UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Klinische biologie en Reumatologie
Laboratorium voor niet-infectieuze serologie
Academiejaar 2011-2012
DIAGNOSTISCHE PERFORMANTIE VAN AUTOMATISCHE ANTINUCLEAIRE
ANTISTOF DETECTIE MET BEHULP VAN INDIRECTE
IMMUNOFLUORESCENTIE IN PATIËNTEN MET SYSTEEMSCLEROSE
Hanan KHAJOU
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. dr. Filip De Keyser
Commissarissen
Prof. dr. Apr. Dieter Deforce
Prof. dr. Apr. Jan Van Bocxlaer
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking
tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten
uit deze masterproef.”
24 mei 2012
Promotor Auteur
Prof. dr. Filip De Keyser Hanan Khajou
SAMENVATTING
Volgens de American College of Rhematology is de manuele indirecte
immunofluorescentie test de gouden standaard voor screening naar antinucleaire
antilichamen die belangrijke diagnostische merkers zijn voor systemische auto-
immuunziekten (o.a. systeemsclerose). Door heel wat nadelen verbonden aan deze
test zijn de laatste jaren alternatieven ontwikkeld. Eén hiervan is de geautomatiseerde
indirecte immunofluorescentie test (combinatie van hoge gevoeligheid enerzijds en
automatisatie en standaardisatie anderzijds) (cfr. Inleiding).
Het doel van dit onderzoek was om de diagnostische performantie van de
automatische indirecte immunofluorescentie test te evalueren in patiënten met
systeemsclerose versus controlegroepen (gezonde bloeddonoren en zieke controles).
Bovendien werd de correlatie tussen de klassieke titer en de kwantitatieve waarde
(index) van de automatische fluorescentiemicroscoop onderzocht (cfr. Objectieven).
Hiervoor werd gebruik gemaakt van de Zenit G-sight (automatische digitale
immunofluorescentiemicroscoop), na voorafgaand inzetten van de plaatjes met een
pipetteertoestel. De resultaten (differentiatie positief/negatief en patronen) bekomen
met de automatische microscoop, werden bijgestuurd indien de gebruiker hier niet mee
akkoord was (cfr. Resultaten).
De optimale cut-off waarden (voor maximale sensitiviteit en specificiteit) werden
bepaald a.h.v. een ROC-analyse. De resultaten (titers, patronen, gevoeligheid voor
antistof-subsets en differentiatie positief/negatief) bekomen met behulp van de Zenit G-
sight met en zonder bijsturing van de gebruiker werden vergeleken. Hiernaast werden
de likelihoodratio’s van de titers en de index-intervallen berekend (cfr. Discussie).
Men kon besluiten dat de automatische indirecte immunofluorescentie test (Zenit G-
sight) een goede performantie vertoont voor screening naar antinucleaire antilichamen
in patiënten met systeemsclerose, maar dat actie door een expert noodzakelijk blijft.
Hiernaast is er mogelijkheid om in de toekomst, de index als alternatief te gebruiken
voor de titer aangezien deze significant gecorreleerd zijn (cfr. Besluit).
DANKWOORD
Ten eerste wil ik mijn promotor
Prof. dr. Filip De Keyser bedanken voor de kans die hij mij gaf om mijn masterproef uit
te voeren in het laboratorium voor Klinische biologie, niet-infectieuze serologie in
samenwerking met de dienst Reumatologie. Hierna wil ik dr. Carolien Bonroy superveel
bedanken voor de tijd die ze voor mij maakte voor het opstellen van een planning,
dagelijkse begeleiding, verbeteren van de masterproef en het ter beschikking stellen
van al het materiaal dat ik nodig had voor mijn masterproef. Dankzij Prof. De Keyser en
dr. Bonroy heb ik een interessante studie kunnen opbouwen en veel bijgeleerd. Ik
bedank ook de laboranten Vicky, Virgie en Anette voor de hulp in het labo bij het
uitvoeren van de experimenten (en de aangename werksfeer!) en Heidi voor de
begeleiding tijdens het werken met de nieuwe toestellen. Evy wil ik bedanken voor haar
begeleiding bij het schrijven van de thesis en de leuke momenten. Ik zal ook MLT
student en collega in het labo Hanife nooit vergeten en bedank haar voor de steun
tijdens de moeilijke momenten. Tenslotte wil ik zeker en vast mijn familie vooral mijn
ouders bedanken voor hun steun tijdens mijn masterproef en tijdens mijn
studentenjaren. Ik dank jullie allemaal en zal deze leerrijke ervaring
nooit vergeten !
INHOUDSTABEL
1. INLEIDING……………………………………………………………………………......1
1.1 HET IMMUUNSYSTEEM……………………………………………………………..1
1.2 AUTO-IMMUNITEIT............................................................................................2
1.3 SYSTEEMSCLEROSE........................................................................................3
1.3.1 Epidemiologie.............................................................................................3
1.3.2 Pathogenese……………..............................................................................3
1.3.3 Klinische manifestaties………………………………………………………..4
1.3.4 Classificatie criteria…………………………………………………………….5
1.4 ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN…………………………………………………6
1.4.1 Definitie ANA…………………………………………………………………….6
1.4.2 Diagnostische waarde van ANA……………………………………………...6
1.4.3 Detectie van ANA…………………………………………………………….....7
1.4.3.1 Indirecte immunofluorescentie….................................................................7
1.4.3.2 Enzyme immunoassay………………………………………………………….9
1.4.3.3 Voor- en nadelen van ANA detectie…………………………………………...9
1.4.3.4 Geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie…………......................10
1.4.4 Identificatie van ENA……………………………………………………….....10
1.4.5 Reflextesting……………………………………………………………………12
2. OBJECTIEVEN………………………………………………………………………..13
3. MATERIALEN EN METHODEN………………………………………………….14
3.1 STAALVERZAMELING……………………………………………………………...14
3.2 STAALVOORBEREIDING…………………………………………………………..15
3.2.1 Principe………………………………………………………………………….15
3.2.1.1 Aanmaak van de verdunningsreeksen………………………………….......15
3.2.1.2 Inzetten van de IIF plaatjes……………………………………………..........16
3.2.2 Materialen……………………………………………………………………….16
3.2.3 Methode………………………………………………………………………….17
3.3 GEAUTOMATISEERDE AFLEZING VAN ANA IIF………………………………18
3.3.1 Principe………………………………………………………………………….18
3.3.2 Materialen………………………………………………………………………..20
3.3.3 Methoden………………………………………………………………………..21
3.4 BEPALING VAN SSC-GEASSOCIEERDE ANTISTOFFEN MET BEHULP VAN
EEN LINE IMMUNO ASSAY…………………………...................................................24
3.4.1 Principe………………………………………………………………………….25
3.4.2 Materialen……………………………………………………………………….26
3.4.3 Methode…………………………………………………………………………27
3.4.4 Digitalisatie en interpretatie van de resultaten…………………………..28
3.5 DATA-ANALYSE…………………………………………………………………..28
4. RESULTATEN…………………………………………………………………………..29
4.1 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN
ZENIT G-SIGHT ZONDER BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER………………………..29
4.1.1 Distributiecurve en ROC analyse………………………………………….29
4.1.2 ANA IIF titers zonder bijsturing in elke subset………………………….32
4.1.3 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets zonder
bijsturing……………………………………………………………………………………….32
4.1.4 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight zonder
bijsturing……………………………………………………………………………………….33
4.1.5 Berekening van likelihoodratio’s van de index-intervallen…………...34
4.2 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN
ZENIT G-SIGHT NA BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER…………………………….....35
4.2.1 ANA IIF titers na bijsturing in elke subset……………………………….35
4.2.2 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets na
bijsturing……………………………………………………………………………………….36
4.2.3 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight met
bijsturing……………………………………………………………………………………….36
4.2.4 Berekening van likelihoodratio’s van de titers……………...................37
4.3 VERGELIJKING VAN DE ANA IIF RESULTATEN (POSITIEF/NEGATIEF)
BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT G-SIGHT MET EN ZONDER BIJSTURING VAN
DE GEBRUIKER……………………………………………………………………………….38
4.4 CORRELATIE TUSSEN TITER EN INDEX…………………………………………41
5. DISCUSSIE……………………………………………………………………………….43
6. BESLUIT…………………………………………………………………………………..45
7. LITERATUURLIJST…………………………………………………………………...46
BIJLAGEN
BIJLAGE 1: DISCORDANTIES TUSSEN HET ANA IIF RESULTAAT
(POSITIEF/NEGATIEF) BEKOMEN MET DE ZENIT G-SIGHT ZONDER EN MET
BIJSTURING
BIJLAGE 2: LEZINGEN
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ACR American College of Rheumatology
AIZ Auto-immuunziekte
ALT Alanine aminotransferase
ANA Antinucleaire antilichamen
ANF Antinucleaire factoren
AST Aspartaat aminotransferase
AUC Oppervlakte onder curve
BCR B-cel antigen receptor
CD: Centers for Disease Control
CREST Calcinosis, Raynaud fenomeen, stoornis slokdarmmotiliteit (Oesofagus),
Sclerodactylie en Teleangiëctasieën
CRP C-reactief proteïne
CTD Connective tissue disease
DC Disease controls
DcSSc Diffuse cutaneous systemic sclerosis
DNA Desoxyribonucleïnezuur
EIA Enzyme immunoassay
ENA Extraheerbare nucleaire antigenen
FITC Fluoresceïne isothiocyanaat
HD Healthy donors
HEp Human epithelioma
IIF Indirecte immunofluorescentie
LcSSc Limited cutaneous systemic sclerosis
LED Light-emitting diode
LIA Line immunoassay
LR Likelihoodratio
lSSc Limited Systemic Sclerosis
MHC Major histocompatibility complex
NBT/ BCIP Nitrobluetetrazoliumchloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate
NCCLS National committee for Clinical Laboratory Standards
NK-cellen Natural Killer-cellen
PAH Pulmonaire arteriële hypertensie
PBS Phosphate buffer saline
PI Probabiliteitsindex
RNA Ribonucleïnezuur
ROC-curve Receiver Operating Characteristic-curve
SSc Systeemsclerose
TSH Thyroïd-stimulerend-hormoon
WB Western blot
WHO Wereldgezondheidsorganisatie
1
1. INLEIDING
1.1 HET IMMUUNSYSTEEM
Het immuunsysteem is een heel complex systeem van effectorcellen en moleculen dat
het organisme verdedigt tegen lichaamsvreemde componenten zoals micro-organismen
en afwijkende cellen zoals tumorcellen. Klassiek wordt onderscheid gemaakt tussen het
aangeboren en het adaptieve immuunsysteem.(1, 2)
Het aangeboren immuunsysteem is een snelle maar niet-specifieke bescherming
(m.a.w. onafhankelijk van het antigen) waarbij geen immunologisch geheugen wordt
opgebouwd. In deze eerstelijns verdediging spelen mechanische (bv. huid en mucosa),
biochemische (bv. lage pH in de maag) en microbiologische barrières (bv. normale
commensale flora) een belangrijke rol. In sommige omstandigheden volstaan deze
barrières echter niet en slaagt het micro-organisme er toch in om het lichaam binnen te
dringen en zich te vermenigvuldigen. In dit geval zullen fagocyten (o.a. macrofagen en
neutrofielen), na herkenning via oppervlakte receptoren, optreden om het pathogeen te
vernietigen. Door deze interactie wordt eveneens een inflammatoire respons
geïnitieerd, die op zijn beurt zorgt voor de accumulatie van plasmaproteïnen (o.a.
complement factoren en cytokines) en de rekrutering van neutrofielen en natural killer
(NK)-cellen op de plaats van de infectie.(1, 2)
Naast het aangeboren immuunsysteem bestaat ook het adaptief of verworven
immuunsysteem. Dit systeem is de tweedelijns verdediging en treedt in actie bij falen
van het aangeboren immuunsysteem. Het adaptieve immuunrespons is niet vanaf de
geboorte aanwezig en moet bij elk individu worden opgebouwd door contact met
verschillende antigenen. Hierdoor ontwikkelt er zich eveneens een immunologisch
geheugen dat toelaat om bij blootstelling aan een specifiek antigen snel te anticiperen
door de ontwikkeling van een antigen specifieke respons. De belangrijkste cellen van
het adaptief immuunsysteem zijn de T-cellen en B-cellen. Deze cellen zijn
respectievelijk de belangrijkste componenten van de cellulaire en humorale immuniteit.
Beide systemen lopen echter in elkaar over.(1, 2)
De cellulaire immuniteit is een samenspel van T-cellen en antigen presenterende cellen
zoals B-cellen, macrofagen en dendritische cellen. De T-cel voorlopers ontwikkelen zich
in het beenmerg en migreren naar de thymus. Na een proces van positieve en
negatieve selectie ter hoogte van de thymus herkennen de T-cellen normaal enkel
2
lichaamsvreemde antigenen die gebonden zijn aan de major histocompatibility complex
(MHC)-moleculen.(1, 2)
De humorale immuniteit wordt gemedieerd door de B-cellen die specifieke antilichamen
(immunoglobulines) produceren. De B-cel ontwikkeling vindt plaats in het beenmerg.
Voordat deze cellen het beenmerg verlaten, worden ze getest op autoreactiviteit
(negatieve selectie). De B-cel antigen receptor (BCR), een immunoglobuline gebonden
op het oppervlak van de B-cellen, herkent oplosbare antigenen. Binding van deze
antigenen aan de BCR leidt tot B-cel activatie, proliferatie en finaal differentiatie tot
antistof-secreterende plasmacellen of geheugencellen. De nood aan T-cel hulp voor de
activatie van de B-cellen is afhankelijk van het type antigen (eiwitten of
polysacchariden). De antistoffen hebben verschillende functies zoals neutralisatie (bv.
door binding van toxines op het oppervlak van het pathogeen), opsonisatie voor
fagocytose en activatie van de complementcascade.(1, 2)
1.2 AUTO-IMMUNITEIT
Een heel belangrijke eigenschap van het immuunsysteem is het vermogen om
onderscheid te maken tussen lichaamseigen (self) en lichaamsvreemde (non-self)
elementen. Dit vermogen ontstaat door de aanwezigheid van centrale (o.a. verwijdering
van potentieel autoreactieve lymfocyten door negatieve selectie) en perifere tolerantie.
Een deel van deze autoreactieve lymfocyten ontsnapt echter aan dit eliminatieproces en
kan aanleiding geven tot het ontstaan van auto-immuniteit.(1, 2) Auto-immuniteit
betekent dat er een immuunrespons is tegen lichaamseigen componenten. Doordat
deze auto-antigenen niet volledig kunnen worden verwijderd ontstaat chronische
activatie van het immuunsysteem met eventueel functionele en structurele schade van
lichaamseigen weefsels tot gevolg. In dit geval spreekt men van een auto-immuunziekte
(AIZ).(1, 2)
Ongeveer 5% van de Westerse populatie heeft een AIZ. Vanuit klinisch standpunt
bestaan er twee soorten AIZ, namelijk de orgaanspecifieke en de systemische AIZ. In
het eerste geval wordt slechts één bepaald orgaan aangetast. Een voorbeeld hiervan is
de ziekte van Graves waarbij de schildklier wordt aangetast door de aanwezigheid van
auto-antistoffen tegen het thyroïd-stimulerend-hormoon (TSH) receptor.(1, 2) In het
tweede geval worden meerdere weefsels aangetast. Een voorbeeld hiervan is
systeemsclerose (SSc). Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van
3
Fibrose ter hoogte
van de huid en
organen
Proliferatie van
fibroblasten
Vasculaire schade
Activatie van het
immuunsysteem/
Inflammatie
Genetische
voorbeschiktheid Omgevingsfactoren
auto-antistoffen gericht tegen antigenen die in gans het lichaam voorkomen, namelijk
antinucleaire componenten.(3)
1.3 SYSTEEMSCLEROSE
1.3.1 Epidemiologie
SSc is een zeldzame ziekte. De prevalentie in West-Europa bedraagt ongeveer 150 per
106 inwoners.(4) De ziekte komt 4 tot 7 maal meer voor bij vrouwen dan bij mannen.(5-
8) De incidentie bedraagt ongeveer 1 per 105 en neemt toe met de leeftijd.(9) De
diagnose wordt meestal gesteld rond de leeftijd van 44 à 55 jaar.(10) Bij het zwarte ras
is de incidentie hoger en heeft de ziekte vaak een ernstiger verloop.(5, 11)
1.3.2 Pathogenese
De pathogenese van SSc is zeer complex en nog onvoldoende gekend.(12) Tot op
heden verklaart geen enkele hypothese alle aspecten van de ziekte.(13) In het
algemeen wordt aanvaard dat er een interactie bestaat tussen de belangrijkste
pathofysiologische kenmerken van de ziekte, met name vasculaire schade, overmatige
fibrose ter hoogte van de huid en de organen en chronische activatie van het
immuunsysteem.(12) Verder zouden ook genetische factoren en omgevingsfactoren
een belangrijke rol spelen.(14, 15) Een overzicht van deze interacties wordt
weergegeven in Figuur 1.1.
Figuur 1.1: Interactie tussen de vasculaire, fibrotische, immunologische, genetische en
omgevingsfactoren bij SSc. Opgemaakt op basis van (9)
4
Als onderdeel van de auto-immuunrespons ontstaan bij meer dan 95% van de SSc
patiënten antinucleaire antilichamen (ANA) (cf.1.4.).(2) (16) Verdere identificatie van
deze ANA draagt bij in de diagnose en prognose van de ziekte.(17-19)
De belangrijkste auto-antistoffen specifiek geassocieerd met SSc zijn anti-Scl-70, anti-
centromeer, anti-RNA-polymerase I/III, anti-Th/To, anti-fibrillarine en anti-PM/Scl.(20)
De precieze rol van deze ANA in de pathogenese van SSc is nog niet gekend.(20-22)
1.3.3 Klinische manifestaties
De twee voornaamste pathofysiologische kenmerken van SSc zijn fibrose en
vasculopathie.(23) Fibrose uit zich voornamelijk in xerose en verdikking van de huid
(sclerodermie) (cfr. Figuur 1.2.).(24) Het tweede kenmerk van SSc is vasculopathie
(aantasting van de bloedvaten) en komt vooral tot uiting in de aanwezigheid van het
Raynaud fenomeen (cfr. Figuur 1.2.). Raynaud is vaak het eerste symptoom van SSc
en komt voor bij de meeste SSc patiënten. Hierbij worden de vingers of tenen wit en
koud door vasoconstrictie van de arteriolen.(25) Andere symptomen ter hoogte van de
huid bij SSc zijn onder andere teleangiëctasieën en verzweringen ter hoogte van de
vingers.(26) Op microvasculair niveau is de schade waarneembaar met behulp van een
capillaire microscoop. Naast het diagnostische belang heeft dit onderzoek, dat wordt
uitgevoerd door de reumatoloog, vermoedelijk ook een prognostische waarde.(27)
Figuur 1.2: Sclerodermie (links). (cfr. http://www.dermis.net/dermisroot/en/39210/image.htm)
en het Raynaud fenomeen (rechts).(cfr. http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm)
Naast aantasting van de huid komt fibrose en vasculopathie ook voor ter hoogte van de
interne organen.(3) Dit uit zich onder andere in maag-darmstoornissen (vertraagde
maaglediging, slikstoornissen, constipatie, malabsorptie,…), longaandoeningen
(interstitieel longlijden en pulmonaire arteriële hypertensie (PAH)), nierfalen (gepaard
gaande met een verhoogde bloeddruk), myocard fibrose leidend tot hartfalen en
hartritmestoornissen en aantasting van het musculoskeletaal systeem (gewrichtspijnen,
5
immobiliteit en krampen).(3) De belangrijkste orgaancomplicaties geassocieerd met een
slechte prognose en hoge mortaliteit zijn longaantasting (PAH en interstitieel longlijden,
respectievelijk het gevolg van vasculopathie en fibrose) en niercrisissen.(10)
De klinische manifestaties en het ziekteverloop bij SSc patiënten is dus heel
variabel.(12) Globaal kunnen we stellen dat de ernst van de huid- en orgaan aantasting
het klinisch verloop en de prognose bepalen.(3)
1.3.4 Classificatie criteria
Gezien het variabel ziektebeeld en ziekteverloop van SSc zijn classificatie criteria
belangrijk met het oog op vergelijkbaarheid van studies.(12) In 1980 stelde het
American College of Rheumatology (ACR) de eerste classificatie criteria voor.(28) Deze
criteria waren vooral specifiek maar niet zeer gevoelig, waardoor patiënten met een
gelimiteerde huidaantasting soms werden gemist.(29) Vervolgens werden de patiënten
opgedeeld op basis van de uitgebreidheid van de huidaantasting in patiënten met een
gelimiteerde huidaantasting (LcSSc) en patiënten met een uitgebreide, diffuse
huidaantasting (DcSSc) (cfr. Figuur 1.3.).(30)
A B
Figuur 1.3: A) LcSSc versus B) DcSSc waarbij voor elke subset de potentieel aangetaste
cutane zones rood gemarkeerd zijn.(31)
Meer recent werden nieuwe classificatie criteria voorgesteld door Leroy en
Medsger.(25) Zij onderscheiden, naast de klassieke subsets LcSSc en DcSSc, een
derde subset van patiënten zonder huidaantasting (ook wel gelimiteerde of vroege SSc
genoemd) maar met een verhoogd risico op evolutie naar SSc. Centraal in deze nieuwe
criteria staat de aanwezigheid van het Raynaud fenomeen. Daarnaast is de
6
aanwezigheid van ofwel een afwijkend capillaroscopisch beeld of de aanwezigheid van
SSc specifieke antistoffen (anti-Scl-70, anti-centromeer, anti-RNA-polymerase I/III, anti-
Th/To, anti-fibrillarine antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen) vereist. Indien
patiënten zowel een afwijkende capillaroscopische beeldvorming als een SSc specifieke
ANA hebben, is de kans 60 maal groter op het ontwikkelen van systeemsclerose in
vergelijking met patiënten die niet voldoen aan deze criteria.(32)
1.4 ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN
1.4.1 Definitie ANA
ANA staat voor antinucleaire antilichamen, ook antinucleaire factoren (ANF) genoemd.
Dit zijn antilichamen gericht tegen auto-antigenen in de celkern zoals
desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA), eiwitten of celkernextract.(33)
1.4.2 Diagnostische waarde van ANA
ANA zijn aanwezig in 95 % van de patiënten met SSc maar komen ook voor bij andere
CTD (bv. systeemlupus, Sjögren syndroom, polymyositis/dermatomyositis),
orgaanspecifieke AIZ, bacteriële en virale infecties en maligniteiten.(34-36)
Ook medicatie kan de vorming van ANA opwekken (bv. procaïnamide en
hydralazine).(37) Bovendien neemt de aanwezigheid van ANA toe met de leeftijd.(38)
Kortom, ANA is een gevoelige maar weinig specifieke merker in de diagnose van
systeemsclerose. Dit impliceert dat indien er een negatieve ANA gevonden wordt bij
een patiënt waarbij men klinisch SSc vermoedt (bv. omwille van de aanwezigheid van
fibrotische letsels), de ziekte nagenoeg kan uitgesloten worden. Positiviteit voor ANA is
daarentegen onvoldoende om de ziekte te bevestigen. Gezien de lage specificiteit is
verdere identificatie van de ANA vereist (cfr. 1.4.5.). Een overzicht van de specificiteit
en sensitiviteit van ANA in het kader van de verschillende CTD wordt weergegeven in
Tabel 1.1.
7
Tabel 1.1: Sensitiviteit en specificiteit van ANA
voor de voornaamste reumatische aandoeningen.
Specificiteit t.o.v. controlepopulatie (%)
Reumatische
aandoeningen
Aantal
studies
Sensitiviteit
(%)
Andere
eCTD
Niet reumatische
eCTD
Gezonde
controles
Totaal
SLEa 21 93 75 78 78 57
SScb 30 85 75 71 71 54
PM/DMc 14 61 91 82 82 63
SSd 16 48 91 71 71 52
RAe 14 41 85 82 82 56
aSLE: systemische lupus erythematosus,
bSSc: systeemsclerose,
cPM/DM: polymyositis/
dermatomyosistis, dRA: reumatoïde artritis,
eCTD: connective tissue disease. Tabel overgenomen uit (39).
Naast de lage specificiteit beperkt eveneens de lage prevalentie van SSc het
diagnostisch nut van ANA in de diagnose van deze ziekte. De diagnostische waarde
kan verhoogd worden door pas te gaan testen indien er een klinisch vermoeden is van
SSc (hoge pre-test probabiliteit).
1.4.3 Detectie van ANA
1.4.3.1 Indirecte immunofluorescentie
Klassiek wordt de indirecte immunofluorescentie (IIF) test gebruikt voor detectie van
ANA. Volgens ACR advies blijft ook vandaag IIF de aangewezen techniek voor ANA
screening. (cfr. http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf)
Het principe van deze test wordt afgebeeld in Figuur 1.4. HEp2(000) cellen gefixeerd op
draagglaasjes worden geïncubeerd met patiënt serum. Indien er ANA aanwezig zijn
wordt er een stabiel antigen-antilichaam complex gevormd. Aankleuring van dit complex
gebeurt met een secundair anti-humaan IgG antilichaam gebonden aan een
fluorochroom (bv. FITC), waardoor detectie onder een fluorescentiemicroscoop mogelijk
wordt.(40) Zowel het patroon (het microscopisch beeld van de HEp2(000) cellen) als de
intensiteit van de ANA fluorescentie worden beoordeeld.(39)
8
Figuur 1.4: Het principe van de indirecte immunofluorescentie.
Het te testen serum voor ANA IIF analyse wordt vooraf verdund. De aanbevolen
startdilutie (ook wel de screeningstiter genoemd) varieert van 1:40 tot 1:160.
Verschillende richtlijnen, o.a. the National committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), Centers for Disease Control (CDC), de Wereldgezondheidsorganisatie
(WHO) geven ieder hun aanbevelingen over de meest nuttige screeningstiter.(41) Bij
het detecteren van een positief staal kunnen dan verdunningsreeksen gemaakt worden
om de eindtiter te bepalen. De eindtiter is de hoogste verdunning van het serum dat nog
een positieve fluorescentie met een duidelijk patroon geeft en is recht evenredig met de
antilichaamconcentratie. Een alternatief is het visueel scoren van de ANA fluorescentie-
intensiteit (negatief of een score van 1+ t.e.m. 5+). (42)
In talloze naslagwerken zijn er meer dan 40 ANA IIF patronen beschreven, maar niet
alle patronen zijn even klinisch relevant.(33) Daarnaast komen, in geval van
aanwezigheid van verschillende auto-antilichamen in het serum, ook gecombineerde
patronen voor. Er is geen eenduidig verband tussen patroon en auto-antistof, noch
tussen patroon en ziekte.(33, 43) ANA patronen zijn dus noch specifiek, noch
diagnostisch. Een uitzondering hierop is het centromeer patroon dat sterk suggestief is
voor de aanwezigheid van anti-centromeer-B antistoffen.(39, 44) Op HEp-2(000) cellen
worden klassiek vier hoofpatronen onderscheiden: het homogeen, gespikkeld,
nucleolair en centromeer patroon. Figuur 1.5. geeft foto’s weer van deze
fluorescentiepatronen.
Fluorochroom (FITC)
Secundair antilichaam
Primair antilichaam
Antigen
9
Figuur 1.5: De vier voornaamste patronen (homogeen, gespikkeld, nucleolair en
centromeer) met telkens een cel in rust en een cel in deling (mitosefase) omcirkeld.
1.4.3.2 Enzyme Immunoassay
Alternatief kan een enzyme immunoassay (EIA) gebruikt worden voor de ANA
analyse.(45, 46) Hierbij worden nucleaire antigenen, gebonden op een vaste drager,
geïncubeerd met patiëntenserum. Indien er ANA in het serum van de patiënt aanwezig
zijn, binden ze met hun specifieke antigenen. Aankleuring van deze antigen-antilichaam
complexen gebeurt met een secundair enzym-gebonden anti-humaan IgG antilichaam.
Visualisatie gebeurt door toevoeging van een chromogeen substraat dat door het
enzym wordt omgezet in een gekleurd product. De kleurintensiteit is recht evenredig
met de ANA concentratie. In het routine laboratorium gebeuren EIA meestal op
geautomatiseerde systemen die de hoeveelheid kleurreactie spectrofotometrisch meten
en vergelijken met die van standaarden met gekende concentraties aan de hand van
een kalibratiecurve.(47)
De nucleaire antigenen aanwezig in commerciële EIA voor ANA analyse zijn vaak van
verschillende samenstelling. Hierdoor hebben deze EIA een verschillende sensitiviteit.
In sommige kits is volledig HEp-2 kernextract aangebracht op de drager, in andere kits
is een selectie van gezuiverde of recombinante antigenen aanwezig (meestal een
combinatie van SSA/Ro, SSB/La, Sm, U1-RNP, Jo-1 en Scl-70).(39, 48, 49)
1.4.3.3 Voor- en nadelen van ANA detectie
De manuele IIF heeft vele nadelen, o.a. inter- en intra-laboratorium variabiliteit.
Vandaar zijn er enkele alternatieven ontwikkeld.(50) Het eerste alternatief is de EIA.
Volgens de ACR blijft de IIF echter de aangewezen techniek voor ANA detectie. Dit
HO
MO
GE
EN
CE
NT
RO
ME
ER
GE
SP
IKK
EL
DN
UC
LE
OL
AIR
Positief
Egale kern
Negatief
Granulair
Nucleoli
zichtbaar
Positief of
negatief’46’ puntjes
GespikkeldH
OM
OG
EE
NC
EN
TR
OM
EE
R
GE
SP
IKK
EL
DN
UC
LE
OL
AIR
Positief
Egale kern
Negatief
Granulair
Nucleoli
zichtbaar
Positief of
negatief’46’ puntjes
Gespikkeld
10
voornamelijk o.w.v. de hogere sensitiviteit van IIF in vergelijking met de EIA waarbij
slechts een beperkt aantal antigenen getest worden. Dit kan verbeterd worden door
toevoeging van nieuwe gezuiverde of recombinante antigenen. Daarentegen detecteert
EIA wel anti-ENA antilichamen (o.a. anti-SSA en anti-Jo1) die vaak gemist worden bij
IIF.(43) Een globaal overzicht van de voor- en nadelen van IIF en EIA is terug te vinden
in Tabel 1.2.
Tabel 1.2: Voor- en nadelen van IIF versus EIA. (42, 44)
IIF EIA
Prijs Goedkope reagentia Dure reagentia
Werkbelasting Arbeidsintensief en tijdrovend
Automatisatie mogelijk
Informatie over patroon Ja Neen
Sensitiviteit Hoog Afhankelijk van de uitgebreidheid in geïncludeerde antigenen als
substraat. (Maar theoretisch steeds minder dan IIF).
Specificiteit Laag Hoog
Reproduceerbaarheid Moeilijk te standaardiseren + subjectiviteit van de
analist
Hoog door automatisatie
1.4.3.4 Geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie
Een recente evolutie in ANA detectie is het beschikbaar worden van commerciële
systemen die een geautomatiseerde IIF aflezing toelaten. Dergelijk systeem combineert
de voordelen van IIF (hoge gevoeligheid) en EIA (automatisatie en standaardisatie) met
als gevolg minder werkbelasting en een lagere inter- en intra-laboratorium
variabiliteit.(50, 51) Deze geautomatiseerde IIF systemen differentiëren hoofdzakelijk
tussen positief versus negatief voor ANA. Sommige systemen laten zelfs een objectieve
patroonherkenning toe.(51) Daarnaast wordt er vaak een kwantitatieve waarde per staal
toegekend. De bruikbaarheid van deze waarde als alternatief voor de ANA titer is tot op
heden nog niet gedocumenteerd en vermoedelijk systeemafhankelijk.
1.4.4 Identificatie van ENA
Aangezien IIF weinig specifiek is voor ENA (extraheerbare nucleaire antigenen)
detectie, zijn er meer specifieke testen nodig (cfr. 1.4.5.). ENA zijn oplosbare
nucleoplasmatische eiwitten die in het verleden vanuit de kern geëxtraheerd werden
met zout. Volgens de richtlijnen moeten volgende anti-ENA antilichamen routinematig
11
opgespoord worden: antilichamen tegen Jo-1, histonen, ribosomaal P, Scl-70, SSA/Ro,
SSB/La, Sm en RNP.(39) Een veel gebruikte techniek voor de uitwerking van anti-ENA
antilichamen is de line immunoassay (LIA).
In Tabel 1.3. worden auto-antilichamen besproken die klinisch relevant zijn voor SSc.
Antilichamen gericht tegen centromeer, topoisomerase I (synoniem Scl-70), Th/To en
RNA-polymerase III komen nagenoeg uitsluitend voor bij SSc patiënten. Deze vier
antilichamen vertegenwoordigen 75 à 80% van de ANA in SSc. Anti-PM/Scl en anti-
fibrillarine zijn geassocieerd met SSc maar in overlap met andere CTD.(52) Deze SSc
specifieke/geassociëerde antistoffen komen in theorie mutueel exclusief voor.(3) Er zijn
associaties gelegd tussen het voorkomen van deze antistoffen en de subclassificatie op
basis van de uitgebreidheid van huidaantasting.(16) Verder hebben deze specifieke
antistoffen ook een diagnostisch belang (cfr. 1.3.4). Bijgevolg is het zinvol om deze
antistoffen verder te identificeren.
Tabel 1.3: Prevalentie van SSc-geassocieerde antistoffen, functie van hun antigenen en
de belangrijkste identificatiemethoden. Tabel opgemaakt op basis van volgende
referenties (20, 21, 53, 54).
Antistof Prevalentie
in fSSC
Functie van het antigen Identificatie
Anti-topoisomerase I
(Scl-70)
9-39% ontvouwen van DNA aLIA, bWB of cproteïne
radio-IP
Anti-centromeer 16-39% scheiden van
chromosomen bij celdeling
dIIF, bWB of aLIA
Anti-RNA-polymerase I/III 4-25% RNA synthese cproteïne radio-IP
Anti-fibrillarine ( U3RNP) 1-6% bewerken van pre-
ribosomaal RNA
bWB of
cproteïne radio-IP
Anti-Th/To 1-7% bewerken van transfer
RNA en ribosomaal RNA
eRNA IP
Anti-PM/Scl 0-6% RNA bewerken bWB of
c proteïne radio- IP
aLIA: line immunoassay;
bWB:
western blotting,
cproteïne radio-IP: proteïne radio-immunoprecipitatie,
dIIF:
indirecte immunofluorescentie, eRNA IP: RNA immunoprecipitatie,
fSSc: systeemsclerose.
12
1.4.5 Reflextesting
Zoals reeds vermeld is de ANA IIF een screeningstest met hoge sensitiviteit maar lage
specificiteit. Verdere identificatie van de ANA met meer specifieke testen is belangrijk
om de diagnostische waarde te verhogen. Deze testen worden vaak pas in tweede lijn
uitgevoerd bij een positieve ANA IIF. Deze ‘getrapte’ analyse wordt cascade-testing of
reflextesting genoemd.(55, 56) In het klinisch laboratorium UZ Gent wordt momenteel
een driestapscascade uitgevoerd waarbij tussen IIF en LIA een geautomatiseerde EIA
met een mengsel van antigenen is geplaatst (cfr. Figuur 1.6.)
Figuur 1.6: De driestapscascade met twee sceeningsstappen (IIF en EIA), gevolgd door
een identificatiestap van anti-ENA antilichamen.
ANA screening met IIF
ANA screening met EIA
Anti-ENA identificatie met LIA
(anti-CENP-B, anti-Jo1,
anti-histonen, anti-ribosomaal P,
anti-topoisomerase I, anti-SSA,
anti-SSB, anti-Sm, anti-PM/Scl, anti-
RNA-polymerase III en anti-U1RNP)
13
2. OBJECTIEVEN
Detectie van ANA is belangrijk in de diagnostiek van CTD. Volgens ACR is de manuele
IIF de gouden standaard voor screening naar ANA. Er zijn echter heel wat nadelen
verbonden aan de manuele IIF test (cfr.1.4.3.3.). Hierdoor zijn de laatste jaren een
aantal alternatieven gecommercialiseerd. Een eerste alternatief is een ANA
screeningstest op basis van EIA met een beperkt aantal recombinante antigenen. Dit
impliceert dat niet alle antistoffen geassociëerd met SSc kunnen worden opgepikt. Een
tweede alternatief is de geautomatiseerde ANA IIF analyse. Hierbij wordt de brede
screening (hoge sensitiviteit voor de SSc geassociëerde antistoffen) gecombineerd met
het aspect van automatisatie en standaardisatie (gezien een visuele waarneming wordt
omgezet in een gestandaardiseerde kwantitatieve waarde) (cfr.1.4.3.4.).
De algemene doelstelling van deze thesis is de diagnostische performantie van de
automatische ANA IIF evalueren in SSc patiënten. Hiervoor zal een geautomatiseerde
ANA IIF met behulp van de Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België)
worden uitgevoerd op drie cohorten (systeemsclerose patiënten (SSc), healthy donors
(HD) en disease controls (DC)). Dit systeem geeft in eerste lijn een interpretatie op
basis van een kwantitatieve waarde (probabiliteitsindex) die in tweede lijn kan worden
bijgestuurd door de gebruiker op basis van de digitale beelden. Om die reden zal de
diagnostische waarde voor beide strategieën worden geëvalueerd (cfr. 4.1. en 4.2.) en
vergeleken (cfr. 4.3). Bovendien zal onderzocht worden of er een correlatie bestaat
tussen de klassieke ANA IIF titer en de kwantitatieve waarde bekomen m.b.v. de
geautomatiseerde analyse (cfr. 4.4.).
In de eerste fase zal een ROC analyse worden gebruikt om de optimale afkapwaarden
op de probabiliteitsindex te evalueren (cfr. 4.1.1.). Deze in huis cut-off’s zullen dan
worden gebruikt ter berekening van de performantie-karakteristieken (sensitiviteit en
specificiteit (cfr. 4.1.1.), likehoodratio’s (cfr. 4.1.5. en 4.2.4.)). Ook de verdeling van de
titers en de patronen bekomen met en zonder bijsturing zullen in kaart worden gebracht
(cfr. 4.1.2., 4.1.4. en 4.2.1, 4.2.3.). Voor de SSc populatie zal ook onderscheid worden
gemaakt tussen de antistof subsets (cfr. 4.1.3. en 4.2.2.) en zal gekeken worden naar
de gevoeligheid en juistheid voor het oppikken van het centromeer patroon (cfr. 4.2.3.).
14
3. MATERIALEN EN METHODEN
3.1 STAALVERZAMELING
De geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie test werd uitgevoerd op drie
cohorten (SSc, HD en DC). De analyse gebeurde voor alle patiënten op serum,
gescheiden van de bloedcellen door middel van centrifugatie (bij 1880g gedurende 10
min). Het staal werd eerst op kamertemperatuur gebracht alvorens de analyse uit te
voeren. Serum werd bewaard bij 2-8°C (>7 dagen) of -20°C (langdurige bewaring).
De eerste cohorte bestaat uit 141 patiënten met systeemsclerose (SSc), afkomstig van
de UGent Scleroderma unit (dienst reumatologie UZ Gent). Deze SSc patiënten werden
volgens een bepaald algoritme opgevolgd om de kennis omtrent deze zeldzame ziekte
uit te breiden. Alle patiënten voldeden aan de Leroy en Medsger criteria.(25) Het serum
dat in deze studie werd gebruikt, is afkomstig van de bloedafname bij diagnose. De
leeftijd varieert van 20 tot 82 jaar met het hoogste percentage (6.40%) bij 46 jaar, M:V
ratio bedraagt ongeveer 1/3 (76.6% vrouwen en 23.4% mannen).
De tweede cohorte bevat 78 disease controls (DC), dit zijn patiënten met een andere
ziekte dan de bestudeerde ziekte (SSc) en zonder geassocieerde ANA (polymyalgia
rheumatica, osteoarthritis, ANCA geassociëerde vasculitis, spondyloarthritis). De
verdeling en classificatie van de disease controls wordt weergegeven in Tabel 3.1. De
M:V ratio bedraagt ongeveer 1/1.3 (56.4% vrouwen en 43.6% mannen).
Tabel 3.1: Verdeling en classificatie van de disease controls.
Disease controls Aantal (n) Percentage (%)
PMRa 13 16.7
OAb 22 28.2
AAVc 5 6.4
SpAd 38 48.7
Totaal 78 100
aPMR: Polymyalgia rheumatica,
b OA: Osteoarthritis,
c AAV:
ANCA geassociëerde vasculitis, dSpA: Spondyloarthritis.
De laatste cohorte bestaat uit 100 gezonde bloeddonoren (HD) afkomstig van het Rode
kruis Vlaanderen (patiënten zonder een auto-immuunziekte). Op al deze stalen werd
aspartaat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) en C-reactief
15
proteïne (CRP) bepaald en een waarde binnen de referentiewaarden gevonden. Hoge
serumlevels van AST/ALT en CRP in het bloed wijzen respectievelijk op leverschade en
inflammatie of weefseldestructie. Deze testen werden uitgevoerd ter confirmatie dat
deze donoren inderdaad gezond waren (analyse gebeurde op de Cobas 6000, Roche
diagnostics, Brussels, Belgium - dit toestel werd verder niet besproken aangezien dit
toestel geen deel uitmaakt van de studie).
3.2 STAALVOORBEREIDING
3.2.1 Principe
De staalvoorbereiding bestaat uit twee stappen: ten eerste de aanmaak van
verdunningsreeksen van de sera in een microtiterplaat, vervolgens pipettering van deze
verdunningen op de IIF plaatjes. Beide stappen werden uitgevoerd m.b.v. een
automatische pipetteerautomaat (PhD toestel) (cfr. Figuur 3.1).
Figuur 3.1: Het PhD toestel is een automatische pipetteerautomaat
gestuurd door een computer. (cfr. http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product.htm)
Het PhD toestel heeft 2 naalden. De afzuignaald zuigt gedurende verschillende
wasstappen de overtollige vloeistof weg naar de afvalfles m.b.v. de peristaltische pomp,
terwijl de kortere naald exacte volumina opzuigt en pipetteert m.b.v. een volumetrische
pomp.(57)
3.2.1.1 Aanmaak van de verdunningsreeksen
Voor elk patiëntenstaal werd een verdunningsreeks gemaakt van 1:40 tot 1:2560. De
DC en HD werden eerst in een dilutiereeks van 1:40 en 1:80 ingezet en pas verder
uitgetitreerd indien ze nog positief waren bij deze verdunningen. Tabel 3.2. toont een
overzicht van hoe de verdunningen gemaakt werden door het PhD toestel.
16
Tabel 3.2: Verdunningen PhD toestel.(57)
Verdunning Aantal µl staal Aantal µl PBS
1:40 5 195
1:80 3 237
1:160 2 318
1:320 20 µl uit 1:40 140
1:640 10 µl uit 1:40 150
1:280 6 µl uit 1:40 186
1:2560 3 µl uit 1:40 189
3.2.1.2 Inzetten van de IIF plaatjes
Het inzetten van de IIF plaatjes bestaat uit verschillende stappen (cfr. Inleiding 1.4.3.1):
Aanbrengen van het staal op het draagglaasje waarop substraat gefixeerd
is (=ANA plaatje).
Een eerste incubatie van 30 minuten.
Wassen met PBS-buffer om de niet gebonden antilichamen van het ANA-
plaatje te verwijderen.
Aanbrengen van het conjugaat (anti-humaan IgG gebonden aan FITC) op
het ANA-plaatje.
Een tweede incubatie van 30 minuten.
Wassen met PBS-buffer om de niet gebonden antilichamen van het ANA-
plaatje te verwijderen.
Tegenkleuring met Evans Blue.
Monteren van het ANA-plaatje.
Als substraat werd gebruik gemaakt van HEp-2000 cellen, dit staat voor Human
Epithelia cellen type 2000, afkomstig van een larynxcarcinoma cellijn. Deze cellen zijn
HEp2-cellen getransvecteerd met humaan cDNA dat codeert voor SSA/Ro60 waardoor
10 tot 15% van deze cellen een overproductie van dit antigen vertonen. Hierdoor
verhoogt de sensitiviteit voor antistoffen gericht tegen dit antigen.(58)
3.2.2 Materialen
Toestellen
17
Pipetteerautomaat (PhD, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)
Reagentia:
PBS buffer poeder (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)
Gedestilleerd water (Laboratoire Aguetant, Lyon, France)
Monteervloeistof (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)
Evans Blue (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)
HEp-2000 ANA-Ro kit (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA) bevat:
- HEp-2000 plaatjes (14 wellen per plaat)
- Geit anti-humaan IgG gemerkt met FITC (conjugaat)
3.2.3 Methode
1. Haal de stalen, plaatjes en reagentia (conjugaat, Evans Blue, monteervloeistof)
uit de koelkast en laat 10-15 minuten op kamertemperatuur staan.
2. Maak PBS buffer aan als volgt: los een zakje PBS poeder op in 1 liter
gedestilleerd water (1 maand houdbaar in de koelkast bij 2-8°C).
3. Maak Evans blue aan als volgt: voeg aan 30 ml PBS buffer 10 µl 0.5% Evans
Blue toe in een reagensflesje en zwenk goed om.
4. Zet de computer en het PhD toestel aan (cfr. Figuur 3.1.).
5. Lijn de naalden van het toestel uit. (cfr. Figuur 3.2. voor de correcte posities).
Figuur 3.2: Juiste positie van de naalden.(57)
6. Spoel het toestel met gedestilleerd water en vervolgens met PBS buffer
7. Plaats de reagentia en stalen op het toestel (cfr. Figuur 3.3. voor een plattegrond
van de posities).
8. Start de run op de PhD. De PhD voert de stappen beschreven onder 3.2.1.2.
geautomatiseerd uit.
18
9. Breng, nadat de run is afgelopen, in een aantal welletjes een druppel mounting
medium aan en dek de plaatjes af met een dekglaasje (vermijd luchtbellen en
beweging van het dekglaasje). De immuonfluorescentieplaatjes kunnen nu op de
geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop geladen worden. Gemonteerde
plaatjes kunnen 2 dagen in het donker in de koelkast bewaard worden.
Opmerking:
Een positieve (bv. een gekend, gespikkeld 4+/5+ serum) en een negatieve controle
(pool van negatieve stalen) wordt meegenomen in elke run. Hiermee wordt
gecontroleerd of het proces goed verlopen is (technische validatie). Indien de resultaten
van de controles niet overeenkomen met de vooropgestelde waarden wordt de
aanmaak van de plaatjes herhaald.
Figuur 3.3: Het PC-scherm geeft een plattegrond van de staalposities, de
immunofluorescentieplaatjes en de reagentia op het PhD toestel.
3.3 GEAUTOMATISEERDE AFLEZING VAN ANA IIF
3.3.1 Principe
De aflezing van de ANA-plaatjes gebeurt met behulp van fluorometrie. Dit meetprincipe
betekent dat wanneer er elektromagnetische straling met een bepaalde golflengte
geabsorbeerd wordt, de moleculen in een geëxciteerde, hogere energietoestand
worden gebracht (excitatie). Hierna vallen de moleculen terug naar een grondtoestand
met lagere energie door het uitzenden van een foton (licht) met een lagere energie
(langere golflengte) in vergelijking met de geabsorbeerde energie
IIF plaatjes stalen
Controles en
reagentia Verdunningen
(microtiterplaat)
19
(emissie/fluorescentie) (cfr. Figuur 3.4.).(47) Het absorptiespectrum van de meeste
fluorescente verbindingen is 300 tot 550 nm.(47)
Figuur 3.4: Het ontstaan van fluorescentie.
(cfr. http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/a250/public_html/theorie.shtml)
Het principe van de fluorescentiemicroscoop is als volgt: invallend licht afkomstig van
een lichtbron (kwiklamp of light emitting diode-lamp (LED-lamp)), gaat door de excitatie-
monochromator (dit is een filter die enkel straling doorlaat met een specifieke golflengte,
nodig om het fluorochroom te exciteren). Licht met de geselecteerde golflengte wordt
door een dichromatische spiegel (‘beam splitter’) weerkaatst en via het objectief op het
preparaat gericht dat het licht absorbeert. Het uitgestraalde licht met een bepaalde
golflengte gaat via hetzelfde objectief door een dichromatische spiegel (die het
fluorescerende emissie-licht doorlaat i.t.t. tot het excitatie-licht). Het fluorescerende
emissie-licht gaat naar een emissie-monochromator (dit is een filter die enkel straling
doorlaat met een specifieke golflengte, nodig voor detectie), die vervolgens doorheen
het oculair wordt bekeken. (cfr. http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm)
Bij een automatische fluorescentiemicroscoop wordt een digitale kleurencamera
gebruikt in plaats van een oculair. De digitale kleurencamera neemt foto’s van de
wellen, die dan op een PC-scherm worden getoond. Het principe van een
fluorescentiemicroscoop wordt in Figuur 3.5. weergegeven.
20
Figuur 3.5: Principe van een fluorescentiemicroscoop.
(cfr. http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html)
De werkstroom en automatische interpretatie van een digitale fluorescentiemicroscoop
wordt weergegeven in Figuur 3.6. De automatische fluorescentiemicroscoop doet
achtereenvolgens een focussering, differentiatie positief/negatief en een
patroonherkenning van de positieve wellen.
Figuur 3.6: Werkstroom van een digitale fluorescentiemicroscoop.
3.3.2 Materialen
Toestellen:
Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België):
Hardware: (cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-
features-and-specifications.htm)
- Software van de computer (Windows XP SP3 Professional, harde schijf:
4x500GB, Processor: Xeon quadcore, 4GB RAM)
- Lichtbron: LED (2W Power) met B2A filter (Ex: 450-490nm, DM: 505 nm)
- Digitale kleurencamera (QiCam QImaging 12bit x pixel, 1392x1040 pixels,
1/2" optical format)
- Gemotoriseerd revolver met objectief lenzen 4x en 40x
- Monitor (LCD Eizo 24’’ – 16/9, Scherm Resolutie, 1920x1200 pixels)
- Gemotoriseerd platform voor maximaal 5 plaatjes
Focussering Differentiatie pos/neg Scanning Patroon
21
3.3.3 Methode
De Zenit G-sight is een automatische fluorescentiemicroscoop ontwikkeld door de
Italiaanse firma HESP en in België verdeeld door A. Menarini Diagnostics. Vanaf maart
2012 beschikbaar in het laboratorium klinische biologie van het UZ Gent (cfr. Figuur
3.7.). De Zenit G-sight maakt gebruik van een LED lamp als lichtbron. Het gebruik van
een LED-lamp zorgt voor minder snelle fotobleaching (zwakkere excitatie en emissie).
Bovendien hebben deze lampen een langere levensduur en verbruiken ze minder
energie in vergelijking met kwiklampen die vroeger gebruikt werden in de conventionele
manuele fluorescentiemicroscoop.
(cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-
Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm)
De Zenit G-sight maakt volautomatisch digitale beelden van de IIF-plaatjes, die
vervolgens met een hoge resolutie op het verbonden computerscherm kunnen bekeken
worden.
Figuur 3.7: Zenit G-sight met gekoppelde computer.
(cfr. http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm)
Voor het inscannen van de plaatjes heeft men de keuze tussen drie instellingen: een
small, medium of een full scan. Tabel 3.3. geeft de verschillen tussen de drie scan
opties weer. In het UZ Gent is geopteerd om te werken met de instelling ‘medium scan’
gezien dit een compromis is tussen de snelheid en het aantal foto’s.
22
Tabel 3.3: Vergelijking van de verschillende scanmodi
Scanmodus Aantal
focuspunten
Aantal
foto’s
Tijdsduur (min)
Small scan 5 6 2
Medium scan 5 50 3
Full Scan 13 220 6
Eerst zoekt de microscoop met het 4x objectief het meest optimale beeld (ruwe
focussering) ter hoogte van de gekleurde coating van het plaatje. Eens het optimale
beeld is vastgesteld, gebruikt de Zenit G-sight het 40x objectief voor de fijne focussering
in de well zelf. De microscoop focust, naargelang de gekozen scanmodus, op 5 of 13
verschillende plaatsen in 1 well (cfr. Figuur 3.8.). Bij de medium scan, gaat de
microscoop focussen op 5 punten, het gemiddelde van de focusafstand maken en deze
afstand gebruiken voor het inscannen van het plaatje (1/4 van de well). Bij de full scan,
gebeurt dit op basis van 13 punten en wordt de volledige well gescand.
Figuur 3.8: Well met 13 focuspunten (links –full scan)
of 5 focuspunten (rechts – medium scan/small scan).
Gedurende de focussering maakt de microscoop onderscheid tussen een positief en
een negatief beeld op basis van een cut-off waarde voor de probabiliteitsindex (PI) (cfr.
Tabel 3.4). Deze index wordt per well afgeleid uit de tijd nodig voor het vinden van een
scherp beeld en is omgekeerd evenredig met de fluorescentie-intensiteit.
(cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-features-
of-Zenit-G-Sight.htm)
23
Tabel 3.4: De verschillende probabiliteitsindexen met hun respectievelijke kwalitatieve
beoordeling.
Probabiliteitsindex Interpretatie
<8 Negatief
8-50 Onzeker negatief (negative uncertain)
> 50 Positief
NB.: De cut-off’s van 8 en 50 werden door de firma gekozen om respectievelijk een zo hoog mogelijke sensitiviteit en specificiteit te
behalen.
Vervolgens zal de Zenit G-sight verschillende naast elkaar liggende foto’s nemen met
de digitale kleurencamera (cfr. Tabel 3.3.) die finaal als één beeld voor de gebruiker
worden weergegeven op het computerscherm.
Indien het beeld door de Zenit G-sight als positief wordt beoordeeld, wordt een
patroonherkenning uitgevoerd. Het systeem is getraind om 5 patronen te herkennen,
namelijk homogeen, gespikkeld, centromeer, nucleolair en mitochondriaal. Deze
patroonherkenning is gebaseerd op een combinatie van statistische, geometrische en
morfologische kernmerken (> 100 distinctieve kenmerken voor patroonherkenning). (cfr.
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-
autoimmune-disorder-diagnostics.htm) Verdere details m.b.t. het theoretisch algoritme achter
de patroonherkenning worden niet vrijgegeven door de firma. Zie Figuur 3.9 voor een
schematische voorstelling van de opeenvolgende stappen uitgevoerd door Zenit G-sight
bij de patroonherkenning.
Figuur 3.9: Schematische voorstelling van de werkwijze Zenit G-sight.
Focussering en scanning
Probabiliteitsindex
Negatief
Positief
Homogeen
Gespikkeld
Centromeer
Nucleolair
Mitochondriaal
Onzeker negatief
24
Het hoofdmenu van de software bestaat uit drie onderdelen: scanning, validatie en
archief. (cfr. figuur 3.10.).
Na inbreng van de te analyseren stalen op niveau van de software en plaatsing van de
plaatjes op het platform (maximale capaciteit van 5 plaatjes per run) kunnen de IIF-
plaatjes via het scanning-menu worden gescand. Eens de sessie is afgelopen, kunnen
de beelden met een hoge resolutie bekeken worden op het computerscherm ter hoogte
van het validatie-menu. Validatie (beelden bekijken en beoordelen) gebeurt best in een
donkere kamer. Er wordt bijgestuurd indien de gebruiker niet akkoord is met het
resultaat (interpretatie positief/negatief en patroon) gesuggereerd door de Zenit G-sight.
De software archiveert vervolgens de genomen beelden die nadien nog kunnen
bekeken worden. (cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-
Sight/What-are-the-key-features-of-Zenit-G-Sight.htm)
Figuur 3.10: Hoofdmenu Zenit G-sight.
(cfr. http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm)
3.4 BEPALING VAN SSC-GEASSOCIEERDE ANTISTOFFEN MET BEHULP VAN
EEN LINE IMMUNOASSAY
Identificatie van de meest voorkomende SSc geassocieerde antilichamen (anti-
centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werd uitgevoerd met
behulp van een LIA op 141 patiënten met SSc. Deze test vertoont een goede correlatie
met de tijdrovende en werkbelastende conventionele confirmatietechnieken (zoals
western blot, immunodiffusie, immunoprecipitatie,..) voor de detectie van de SSc
specifieke antilichamen.(59)
25
3.4.1 Principe
LIA is een test voor het opsporen van specifieke auto-antilichamen. Hierbij wordt een
selectie van relevante antigenen gecoat op een vaste drager in de vorm van een strip
(bv. een polystyreen strip) (cfr. Figuur 3.11.). De gecoate antigenen kunnen van
recombinante of natieve oorsprong zijn.
Indien in het serum auto-antistoffen aanwezig zijn gericht tegen de gecoate antigenen
ontstaat antistof – antigen binding. Vervolgens wordt een secundair anti-humaan IgG
antilichaam gebonden aan een enzym (bv. alkalisch fosfatase) toegevoegd. Dit complex
wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van een substraat dat door het enzym
wordt omgezet in een gekleurd product (bv. NBT/BCIP (nitrobluetetrazoliumchloride/5-
Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate).(60) De resultaten kunnen vervolgens visueel
worden afgelezen of worden ingescand met behulp van een gekalibreerde scanner om
een kwantitatief resultaat te bekomen.
Figuur 3.11: Een strip gecoat met 13 antigenen en een controle.
(cfr. http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=aak_gegen_zellkerne_ana&L=1.htm)
Het inzetten van de strips bestaat uit verschillende stappen:
Aanbrengen van het verdund serumstaal op de strips waarop de
antigenen gecoat zijn.
Een eerste incubatie van 30 minuten.
Wassen met wasbuffer om de niet gebonden antilichamen van de strips te
verwijderen.
Aanbrengen van het verdund conjugaat (secundair anti-humaan IgG
antilichaam gebonden aan een enzym) op de strips.
Een tweede incubatie van 30 minuten.
26
Wassen met wasbuffer om de niet gebonden antilichamen van de strips te
verwijderen.
Toevoegen van het substraat.
Een derde incubatie van 10 minuten.
Stopzetten van de reactie door afzuigen van het substraat, nadien wassen
met gedestilleerd water.
Na het drogen zijn de strips zijn klaar om visueel af te lezen of in te
scannen.
In het UZ Gent worden de stalen automatisch ingezet met het was- en incubatietoestel,
de EuroBlotmaster (cfr. Figuur 3.12.). Digitalisatie van de resultaten gebeurt met behulp
van de EuroLineScan software (cfr. Figuur 3.13.).
Figuur 3.12: de EuroBlotmaster is een automatische was- en incubatietoestel.
(cfr. http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm)
Figuur 3.13: De strips in de incubatietray (links) worden gescand m.b.v. EUROLineScan
(rechts). (cfr. http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm)
3.4.2 Materialen
Toestellen
EuroBlotmaster (Euroimmun, Lübeck, Germany)
EUROLineScan software (Euroimmun, Lübeck, Germany)
27
Reagentia
De Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay test kit
(Euroimmun, Lübeck, Germany) bevat:
- 16 strips gecoat met de 13 antigenen: Scl-70, CENP-A, CENP-B, twee
RNA-polymerase III subunits, fibrillarine, NOR90, Th/To, PM/Scl100,
PM/Scl75, Ku, PDGFR en Ro-52. Met uitzondering van Scl-70 (gezuiverd
natief) zijn alle antigenen van recombinante oorsprong.
- Positieve controle (IgG, humaan)
- Alkalisch fosfatase gelabeld anti-humaan IgG (geit) (conjugaat)
- Substraat (NBT/BCIP)
- Sample buffer
- Wasbuffer
Opmerking: enkel de data voor de meest voorkomende antistoffen (anti-centromeer,
anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) zijn gebruikt in deze studie.
3.4.3 Methode(60)
1. Haal de stalen, strips en reagentia (conjugaat, wasbuffer en sample buffer) uit de
koelkast en laat 30 minuten op kamertemperatuur komen.
2. Zet de Euroblotmaster aan (cfr. Figuur 3.12.).
3. Laad de strips en reagentia op het toestel.
4. Verdun de serum stalen en positieve controle in sample buffer als volgt: 15µl
staal/controle + 1,5 ml sample buffer.
5. Breng deze verdunningen aan op de strips.
6. De EuroBlotmaster voert vervolgens de stappen beschreven onder 3.4.1.
geautomatiseerd uit (vanaf eerste incubatie).
7. Digitaliseer de resultaten m.b.v. de EuroLineScan software. Interpreteer de
resultaten vervolgens op basis van de in huis afgeleide criteria.(59) (cfr. 3.4.4.)
Opmerking:
Een positieve commerciële controle wordt meegenomen in elke run. Hiermee wordt
gecontroleerd of het proces goed verlopen is (technische validatie). Indien de resultaten
van de controles niet voldoen aan de criteria vooropgesteld door de producent van de
kit wordt het inzetten van de strips herhaald.
28
3.4.4 Digitalisatie en interpretatie van de resultaten
De EuroLineScan is een gekalibreerde scanner die toelaat om de resultaten te
digitaliseren en om te zetten in een kwantitatief resultaat (Units (U)). Een staal wordt als
positief beschouwd als de cut-off voor de signaalsterkte overschreden wordt. (cfr. Tabel
3.5.)
Tabel 3.5: De auto-antistof met bijhorende criteria voor de signaalsterkte.(59)
Auto-antistof Cut-off voor positiviteit
Anti-centromeer anti-cenp-A of anti-cenp-B
>10U
Anti-Scl-70 anti-Scl-70 >10U
Anti-RNA-
polymerase III
anti-RNA-polymerase III/RP11
en RP155 >10U
Anti-PM/Scl anti-PM/Scl-75 en anti-
PM/Scl-100 >10U
3.5 DATA-ANALYSE
Statistische analyse werd uitgevoerd met PasW 19.0 statistical package (SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA).
29
4. RESULTATEN
4.1 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT
G-SIGHT ZONDER BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER
4.1.1 Distributiecurve en ROC analyse
De algemene doelstelling van deze thesis is evaluatie van de diagnostische
performantie van de automatische ANA IIF in SSc patiënten. Geautomatiseerde ANA
IIF m.b.v. de Zenit G-sight werd uitgevoerd op drie cohorten (141 SSc patiënten, 78 DC
en 100 HD). Differentiatie positief/negatief werd gedaan met behulp van een cut-off op
de PI. Figuur 4.1. geeft een distributiecurve weer van de indexen bij een dilutie 1:40 per
cohorte.
Figuur 4.1: Distributiecurve van de indexen per cohorte.
In de SSc populatie varieert de index van 1.5 tot 90.6 (mediaan= 86.6) en komen de
hoogste indexen voor. In de controlepopulatie varieert de index van 2.1 tot 88.8
(mediaan=9.1). De meeste gezonde bloeddonoren geven lage indexen, die variëren
van 0.9 tot 57.7 (mediaan= 7.2).
ROC-curve (receiver operating characteristic-curve) is een grafiek waarbij sensitiviteit in
de y-as wordt uitgezet tegenover 1 – specificiteit in de x-as. Elk punt op de curve stelt
een cut-off voor overeenkomstig met een bepaalde sensitiviteit en specificiteit.(61) De
sensitiviteit is het percentage patiënten met de bestudeerde ziekte die een positief
testresultaat hebben (% echt positieven) en specificiteit is het percentage patiënten
zonder de ziekte die een negatief testresultaat hebben (% echt negatieven).(62)
30
ROC-curven worden gebruikt om de optimale cut-off te kiezen. Een optimale test heeft
een sensitiviteit en een specificiteit van 100%. De cut-off waarde overeenkomstig met
de hoogste sensitiviteit en een specificiteit is het punt op de grafiek in de
linkerbovenhoek. Bij een lage cut off, is de sensitiviteit van een test hoger, maar is de
specificiteit lager en omgekeerd. De oppervlakte onder deze curve (AUC) is een maat
voor de accuraatheid van een diagnostische test (hoe dichter de AUC bij 1, hoe beter
de accuraatheid van de test).(61)
Figuur 4.2. en 4.3. geven de ROC-curves van respectievelijk de SSc versus HD en de
SSc versus DC. De oppervlakte onder de curve bedraagt respectievelijk 0.955 en 0.919
wat betekent dat de Zenit G-sight heel goed onderscheid kan maken tussen SSc
patiënten en gezonde bloeddonoren, maar ook tussen SSc patiënten en de zieke
controles.
De software van de firma van de Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem,
België) gebruikt verschillende afkapwaarden of cut-off’s op de PI (cfr. Tabel 3.4.). De
cut-off van 8 is door de firma gekozen met de bedoeling een zo hoog mogelijke
sensitiviteit (percentage vals negatieven minimaliseren) te hebben. Bij deze
afkapwaarde bekomen wij een sensitiviteit en specificiteit van respectievelijk 95.0%
(n=134/141) en 59.0% (n=59/100).
Aangezien de indirecte immunofluorescentie test een screeningstest is, wordt er
gestreefd naar maximale sensitiviteit. De gouden standaard (manuele microscopie)
heeft een sensitiviteit van 95.7% (n=135/141). Dit wil zeggen dat 95.7% van de SSc
patiënten positief zijn op de manuele microscopie. Met de automatische microscoop
wordt op onze cohorte een vergelijkbare sensitiviteit gehaald bij een cut-off van 6.
Sensitiviteit en specificiteit bij deze cut-off bedragen respectievelijk 96.5% (n=136/141)
en 39.0% (n=39/100).
Aangezien specificiteit afhankelijk is van de samenstelling van de controlegroep,
werden beide cut-off’s (PI ≥8 en PI ≥6) eveneens toegepast op de DC.(62) Bij deze
populatie wordt een specificiteit van respectievelijk 37.2% (n=29/78) en 23.1%
(n=18/78) teruggevonden.
31
Figuur 4.2: ROC-curve van de SSc patiënten versus gezonden met AUC=0.955.
Figuur 4.3: ROC-curve van de SSc patiënten versus zieke controles met AUC=0.919.
Naast de cut-off van 8 op de PI stelt de firma een tweede cut-off van 50 voor met de
bedoeling een zo hoog mogelijke specificiteit (percentage vals positieven
minimaliseren) te hebben. Door toepassing van deze cut-off op onze populaties wordt
een sensitiviteit van 83,7% (op SSc patiënten) en specificiteit van 93.6% (op HD)
gehaald. Met de gouden standaard (manuele microscopie) wordt daarentegen een
specificiteit van 94,0% (n=94/100, op de HD) bekomen. Gezien de interesse om
vergelijkbare specificiteit te bekomen met de geautomatiseerde analyse als de manuele
microscopie werd nagegaan bij welke cut-off dit criterium werd gehaald. Bij een cut-off
op de PI’s van 61.7 wordt respectievelijk een sensitiviteit en specificiteit van 79.4% en
94.9% gehaald.
32
4.1.2 ANA IIF titers zonder bijsturing in elk subset
Om inzicht te krijgen in de ANA titers bekomen op de Zenit G-sight werd van elk
patiënten staal een verdunningsreeks gemaakt (1:40 t.e.m. 1:2560). De controles
werden eerst 1:40 en 1:80 verdund en pas uitgetitreerd indien een positief beeld werd
bekomen bij deze titers. Een eindtiter is de hoogste verdunning van het serumstaal
waarbij nog een PI ≥8 wordt gezien. Dezelfde analyse werd uitgevoerd op basis van de
in huis afgeleide cut-off (PI ≥6).
Een overzicht van de ANA titers bekomen op de Zenit G-sight zonder bijsturing in
patiënten (SSc) en de controlegroepen (HD en DC) op basis van de onderste cut-off
waarden (PI ≥6 of ≥8) wordt weergegeven in Tabel 4.1. Er is geen verschil in distributie
van de titers voor beide cut-off’s waardoor slechts 1 tabel moest worden opgemaakt.
Tabel 4.1: Overzicht van de ANA titers op basis van de PI’s.
Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560 aSSc
(n=141)
3.5
(5)
3.5
(5)
5.0
(7)
17.7
(25)
9.2
(13)
28.4
(40)
15.6
(22)
17.0
(24) bHD
(n=100)
59.0
(59)
32.0
(32)
7.0
(7)
1.0
(1)
/ 1.0
(1)
/ /
cDC
(n=78)
39.7
(31)
38.5
(30)
15.4
(12)
5.1
(4)
1.3
(1)
/ / /
aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls. De getallen geven percentages per
subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de titers in elk subset is aangeduid in het vet.
Bij de cohorte van SSc patiënten, HD en DC is de titer met het hoogste percentage
respectievelijk 1:640 (28.4%), negatief (59.0%) en negatief (39.7%). Bij de HD en DC
wordt ook een relatief hoog percentage (respectievelijk 32.0% en 38.5%) gevonden dat
positief is met een titer van 1:40.
4.1.3 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets zonder bijsturing
Naast de globale performantie van de geautomatiseerde ANA analyse zonder bijsturing
werd ook gekeken naar de sensitiviteit voor het oppikken van de ANA positiviteit binnen
de verschillende antistof-subsets in de SSc populaties. Tabel 4.2. geeft een overzicht
van de gevoeligheid van Zenit G-sight in functie van de antistof-subsets. De analyse
gebeurde op basis van de cut-off van firma (PI ≥8) en de in huis cut-off (≥6). Beide cut-
off’s geven dezelfde resultaten waardoor slechts 1 tabel moest worden opgemaakt.
Enkel de PI’s bij een serum dilutie van 1:40 werden in rekening gebracht.
33
Tabel 4.2: Overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight in functie van de antistof-
subsets (op basis van PI’s bij serum dilutie van 1:40).
Patiënten positief met volgende antistof:
Anti-centromeer
(n=69)
Anti-Scl-70
(n=26)
Anti-RNA-polymerase III
(n=11)
Anti-PM/Scl
(n=3)
Sensitiviteit (%)
97.0%
(n=67/69)
100%
(26/26)
100%
(11/11)
100%
(3/3)
De antistof-subsets (anti-centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werden gedefinieerd op basis van LIA (Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay
(Euroimmun, Lübeck, Germany)).
De geautomatiseerde ANA analyse pikt alle patiënten op met anti-Scl-70 antilichamen,
RNA-polymerase III antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen (100% sensitiviteit). De
sensitiviteit voor anti-centromeer antilichamen is ook hoog en bedraagt 97.0%. Slechts
2 patiënten met anti-centromeer antilichamen worden gemist bij een startdilutie van
1:40. Eén van beide patiënten heeft een lage ANA titer (1:80) bij beoordeling op de
digitale beelden. De andere patiënt (staal: LP240171) heeft daarentegen een hoge ANA
titer (>1:2560) op de digitale beelden (cfr. Figuur 4.4. en Figuur 4.5.).
4.1.4 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight zonder bijsturing
Met behulp van Zenit G-sight is naast differentiatie positief/negatief (aan de hand van
de PI) ook patroonherkenning mogelijk. Tabel 4.3. geeft de spreiding weer van de
patronen over de 4 voornaamste patronen (homogeen, gespikkeld, nucleolair en
centromeer) bij een serum dilutie van 1:40. Het SSA-patroon wordt niet herkend door de
Zenit G-sight (de software is hiervoor niet getraind).
Tabel 4.3: Overzicht van de ANA patronen in alle subsets zonder bijsturing.
Negatief Homogeen gespikkeld Nucleolair centromeer Geen patroon
aSSc
(n=141)
3.5
(5) 4.3
(6) 25.5
(36) 19.1
(27) 44.0
(62) 3.5
(5) bHD
(n=100)
59.0
(59) 7.0
(7) 2.0
(2) 4.0
(4) 0.0
(0) 28.0
(28) cDC
(n=78)
39.7
(31) 9.0
(7) 6.4
(5) 9.0
(7) 0.0
(0) 35.9
(28) aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls. Bij een geïsoleerd cytoplasmatisch
patroon werd ANA als negatief gezien. De getallen geven percentages per subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de patronen in elk subset is
aangeduid in het vet.
Het patroon met het hoogste percentage in SSc, HD en DC zonder bijsturing is
respectievelijk centromeer patroon (44.0%), negatief (59.0%) en negatief (39.7%). Bij
34
de DC en HD worden ook relatief hoge percentages (respectievelijk 35.9% en 28.0%)
gevonden voor stalen waaraan Zenit G-sight geen patroon toekent.
4.1.5 Berekening van likelihoodratio’s van de index-intervallen Bij een dichotome test, zijn er 4 probabiliteiten of likelihoods van een testresultaat die
de ziektestatus geven: P(T+/D+), P(T-/D+), P(T+/D-) en P(T-/D-). (P staat voor
probabiliteit, T voor testresultaat en D voor ‘diseasestate’). De likelihood ratio’s (LR) van
een specifiek testresultaat voor een bepaalde ziekte is de probabiliteit van het
testresultaat in personen met de bestudeerde ziekte (hier, systeemsclerose) gedeeld
door de probabiliteit van hetzelfde testresultaat in controles zonder deze ziekte.(62) De
positieve likelihoodratio stemt overeen met sensitiviteit / [1-specificiteit]. De negatieve
likelihoodratio stemt overeen met [1-sensitiviteit]/ specificiteit. Tabel 4.4. geeft de
interpretatie van de beide likelihoodratio’s weer. Een heel hoge positieve LR (bv.
LR>10) geeft aan in welke mate een ziekte aannemelijker wordt na het vinden van een
positief testresultaat, terwijl een heel lage negatieve LR (bv. LR<0.1) aangeeft in welke
mate een ziekte minder aannemelijk wordt bij een negatief testresultaat. Als LR = 1 dan
zal de post-testprobabiliteit niet van de pre-testprobabiliteit verschillen en is de test dus
waardeloos.(62)
Om inzicht te krijgen in de likelihoodratio per interval op de index werd voor volgende
intervallen de likelihoodratio berekend: PI≤6, 6<PI≤61.7 en PI >61.7 (cfr. ROC analyse
4.1.1.). Likelihood ratio’s voor testresultaat-intervallen zijn meer informatief dan
likelihoodratio’s op basis van één cut-off waarde.(62) De resultaten zijn weergegeven in
Tabel 4.5.
Tabel 4.4: Interpretatie van positieve en negatieve likelihoodratio’s.(62)
Interpretatie LR+ LR-
Geen verschil tussen pre- en post-test probabiliteit (test heeft geen klinisch nut)
1 1
Klein verschil (zelden klinisch significant) 1-2 0.5-1
Klein verschil dat relevant kan zijn in een specifieke situatie (test is niet bruikbaar)
2-5 0.2-0.5
Bescheiden maar substantieel klinisch verschil (test is bruikbaar)
5-10 0.1-0.2
Vaak een klinisch significant verschil >10 <0.1
35
Tabel 4.5: Likelihoodratio’s van de index-intervallen.
PI≤6 6<PI≤61.7 PI >61.7
aSSc 0.11 0.26 35.35
aSSc: systeemsclerose. De controlegroepen (HD + DC) werden
opgeteld voor de berekening van de likelihoodratio’s.
Bij een PI≤ 6 bekomen we een LR van 0.11. Dit impliceert een bescheiden maar
substantieel klinisch verschil (test is bruikbaar). Indien de PI >6 en ≤ 61.7 is de test niet
erg bruikbaar. Bij een PI >61.7 is de LR>10 wat wijst op een klinisch significante
bijdrage van het testresultaat.
4.2. DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT
G-SIGHT NA BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER
4.2.1 ANA IIF titers na bijsturing in elke subset
Tabel 4.6 geeft een overzicht van de titers in alle subsets op basis van de aflezing van
de digitale beelden (= Zenit G-sight resultaat na bijsturing door de gebruiker).
Bij de cohorte van patiënten met SSc, HD en DC is de titer met het hoogste percentage
na bijsturing respectievelijk >1:2560 (51.8%), negatief (70.0%) en negatief (61.5%). Bij
vergelijking van deze resultaten met de resultaten bekomen met de Zenit G-sight
zonder bijsturing van de gebruiker valt op dat er meer SSc patiënten zijn met een
hogere titer (51.8 % heeft titer >1:2560 versus 17.0%, p<0.05, Chi-kwadraattest). In
contrast zijn er voor de controle groepen opvallend meer negatieve stalen (70.0%
versus 59.0% voor de HD (p=0.14, Chi-kwadraattest), 61.5% versus 39.7% voor de DC
(p<0.05, Chi-kwadraattest)).
Tabel 4.6: Overzicht van de ANA titers op basis van aflezing van de digitale beelden.
Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560
aSSc
(n=141)
5.0
(7)
2.1
(3)
0.7
(1)
5.7
(8)
7.1
(10)
11.3
(16)
16.3
(23)
51.8
(73) bHD
(n=100)
70.0
(70)
18.0
(18)
8.0
(8)
3.0
(3)
/ 1.0
(1)
/ /
cDC
(n=78)
61.5
(48)
15.4
(12)
9.0
(7)
6.4
(5)
2.6
(2)
3.8
(3)
1.3
(1)
/
aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls. De getallen geven percentages per
subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van titers in elk subset is aangeduid in het vet.
36
4.2.2 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets na bijsturing
Naast de globale performantie van de geautomatiseerde ANA analyse na bijsturing
(aflezing van de digitale beelden), werd ook gekeken naar de sensitiviteit voor het
oppikken van de ANA positiviteit binnen de verschillende antistof-subsets in de SSc
populaties. Tabel 4.7. geeft een overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight na
bijsturing in functie van de antistof-subsets. Enkel de digitale beelden bij een serum
dilutie van 1:40 worden in rekening gebracht.
Tabel 4.7: Overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight op basis van digitale beelden
in functie van de antistof subset (serum dilutie van 1:40).
Patiënten positief met volgende antistof:
Anti-centromeer
(n=69)
Anti-Scl-70
(n=26)
Anti-RNA-polymerase
(n=11)
Anti-PM/Scl
(n=3)
Sensitiviteit
(%)
100%
(n=69/69)
100%
(n=26/26)
91%
(n=10/11)
100%
(n=3/3)
De antistof-subsets (anti-centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werden gedefiniëerd op basis van LIA (Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay
(Euroimmun, Lübeck, Germany)).
Sensitiviteit van de geautomatiseerde ANA analyse na bijsturing bedraagt 100% voor
anti-Scl-70 antilichamen, anti-PM/Scl antilichamen en anti-centromeer antilichamen. De
sensitiviteit voor RNA-polymerase III antilichamen na bijsturing bedraagt 91.0%. Eén
patiënt met RNA-polymerase III antistoffen wordt gemist. Dit staal wordt wel opgepikt
voor de bijsturing (PI=66.8 bij serum dilutie 1:40).
4.2.3 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight met bijsturing
Tabel 4.8. geeft de spreiding weer van de patronen met bijsturing over de 4
voornaamste patronen en het SSA patroon, bij een serum dilutie van 1:40.
Tabel 4.8: Overzicht van de ANA patronen in alle subsets met bijsturing.
Negatief Homogeen gespikkeld Nucleolair centromeer SSA aSSc
(n=141)
5.0
(7) 11.3
(16) 21.3
(30) 10.6
(15) 47.5
(67) 4.3
(6) bHD
(n=100)
70.0
(70) 18.0
(18) 8.0
(8) 3.0
(3) 0.0
(0) 1.0
(1) cDC
(n=78)
61.5
(48) 12.8
(10) 21.8
(17) 3.8
(3) 0.0
(0) 0.0
(0) aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls. Bij meerdere patronen per staal
werd het patroon met de hoogste titer weerhouden. Bij een geïsoleerd cytoplasmatisch patroon werd ANA als negatief gezien. De getallen geven percentages per subset weer – de getallen tussen haakjes
het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de patronen in elk subset is aangeduid in het vet.
37
Het patroon met het hoogste percentage in SSc, HD en DC met bijsturing is
respectievelijk centromeer patroon (47.5%), negatief (70.0%) en negatief (61.5%). De
frequenties zijn vergelijkbaar voor en na bijsturing voor alle patronen bij de HD en SSc
patiënten met uitzondering van het homogeen patroon (p<0.05, Chi-kwadraattest). Voor
de DC zijn er meer negatieve en gespikkelde patronen na bijsturing dan zonder
bijsturing (p<0.05, Chi-kwadraattest).
Aangezien het belangrijk is om het centromeer patroon goed te kunnen herkennen,
werd ook nagegaan hoeveel % van de positieve sera met anti-centromeer antilichamen
op LIA, daadwerkelijk als centromeer patroon werden herkend op de digitale beelden
(Zenit G-sight na bijsturing, bij een dilutie van 1:40). In totaal wordt bij 96.9% (n=63/65)
van de anti-centromeer LIA positieve stalen het patroon correct geïdentificeerd. Bij geen
van beide discordante stalen (n=2) kon een centromeer patroon worden teruggevonden
op de digitale beelden van de titratiereeks. Beide stalen worden als gespikkeld
beoordeeld.
4.2.4 Berekening van likelihoodratio’s van de titers Voor elke titer (bekomen op basis van de digitale beelden na bijsturing) werd een
likelihoodratio berekend (cfr. Tabel 4.9.).
Tabel 4.9: De likelihoodratio’s per ANA IIF titer van de Zenit G-sight met bijsturing.
Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560
aSSc 0.07 0.12 0.08 1.27 6.32 5.03 29.01 ∞
aSSc: systeemsclerose. De controlegroepen (HD + DC) werden opgeteld voor de berekening
van de likelihoodratio’s.
De positieve likelihoodratio’s bij 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 en 1:2560
bedragen respectievelijk 0.12, 0.08, 1.27, 6.32, 5.03, 29.01 en ∞. Dit wil zeggen dat een
resultaat met een titer van 1:160 slechts een klein verschil in pre- en post-
testprobabiliteit betekent (slechts zelden klinisch significant, test niet bruikbaar). Titers
van 1:320 t.e.m. 1:640 (LR tussen 5 en10) geven aanleiding tot een bescheiden maar
potentieel klinisch relevant verschil (test is bruikbaar). Resultaten met titers ≥1:1280
(LR>10) hebben vaak een klinisch significant verschil in pre- naar post-testprobabiliteit.
Een negatief test resultaat en resultaten met titers ≤1:80 hebben een negatieve
likelihoodratio ≤0.2. Dit wil zeggen dat bij deze resultaten er een substantieel tot vaak
klinisch significant verschil is tussen pre- en post test probabiliteit.
38
4.3 VERGELIJKING VAN DE ANA IIF RESULTATEN (POSITIEF/NEGATIEF)
BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT G-SIGHT MET EN ZONDER BIJSTURING VAN
DE GEBRUIKER
Bij deze analyse werden de ANA IIF resultaten bekomen m.b.v. Zenit G-sight met en
zonder bijsturing onderling vergeleken. Voor het dichotomiseren van de PI data werd
gebruik gemaakt van een cut-off van 6 (in huis criterium), dit impliceert dat de stalen die
door de Zenit G-sight als ‘negatief uncertain’ werden geklasseerd als positief werden
weerhouden. Tabel 4.10. geeft een kruistabel weer van de resultaten bekomen op de
totale cohorte.
Tabel 4.10: Vergelijking van de resultaten bekomen o.b.v. de digitale beelden versus de
resultaten bekomen o.b.v. de PI (totale cohorte).
Totaal Aflezing digitale
beelden
Totaal
neg pos
Index neg 53 9 62
pos 70 187 257
Totaal 123 196 319
Op de totale cohorte is er een overeenkomst van 75.2% van de geanalyseerde stalen
(n=240/319) voor de interpretatie positief/negatief. Om inzicht te krijgen of de
overeenkomst tussen de Zenit G-sight resultaten met en zonder bijsturing verschillend
is voor de verschillende cohorten werden eveneens kruistabellen gemaakt per cohorte
(cfr. Tabel 4.11.). Het percentage overeenkomst tussen beide aflezingen (met en
zonder bijsturing – per cohorte) is eveneens weergegeven in Tabel 4.11.
Er worden significant meer discordanties gezien in de controle groepen dan in de SSc
groep (p<0.05 zowel voor DC als HD, Chi-kwadraattest).
Een detailoverzicht van de discordanties tussen de resultaten zonder bijsturing (indexen
bij PI ≥6) en met bijsturing (aflezing van de digitale beelden) is terug te vinden in Bijlage
1. De meeste discordanties (63.3%, n=50/79) zijn terug te vinden voor zwakke stalen
(lage PI’s of lage titers ≤1:80). Slechts vier discordante stalen hadden titers van ≥1:80
op basis van aflezing van digitale beelden (twee met een zwak nucleolair patroon, 1 met
een SSA patroon en 1 met een gemengd centromeer + nucleolair patroon). Ook
aspecifieke aankleuring van de plaatjes door de aanwezigheid van vuil (20.3%,
n=16/79) of cytoplasmatische patronen (16.5%, n=13/79) leiden tot discordanties. Het
39
toestel kan immers geen onderscheid maken tussen fluorescentie afkomstig van de
kern of het cytoplasma, terwijl bij beoordeling van de digitale beelden enkel
kernfluorescentie in rekening werd gebracht.
Tabel 4.11: Vergelijking van de resultaten bekomen o.b.v. de digitale beelden versus de
resultaten bekomen o.b.v. de PI (index) per subset.
SSc Aflezing digitale
beelden
Totaal
neg pos
Index neg 3 2 5
pos 2 134 136
Totaal 5 136 141
% overall agreement= 97.2%
DC Aflezing digitale
beelden
Totaal
neg pos
Index neg 16 2 18
Pos 32 28 60
Totaal 48 30 78
% overall agreement= 56.4%
HD Aflezing digitale
beelden
Totaal
neg pos
Index neg 34 5 39
Pos 36 25 61
Totaal 70 30 100
% overall agreement= 59.0%
Opvallend is de discordantie voor staal LP240171. Dit staal heeft op de digitale beelden
een titer >1:2560, terwijl de PI slechts 4.73 is bij een serum dilutie van 1:40. Bij verdere
serum dilutie neemt de PI eerst toe en nadien weer af (cfr. Figuur 4.5). Figuur 4.4. geeft
de digitale beelden van het staal bij een dilutie van 1:40, 1:320 en 1:2560.
Figuur 4.4: De digitale beelden voor staal LP240171 bij een dilutie van 1:40 (links), 1:320
(midden) en 1:2560 (rechts).
40
Figuur 4.5: Evolutie van de PI in functie van de titer voor staal LP240171
(voor de X-as: 0=dilutie 1:40, 1= dilutie 1:80, 2=dilutie 1:160, 3=dilutie 1:320, 4=dilutie
1:640, 5=dilutie 1:1280, 6=dilutie 1:2560).
Een andere benadering voor de evaluatie van de overeenkomst tussen de resultaten
van Zenit-G-sight met en zonder bijsturing is de berekening van de kappa-coëfficiënt.
De kappa-coëfficiënt (cohen-coëfficiënt) is een statistische waarde om de graad van
overeenkomst tussen dichotome testen (hier, differentiatie positief/negatief met en
zonder bijsturing) weer te geven. Hoe dichter de kappa-waarde bij 1, hoe groter de
overeenkomst. Tabel 4.12. geeft de interpretatie van de kappa-coëfficiënt weer.
De kappa-coëfficiënt in de subset van SSc, HD en DC bedraagt respectievelijk 0.59,
0.25 en 0.23 wat een matig tot redelijke overeenkomst betekent tussen de resultaten
van de Zenit G-sight analyse met en zonder bijsturing. De kappa-coëfficiënt op de totale
cohorte bedraagt 0.42, wat betekent dat er een matig overeenkomst bestaat tussen de
resultaten van de Zenit G-sight analyse zonder en met bijsturing op de globale cohorte.
Tabel 4.12: Interpretatie van Kappa-waarde (volgens Landis & koch).(63)
Interpretatie Kappa-waarde
Goed қ >80
Substantieel 0.61≤ қ ≤ 0.80
Matig 0.41≤ қ ≤ 0.60
Redelijk 0.21≤ қ ≤ 0.40
Zwak қ ≤ 0.20
41
4.4 CORRELATIE TUSSEN TITER EN INDEX
Er werd eveneens nagegaan of er een correlatie bestaat tussen de titer (na bijsturing)
en de index (PI bij een dilutie van 1:40). Bruikbaarheid van de index als alternatief voor
de ANA IIF titer is tot op heden nog niet gedocumenteerd. Figuur 4.6. geeft de indexen
weer in functie van de titer. Stalen met een cytoplasmatisch patroon (al dan niet in
combinatie met een kernfluorescentie) werden geëxcludeerd voor deze analyse (n=10)
aangezien voor het aflezen van de titer op de digitale beelden de cytoplasmatische
patronen niet in rekening werden gebracht. Er wordt een significante correlatie
teruggevonden tussen de titer en de index (r=0.919 (95% CI 0.8922-0.9298), p<0.0001,
pearson correlation).
Uit Figuur 4.6. blijkt dat de PI’s bij stalen met een titer van 1:40 significant hoger zijn
dan de PI’s bij stalen die negatief zijn (p<0.05, Mann Whitney U test). Tussen de stalen
met een titer van 1:40 versus 1:80 is er geen significant verschil in PI’s (P>0.05, Mann
Whitney U test). De PI’s bij stalen met een titer van 1:80 versus stalen met een titer van
1:160 zijn wel significant verschillend (p<0.05, Mann Whitney U test). Idem voor de
vergelijking van titer 1:160 versus 1:320. Vanaf de stalen met titer >1:640 is er geen
significant verschil meer tussen de PI’s (P>0.05, Mann Whitney U test).
Figuur 4.6: Medianen en boxplots (eerste kwartiel (Q1) tot derde kwartiel(Q3)) van de
index (dilutie 1:40) per titer. *betekent dat de observatie een punt is dat buiten Q3±1.5 (Q3-Q1) valt.
°betekent dat de observatie een punt is dat buiten Q3±3 (Q3-Q1) valt.
42
Een overzicht van de stalen die gelegen zijn buiten 1.5 (Q3-Q1) en buiten 3 (Q3-Q1)
zijn opgelijst in Tabel 4.13. en Tabel 4.14. respectievelijk.
Tabel 4.13: Stalen gelegen buiten 1.5 (Q3-Q1).
Staal Volgn° Index Patroon (na
bijsturing)
Titer (na
bijsturing)
Opmerking
53692 260 39.07 Gespikkeld 1 :40 /
DV040654 61 52.93 Gespikkeld 1 :1280 /
LP240171 99 4.73 Centromeer + Nucleolair
>1 :2560 cfr. Figuur 4.4. en 4.5.
CVL201166 106 51.03 Centromeer 1 :1280 /
RB150947 126 58.18 Centromeer + Nucleolair
>1 :2560 /
HVC161032 129 46.15 Centromeer 1 :1280 /
GH040250 139 32.10 Centromeer+ Nucleolair
1 :1280 /
2944 535 37.82 Gespikkeld 1 :40 /
Tabel 4.14: Stalen gelegen buiten 3 (Q3-Q1).
Staal Volgn° Index Patroon (na
bijsturing)
Titer (na
bijsturing)
MDC010461 25 75.00 Centromeer+ Nucleolair
>1 :2560
DM060433 29 68.06 Centromeer+ Nucleolair
>1 :2560
BA110760 92 74.66 Centromeer >1 :2560
JD241062 119 74.57 Gespikkeld >1 :2560
PL111160 123 67.24 Centromeer >1 :2560
MVC161138 140 68.65 Centromeer+ Nucleolair
>1 :2560
52736 228 17.51 Negatief /
53037 243 19.05 Negatief /
57452 325 23.51 Gespikkeld 1 :80
090826-2420 421 17.06 Negatief /
43
5. DISCUSSIE
Geautomatiseerde ANA IIF m.b.v. de Zenit G-sight werd uitgevoerd op drie cohorten
(141 SSc patiënten, 78 DC en 100 HD) met het oog op de evaluatie van de
diagnostische waarde van de automatische ANA IIF met focus op SSc patiënten.
Uit een ROC analyse op de PI’s kon worden afgeleid dat Zenit G-sight heel goed
onderscheid kan maken tussen SSc patiënten en de controlegroepen (HD en DC). We
evalueerden eveneens of de afkapwaarde voorgesteld door de firma (PI ≥8) optimaal
was voor screening (maximale gevoeligheid – vergelijkbaar met manuele microscopie)
en stellen vast dat bij een afkapwaarde ≥6 op de PI dit criterium beter wordt gehaald. Bij
gebruik van deze grens wordt zoals verwacht slechts een lage specificiteit bekomen
(23% en 39%).(36) Naar analogie evalueerden we de tweede afkapwaarde voorgesteld
door de firma (PI>50, maximale specificiteit). Hier wordt vastgesteld dat bij een hogere
afkapwaarde (PI≥61.7) een betere overeenkomst met manuele microscopie voor het
niet oppikken van de controle patiënten kan worden bereikt.
Bij evaluatie van de titers voor onze drie cohorten zien we de hoogste ANA titers bij de
SSc patiënten (1:640 voor bijsturing, >1:2560 na bijsturing). Dit resultaat is vergelijkbaar
met de manuele ANA IIF resultaten bekomen op SSc patiënten.(36) Op De Beeck et al.
vonden hoge frequenties bij titers van 1:640 en 1:1280. Bij de HD en DC zijn de meeste
controles zoals verwacht negatief (met en zonder bijsturing).(36) We vergeleken
eveneens de resultaten van de ANA IIF voor en na bijsturing en stellen vast dat er meer
SSc patiënten met een hogere titer worden gevonden op basis van de digitale beelden
dan op basis van de PI. Ook voor de controle groepen worden opvallend meer
negatieve stalen gevonden na bijsturing. Dit is te verklaren doordat cytoplasmatische
patronen en aspecifieke fluorescentie door vuil een hogere index krijgen, waardoor ze
als positief beschouwd worden door de Zenit G- sight (vals positieven). Hieruit blijkt dat
bijsturing door de gebruiker noodzakelijk blijft.
Wat betreft het patroon bij de SSc populatie kon worden bevestigd wat al eerder in de
literatuur bekend was, namelijk dat het centromeer het meest voorkomend patroon is bij
SSc.(36, 64) We zien voor alle patronen geen significante verschillen bij de vergelijking
voor en na bijsturing bij de HD en SSc patiënten met uitzondering van het homogeen
patroon. Voor de DC zijn er significant meer negatieve en gespikkelde patronen na
bijsturing. Deze verschuivingen zijn vermoedelijk te verklaren doordat voor bijsturing
44
aan een groot percentage van de stalen geen patroon werd toegekend. Dit dient verder
te worden onderzocht.
We evalueerden ook de gevoeligheid van de Zenit G-sight voor het oppikken van de
patiënten verdeeld over de verschillende antistof-subsets. Voor patiënten met anti-Scl-
70 antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen is de gevoeligheid maximaal (met en
zonder bijsturing). De sensitiviteit voor patiënten met anti-centromeer antilichamen is
hoog (ook op niveau van het patroon). Twee patiënten met anti-centromeer
antilichamen worden gemist zonder bijsturing, maar worden toch gevonden op basis
van de digitale beelden. De ene patiënt heeft een lage ANA titer (1:80). De andere
patiënt heeft een hoge ANA titer (>1:2560) op de digitale beelden in combinatie met een
lage index op serum dilutie 1:40. Opvallend is dat voor dit laatste staal de index piekt
met toenemende dilutie, hetgeen ook bevestigd werd op de digitale beelden. Dit beeld
zou kunnen passen bij een ‘prozone’ effect waarbij een vals negatief (of vals verlaagd)
resultaat wordt bekomen in de aanwezigheid van een overmaat aan antistof. Dit effect
is slechts zeldzaam beschreven bij ANA IIF.(65)
Er werden ook LR berekend op basis van de index-intervallen en de titers. Hieruit kon
worden afgeleid dat indexen ≤6 en >61.7 een grote diagnostische bijdrage kunnen
leveren. Titers ≤1:80 hebben een LR<0.2 (test is bruikbaar), terwijl voor stalen met titers
vanaf 1:320 een LR>5 wordt gevonden (test is bruikbaar). Deze resultaten wijken af van
de data van Bossuyt et al. die aantoonden dat stalen met een titer van 1:40 en 1:80
aanleiding gaven tot geen of een klein verschil in pre-test naar post-testprobabiliteit.(36)
Op de totale cohorte, bij SSc, HD en DC is er een overeenkomst voor de differentiatie
positief/negatief met en zonder bijsturing van respectievelijk 75.2%, 97.2%, 59.0% en
56.1% (kappa-coëfficiënt’s geven respectievelijk een matig tot redelijke overeenkomst).
Er worden significant meer discordanties gezien in de controle groepen dan in de SSc
groep. Van de 79 discordanties zijn de meeste stalen zwak (lage PI’s of titers ≤1:80)
wat compatibel is met de aanwezigheid van meer discordanties in de controle groepen.
Tenslotte wordt een significante correlatie teruggevonden tussen de titer (na bijsturing)
en de index (bij dilutie 1:40). Er zijn geen significante verschillen tussen de PI’s van de
stalen met een titer van 1:40 en 1:80. Eveneens is er geen significant verschil meer
tussen de PI bij de stalen met een titer >1:640.
45
6. BESLUIT
Onze resultaten tonen aan dat de geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie test
m.b.v een automatische microscoop (Zenit G-sight) heel goed onderscheid kan maken
tussen SSc patiënten en de controlegroepen (HD en DC).
De patronen en titers bekomen met het systeem zijn zoals verwacht voor de SSc
patiënten en de controlegroepen. Hoge titers, vaak met een centromeer patroon worden
gezien in de SSc populatie. Terwijl voor de controlegroepen ANA meestal negatief of
zwak positief zijn. Ook de gevoeligheid binnen de antistof-subsets is hoog.
Op basis van deze resultaten kan worden besloten dat dit systeem goed performeert als
ANA screeningstest in de SSc populatie. Bijsturing door een expert blijft noodzakelijk
gezien het systeem een groot percentage van de stalen niet classificeert (‘negative
uncertain’) en eventuele stalen met een ‘prozone’ effect kan missen.
Verder wordt ook een correlatie vastgesteld tussen de index en de titer hetgeen
mogelijkheden opent om deze kwantitatieve en gestandaardiseerde waarde (index) in
de toekomst te gaan gebruiken als een alternatief voor de klassieke ANA titer in het
routine laboratorium.
46
7. LITERATUURLIJST
1. Sompayrac L. How the immune system works. 4th ed. Chichester, West Sussex ; Hoboken, NJ:
Wiley-Blackwell; 2012.
2. Murphy K, Travers P, Walport M. Janeway's immunobiology. 7th ed: Garland Science; 2007. 888
p.
3. Steen VD. The many faces of scleroderma. Rheumatic diseases clinics of North America.
2008;34(1):1-15; v. Epub 2008/03/11.
4. Le Guern V, Mahr A, Mouthon L, Jeanneret D, Carzon M, Guillevin L. Prevalence of systemic
sclerosis in a French multi-ethnic county. Rheumatology. 2004;43(9):1129-37. Epub 2004/06/24.
5. Mayes MD. Scleroderma epidemiology. Rheumatic diseases clinics of North America.
2003;29(2):239-54. Epub 2003/07/05.
6. Steen VD, Oddis CV, Conte CG, Janoski J, Casterline GZ, Medsger TA, Jr. Incidence of systemic
sclerosis in Allegheny County, Pennsylvania. A twenty-year study of hospital-diagnosed cases, 1963-
1982. Arthritis and rheumatism. 1997;40(3):441-5. Epub 1997/03/01.
7. Roberts-Thomson PJ, Jones M, Hakendorf P, Kencana Dharmapatni AA, Walker JG, MacFarlane
JG, et al. Scleroderma in South Australia: epidemiological observations of possible pathogenic
significance. Internal medicine journal. 2001;31(4):220-9. Epub 2001/07/18.
8. Ferri C, Valentini G, Cozzi F, Sebastiani M, Michelassi C, La Montagna G, et al. Systemic
sclerosis: demographic, clinical, and serologic features and survival in 1,012 Italian patients. Medicine.
2002;81(2):139-53. Epub 2002/03/13.
9. Smith V. Start of the Ghent University, Scleroderma unit: First results. Ghent, Belgium: Ghent
University; 2011.
10. Steen VD, Medsger TA. Changes in causes of death in systemic sclerosis, 1972-2002. Annals of
the rheumatic diseases. 2007;66(7):940-4. Epub 2007/03/03.
11. Laing TJ, Gillespie BW, Toth MB, Mayes MD, Gallavan RH, Burns CJ, et al. Racial differences in
scleroderma among women in Michigan. Arthritis and rheumatism. 1997;40(4):734-42.
12. Balbir-Gurman A, Braun-Moscovici Y. Scleroderma - New aspects in pathogenesis and treatment.
Best practice & research Clinical rheumatology. 2012;26(1):13-24. Epub 2012/03/20.
13. Radic M, Martinovic Kaliterna D, Radic J. Infectious disease as aetiological factor in the
pathogenesis of systemic sclerosis. The Netherlands journal of medicine. 2010;68(11):348-53. Epub
2010/12/16.
14. Diot E, Lesire V, Guilmot JL, Metzger MD, Pilore R, Rogier S, et al. Systemic sclerosis and
occupational risk factors: a case-control study. Occupational and environmental medicine.
2002;59(8):545-9. Epub 2002/08/02.
15. Johnson RW, Tew MB, Arnett FC. The genetics of systemic sclerosis. Current rheumatology
reports. 2002;4(2):99-107. Epub 2002/03/14.
16. Steen VD. Autoantibodies in systemic sclerosis. Seminars in arthritis and rheumatism.
2005;35(1):35-42. Epub 2005/08/09.
47
17. Hu PQ, Fertig N, Medsger TA, Jr., Wright TM. Correlation of serum anti-DNA topoisomerase I
antibody levels with disease severity and activity in systemic sclerosis. Arthritis and rheumatism.
2003;48(5):1363-73. Epub 2003/05/15.
18. Perera A, Fertig N, Lucas M, Rodriguez-Reyna TS, Hu P, Steen VD, et al. Clinical subsets, skin
thickness progression rate, and serum antibody levels in systemic sclerosis patients with anti-
topoisomerase I antibody. Arthritis and rheumatism. 2007;56(8):2740-6. Epub 2007/08/01.
19. Hanke K, Dahnrich C, Bruckner CS, Huscher D, Becker M, Jansen A, et al. Diagnostic value of
anti-topoisomerase I antibodies in a large monocentric cohort. Arthritis research & therapy.
2009;11(1):R28. Epub 2009/02/24.
20. Walker JG, Fritzler MJ. Update on autoantibodies in systemic sclerosis. Current opinion in
rheumatology. 2007;19(6):580-91. Epub 2007/10/06.
21. Nihtyanova SI, Denton CP. OPINION Autoantibodies as predictive tools in systemic sclerosis. Nat
Rev Rheumatol. 2010;6(2):112-6.
22. Senecal JL, Henault J, Raymond Y. The pathogenic role of autoantibodies to nuclear
autoantigens in systemic sclerosis (scleroderma). J Rheumatol. 2005;32(9):1643-9. Epub 2005/09/06.
23. Gabrielli A, Avvedimento EV, Krieg T. Scleroderma. The New England journal of medicine.
2009;360(19):1989-2003. Epub 2009/05/08.
24. Krieg T, Takehara K. Skin disease: a cardinal feature of systemic sclerosis. Rheumatology.
2009;48 Suppl 3:iii14-8. Epub 2009/06/12.
25. LeRoy EC, Medsger TA, Jr. Criteria for the classification of early systemic sclerosis. J Rheumatol.
2001;28(7):1573-6. Epub 2001/07/27.
26. Steen V, Denton CP, Pope JE, Matucci-Cerinic M. Digital ulcers: overt vascular disease in
systemic sclerosis. Rheumatology. 2009;48 Suppl 3:iii19-24. Epub 2009/06/12.
27. Cutolo M, Sulli A, Smith V. Assessing microvascular changes in systemic sclerosis diagnosis and
management. Nat Rev Rheumatol. 2010;6(10):578-87. Epub 2010/08/13.
28. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Subcommittee for
scleroderma criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria
Committee. Arthritis and rheumatism. 1980;23(5):581-90. Epub 1980/05/01.
29. Lonzetti LS, Joyal F, Raynauld JP, Roussin A, Goulet JR, Rich E, et al. Updating the American
College of Rheumatology preliminary classification criteria for systemic sclerosis: addition of severe
nailfold capillaroscopy abnormalities markedly increases the sensitivity for limited scleroderma. Arthritis
and rheumatism. 2001;44(3):735-6.
30. LeRoy EC, Black C, Fleischmajer R, Jablonska S, Krieg T, Medsger TA, Jr., et al. Scleroderma
(systemic sclerosis): classification, subsets and pathogenesis. J Rheumatol. 1988;15(2):202-5. Epub
1988/02/01.
31. Poormoghim H, Lucas M, Fertig N, Medsger TA, Jr. Systemic sclerosis sine scleroderma:
demographic, clinical, and serologic features and survival in forty-eight patients. Arthritis and rheumatism.
2000;43(2):444-51. Epub 2000/02/29.
32. Koenig M, Joyal F, Fritzler MJ, Roussin A, Abrahamowicz M, Boire G, et al. Autoantibodies and
microvascular damage are independent predictive factors for the progression of Raynaud's phenomenon
48
to systemic sclerosis: a twenty-year prospective study of 586 patients, with validation of proposed criteria
for early systemic sclerosis. Arthritis and rheumatism. 2008;58(12):3902-12. Epub 2008/11/28.
33. Bradwell A, Hughes R, Harden E. Atlas of HEp-2 patterns. United Kingdom: The binding site;
2003. 129 p.
34. Reveille JD, Solomon DH, Comm ACRAH. Evidence-based guidelines for the use of immunologic
tests: Anticentromere, Scl-70, and nucleolar antibodies. Arthrit Rheum-Arthr. 2003;49(3):399-412.
35. von Muhlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases.
Seminars in arthritis and rheumatism. 1995;24(5):323-58. Epub 1995/04/01.
36. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al.
Detection of antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence and by solid phase assay.
Autoimmunity reviews. 2011;10(12):801-8. Epub 2011/07/12.
37. Robinson CJ, Balazs T. Drug-induced antinuclear antibodies in the guinea pig. Life sciences.
1982;30(2):199-205. Epub 1982/01/11.
38. de Vlam K, De Keyser F, Verbruggen G, Vandenbossche M, Vanneuville B, D'Haese D, et al.
Detection and identification of antinuclear autoantibodies in the serum of normal blood donors. Clinical
and experimental rheumatology. 1993;11(4):393-7. Epub 1993/07/01.
39. Solomon DH, Kavanaugh AJ, Schur PH, Comm ACRAH. Evidence-based guidelines for the use
of immunologic tests: Antinuclear antibody testing. Arthrit Rheum-Arthr. 2002;47(4):434-44.
40. Sack U, Conrad K, Csernok E, Frank I, Hiepe F, Krieger T, et al. Autoantibody detection using
indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Annals of the New York Academy of Sciences.
2009;1173:166-73. Epub 2009/09/18.
41. Gonzalez DA, Leon AC, Varela AR, Garcia MG, Rahola Mde S, Perez Mdel C, et al. Autoantibody
detection with indirect immunofluorescence on HEp-2 cells: starting serum dilutions for systemic
rheumatic diseases. Immunology letters. 2011;140(1-2):30-5. Epub 2011/06/21.
42. Kumar Y, Bhatia A, Minz RW. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of
connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn Pathol. 2009;4.
43. Peene I, Meheus L, Veys EM, De Keyser F. Detection and identification of antinuclear antibodies
(ANA) in a large and consecutive cohort of serum samples referred for ANA testing. Annals of the
rheumatic diseases. 2001;60(12):1131-6. Epub 2001/11/16.
44. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA. Guidelines for clinical use of
the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arch Pathol Lab
Med. 2000;124(1):71-81.
45. Van Praet JT, Cruyssen BV, Bonroy C, Smith V, Delanghe J, De Keyser F. Validation of a new
screening strategy for anti-extractable nuclear antigen antibodies. Clinical and experimental
rheumatology. 2009;27(6):971-6.
46. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al.
Antinuclear antibody detection by automated multiplex immunoassay in untreated patients at the time of
diagnosis. Autoimmunity reviews. 2012. Epub 2012/03/06.
47. Burtis CA. Fundamentals of clinical chemistry. Sixth edition ed2008 2008.
49
48. Emlen W, O'Neill L. Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with
immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arthritis and rheumatism.
1997;40(9):1612-8. Epub 1997/10/27.
49. Russell AS, Johnston C. Relative value of commercial kits for ANA testing. Clinical and
experimental rheumatology. 2003;21(4):477-80. Epub 2003/08/29.
50. Kivity S, Gilburd B, Agmon-Levin N, Carrasco MG, Tzafrir Y, Sofer Y, et al. A novel automated
indirect immunofluorescence autoantibody evaluation. Clinical rheumatology. 2012;31(3):503-9. Epub
2011/11/08.
51. Sack U, Knoechner S, Warschkau H, Pigla U, Emmrich F, Kamprad M. Computer-assisted
classification of HEp-2 immunofluorescence patterns in autoimmune diagnostics. Autoimmunity reviews.
2003;2(5):298-304. Epub 2003/09/11.
52. Koenig M, Dieude M, Senecal JL. Predictive value of antinuclear autoantibodies: The lessons of
the systemic sclerosis autoantibodies. Autoimmunity reviews. 2008;7(8):588-93.
53. Harvey GR, Butts S, Rands AL, Patel Y, McHugh NJ. Clinical and serological associations with
anti-RNA polymerase antibodies in systemic sclerosis. Clinical and experimental immunology.
1999;117(2):395-402. Epub 1999/08/12.
54. Bell S, Krieg T, Meurer M. Antibodies to Ro/SSA detected by ELISA: correlation with clinical
features in systemic scleroderma. The British journal of dermatology. 1989;121(1):35-41. Epub
1989/07/01.
55. Homburger HA. Cascade Testing for Autoantibodies in Connective-Tissue Diseases. Mayo Clin
Proc. 1995;70(2):183-4.
56. Phan TG, Wong RCW, Adelstein S. Autoantibodies to extractable nuclear antigens: Making
detection and interpretation more meaningful. Clin Diagn Lab Immun. 2002;9(1):1-7.
57. PhD-system. CA, USA: Bio-Rad Laboratories, 2007.
58. Peene I, Van Ael W, Vandenbossche M, Vervaet T, Veys E, De Keyser F. Sensitivity of the HEp-
2000 substrate for the detection of anti-SSA/Ro60 antibodies. Clinical rheumatology. 2000;19(4):291-5.
Epub 2000/08/15.
59. Bonroy C, Van Praet J, Smith V, Van Steendam K, Mimori T, Deschepper E, et al. Optimization
and diagnostic performance of a single multiparameter lineblot in the serological workup of systemic
sclerosis. Journal of immunological methods. 2012;379(1-2):53-60. Epub 2012/03/27.
60. Euroimmun Antibodies against systemic sclerosis specific antigens. Test instructions for the
Systemic Sclerose (Nucleoli) Profile EUROLINE (IgG). . Lubeck, Germany: Euroimmuun: Medizinische
labordiagnostica AG., 2010.
61. Zweig MH, Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation
tool in clinical medicine. Clinical chemistry. 1993;39(4):561-77. Epub 1993/04/01.
62. Bossuyt X. Clinical performance characteristics of a laboratory test. A practical approach in the
autoimmune laboratory. Autoimmunity reviews. 2009;8(7):543-8. Epub 2009/02/10.
63. Moor GD. Inleiding tot de biomedische statistiek: Acco 2008.
50
64. Van Praet JT, Van Steendam K, Smith V, De Bruyne G, Mimori T, Bonroy C, et al. Specific anti-
nuclear antibodies in systemic sclerosis patients with and without skin involvement: an extended
methodological approach. Rheumatology. 2011;50(7):1302-9.
65. Bossuyt X, Marien G, Vanderschueren S. A 67-year-old woman with a systemic inflammatory
syndrome and sicca. Clinical chemistry. 2010;56(9):1508-9. Epub 2010/08/31.
URL-lijst:
http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product.htm (05-04-2012)
http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm (10-05-2012)
http://www.dermis.net/dermisroot/en/39210/image.htm (03-05-2012)
http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm (13-05-
2012)
http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm (13-05-2012)
http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=aak_gegen_zellkerne_ana&L=1 (13-05-2012)
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm (16-
05-2012)
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-
and-specifications.htm (17-05-2012)
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-
features-of-Zenit-G-Sight.htm (16-05-2012)
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-
autoimmune-disorder-diagnostics.htm (16-05-2012)
http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-
Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm (16-05-2012)
http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf. (07-04-2012)
http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/a250/public_html/theorie.shtml (11-05-2012)
http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm (03-05-2012)
http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html (10-05-2012)
BIJLAGEN
BIJLAGE 1: DISCORDANTIES TUSSEN HET ANA IIF RESULTAAT
(POSITIEF/NEGATIEF) BEKOMEN MET DE ZENIT G-SIGHT ZONDER EN MET
BIJSTURING
Tabel 1: Stalen die positief werden geïnterpreteerd door de Zenit G-sight en negatief na
bijsturing (Zie volgende drie pagina’s voor vervolg Tabel 1):
Subset Staal Volgn° Patroon(*) Titer(*) Index
(1:40)
Reden
aSSc FK0610325 93 Nucleolair 1:1280 66.76 Cytoplasmatische aankleuring
aSSc NL250572 83 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2601 426 Geen patroon
1:40 14.27 Zwak staal
bHD 2622 436 / / 7.23 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
bHD 2627 440 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
bHD 2640
443 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2679 447 / / 6.01 Zwak staal
bHD 2682 450 Geen patroon
1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
bHD 2684 452 Geen patroon
1:80 9.11 Cytoplasmatische aankleuring
bHD 2699 456 Geen patroon
1:40 11.45 zwak staal
bHD 2796 490 Geen patroon
1:40 8.24 Zwak staal
bHD 2820
498 / / 7.23 Cytoplasmatische aankleuring
bHD 2826
501 Geen patroon
1:40 9.11 Cytoplasmatische aankleuring
bHD 2838 504 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2846 509 Geen patroon
1:40 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
bHD 2901 510 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2904 511 Geen patroon
1:40 11.72 Zwak staal
bHD 2921 516 / / 7.23 cytoplasmatisch
bHD 3001 520 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2998 521 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2997
522 Geen patroon
1:40 11.84 Zwak staal
bHD 2974 527 / / 6.44 Cytoplasmatische aankleuring
bHD 2972 528 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
bHD 2949
533 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
bHD 2926 541 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
bHD 2923
542 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
bHD 2910
546 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2811 552 / / 6.01 Zwak staal
bHD 2806 554 / / 7.23 Zwak staal
bHD 2795
559 Geen patroon
1:40 9.11 Cytoplasmatische aankleuring
bHD 2794
560 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
bHD 2788 561 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
bHD 2784 562 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
bHD 2769
564 Geen patroon
1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
bHD 2737 573 Geen patroon
1:40 14.32 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
bHD 2732 574 Geen patroon
1:40 14.32 Zwak staal
bHD 2727
576 Geen 1:40 13.40 Cytoplasmatische
patroon aankleuring
bHD 1204242752 579 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
cDC 52287
203 Geen patroon
1:40 15.20 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 52349 206 Geen patroon
1:40 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 52414 210 Geen patroon
1:40
37.01 Cytoplasmatische aankleuring + aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 52462 212 Geen patroon
1:40 7.23 Zwak staal
cDC 52736 228 Geen patroon
1:40 17.51
Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 52920 239 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
cDC 53037 243 Geen patroon
1:40 19.06 Cytoplasmatische aankleuring
cDC 53187 245 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
cDC 53212 246 Geen patroon
1:40 9.11
Zwak staal
cDC 53213 247 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
cDC 53214 248 Geen patroon
1:40 28.36
Cytoplasmatische aankleuring
cDC 53359 251 / / 7.23 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 53653 258 Geen patroon
1:40 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 53904
266 / / 7.23 Zwak staal
cDC 54015 268 Nucleolair 1:40 9.11
Zwak staal
cDC 54060 271 / / 6.01 Zwak staal
cDC 54451 276 Geen patroon
1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 54708 278 / / 7.23 Zwak staal
cDC 54787
279 Geen patroon
1:40 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 55055 283 Geen patroon
1:80 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 55613 291 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
cDC 55674 294 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
cDC 56417 305 Geen patroon
1:40 9.11 Zwak staal
cDC 56766 310 Geen patroon
1:40 11.45 Zwak staal
cDC 57019 318 / / 7.23 Zwak staal
cDC 57224
322 Geen patroon
1:80 13.40 Cytoplasmatische aankleuring
cDC 57459 326 Geen patroon
1:80 7.23 Zwak staal
cDC 57637 328 Geen patroon
1:40 9.11 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)
cDC 57680 330 Geen
patroon 1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie
(vuil op plaatje)
cDC 58455 335 / / 7.23 Zwak staal
cDC 58886 339 Geen patroon
1:80 16.67 Cytoplasmatische aankleuring
cDC 090826-2420
421 Geen patroon
1:40 17.06 Zwak staal
aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls, (*) Patroon en titer op basis van
Zenit G-sight zonder bijsturing. De stalen zonder patroon en titer zijn positief bij een cut-off op de PI ≥6, maar negatief bij een cut-off op de PI ≥8.
Tabel 2: Stalen die negatief werden geïnterpreteerd door de Zenit G-sight en positief na
bijsturing:
Subset Staal Volgn° Patroon(*) Titer(*) Index (1:40)
Reden
aSSc LP240171 99
Centromeer+Nucleolair
>1:2560
4.73
Toenemende index i.f.v. dilutiereeks
SSc RVH060837 90 Centromeer 1:40 2.12 Zwak staal
bHD 2818 497 SSA 1:80 2.12 Zwak staal
bHD 2842 506 Nucleolair 1:40 5.99 Zwak staal
bHD 2989 524 Nucleolair 1:80 5.99 Zwak staal
bHD 2815 551 Homogeen+Nucleolair
1:40 5.99 Zwak staal
bHD 2730 575 Gespikkeld 1:40 5.99 Zwak staal
cDC 52578 220 Nucleolair 1:80 5.99 Zwak staal
cDC 52679 224 Homogeen 1:40 2.81
Zwak staal
aSSc: systeemsclerose,
bHD: healthy donors,
cDC: disease controls, (*) Patroon en titer op basis van
Zenit G-sight met bijsturing.
BIJLAGE 2: LEZINGEN
Lezing 1: Improving adherence. From research to policy to practice. (Professor Nick
Barber, UCL School of Pharmacy) (1-3) (cfr. http://www.cppe.ac.uk/nms.htm)
Onderzoek heeft aangetoond dat medicatiefouten verantwoordelijk zijn voor ongeveer
vijf percent (is ook de prevalentie van kanker!) van de ziekenhuisopnames. Deze
medicatiefouten ontstaan op verschillende stadia o.a. bij het voorschrijven van
medicatie door de arts die druk bezig is met de diagnose waardoor er onvoldoende tijd
wordt gemaakt voor advies- en informatieverstrekking over medicatie aan de patiënt.
Een ander grote oorzaak van schade door medicatie is de slechte therapietrouw (33-
50%). De aanpak hiervan is afhankelijk van de soort ‘therapie-ontrouw’ (intentioneel
versus niet-intentioneel). Hierbij moet respectievelijk, het gedrag van de patiënt t.o.v.
medicatie veranderd worden en de oorzaak van het niet innemen van de medicatie
achterhaald worden. Verandering (om problemen door medicatie op te lossen) kan pas
gebeuren nadat de regering overtuigd wordt en overeenstemt. NMS (New Medicine
service) is een kosten effectieve interventie dat werd geïntroduceerd in Engeland vanaf
1 oktober 2011. Hier lossen opgeleide apothekers heel wat problemen op i.v.m.
medicatie (o.a. ↑therapietrouw, ↓medicatie-verspilling, ↓ziekenhuisopnames door
bijwerkingen van medicijnen,...). Mijn eigen visie: Apothekers kunnen met een juiste
aanpak bijdragen in een heel belangrijk aspect van de gezondheid van hun patiënten
en dat is het verbeteren van de therapietrouw.
Lezing 2: Acces to quality medicines in resources limited setting. The role and
challenges of a humanitarian pharmacist. (Raffaella Ravinetto, Benedetta
Schiavetti)(4) (cfr.http://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/en/index.html)
Biljoenen mensen in lage- en middenlage inkomstenlanden (vnl. Afrika en India),
hebben geen toegang tot essentiële medicatie. In de privésector zijn generica nog veel
duurder dan in de publieke sector. Een lijst met de essentiële medicijnen die werkzaam,
veilig, kwaliteitsvol, kosten- effectief, beschikbaar en betaalbaar moeten zijn werd
opgesteld. Een tekort aan kwaliteitsvolle producten kan leiden tot onderdosering,
contaminatie, slechte biologische beschikbaarheid en stabiliteit,…Naast
beschikbaarheid en goede kwaliteit van medicijnen is opslag, distributie en transport
ook heel belangrijk. Er is een tekort aan menselijke, technische en financiële bronnen
om alle taken van de medicatie regulerende autoriteiten uit te voeren. Zo wordt ook
weinig onderzoek uitgevoerd voor ziekten die zeldzaam zijn in de welvaartslanden,
maar in grote mate aanwezig in ontwikkelingslanden (vb. slaapziekte). Mijn eigen visie:
Apothekers kunnen een belangrijke rol spelen in het helpen toegankelijk maken van
medicatie in ontwikkelingslanden en bijgevolg bijdragen tot de volksgezondheid in deze
landen.
Lezing 3: Counterfeit medicines: Pfizer Forensic Laboratories-EMEA Region.
(Wendy Greenall, Senior Chemist/Counterfeit Medicines Laboratory Manager) (cfr.
http://www.pfizer.co.uk)
Vervalst geneesmiddelen (verschillende indicaties vb. Viagra, Lipitor, Ponstan,...) zijn
fysisch heel moeilijk te onderscheiden van de echte producten en bevatten al dan niet
dezelfde actief bestanddeel (sommigen bevatten enkel lactose, talk,…). Vervalste
geneesmiddelen zijn gemakkelijk te produceren en te verdelen (vb. via het Internet) en
geven bovendien een hoge winst. Bijgevolg komen ze frequent voor. Ze worden bereid
in onhygiënische omstandigheden en soms worden er schadelijke producten
toegevoegd om het te doen lijken op het echte product. Pfizer’s laboratoria (gevestigd in
Amerika, UK en Azië), ontvangen stalen van overal in de wereld. Deze laboratoria
gebruiken verschillende analytische testen om de dosering en de samenstelling te
bepalen (o.a. X-straal diffractie, HPLC, Gaschromatografie, de TruScan®). Hiernaast
worden de geneesmiddelen visueel geëvalueerd (spelfouten op verpakking, vuilheid,
slijtage, uniformiteit van vorm, grootte, kleur,…). Pfizer geeft een donker blauwe logo
aan de echte producten, dat om de 2 jaar verandert. Mijn eigen visie: Pfizer Forensic
Laboratoria die de echtheid van medicatie controleren zijn onmisbaar om de
volksgezondheid te beschermen tegen vervalste geneesmiddelen.
Lezing 4: Application of Antibodies in the Analysis of Drugs, Disease Markers,
Bacteria and Toxins. (Richard O’ Kennedy, Prof. Biological sciences, School of
Biotechnology and Deputy Director/ Biomedical Diagnostics Institute, Dublin City
University, Ireland) (5)
Antilichamen zijn immunoglobulinen die heel goed opgebouwd zijn voor hun functies.
Verschillende soorten (polyclonaal, monoclonaal en recombinant) antilichamen met
verschillende eigenschappen (specificiteit, stabiliteit, beschikbaarheid, affiniteit,…)
worden geproduceerd. Hierna gebeurt een selectie van antilichamen met de gewenste
eigenschappen en karakterisatie a.h.v. de ‘Six-s’ (‘Specificiteit, Sensitiviteit, Sources,
Selectie, Screening en Sensing’). Kwantificatie van vele ziektemerkers (vb. cardiaal
troponine-I voor cardiovasculaire ziektes) gebeurt m.b.v. antilichaamtesten waarbij
ziektemerker-antilichaam interactie omgezet wordt tot een kwantitatief signaal.
Hiernaast hebben antilichaamtesten vele andere toepassingen zoals het opsporen van
heroïne in speeksel (test duurt lang, vandaar de nood aan een snellere en meer
specifieke test). Bij detectie van Listeria Monocytogenes is men ook op zoek naar een
snellere en meer specifieke test m.b.v. antilichamen gelabeld met kwantum dots
(ELISA) en gericht tegen een virulent proteïne van de bacterie. Mijn eigen visie:
Antilichamen zijn heel gebruikelijk omdat ze kunnen gewijzigd worden naargelang de
gewenste eigenschappen. Ze worden meer en meer gebruikt voor verschillende
toepassingen.
REFERENTIELIJST BIJLAGE 2:
1. Clifford S, Barber N, Elliott R, Hartley E, Horne R. Patient-centred advice is effective in improving
adherence to medicines. Pharm World Sci. 2006;28(3):165-70.
2. Clifford S, Barber N, Horne R. Understanding different beliefs held by adherers, unintentional
nonadherers, and intentional nonadherers: application of the Necessity-Concerns Framework. Journal of
psychosomatic research. 2008;64(1):41-6. Epub 2007/12/26.
3. Dean B, Barber N, van Ackere A, Gallivan S. Can simulation be used to reduce errors in health
care delivery? The hospital drug distribution system. Journal of health services research & policy.
2001;6(1):32-7. Epub 2001/02/24.
4. Navarro V. The world situation and WHO. Lancet. 2004;363(9417):1321-3.
5. Conroy PJ, Hearty S, Leonard P, O'Kennedy RJ. Antibody production, design and use for
biosensor-based applications. Semin Cell Dev Biol. 2009;20(1):10-26.
URL-lijst:
http://www.cppe.ac.uk/nms.htm (24-02-2012)
http://www.pfizer.co.uk.htm (15-03-2012)
http://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/en/index.html (01-03-2012)