Ml
Volumen final ml
N° Células
0 0,05 9,95 10 1,5.108
1 0,1 9,9 10 3.108
2 0,2 9,8 10 6.108
3 0,3 9,7 10 9.108
4 0,4 9,6 10 12.108
Fuente: Caiza R, 2019
3. Se agregó cada volumen según los tubos hasta llegar a 10 ml.
4. Se midió la absorbancia en el espectrofotómetro de todos los tubos que se
prepararon para realizar la escala.
5. Se realizó la recta de calibración según la absorbancia de cada tubo.
6. Se usaron los tubos tres y cuatro para comparar la turbidez con el tubo a inocular
con la bacteria en agua A1 (Agua ultra pura) y se ajustaron a la turbidez deseada.
7. Se ajustó la turbidez en el turbidímetro de cada tubo con la bacteria (Ulloa, 2015).
Preparación del inóculo
Para la preparación del inoculo se usaron los tubos 3 y 4 (escala de McFarland), en los que se
realizó la curva de calibración, alcanzando una concentración de 10-8. Los tubos se prepararon
20
en 8 ml con agua A1 (Agua ultra pura) y mediante hisopos se agregaron colonias de bacterias de
24 horas de incubación, y mediante el turbidímetro se comprobó la turbidez exacta del inoculo
y además se comparó con los tubos de calibración, esta concentración produce patogenicidad a
la planta (Jiménez et al., 2007).
3.3.2.3. Tiempos de inoculación
La inoculación con los re-aislamientos obtenidos a partir del proceso de aislamiento primario e
identificación, se realizó bajo invernadero usando la variedad INIAP 103-Mishqui sara como
hospedero susceptible. Para el efecto, se usaron 10 macetas plásticas con un volumen de 8 litros;
con 2,25 lb de compost esterilizado en cada maceta; con 2 semillas de maíz por maceta (2
macetas para cada inoculación), y se procedió a inyectar 2 ml de la solución en agua A1 (Agua
ultra pura) (8ml) junto con la bacteria de acuerdo a los tubos en la escala Mcfarland 3 y 4 (10-8),
y se inocularon dos macetas a partir de la siembra y luego cada 15 días hasta los 60 días después
de la siembra (Anexo 4A y 4B), para un total de 5 inoculaciones.
3.3.2.3.1. Inoculación a la semilla
Material vegetal: Dos macetas, con 2,25 lb de compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin
desinfectarlas) por maceta.
Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C, 15 PSI de seis a ocho horas.
Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, se observó turbidez y
se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN, y se la incubó por 12 horas a temperatura
ambiente. Al observar colonias típicas del género estudiado se agregaron en agua A1 hasta llegar
a la absorbancia indicada mediante el turbidímetro. Para la inoculación se inyectaron 2 ml a la
semilla (2 semillas por maceta con compost estéril) de maíz previo al remojo por 12 horas.
3.3.2.3.2. Inoculación al tallo
Las siguientes inoculaciones se llevaron a cabo a los 15-30-45-60 días después de la siembra:
Material vegetal: plantas de maíz de edades con 15-30-45-60 días después de la siembra, con
1,2 kg de compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin desinfectarlas) por maceta.
Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C de seis a ocho horas.
Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, inmediatamente se
observó turbidez y se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN y se la incubó por 12
horas. Al observar colonias se tomaron y agregaron en agua A1 hasta llegar a la absorbancia
Figura 7. Método de inoculación de la bacteria en la semilla.
Fuente: Caiza R, 2019
Las semillas usadas en la investigación contaron con una tasa de germinación del 100 %, la humedad y temperatura del compost son factores determinantes en la germinación, y el desarrollo en este caso en un invernadero las temperaturas mínimas son 10 – 12 °C y máximas de 30 °C, temperaturas de 12 a 28 °C y la humedad de 60 %, son ideales en la germinación de las semillas (NOVAGRIC, 2015), por esta razón a esta inoculación no estuvieron cubiertas con fundas de polifán como a los otros tratamientos.
3.3.2.3.3. Inoculación al tallo
Las siguientes inoculaciones se llevaron a cabo a los 15-30-45-60 días después de la siembra:
21
Material vegetal: plantas de maíz de 15-30-45-60 días después de la siembra, con 2,25 lb de
compost esterilizado y dos semillas de maíz (sin desinfectarlas) por maceta.
Sustrato: Compost esterilizado en vapor húmedo a 121 °C, 15 PSI de seis a ocho horas.
Procedimiento: se reactivó la bacteria en caldo nutritivo y a las 24 horas, inmediatamente se
observó turbidez y se procedió a sembrar en cajas Petri con medio AN y se la incubó por 12
horas. Al observar colonias se tomaron y agregaron en agua A1 hasta llegar a la absorbancia
indicada mediante el turbidímetro. Para la inoculación se inyectaron 2 ml a la base del tallo (2
plantas por maceta con compost estéril) y se cubrieron con una fundan de polifán para simular
una cámara húmeda.
Figura 8. Método de inoculación de la bacteria al tallo
Fuente: Caiza R, 2019
3.3.3. Evaluación de plantas inoculadas
3.3.3.1. Presencia o ausencia de la enfermedad
Las plantas fueron consideradas sanas o enfermas de acuerdo a la presencia de la enfermedad
en los diferentes órganos vegetativos de la planta. En este caso se observaron los síntomas sobre
hojas de maíz y tallo principalmente, y esto dependerán de las distintas fechas de inoculación
en las plantas de maíz (0, 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra).
3.3.3.2. Escala de la enfermedad
De acuerdo a Castaño & Del Rio (1993), la escala consistió en una descripción numérica y verbal
de las clases o categorías que se distinguen. Para enfermedades se ha descrito una escala
general, donde:
1= síntomas muy leves en hojas; afectando el 1 % del área foliar.
3= síntomas cubriendo el 10 % del área foliar.
7= síntoma cubriendo el 25 % del área foliar.
9= síntomas cubriendo 50 % del área foliar.
22
3.3.3.3. Descripción de síntomas
En las plantas de maíz el síntoma característico que permitieron identificar es la presencia de
hojas con manchas acuosas, donde generalmente las hojas del cogollo se marchitan y se
desprenden fácilmente (Figura 9).
Figura 9. A) Manchas acuosas B) Desprendimiento de las hojas
Fuente: Caiza R, 2019
Al momento de hacer un corte longitudinal del tallo enfermo se observó una pudrición con un
borde pardo oscuro, y un olor característico de la presencia de la bacteria (Figura 10).
Figura 10. Pudrición bacteriana de tallo.
Fuente: Caiza R, 2019
3.3.4. Re-aislamiento bacteriano
El re-aislamiento bacteriano a partir de la semilla y del tallo se realizaron bajo condiciones asépticas, en la que se extrajo a la plántula completa (Figura 17B), y se llevó la muestra al Laboratorio de Fitopatología de Agrocalidad en Tumbaco-Pichincha. El re-aislamiento se lo realizó en cajas Petri con agar nutriente incubado a 30 °C por 24 horas, siguiendo la misma metodología propuesta para el aislamiento primario. Inicialmente, para la identificación de la bacteria con un cultivo puro se realizó una tinción de Gram y la prueba del indol que es más específica para la identificación del género Pantoea. Adicionalmente, los aislamientos obtenidos fueron identificados mediante la prueba bioquímica BIOLOG.
3.3.5. Identificación con BIOLOG
La identificación bioquímica mediante el sistema BIOLOG, se la llevó a cabo siguiendo la metodología propuesta por BIOLOG (2011), misma que se describe a continuación:
A B
23
Aislar y obtener un cultivo puro de la bacteria en medio Agar Nutriente.
Preparar el inóculo con la bacteria a la densidad celular específica, mediante espectrofotometría (9 X 108).
Sembrar la bacteria en las microplacas de BIOLOG.
Incubar la placa, observar e ingresar el patrón de reacción para obtener el resultado de la identificación.
Figura 11. Pasos para la identificación bioquímica con el sistema BIOLOG. Fuente: Caiza R, 2019
3.3.6. Capacidad enzimática
La capacidad enzimática de las bacterias re-aisladas, se verificaron en rodajas de tubérculos de papa y cebolla a concentraciones de 10-8 (Huerta et al., 2016). Estos ensayos se realizaron en cámara húmeda 24 °C durante 14 días. Esta variable se evaluó mediante la presencia o ausencia de la pudrición en las rodajas.
3.3.7. Identificación molecular
Los análisis que se detallan a continuación, se llevaron a cabo en el laboratorio de Fitopatología
y en Biología Molecular de Agrocalidad en Tumbaco-Pichincha, a excepción de la secuenciación
que fue realizada en la empresa Macrogen en Corea del Sur.
1. Extracción de ADN
Se obtuvieron aislados bacterianos puros de Pantoea agglomerans tanto del aislamiento inicial,
como del aislamiento para las pruebas de patogenicidad de cada aislamiento. Los aislamientos
fueron reactivados en tubos de ensayo con 5 ml de caldo nutritivo (agua peptonada y extracto
de carne), y fueron colocados en tubos de microcentrífuga de 2 ml de volumen con un duplicado
por cada tubo. Posteriormente, cada tubo fue centrifugado a 14000 rpm durante 10 minutos, y
se eliminó el sobrenadante cuidadosamente hasta quedarse con el precipitado (pellet
bacteriano).
24
El pellet bacteriano, fue lavado con 0,5 ml de agua estéril, luego vuelto a centrifugar a 1,700 x g
(5000 rpm) por 3 minutos. Se procedieron a eliminar con cuidado y desechar el sobrenadante,
añadiendo 100 μl de QuickExtract Bacterial, solución de extracción de ADN al sedimento celular.
Se agregaron 1 μl de solución de lisozima Ready-Lyse a cada tubo, y se mezcló suavemente por
inversión. Se aseguró de que tanto la bacteria como la Lisozima Ready-Lyse estén dispersas en
la solución. Se incubó la suspensión a temperatura ambiente durante 15 minutos. La digestión
puede extenderse a varias horas si es necesario y el ADN ya está listo para la PCR.
2. Reacción de amplificación
Para la identificación molecular se ocuparon dos cebadores universales para bacterias
(F27/R1492), amplificando los fragmentos del gen 16S RNAr (Morales-Valenzuela et al., 2007).
Cuadro 3. Primer usados para la identificación bacteriana en esta investigación.
Primer Secuencia Temperatura (Tm*)
Especificidad
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
55°C Bacteria
1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT Universal
Tm*(Temperatura de melting del cebador). Temperatura óptima PCR
Fuente: Caiza R, 2019
La amplificación se realizó empleando 2 μl de ADN genómico + 48 μl PCR mix (primer 27F/1492R,
buffer PCR, MgCl2, dNTP´S, enzima Taq Platinum) con un volumen final 50 μl. El ciclo térmico
para la mezcla fue sometida a una desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min y 35 ciclos con
1 min de desnaturalización a 94 °C; 1 min de hibridización a 55 °C y extensión a 72 °C durante
1.30 min. Se realizó una extensión final a 72 °C durante 8 min. Los productos de PCR se dejaron
refrigerar a 4 °C durante 5 min.
Los productos de amplificación fueron observados mediante electroforesis en gel de agarosa al
2 % en buffer TBE 0.5X, al que se añadió 3 µL de Promega Diamond™ Nucleic Acid Dye para
colorear los amplicones y así observar el tiempo de corrida. Este gel se colocó en una cámara de
electroforesis BIO-RAD hasta su gelificación. Los marcadores de peso molecular fueron de 4 µL
de Invitrogen Low DNA Mass Ladder más 1 µL de buffer de carga Invitrogen™ BlueJuice™ Gel
Loading Buffer (10X). Inmediatamente se prepararon los controles con 4 µL del producto de PCR
o del control más 1 µL de buffer de carga y las muestras. La corrida del gel se programó a 100 V
durante 30 minutos, después las bandas resultantes se visualizaron en un transiluminador
modelo DR-46B.
3. Secuenciación y análisis bioinformático de secuencias
Los productos obtenidos de la PCR, se enviaron a secuenciar en la empresa Macrogen en Corea
del Sur mediante el método Sanger por electroforesis capilar. Las secuencias que se obtuvieron
fueron editadas en el programa BioEdit (Biological sequence alignment editor), en el cual se
eliminaron gaps y compararon con secuencias referencia para dar confiabilidad al alineamiento.
Las secuencias editadas se compararon contra secuencias obtenidas de la base de datos
GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) mediante la herramienta
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), donde se seleccionaron las identificaciones con
porcentajes de identidad aproximados al 100 %.
25
Para las relaciones filogenéticas entre las secuencias de esta investigación y las secuencias
obtenidas de los aislamientos a partir de GenBank, se empleó el software MEGA versión 10.0.5,
utilizando para ello el método “Maximum Likelihood”. El árbol obtenido corresponde a una
comparación con el árbol de filogenia de especies de Pantoea (Brady et al., 2008).
26
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Aislamiento primario y purificación
En esta investigación se obtuvo un total de 10 aislamientos bacterianos, mismos que fueron
colectados de muestras de maíz que mostraban marchitamiento y pudrición bacteriana de tallo
(Figura 12) en Tumbaco, Pifo, Puembo y Checa. En Tumbaco se obtuvo 3 aislamientos, en Pifo
se obtuvo 2 aislamientos, en Puembo se obtuvo 3 aislamientos y en Checa se obtuvo 2
aislamientos. En el medio de cultivo agar nutritivo, las colonias bacterianas se seleccionaron con
base a su pigmentación (amarilla) y forma completa y redonda (Ruíz et al., 2018).
Figura 12. A) Marchitamiento de maíz observado en campo. B y C) Pudrición bacteriana de
tallo. Fuente: Caiza, 2019
En este estudio, las colonias con pigmentación amarilla (Figura 13) fueron seleccionadas como
un posible agente causal de la pudrición bacteriana del tallo y hojas del maíz. Según Mallaupoma
(2007) y Ruíz et al. (2018), mencionan que esta apariencia fenotípica de la bacteria podría estar
asociada al género Pantoea. Por esta razón, en esta investigación esta bacteria fue seleccionada
para ser sometida a pruebas patogénicas, bioquímicas y moleculares para probar su identidad y
patogenicidad.
Figura 13. Colonias bacterianas con pigmentación amarilla en medio AN.
Fuente: Caiza, 2019
4.2. Identificación bioquímica de Pantoea agglomerans
Una vez obtenidas colonias puras de la bacteria, se realizaron pruebas bioquímicas y fisiológicas para Pantoea agglomerans, los resultados se describen a continuación:
B
A C
27
4.2.1. Características bioquímicas
Los aislamientos bacterianos seleccionados resultaron ser Gram negativos (Figura 14), bacilares perítricos (Algoria, 2002) , hidróxido de potasio (KOH) positivo (+), catalasa positivo (+), citrato negativo (-), oxido fermentativo positivo (+), respiración aerobia positiva (+), y principalmente indol negativa (-), tal como lo menciona Jiménez et al. (2007) para Pantoea (Cuadro 4).
Figura 14: Vista microscópica (100X) de Pantoea agglomerans.
Fuente: Caiza, 2019
Pantoea agglomerans pertenece a la familia Enterobacteriaceae dando como resultado bacterias Gram negativas, catalasa con reacción positiva, citrato negativo, el hidróxido de potasio y oxidasa negativo (Algoria, 2002). La reacción fermentativa que produce la bacteria es un rápido cambio de color a amarillo que coincide con lo señalado para la bacteria por Jiménez et al. (2007), y a su metabolismo anaerobio facultativo. La prueba del indol genera una reacción negativa indicando una especificidad para la especie P. agglomerans y diferenciándolo de la especie Pantoea ananatis que muestra una reacción positiva (halo rosado), como lo menciona Gutierrez-Barranquero et al. (2011). Cuadro 4. Pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de Pantoea agglomerans.
Fuente: Caiza, 2019
4.3. Identificación bioquímica en BIOLOG
Las bacterias aisladas en medio agar nutriente y procesadas en el sistema de identificación de
bacterias BIOLOG son: Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Serratia, Hafnia alvei,
Enterobacter amnigenus, Pantoea dispersa y Pantoea agglomerans. Es importante mencionar
Prueba Bioquímica Medio o reactivo empleado
Reacción Observaciones Referencia
Tinción de Gram Cristal violeta, Lugol, alcohol 96% y safranina
- Gram negativa. Jiménez et al., 2007
Hidróxido de potasio
Agua oxigenada + Formación de hilo. Jiménez et al., 2007
Catalasa Peróxido de hidrogeno + Presencia de burbujas. Jiménez et al., 2007
Oxidasa Disco de papel en oxalato de para- aminodimetilanilina
- No presencia del citocromo C (Enterobacteriaceae).
Jiménez et al., 2007
Citrato Agar Citrato de Simmons - No cambio la coloración de verde a azul.
HUGH & LEIFSON Glucosa + Cambio de color a amarillo. (Anaerobio facultativo),
Jiménez et al., 2007
Indol Reactivo de Kovacs - No formación de anillo rojo en el caldo de triptona.
Jiménez et al., 2007
28
que las características bioquímicas de Klebsiella oxytoca, Serratia, Hafnia alvei, Enterobacter
amnigenus, y el género Pantoea son similares ya que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
siendo todas ellas Gram negativas (León & Sernaqué, 2014).
Sin embargo, consistentemente en todos los aislamientos el sistema BIOLOG detectó reducción de carbohidratos como la sacarosa, manosa, maltosa, arabinosa y glucosa, y negativo en melibiosa. Jiménez et al. (2007), mencionan que el género Pantoea tiene una alta capacidad enzimática para degradar los carbohidratos antes mencionados, sugiriendo una buena probabilidad de identificación de la bacteria cuando la probabilidad en BIOLOG supere el 0.5 (Cuadro 5). De acuerdo a BIOLOG (2011), para concluir sobre la identidad de una bacteria debe superar 0.5, por lo que se asume que la identidad bioquímica de la bacteria causante de la pudrición del tallo es Pantoea agglomerans. Entre todas las enterobacterias obtenidas, los géneros Klebsiella, Serratia, Hafnia y Enterobacter
son encontradas en la rizósfera del suelo de un cultivo de maíz actuando como promotores del
crecimiento y rendimiento en plantas; en este caso no son consideradas como fitopatógenas en
el cultivo de maíz (León & Sernaqué, 2014). Además, Pantoea dispersa está siendo usada como
agente en el control biológico de bacterias y hongos fitopatógenos de acuerdo a lo que
menciona Fernández et al., (2008); en este caso para el cultivo de maíz no se ha reportado como
fitopatógeno. Por otro lado, Ruiz, (2018) en contraposición con lo mencionado anteriormente,
indica que P. agglomerans actúa como un nuevo agente fitopatógeno en el cultivo de maíz en
México, sin embargo, no se han registrado pérdidas económicas sustanciales.
Cuadro 5. Resultados del análisis de identificación mediante el sistema BIOLOG.
Códigos Probabilidad Tipo de Organismo
Especie
FP-19-0070 0,653 GN- Ent* Pantoea agglomerans
FP-19-0071 0,617 GN- Ent* Pantoea agglomerans
FP-19-0072 0,697 GN- Ent* Pantoea agglomerans
*GN: Gram Negativa, Ent: enterobacteria Fuente: Caiza R, 2019
4.4. Identificación molecular de la bacteria
Una vez obtenido el resultado del análisis bioquímico mediante BIOLOG, los aislamientos
fueron sometidos a identificación molecular para confirmar su identidad molecular. Por ello,
el contenido total de material genético de los aislados bacterianos en el NanoDrop reportó
que el 100 % de las muestras de ADN presentaron altas concentraciones, obteniéndose
buena calidad del material genético con una longitud de onda de 280 nm y la pureza de las
muestras con una relación de absorbancias de A260/280, considerándose un ADN de pureza
óptima con los que arrojan resultados entre 1,9 (Anexo 5).
Los resultados de la PCR para amplificar el gen 16S-RNAr, sugirieron que los amplicones
obtenidos de los aislamientos identificados bioquímicamente por BIOLOG como Pantoea
agglomerans, generaron fragmentos con un tamaño de aproximadamente 1400 pb para la
secuencia del gen en estudio (Figura 15); lo que está de acuerdo con los resultados
obtenidos por Frank et al. (2008), quienes mencionan que el uso de estos cebadores
universales originó bandas de aproximadamente 1400 bp.
29
Figura 15. Perfil de amplificación de Pantoea agglomerans obtenidos de la secuencia RNAr
16S; donde; 1 es el marcador de peso molecular, 2 es el control positivo, 3 es el aislamiento
inicial FP-19-0071 AI, 4 es el aislamiento postulados FP-19-0071 POST, y 5 es el control
negativo del gel de agarosa (agua).
Análisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool)
Una vez secuenciados los productos de PCR mediante la metodología de electroforesis
capilar, las secuencias del gen 16S RNAr fueron editadas y ensambladas para obtener una
secuencia consenso, misma que fue sometida a comparación genética con la base de datos
de GenBank. En este sentido, los aislamientos FP-19-0071 (425) AI y FP-19-0071 (426) POST,
tuvieron un alto porcentaje de homología del 97,97 % y 99,69 %, respectivamente con
Pantoea agglomerans (Número de accesión: NR_111998). Las muestras analizadas con
referencia a la información depositada en GenBank, tuvieron un alto porcentaje de identidad
correspondiente a la especie en estudio, por tal motivo con las pruebas de bioquímicas,
patogenicidad y moleculares, concuerdan que la identidad genética y bioquímica es Pantoea
agglomerans.
Análisis filogenético
La relación filogenética de las secuencias consenso de P. agglomerans obtenidas en esta
investigación, se realizó mediante la construcción de un árbol de filogenético mediante el
algoritmo “Maximum Likelihood”, incluyendo para ello las especies de Pantoea propuestas
por Brady et al. (2008).
Las relaciones filogenéticas agruparon consistentemente en un solo clado a los aislamientos
de P. agglomerans obtenidos en esta investigación, con los aislamientos de P. agglomerans
identificados y registrados en países como Venezuela (Número de accesión: KJ650323),
Colombia (Número de accesión: KY938144) y China (Número de accesión: DQ133596) (Figura
11). Adicionalmente, la topología del árbol propuesto por Brady et al. (2008), estuvo acorde
al árbol obtenido en este estudio donde el agrupamiento tomó en cuenta especies de
bacterias representativas de la familia Enterobacteriaceae, tomando a Escherichia coli como
el género fuera de grupo (outgroup); además, de géneros como Erwinia, Enterobacter,
Tatumella ptyseos y Enterobacter nimipressuralis, que se encontraron filogenéticamente
emparentados al género Pantoea. Brenner et al. (1986), indican que Enterobacter
nimipressuralis o Enterobacter agglomerans es la especie más cercana genéticamente a
Pantoea agglomerans, tal como se observó en esta investigación, con un porcentaje de
250 pb
2000 pb
30
relacionamiento del 66 % con respecto a los aislamientos de P. agglomerans identificados en
este estudio.
De acuerdo a los resultados obtenidos, para nuestro conocimiento este es el primer estudio
que identifica y describe bioquímica, patogénica y molecularmente a Pantoea agglomerans
como el agente causal de la pudrición de tallo del maíz en Pichincha-Ecuador.
Figura 16. Árbol filogenético derivado de las secuencias del gen 16S-RNAr, construido mediante el
algoritmo “Maximun Likelihood” diseñado para la especie Pantoea agglomerans. Los codones
estuvieron basados en el alineamiento MUSCLE del programa MEGA 10.0.5. Los valores de bootstrap
con más de 50 % son fiables, están mostrados frente a cada rama del árbol. Los números de
accesiones de referencia están indicadas entre paréntesis. Los puntos negros indican las secuencias
de los aislamientos estudiados en esta investigación.
31
4.5. Pruebas de patogenicidad
4.5.1. Germinación y viabilidad de las semillas de maíz
Para el desarrollo de la fase de invernadero con las inoculaciones se hizo necesario saber si la semilla a utilizar estaba sana, por ello el uso de pruebas de germinación fueron necesarias para garantizar la inoculación en semilla libre de patógenos. Los resultados indicaron un 89 % de germinación, y un 11 % que no germinó por problemas internos de la semilla (Cuadro 6). Es importante mencionar que no se observaron daños en la semilla por causa de algún patógeno que se transmita por semilla.
Cuadro 6. Porcentaje de semillas germinadas usadas para las pruebas de patogenicidad.
N° Semillas total
7 días
14 días % Total
N° Dañadas
N° Germinadas
N° Dañadas
N° Germinadas
% Germinación 100 7 93 4 89 89
Fuente: Caiza, 2019 Adicionalmente, las semillas fueron mantenidas en la incubadora por 14 días más, para observar a los 7 y 14 días la germinación el sistema radicular de la semilla y así asegurar la germinación y establecimiento de todas las semillas de maíz en estudio (Cuadro 7). El resultado indicó que el 87 % de las semillas fueron teñidas obteniendo un color rosado, asegurando que la radícula y el hipocotilo están bien formados, por lo que se espera un buen porcentaje de efectividad al momento de la siembra y el establecimiento de las semillas, previo a la inoculación de la bacteria. Cuadro 7. Porcentaje de semillas viables de maíz
N° Semillas total
Semillas teñidas Semillas no teñidas
% Total
% Viabilidad 100 87 13 87
Fuente: Caiza, 2019 Curva de calibración del inóculo En el Anexo 2 y 3, se observa la recta de calibración obtenida para ajustar la concentración del inóculo inicial a las escalas 3 (9 x 10-8) y 4 (12 x 10-8) de McFarland. En todos los tiempos de inoculación (0, 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra), la concentración del inoculo estuvo ajustada a la función de regresión lineal con un coeficiente de determinación (R2) de 1. Cabeza (2013), menciona que, para asegurar una correcta inoculación de bacterias fitopatógenas en semilla y tallo, las concentraciones usadas del inóculo deben estar calibradas (R2>0,98) con la función lineal obtenidas en el espectrofotómetro. Adicionalmente, el mismo autor indica que Pantoea agglomerans puede estar presente en la semilla, siendo este un potencial agente de diseminación de la enfermedad. En nuestra investigación, las concentraciones obtenidas del inóculo fueron comparados con las concentraciones stock de la escala de McFarland, haciendo el uso del turbidímetro (Ulloa, 2015), donde se observó que la absorbancia entre ambas concentraciones fue muy similar, quedando dentro de los límites de la absorbancia 3 y 4.
Patogenicidad de Pantoea agglomerans en semilla
De manera general, de las 4 semillas sembradas (100 % germinación) e inoculadas con la bacteria, solo se presentó la sintomatología típica de la enfermedad (marchitamiento bacteriano en los primordios foliares) en una de ellas a los 14 días después de la siembra (Figura 17A). Por otro lado, en las 3 semillas restantes que llegaron a emerger y formar planta, en una de ellas se
32
mostró una pudrición bacteriana en la panoja a los 60 días después de la siembra(Figura 18), indicando que esta bacteria daña vascularmente a la planta afectando sus puntos de crecimiento, causando algún tipo de marchitamiento bacteriano (Figura 17B). Mezzalama (2016), menciona que P. agglomerans en la semilla de maíz es de menor importancia, sin embargo, Ruíz et al. (2018), mencionan que la misma bacteria puede causar síntomas iniciales en las hojas jóvenes en forma de manchas verdes acuosas inclusive marchitamiento. En nuestra investigación se evidenció que, la semilla germinada e inoculada en comparación de los testigos absolutos (sin inoculación) (Figura 17C), fue más pequeña y sin mucho vigor conforme pasaron los días, llegando a alcanzar un marchitamiento total a los 14 días después de la siembra. Las bacterias re-aisladas de las plántulas afectadas, fueron sometidas a identificación bioquímica mediante BIOLOG, para confirmar su asociación con la enfermedad.
Figura 17. A) Plántula con sintomatología de pudrición bacteriana. B) Plántula extraída para
prueba de identificación BIOLOG; C) Testigos sin inoculación. Fuente: Caiza, 2019
Figura 18. Pudrición bacteriana en la panoja después de 60 días de inoculación.
Fuente: Caiza, 2019
Patogenicidad de Pantoea agglomerans en tallo
La inoculación en tallo a los 15, 30, 45 y 60 días después de la siembra, indicó una alta patogenicidad de la bacteria, originando síntomas tales como manchas acuosas, marchitamiento de hojas (Figura 14A) y pudrición de tallo (Figura 14B), a los 8, 14 y 35 días en promedio después de la inoculación, respectivamente. Cabe mencionar que los síntomas antes descritos en esta investigación, están acorde con la descripción de la enfermedad en maíz propuesta por Ruíz et al. (2018), quienes sugieren que los síntomas iniciales de la enfermedad
A B C
33
provocadas por Pantoea agglomerans se presentan como manchas acuosas verdes (Figura 13C), seguida de un marchitamiento severo de hojas y por ende de la planta. Ruíz et al. (2018), en su estudio el desarrollo de los síntomas se presenta en hojas durante el crecimiento vegetativo (Figura 19A), mencionando que la etapa Vn (Desarrollo vegetativo) fue la más afectada, por lo tanto es necesario correlacionar el efecto de la enfermedad con el crecimiento de la planta y por lo tanto en el rendimiento del cultivo; con respecto a este estudio el desarrollo vegetativo se vio afectado en cada inoculación aproximadamente después de 8 días (Figura 20), demostrándose que lo sugerido es correcto con respecto a la investigación.
Figura 19. A) Hojas con presencia de marchitamiento bacteriano; B) Tallo con presencia de
pudrición bacteriana; C) Manchas acuosas en plantas inoculadas. Fuente: Caiza, 2019
Figura 20. Avance de la enfermedad manchas acuosas en 20 días después de la inoculación.
Fuente: Caiza, 2019
El marchitamiento vascular generado en todas las inoculaciones realizadas al tallo muestran un gran parecido a lo que mencionan, Morales-Valenzuela et al. (2007) en su primer reporte de Pantoea agglomerans, en una parcela de experimento donde se observaron síntomas de marchitamientos de hojas y marchitamiento vascular, generado por el agente causal de la familia Enterobacteriaceae que presentan un sistema de secreción tipo III con la capacidad de exportar proteínas involucradas en el proceso de colonización donde los espacios intercelulares de los tejidos vegetales causan la muerte. Según Barash & Manulis-Sasson (2007), reportan que los expolisacáridos (EPS) producidos por la bacteria en ambientes significativamente diferentes
A
B C
34
en términos de temperatura y humedad producen síntomas como putrescencia y esto es debido a enfermedades bacterianas del maíz generando una preocupación mundial.
4.3.4. Re-aislamiento bacteriano En medio de cultivo agar nutritivo (AN), se realizó el re-aislamiento bacteriano de los órganos de la planta que mostraron síntomas típicos de la enfermedad, provenientes de las pruebas de patogenicidad. En este sentido, en todos los aislamientos se obtuvieron colonias de color amarillo, de forma redonda tal como lo menciona Jiménez et al. (2007), quienes indican que esta fenología es típica del género Pantoea (Figura 21). Además, las colonias con pigmentación amarilla de 24 horas de incubación fueron identificados también en semillas mostrándonos algo específico de la bacteria en estudio ya sea por morfología y pigmentación como lo describe Membreño et al. (2016).
Figura 21. Colonias amarillas obtenidas en AN de re aislamientos en caja Petri. Fuente: Caiza, 2019
4.3.4.1. Identificación bioquímica de los re-aislamientos mediante BIOLOG
Para corroborar la identidad todos los re-aislamientos obtenidos de las pruebas de patogenicidad, estos fueron sometidos a identificación bioquímica mediante BIOLOG (Cuadro 8). De esta manera, la identidad bioquímica de todos aislamientos nuevamente fue Pantoea agglomerans con una probabilidad de acierto del género y especie identificado, que fluctuó desde 0.522 hasta 0.703. De acuerdo a BIOLOG (2011), para aceptar como positivo un resultado de identificación la probabilidad de acierto debe ser superior a 0.5; inclusive esta probabilidad puede incrementar si el período de incubación de la bacteria en las microplacas es mayor. Según Membreño et al. (2016), mencionan que la identificación con el sistema BIOLOG indica resultados de género y especie de los agentes causales de enfermedades con una alta especificidad, inclusive relacionándolo con los resultados encontrados por el análisis molecular mediante el estudio de la filogenia de las bacterias.
35
Cuadro 8. Probabilidad de acierto mediante el sistema de identificación bioquímica BIOLOG.
Inoculación Órgano afectado
Probabilidad de acierto
Tipo de organismo Especie
Semilla
Plántula A 0.660 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 9)
Plántula B 0.682 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 10)
Plántula C 0.653 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 11)
Tallo (15 días)
Tallo 0,522 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 12)
Tallo (30 días)
Tallo 0,667 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 13)
Tallo (45 días)
Tallo 0,703 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 14)
Tallo (60 días)
Tallo 0,694 GN-Ent* Pantoea agglomerans (Anexo 15)
*GN-Ent= Gran Negativa- Enterobacter Fuente: Caiza R, (2019)
4.3.5. Actividad enzimática
4.3.5.1. En rodajas de papa (Solanum tuberosum)
Los resultados indicaron que Pantoea agglomerans no tiene la capacidad enzimática de producir
celulasas y pectinasas para degradar al tubérculo de papa (Figura 22). Estos resultados
concuerdan con los alcanzados por Jiménez et al. (2007), quienes indican que Pantoea
agglomerans (sin. Enterobacter agglomerans o Erwinia herbicola), no tiene la capacidad de
degradar tubérculos de papa. En este sentido, se podría enzimáticamente separar de Erwinia
carotovora ya que esta bacteria si tiene estas propiedades de lisis del tubérculo de papa,
produciendo enzimas pectolíticas y celulolíticas las cuales provocan maceración de los tejidos
conocido como podedumbre (Kunstmann, 2004).
Figura 22. A) Testigo inoculado con agua (8 días después de la inoculación); B) Tubérculo
inoculado con P. agglomerans (8 días después de la inoculación). Fuente: Caiza, 2019
A B
36
4.3.5.2. En cebolla (Allium cepa)
La actividad enzimática de Pantoea agglomerans fue positiva sobre los segmentos de cebolla, es decir, que se observó degradación de los tejidos en la zona de inoculación (Figura 23A y 23B). Por otro lado, en el testigo no se observó ningún tipo de pudrición. Esta bacteria produce proteínas nucleadoras de hielo con un factor de virulencia inusual, donde la formación de cristales de hielo en tejidos blandos a temperaturas superiores a las normales, facilitan la producción de heridas y la entrada del patógeno que induce la muerte celular (Cazorla, 1996).
La patogenicidad y desarrollo de la enfermedad se da por los genes presentes en el sistema de secreción tipo III generando susceptibilidad, activándose la hipersensibilidad que provoca una muerte celular programada, con un colapso celular masivo y una necrosis debido a la alta concentración del inóculo, donde esta reacción tiene un efecto de restringir la multiplicación del patógeno y así mostrarse un progreso de la enfermedad (Pérez-Terrón et al., 2012). Gutierrez-Barranquero et al. (2011), mencionan que la producción de síntomas se da a los 14
días a 28 °C tanto para aislamientos de P. agglomerans y P. ananatis, que producen síntomas
similares en cebolla y de acuerdo a lo observado la prueba de patogenicidad se tuvo un
resultado positivo en cebolla comprobándose la presencia de la bacteria.
Figura 23. A) y B) Segmentos de cebolla inoculada con P. agglomerans; C) Testigo absoluto
inoculado con agua destilada. Fuente: Caiza, 2019
A B C
37
5. CONCLUSIONES
La caracterización bioquímica permitió determinar que las bacterias asociadas a
la pudrición de tallo y marchitamiento de hojas del maíz pertenecen a la familia
Enterobacteriacea. Mediante la prueba negativa del Indol se identificó que el
género bacteriano con mayor presencia en este estudio fue Pantoea spp.
Además, mediante el sistema BIOLOG (prueba bioquímica de alta especificidad),
se confirmó la identidad bioquímica de la bacteria como Pantoea agglomerans.
Los análisis moleculares del gen 16S RNAr confirmaron que el género y especie
bacteriana asociada a la pudrición del tallo del maíz y marchitamiento de hojas
en maíz es causada por Pantoea agglomerans.
Las pruebas de patogenicidad con la bacteria Pantoea agglomerans en la
variedad INIAP 103 Mishqui sara, ayudaron a dilucidar la asociación vascular del
agente causal de la pudrición del tallo y marchitamiento de hojas del maíz.
Los resultados obtenidos en esta investigación sugieren por primera vez en
Ecuador, que el agente causal de la pudrición del tallo y marchitamiento de hojas
en la variedad de maíz INIAP 103 Mishqui sara, es causado por Pantoea
agglomerans.
38
6. RECOMENDACIONES
Ampliar la caracterización molecular del agente causal para definir la posible
existencia de razas especiales de Pantoea agglomerans.
Para las pruebas de patogenicidad en invernadero, realizar una curva de
calibración con concentraciones estándar que nos permita establecer en
concreto la concentración del inóculo que asegure la replicación de los síntomas
en las plantas.
Con el método de inoculación definido en esta investigación, realizar ensayos de eficacia a nivel de invernadero con posibles bactericidas de espectro específico para el control de Pantoea agglomerans en maíz y otros cultivos.
39
7. BIBLIOGRAFÍA Acosta, R. (2009). Redalyn, El cultivo de maiz, su origen y clasificacion, el maiz en Cuba. Habana,
Cuba: Cultivos Tropicales, vol.30, nume. 2, 2009. Obtenido de Redalyn, El cultivo de
maiz, su origen y clasificacion, el maiz en Cuba:
http://www.redalyc.org/pdf/1932/193215047017.pdf
Agrios, G. (2005). Fitopatología. México.
Algoria, G. (2002). BACILOS GRAM NEGATIVOS NO EXIGENTES ENTEROBACTERIACEAE,
VIBRIONACEAE, PSEUDOMONAS.
Alvarez, A., & Sánchez, G. (Diciembre de 2003). ICA, EVALUACIÓN DE DAÑOS CAUSADOS POR
Spodoptera frugiperda (J.E.SMITH). Obtenido de ICA, EVALUACIÓN DE DAÑOS
CAUSADOS POR Spodoptera frugiperda (J.E.SMITH):
https://www.ica.gov.co/getattachment/9f5f1694-d031-49f4-bac1-
f88d55b91ace/Publicacion-7.aspx
Andrade, L. G. (2014). ANÁLISIS DE LA COMERCIALIZACIÓN DE LA CADENA AGROINDUSTRIAL DEL
MAÍZ (Zea mays) EN LA REGIÓN 4 PROVINCIA DE MANABÍ EN EL PERIÓDO 2008-2012.
Guayaquil-Ecuador.
Angulo, J. (12 de Marzo de 2000). Manejo del gusano cogollero del maíz utilizando extractos de
plantas. Obtenido de Manejo del gusano cogollero del maíz utilizando extractos de
plantas: http//www.turipana.org
Arora, D. (2004). Fungal Biotechnology in Agricultural, Food, and Environmental Applications.
Nueva York, Estados Unido: Marcel Dekker.
Barash, I., & Manulis-Sasson, S. (2007). Mecanismos de virulencia y especificidad del hospedador
de Pantoea agglomerans formando agallas. NCBI.
BD. (2005). Patrón de turbidez BBL preparado.
Bertorelli, M., & Rengifo, R. (2008). roducción masiva de Trichogramma spp., en Anzoátegui,
Venezuela y su importancia como alternativa ecológica en el control de plagas. Maracay.
Biolink . (12 de 01 de 2011). Biolog Gen III - Revolucionario. Obtenido de Biolog Gen III -
Revolucionario: http://www.biolinkarg.com/genIII/index.html
BIOLOG. (2011). Microbial Identification state of the science performance with unmatched
power & versatility. California.
Bou, G., Fernandéz-Olmos, A., Garcia, C., Saéz-Nieto, J. A., & Valdezate, S. (2011). Métodos de
identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. ELSEVIER, 561-642.
Cabeza, E. A. (2013). DESARROLLO DE UN MODELO DE RELACION ENTRE DENSIDAD OPTICA
(MÉTODOTURBIDIMÉTRICO) VS RECUENTO EN PLACA. Pamplona- España.
Castaño, J., & Del Rio, L. (1993). Diagramas de severidad para cuantificar daños provocados por
Stenocarpella sp. en maíz (Zea mays L.). Tegucigalpa - Honduras: Publicación DPV/EAP.
Cazorla, F. (15 de 07 de 1996). Factores de virulencia en bacterias patógenas. Obtenido de
Factores de virulencia en bacterias patógenas:
https://dialnet.unirioja.es/revista/2059/A/1996
40
Cha , C., Gao , P., Chen , Y., Shaw, P., & Farrand, S. (1998). Production of acyl-homoserine lactone
quorum-sensing signals by gram-negative plant-associated bacteria. MPMI. Vol 11.
CIMMYT. (2004). Enfermedades del maiz una guia para su identificación en el campo. Mexico,
DF: Cuarta edición.
Cisneros, G. (2013). SELECCIÓN DE RESISTENCIA A Sclerotium rolfsii EN MATERIAL SILVESTRE DE
Solanum lycopersicum Var. cerasiforme. Zapopan Jalisco- México.
Coltran, J. (22 de Abril de 2014). PRUEBAS PARA EL RECONOCIMIENTO DE BACTERIAS. Obtenido
de PRUEBAS PARA EL RECONOCIMIENTO DE BACTERIAS:
http://tecnicasdemicrobiologia.blogspot.com/
Couretot, L., Ferraris, G., & Parisi, L. (05 de Febrero de 2013). Efecto de fungicidas foliares y
momento de aplicación sobre la severidad de tizón foliar y enfermedades de raíz y tallo
en maíz. Obtenido de Efecto de fungicidas foliares y momento de aplicación sobre la
severidad de tizón foliar y enfermedades de raíz y tallo en maíz:
https://www.engormix.com/agricultura/articulos/efecto-fungicidas-foliares-momento-
t29992.htm
Eglenis, Y. (04 de Febrero de 2011). Cultivo de maíz. Obtenido de Cultivo de maíz:
http://elmaizdelzulia.blogspot.com/2011/02/morfologia-de-la-planta-de-maiz.html
Egues, J., & Yánez, C. (2008). INIAP-103 "MISHQUI SARA". Guayaquil, Ecuador.
Eguez, J., & Pintado , P. (2013). Ficha Técnica INIAP-103 "Mishqui Sara". Azuay-Ecuador.
FAO. (2009). Origen, evolución y difusión del maíz.
Fernández, A., Villaverde, M., Nicolás, J., Garcia- Goméz, A., & Malo, J. (2008). Pantoea dispersa;
RHIZOBACTERIA PROMOTORA DEL CRECIMIENTO VEGETAL (PGPR). Murcia- España.
FIRA. (2016). Panorama Agroalimentario, Maiz. Mexico.
Gijón, A. R. (2009). ETIOLOGÍA DE TRES ENFERMEDADES BACTERIANAS DE MAÍZ (Zea mays) EN
VERACRUZ, MEXICO. Veracruz.
Gobernado, M., & López-Hontangas, J. (2003). Bacterial identification methods. ELSEVIER, 1-94.
Gomez, T. (9 de Diciembre de 2014). INCIDENCIA Y SEVERIDAD DE LAS PLANTAS. Obtenido de
INCIDENCIA Y SEVERIDAD DE LAS PLANTAS:
https://prezi.com/xr47kza4awoh/incidencia-y-severidad-de-las-plantas/
Goszczynska , T., Botha, W., & Venter, S. (2007). Isolation and identification of the causal agent
of brown stalk rot, a new disease of maize in South Africa. Plant Dis.
Gutierrez-Barranquero, J. A., Cazoria, F., Arrebola, E., & Codina, J. (2011). LA NECROSIS APICAL
DEL MANGO EN CANARIAS, ¿UNA ETIOLOGÍA ALTERNATIVA? Malaga- España: SEF.
Huerta, H., Pacheco, J., & Vergara, S. (2016). Identificación Bioquímica de Erwinia sp, Asociada a
la Pudrición del Cogollo en Phoenix canariensis. Querétaro.
INAMHI. (2015). Anuario Meteorológico. Estación La Tola. Recuperado el 28 de Noviembre de
2017, de
http://www.serviciometeorologico.gob.ec/meteorologia/boletines/bol_sem.pdf
41
INIAP ESTACION EXPERIMENTAL DEL AUSTRO. (2011). Guia para la produccion de maiz en la
Sierra sur del Ecuador. Cuenca-Ecuador.
INTA. (24 de Noviembre de 2012). Enfermdades foliares reemergentes del cultivo de maiz: royas,
tizon foliar y mancha foliar. Obtenido de Enfermdades foliares reemergentes del cultivo
de maiz: royas, tizon foliar y mancha foliar: https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-
tmp-inta-enfermedades-foliares-reemergentes-del-cultivo-d.pdf
INTA. (2016). ENFERMEDADES FOLIARES REEMERGENTES DEL CULTIVO DE MAÍZ: ROYAS
(PUCCINIA SORGHI Y PUCCINIA POLYSORA), TIZÓN FOLIAR (EXSEROHILUM TURCICUM) y
MANCHA OCULAR (KABATIELLA ZEAE) . Paraná.
INTAGRI. (2017). Manejo Integrado del Gusano Elotero (Helicoverpa zea). Celaya, Guanajuato,
México: INTAGRI S.C.
Isenberg, H. (1992). Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington, D.C: Sociedad
Americana de Microbiología.
Jimbo, M. (2010). Evaluacion de la produccion de 2 variedades. Cuenca -Azuay.
Jiménez, O., Contreras , N., & Rodríguez, C. (2007). Identificación y caracterización de Pantoea
agglomerans aislada en plantas de gloxinia (Gloxinia alba). Bioagro.
Koppert. (2018). Gusano elotero. Mexico.
Kumar, A., Hunjan, M., Dhillon, H., & Singh, P. (24 de Octubre de 2017). Respuestas bioquímicas
asociadas con la resisitencia a la podedumbre bacteriana del tallo causada por Dickeya
zeae en el maíz. Obtenido de Respuestas bioquímicas asociadas con la resisitencia a la
podedumbre bacteriana del tallo causada por Dickeya zeae en el maíz:
https://www.researchgate.net/publication/319605489_Biochemical_responses_associ
ated_with_resistance_to_bacterial_stalk_rot_caused_by_Dickeya_zeae_in_maize
Kunstmann, J. P. (2004). Determinacion de subespecies de Erwinia carotovora(Dye) Hall como
agentes causales de pudricion blanda en cala. Valdivia, Chile.
León, L. H., & Sernaqué, G. H. (2014). “Potencial como promotoras del crecimiento de plantas de
las enterobacterias aisladas de la rizósfera de Zea mays L. “maíz” en Lambayeque,
2013”. Lambayeque, Perú.
Lezaun, J. (2014). Oruga militar o Gusano cogollero un problema para los cultivos de maíz y
sorgo.
MAGAP. (2017). Boletin Agricola Integral Zona 2. Tena- Ecuador.
Mallaupoma, Z. (2007). Determinación y diferenciación de Pantoea agglomerans y patógenos
por medio de perfiles de ácidos grasos a partir de aislamientos de 5 variedades de
semillas de Allium cepa L. . Lima-Perú.
Membreño, J., Zapata, M., Beaver, J., & Smith, R. (2016). Microflora en semillas de frijol
(Phaseolus vulgaris L.). Universidad de Costa Rica, 135-139.
Merino, S. (2014). Materiales y métodos. California, Estados Unidos.
Mezzalama, M. (2016). Enfermedades bacterianas asociadas a semilla de maíz y trigo. México.
42
Microbitos, G. (27 de Septiembre de 2011). ruebas bioquímicas primarias: Tinción de GRAM,
prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba de O/F y motilidad. Obtenido de ruebas
bioquímicas primarias: Tinción de GRAM, prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba
de O/F y motilidad.: http://microbitosblog.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-
primarias/
Ministerio Cultura y Patrimonio. (14 de Julio de 2016). Patrimonio Alimentario. Obtenido de
Patrimonio Alimentario:
http://patrimonioalimentario.culturaypatrimonio.gob.ec/wiki/index.php/Ma%C3%ADz
Morales, R. (07 de Abril de 2017). Principales plagas de la fresa y métodos de control
recomendados. Obtenido de Principales plagas de la fresa y métodos de control
recomendados: http://sistemaagricola.com.mx/blog/control-principales-plagas-de-la-
fresa/
Morales-Valenzuela, G., Silva-Rojas, H., Ochoa-Martinez, Valadez-Moctezuma, Ernestina,
Alarcon-Zuniga, . . . Farbán-Gomez. (2007). First Report of Pantoea agglomerans Causing
Leaf Blight and Vascular Wilt in Maize and Sorghum in Mexico. México: Plant Disease.
Moreno, G., & Peréz , I. (2002). El empleo de Trichogramma en control biológico de plagas:
problemas taxonómicos. Logroño- España.
Navarrete, R., Aranda, S., Rodriguez, M., & Gonzalez, M. (01 de Diciembre de 2014). Revista
mexicana de fitopatología: Bacterias Fitopatógenas en Semillas: Su Detección y
Regulación. Obtenido de Revista mexicana de fitopatología: Bacterias Fitopatógenas en
Semillas: Su Detección y Regulación:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0185-
33092014000200075
NOVAGRIC. (20 de Octubre de 2015). Clima de un Invernadero. Obtenido de Clima de un
Invernadero: http://www.novagric.com/es/blog/articulos/clima-invernadero-como-
conseguir-temperatura-ideal
Ordax, M. (2008). SUPERVIVENCIA DE Erwinia amylovora EN CONDICIONES DE ESTRÉS:
INFLUENCIA DE LA PRESENCIA DE COBRE Y LA LIMITACIÓN DE NUTRIENTES. Valencia -
España.
Oyarzún, P., León, D., Pucha , J., & Forbes, G. (2002). "Pierna negra" y "Pudrición blanda", una
amenaza difícil de enfrentar en el cultivo de papa en Ecuador. Quito-Ecuador: No.16.
PANNAR. (2013). Bacterial stalk rot. South África.
Peña , R., & Páez, J. (2010). GUIA DE LABORATORIO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA
ENFERMEDAD DESCONOCIDA MEDIANTE POSTULADOS DE KOCH. Colombia.
Peñaherrera , D. (2011). Manejo integrado del cultivo de maíz de altura. Quito-Ecuador: Activa
Diseño Editorial. Obtenido de Manejo integrado del cultivo de maíz de altura.
Pérez, C. (2018). Valores nutricionales del maíz. Natursan.
Pérez-Terrón, R. (2008). Evaluación de la diversidad genética y bioquímica de Pantoea sp. en
maíz. Tepetitla, Tlaxcala.
43
Pérez-Terrón, R., Carmona, J. C., Cebada, J. A., & Munive, J. A. (2012). Patogenicidad bacteriana
en maíz (Zea mays). Revista Iberoamericana de las Ciencias Biológicas y Agropecuarias,
9-15.
Pioneer. (2014). Tizón foliar del maíz. Obtenido de Tizón foliar del maíz:
https://www.pioneer.com/CMRoot/International/Mexico_Intl/Agronomia/Articulos_P
DF/CN_6B_TIZON_FOLIAR_2014.pdf
plantwise. (2018). Plantwise Knowledge Bank. Obtenido de Plantwise Knowledge Bank:
https://www.plantwise.org/KnowledgeBank/Datasheet.aspx?dsid=21944
Ramirez , D. M. (2014). Identificacion e incidencia y severidad del tizón norteño del maiz en el
ejido del Prado. Saltillo, Coahulla, México.
Reyes , S., & Paucar , E. (17 de Marzo de 2017). 82 281 hectáreas de maíz están afectadas por
las plagas. El comercio, págs. 12-13.
Reyes, M. (2016). CONTROL QUÍMICO DE TIZÓN TEMPRANO Y PUDRICIÓN DE FRUTO. Villa
Alegre: Imprenta Gutenberg. Obtenido de CONTROL QUÍMICO DE TIZÓN TEMPRANO Y
PUDRICIÓN DE FRUTO:
http://biblioteca.inia.cl/medios/biblioteca/boletines/NR40563.pdf
Rezzonico, F., Smits, T., Montesinos , E., Frey, E., & Duffy, B. (22 de Septiembre de 2009).
Comparación genotípica de Pantoea agglomerans planta y cepas clínicas. BMC
microbiología. Obtenido de NCBI.
Rodriguez , F. (08 de Diciembre de 2018). Pruebas IMVIC, Prueba del indol. Obtenido de Pruebas
IMVIC, Prueba del indol: https://www.franrzmn.com/prueba-del-indol/
Royano, E. (2009). Obtenido de
http://hosting.udlap.mx/profesores/alephzero/archivo/historico/az29/stebaliz.html
Ruíz, D., Azaola , A., Esquivel, G., Segundo , E., & Silva, H. V. (2018). Interaction microenvironment
- Pantoea agglomerans limits maize yield. Chapingo: Terra Latinoam vol.36 no.1.
Santos, F. (Diciembre de 2008). Como controlar el cogollero del maiz sin plaguicidas. Obtenido
de Como controlar el cogollero del maiz sin plaguicidas:
www.consumer.es/seguridadalimentaria.
Seminis. (2018). Pudrición del centro. México: Bayer Group.
Set vivo. (25 de Septiembre de 2013). Feromonas de agregación, señales químicas
multipropósito. Obtenido de Feromonas de agregación, señales químicas
multipropósito: http://ser-vivo.blogspot.com/2013/09/feromonas-de-agregacion-
senales.html
SINAGAP. (2013). Boletín situacional: Maiz duro seco. Quito- Ecuador.
Toth, I., Bell, K., Holeva, M., & Birch, P. (2003). Soft rot erwiniae: from genes to genomes.
Tovar, C. F. (26 de Septiembre de 2012). Técnicas y métodos de aislamiento y selección de
microorganismos. Obtenido de Técnicas y métodos de aislamiento y selección de
microorganismos: https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-
metodos-de-aislamiento-y-seleccion-de-microorganismos/
44
Ulloa, F. D. (2015). “ANÁLISIS DE LOS MÉTODOS PARA MEDIR LA TURBIDEZ DE LOS INÓCULOS Y
SU INFLUENCIA EN EL ANTIBIOGRAMA DE LA BACTERIA E COLI EN UROCULTIVOS”.
Ambato-Ecuador.
Unda, J. R. (1983). Estudio deel Volcamiento del Maiz en CUTUGLAHUA, INIAP. Quito.
Vega, E. (2014). Identificación morfológica de hongos y bacterias aislados en la pudrición de
cogollo en palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq) y en el híbrido interspecífico (Elaeis
oleífera x Elaeis guineensis) en palmeras de los Andes San Lorenzo. Quito: Universidad
de las Fuerzas Armadas ESPE. Carrera de Ingenieria en Biotecnología.
Yanez, C., Zambrano, J. L., Caicedo , M., & Heredia, J. (2013). Guía de producción de maíz para
pequeños agricultores y agricultoras. INIAP. Quito-Ecuador.
45
8. ANEXOS
Anexo 1. Reacciones de las pruebas bioquímicas realizadas a la cepa Pantoea agglomerans
1. Prueba con KOH 3% Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3 %, después con el asa calibrada se recolecta muestra de las colonias bacterianas en estudio, se mezcla con la gota de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos
Medios y reactivos
Acetona
Asa
Ilustración 2. Formación de hilo
Autor: Caiza R, 2019
Interpretación Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba es positiva e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se forma hebra, la prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas El hidróxido de potasio es el causante del rompimiento de la pared de la bacteria lo cual forma una composición viscosa dando una reacción positiva al formar un hilo con el asa. 2. Prueba de catalasa El objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa en la bacteria. El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa.
H2O2 -> H2O + ½ O2
Medios y Reactivos
Peróxido de hidrogeno al 3% (H2O2).
46
Ilustración 3. Burbujas de oxígeno
Autor: Caiza R, 2019 Interpretación
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno que de desprenden de la bacteria, producto de la acción de la enzima catalasa sobre el peróxido de hidrogeno añadido.
Existe una reacción positiva, en este caso se observaran burbujas de oxigeno por acción de la enzima catalasa. 3. Prueba de la oxidasa
El objetivo de la prueba de “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa, en la bacteria.
Se trata de un enzima que oxida el Citocromo C de la cadena transportadora de electrones. Medios y reactivos
Lámina de oxidasa
Asa
Ilustración 4. Lamina con la bacteria
Autor: Caiza R, 2019 Interpretación
47
Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color púrpura y negativo cuando no toma dicha coloración.
Reacción negativa no cambió de color, no existe presencia de citocromo C, especifico de Enterobacteriaceae. 4. Prueba del citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de bacterias quimiorganotróficas. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromothimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Medios y reactivos
Medio de Simmons
Fosfato diácido de amonio: 1 g
Fosfato dipotásico: 1 g
Cloruro de sodio: 5 g
Citrato de sodio: 2 g
Sulfato de magnesio: 0,2 g
Agar: 15 g
Azul de bromotimol: 0,08 g
Agua destilada: 1000 ml
pH: 6,9
Ilustración 5. Citrato negativo Autor: Caiza R, 2019
Interpretación
48
El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Reacción negativa en la prueba, no cambia de color para la bacteria.
5. Prueba de oxidativo/fermentativo en medio HUGH & LEIFSON Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol). Medios y reactivos
Triptona 10 g
Extracto de levadura 1,0 g
Purpura de bromocresol 0,04 g
Agar 2,0 g
Agua destilada 1000,0 ml
Esterilizar a 121° C (15 libras de presión) por 15 minutos
Ilustración 6. Prueba oxidativo/fermentativa Autor: Caiza R, 2019 Interpretación
Prueba para bacterias gram negativas, la reacción es positiva. La bacteria posee un metabolismo oxido fermentativo (anaerobia facultativo) cambio de color en ambos tubos,
6. Prueba del Indol
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol
B A
A
49
es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano.
Medios y reactivos Caldo triptófano
Peptona o digerido pancreático de caseína: 2 g
Cloruro de sodio: 0,5 g
Agua destilada: 100 ml Reactivo de Kovacs
Alcohol amílico o isoamílico: 150 ml
p-dimetilaminobenzaldehído: 10 g
HCl concentrado (37%): 50 ml
Ilustración 6. Prueba del Indol Autor: Caiza, R. 2019
Interpretación
El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
Reacción negativa, no cambió de color, medio realizado en caldo triptona, específica para el
género Pantoea
50
Anexo 2. Elaboración de la recta de calibración de la Escala Mcfarland. 1. Datos obtenidos en el espectrofotómetro: absorbancia y trasmitancia
2. Cuadro resumen con valores obtenidos para la obtención de la pendiente (m)
ABS4
N X Y X2 Y2 X*Y
0,5 1,5 0,120 2,25 0,0144 0,18
1 3 0,230 9 0,0529 0,69
2 6 0,475 36 0,225625 2,85
3 9 0,523 81 0,273529 4,707
4 12 0,642 144 0,412164 7,704
2. Resultados de suma, media, desviación, covarianza con todos los valores obtenidos de
las absorbancias
3. Datos de la pendiente de la recta: y=mx+b
Pendiente
X y m
0,78184898 0,12 0,09119512
1,98805385 0,23
4,67460105 0,475
5,20094499 0,523
6,50583935 0,642
4 Absorbancia obtenida para la curva de calibración
ABS
Y Anti-logaritmo
ABS %
Transmitancia
0,120 0,76 76
0,230 0,59 59
0,475 0,33 33
0,523 0,3 30
0,642 0,23 23
SUMA 31,5 1,99 272,25 0,978618 16,131
MEDIA 6,3 0,398 SX 3,841874542 14,76 SY 0,193182815 SXY 0,7188 R 0,968492807 B 0,048699187 M 0,091195122
51
Anexo 3. Gráfica de la recta de calibración de la Escala de Mcfarland usada para cada inoculación.
Fuente: Caiza R, 2019
Anexo 4. Turbidez para cada inoculación con los tubos 3 y 4
Fuente: Caiza R, 2019
0,12
0,23
0,475
0,523
0,642
y = 0,0912x + 0,0487R² = 1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 2 4 6 8
Series1
Lineal (Series1)
0,120
0,230
0,4750,523
0,642
0,5850,5850,602y = 0,0882x + 0,0522
R² = 1
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 1 2 3 4 5 6 7 8Series1 Lineal (Series1)
1
23
0,5
4
52
1.1. Inoculación en semilla. Recta obtenida entre puntos de calibración y puntos obtenidos entre el punto 3 y 4 para la inoculación en semilla.
Fuente: Caiza R, 2019
1.2. Inoculación en tallo. Recta obtenida entre puntos de calibración y puntos obtenidos entre
el punto 3 y 4 para las diferentes inoculaciones realizadas en la base del tallo.
Anexo 5. Concentración y pureza del ADN de las muestras Pantoea agglomerans
Código de muestra Relación
Rango Pureza
FP-19-0071 (425) A.I* 260/280 1.9 Óptima
FP-19-0071 (426) POST* 260/280 1.9 Óptima
Fuente: Caiza R, 2019
*A.I= Aislamiento inicial
*Post= Postulados
0,120
0,230
0,475
0,523
0,642
0,5690,5690,602
0,5520,5370,537
0,5850,5850,602
0,5690,585
0,553
y = 0,5299x + 0,004R² = 1
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Series1 Lineal (Series1)
0,5
1
2
3
4
53
Anexo 6. Prueba bioquímica de identificación con el sistema Biolog para cepas originales de
Pantoea agglomerans 1
54
Anexo 7. Prueba bioquímica de identificación con el sistema Biolog para cepas originales de
Pantoea agglomerans 2
55
Anexo 8. Informe de análisis de semillas de la Variedad INIAP-103 Mishqui sara
56
Anexo 9. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla.
57
Anexo 10. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas a la inoculación a la semilla.
58
Anexo 11. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas la inoculación a la semilla.
59
Anexo 12. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas de la inoculación II
60
Anexo 13. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas de la inoculación III
61
Anexo 14. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas de la inoculación IV
62
Anexo 15. Prueba bioquímica de identificación de Pantoea agglomerans con el sistema Biolog
para cepas re aisladas de la inoculación V
63
Anexo 16. Pureza y calidad de ADN de la muestra en estudio (Pantoea agglomerans)
Relación Rango Pureza
260/280
1.8-2 Pureza óptima
1.6-1.8 Pureza aceptable
<1.6 Presencia de compuestos aromáticos y proteínas
>2.1 Contaminación con ARN
260/230
2.0-2.2 Rango óptimo
<2.0 Contaminación con sales, fenoles, hidratos de
carbono, etc.
64
9. FOTOGRAFÍAS
Fotografía 1. Tallos obtenidos con la sintomatología de Pantoea agglomerans en diferentes
Parroquias. Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 2. Microplaca de Biolog usada en la prueba bioquímica. Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 3. Semillas de maíz Variedad Iniap-103 Mishqui sara. Fuente: Caiza R, 2019
65
Fotografía 4. Prueba de germinación y desarrollo radicular a los 14 días. Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 5. Semillas dañadas en la pruebas de germinación. Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 6. A. Semilla teñida todo el embrión viable. B. Semilla no viable. Fuente: Caiza R,
2019
A B
66
Fotografía 7. Semillas viables y no viables variedad INIAP-103 Mishqui sara. Fuente: Caiza R,
2019
Fotografía 8. Reactivos en la escala de Mcfarland Fotografía 9. Espectrofotómetro.
Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 10.Cepas para inoculación Fotografía 11. Remojo de las semillas de maíz previo a la
siembra. Fuente: Caiza R, 2019
H2SO4
0,36M BaCl2
0,048M
67
Fotografía 12. A. Plántulas germinadas e inoculadas. Fuente: Caiza R, 2019
Fotografía 13. A. Plantas de la II inoculación B. Tallo extraído de plantas inoculadas. Fuente:
Caiza R, 2019
Fotografía 14. Microplacas de Biolog realizadas al tallo II inoculación. Fuente: Caiza R, 2019
A B
68
Fotografía 15. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la III inoculación. Fuente: Caiza
R, 2019
Fotografía 16. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la IV inoculación. Fuente: Caiza
R, 2019
A B
69
Fotografía 17. A. Plantas con síntomas, y B. Tallos extraídos de la V inoculación. Fuente: Caiza
R, 2019
Fotografía 18. Microplacas de Biolog, inoculación IV y V. Fuente: Caiza R, 2019
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Fotografía 19. A) Muestras conservadas en tubos effendort B) Caja para conservación de
muestras C) Ultracongelador (-80°C). Fuente: Caiza R, 2019