University of Groningen
Physiology in a life history perspectiveVersteegh, Maaike Annechien
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.
Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:2012
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):Versteegh, M. A. (2012). Physiology in a life history perspective: Stonechats' adaptations to differentenvironments. Groningen: s.n.
CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 25-05-2020
Physiology in a life history perspective
Stonechats’ adaptations to different environments
The research presented in this thesis was carried out at the Animal Ecology research group of the Centre for Ecological and Evolutioary Studies (CEES), University of Groningen, the Nether lands, and at the Max Planck Institute for Ornithology, Andechs, Germany.
������������������� ���������������������������������������������������� ��� �������� ��� �����������nwo-veni - 863.04.023) awarded to Prof. B.I.Tieleman and the university of Groningen.
������ �� �������� ������ ��������� ��������������������� ��� ������Groningen and the Faculty of Mathematics and Natural Sciences.
Lay-out and Cover Design: Johanneke Oosten�� �������!�"��##�� $�%���"�������&�'��� ����
ISBN: 978-90-367-5349-4ISBN: 978-90-367-5350-0 (electronic version)
������������� GRONINGEN
Physiology in a life history perspective
Stonechats’ adaptations to different environments
PROEFSCHRIFT
ter verkrijging van het doctoraat in de Wiskunde en Natuurwetenschappenaan de Rijksuniversiteit Groningen
op gezag van de ���������� ��������������������in het openbaar te verdedigen op
vrijdag 24 februari 2012om 14�30 uur
door
Maaike Annechien Versteegh
geboren op 7 januari 1976te Groningen
Promotor: Prof. dr. B. I. Tieleman
Beoordelingscommissie: Prof. dr. K. C. Klasing � � ����� ������� ����� Prof. dr. F. J. Weissing
CONTENTS
I.
General introduction
II.
����������������������� ������������ ������ ����������������������Pace-of-Life axis? Covariation and constraints
among physiological systems
III.!�������"������������ ����� ���� ������� ����������� ��#� �����
���� ������$�����"$���%�&� ����"
���'������� ��#� ���������$�����"$���%�&� ����"�����������(� �������in constitutive immunity: a common garden study with stonechats
from different environments
��'������������������������ �"����� ��������� � ����� �����
mitochondrial function
10
22
44
66
90
�����$���� ����"���������(�������� ���������� ��������� ����� ��������
�������(�$� ���(��)��� ��������� � ��*������������"��� European stonechats
����+���$ � ��������"����������*����$����������������$$ ����������$�
unravel the complexity of the immune system in an ecological context
������������ $��"� ��)������� ������������������������������
avian life history: a synthesis
REFERENCES
���,!�����!-��!��'
DANKWOORD
LIST OF AUTHORS
LIST OF PUBLICATIONS
110
124
166
180
202
212
218
220
10
CHAPTER I
General introduction
-���#��!���� ������
Including physiology in life history thinking!��� ������.��/��������$����� ��� ���� �$ ������(�� ���$���� ���� ������ �����"� ����� ���� ����$ ����)������(�� ���� ���� �������� ��� �$ ������again. There are many strategies that organisms can follow to opti-��0�� ���� �/������� �&$ ������ ��� ����(� ���"���� ���������� ���� ������ ��found on this planet. Ricklefs and Wikelski (20021����� � ����������-�� "�� �������� �����2����������(��(����� ������������������� ���(�� ����$�"�����������������������������$���������������� ��� ��������%�������� (�(������� �$ ������(������������ ����"3��������)���������������/��-������� ���������������������4������ ����"�)����"�����������������/�-�������$�������� ����������� ����������� ���������������������(� ��-������ ����� ����������"������ ������� ������ "�$�"������"�� ���(�� �or demography (Ricklefs and Wikelski 2002). Moreau (1944) and Lack (19471� )� �� ���� / ��� ��� ���� � �� ������������ � ����� ��� �� �� ����������������� ��$� ����� ���������� "� � ���� ��� � ��*� ���������0�����"������������ � ���� ���� �$����� ���������"���)� ������$� ������������� � ���� ������$� ���� ������������$����������������� �������(���-����� "� ��������������������������� ��������������(� �������5������6��"�1966, Ricklefs 1980, 2000, Promislow and Harvey 1990, Hayes et al. 1992, Stearns 1992, Charnov 1993, Ricklefs and Wikelski 2002). It is ��)�)�������� ���������������������0���������"��� �������)�������������� ��������)�������� ����������� "�� �������#����(���$�����������������-gevity (Cody 1966, Williams 19661��!��������� ����(� ����������� ��������������������� "�� �������������� �������������������� �������� ��(Charnov 1993, Ricklefs 2000).
11
��"���������������� ���� ���$� ������ ����� ����� ������� ������)����life history traits (Pearl 1928, Drent and Daan 1980, Wikelski et al. 2003, Tieleman et al. 2004, 2006, Speakman 2005, Wiersma et al. 2007). This results in a single dominant axis of covarying life his-tory traits and physiology, commonly referred to as Pace-of-Life axis 5�������������� ������1996, Ricklefs and Wikelski 2002). Bird spe-cies with a slow Pace-of-Life generally produce small clutches, have �������(���$�����������������������$������)����� ����� ����������(�����low latitudes. Species with a fast Pace-of-Life generally produce large clutches, have short development times, short life spans and live at high latitudes (Promislow and Harvey 1990, Ricklefs and Wikelski 2002, Tieleman et al. 2006, Wiersma et al. 2007). Biologists have put forward many explanations for the latitudinal trends in associated physiological and life history traits, including variation in food avail-� ����"�������$ �������� ��#���������� �����"����� ������� ��� �$ ����-tion, pathogen pressure and disease risk and seasonality of resources (Lack 1947, Ashmole 1963, Ricklefs 1980, 2000�� �������������� -hulst 1996, Cichon 1997, Speakman 2005). These explanations are ��������������������������������(���� ������������������ ���� ������������"���(�������������� ��)��������$ �����������������������������������)�"������/����������$����0���56��"�1966, Gadgil and Bossert 1970, Ricklefs 2000).
Pace-of-Life and physiological constraints���������"$���������&$����������������7��7,�����&���� �� ������������������ ���/���������������� "�� ������ ����������� �������������� �����physiological mechanisms are often proposed to play a part in the evolution of correlated physiological and life history traits (Ketterson et al. 1996, Ricklefs and Wikelski 2002���� �������������2010). The ������������� ���� �������������&�� ������ �"��&$������ ������������"�in relation to reproduction (e. g. Drent and Daan 1980, Harvey et al. 1991, Johnson et al. 2001, Speakman 2005, Tieleman et al. 2006). ��� ���� "� ������ ����� ��� �������� �"��&$������ ��$ ��������� �-���� ��&��� "$ �������� )����� ������� ������ ���� ��%������ �����$���58�� � ���������20071��4������ � ���������������� �"��&$������ ���for example when it has to raise a lot of young or to migrate over �������������������)����$ ���������"�� ��� ������������������)������%�-ence life expectancy (see for a review Dowling and Simmons 2009).
12
Ch
apter i | G
en
eral in
troduction
��������� ��)������%����������(���������� ���� �$ ������������������maintenance (Cichon 1997). Over the last few years not only energy �&$������ ��� ������������ ��"������ ��������������������������������� �����"�7���������� �����"���������������������"����7���(�� ����$ �$�����������������������������7��7,�����&���5�������������� ������1996, Ricklefs and Wikelski 2002, Martin et al. 2004, 2007, Tiele-man et al. 2005, Hau et al. 20101��,��#������������ ����������� ����and immune system exist. For example, the hormone corticoster-������ ���0������ �"�������%������� �������"�� �������� ��������(��limited the variation in these systems that natural selection can act upon, one might expect that they have played a role in the evolution ���������� ������4����� ����������#������������ ����������� ��������immune systems have resulted in the evolution of a single Pace-of-Life axis is unclear. -���� �������� ��(��������������� ����� ���� ��� �������� ��� ���������� "������������� ��0�������� ����������� ����������� ����� ����� � ��������� ����� ���� 59-�1� 5����� ��� ����1990, Hayes et al. 1992, Wikel-ski et al. 2003, Speakman 20051��9-�������/���������������������� �"� �&$������ �� ��� �� $���� �� $��(�� ������� ����� ��� �� ����the rest phase and at thermoneutral temperatures (King 1974). It is ������� ����(� ��������"���� �"��&$������ �� ��� ����/���� 5���"�1987, Daan et al. 19901������(��"�5��� �� � ���������1998, Nudds and Bry-ant 20011��������(���� ����"����������5-��� �1988, Mueller and Dia-mond 20011������������������$� ��"��&$������� "�� ������0������� ��"�composition (Daan et al. 1990, Piersma et al. 1996, Tieleman et al. 2003�1��������� �������)���������������������7��7,�����&���54�#���#�����al. 2003, Tieleman et al. 2004, Wiersma et al. 2007). These proper-ties make it a good measure for researchers interested in constraints among life history and physiology. Corticosterone is an important hormone related to self-maintenance. ��� �������� ���$�"��������������������������������� �"��� ���0���������������)�"��$ ��������� ����������(����5��$���#"��������2000, Landys et al. 2006). Corticosterone increases rapidly when environmental fac-�� ��� ���� ������������:� ���$ ������ ���54���/�����������1998). One of the properties of such a stress-induced corticosterone response is that individuals redirect their activities from those typical of the nor-�������������� "�������5����� �$ ��������1����� ���(��� �����$�"������"��"$���������� (�(���54���/�����������1998, Landys et al. 2006). Baseline �� ������� ���� ��� �������� ��� �������)���� � �����(����������������
13
workloads, like during migration or feeding of young (Landys et al. 2002, Bókony et al. 2009, Hau et al. 2010). Stress induced corticoster-��������"$������0������ �������)��������(�������� �$ ��������������)�and the value of self-maintenance is high (Bókony et al. 2009, Hau et al. 20101��� ������$ ������ �����(� ��������58����������2010).��� ������� �"��������� ����$ �$����� ��� ����� ��� ��������7��7,�����&������)����5�������������� ������1996, Ricklefs and Wikelski 2002). The immune system is a complex system, with many different com-$�������)���������������� ��"���������$���������5������78��$������� � ��2003, Lee 20061�������������"��������� ����(������������;�� ������� ������� �������"�� ���� �� ��(����� ��� ���� ����������(������ �������� �������"� 5������78��$������� � ��2003, Janeway et al. 2004). Constitutive innate immune defenses provide the non-�$���/��/ ������������������������������� ���������������������� ��� ��is an important part of immunity (Janeway et al. 2004, Buehler et al. 2008�1����� ������� ��)���� �$ �����������������7������������and trade-offs with other life history traits are thought to have $��"����� ��������������$��������������"�5������������������� ������1996�� ,�������� � ������� �� � ��2000, Tella et al. 2002, Martin 2005). However, pathogen pressure may differ among environments (Guernier et al. 2004), and the value of immunity may not only de-$�������� ���7�����)�������� ����������� "�� ������ ���������������5�&-pected) pathogen pressures (Horrocks et al. 2011). Geographical and seasonal variation in trade-offs with resource demanding life history traits together with variation in environmental factors, such as patho-gen pressure, may have led to variation among species and seasons in constitutive innate immunity.
������������ ��������������������� ��� �Birds living at low latitudes generally have a slow Pace-of-Life, and � ��� ��(������������ ������������ ���������7��7,�����+����� ���� ���������������� ��� ����#��"� ��� ��%������ ����� ����� "� � � $�"����������� � ����� ��� � ���� +��� � ��(� ��������� ����� �� �� �������� )���� ��������� 5��������$� ��� ��� ��������� ����������"1� � ���� �� ����� ��� ����������� �� �altering clutch size, migration distance, longevity and physiology. One distinct characteristic of environments is that they express pro-�����������$� ���%����������������� �������������������� ����$�������� �(��������� ���������������������������������������"7�������%��-
14
Ch
apter i | G
en
eral in
troduction
tuations (Nelson et al. 20021�������� �������������%������������������(� ���������$��������������������*��������$���������%���������������"7������������ ������������;���� ������������������"7�������%�����-������� �������������)���� ����������� �����������������������(� ��-ment. Depending on the location on earth, environments express a � ������������������������������������������ ������(���� ����"�� ���-fall, temperature, pathogen pressure, photoperiod and many more factors (Nelson et al. 2002). Birds living in these environments may have evolved in such a way ���������������"�������� � ���(�� �����$�"������"�/����$������"������������������"����������(� ����������"����� ���5-���������7����#������and Hahn 2007, Helm 2009). Seasonality as a characteristic of the ��(� ���������"���%���������������� "�� ��������)����5���#�����1980, �� �"� ��� ����1991). Seasonality in physiology is well studied in rela-tion to reproduction and migration (Landys et al. 2002, MacDougall-Shackleton and Hahn 2007, Bauchinger et al. 2008). Animals that ��(�����$�������� � ���(�� �����$�"������"���������������������$ �-���� �"���(�������(��������(� ���������������&$ �������� ����� ����processes randomly (MacDougall-Shackleton and Hahn 2007). Environmental factors affect life history and physiology at different evolutionary timescales, and as a result variation in life history and $�"������"� �%����� ����&�� ���������� ���� �(�������� "�$����������These phenomena include phenotypic plasticity, genetic differences �����������$������������������������� ������ ���������� �������� �-�����(�������� "�$���)�"������ ����� � ����������� �������������� ���"��disentangled when raising organisms from different environments in a common environment (Turesson 1922, Gwinner et al. 1995a, Falconer and Mackay 1996). Such a common-garden experiment minimizes environmental components of variation, and highlights the genetic component of the adaptive response to different environ-������5���� �&�1.1). When the experiment is restricted to closely-re-������ ��&�� ����� ��� ����������� �� �$������� �������� ��� ����� ����� $���-ways are minimized.
Stonechats: a model species for answering evolutionary questions
������������ ��������$���� ��������� ��������)���� ����������(� ��-ments and showing distinct life history variation (Urquhart 2002;
15
���� �&�1.21���������������������������������������� �$������� ������-ing from four locations (Kazakhstan, Austria, Ireland and Kenya), #�$�� ���� ��� ��� ����-�&������#� ���������� �� �+ ��������"�� ���!�-dechs, Germany (Gwinner et al. 1987). Their environments of origin ����� �������"���$�����5�����$ ������ ����"�����$� ��� ��������������-ity) and the stonechats have associated life history characteristics (see �&�1.2). When held in captivity stonechats display life history traits �"$������� �� ��7��(������ �$�������<� ��&��$���������������� �$������maintain variation in clutch size, development time and timing of $����=�(������������)���� � ������ �����������$��(��"�5� ������1922, König and Gwinner 1995, Starck et al. 1995, Helm and Gwinner 1999). The fact that variation is maintained in captivity indicates ��������������� "�� �������(������������ ��#� �����������������������������������$��(��"���������#��)������� �������� ����������� ������#��them ideal study species for researchers interested in the evolution of physiology and life history.
Variation among physiology and life history traits in stonechats
In chapter 2 of this thesis we take measurements of three physiologi-�����"�����7����� ����������� ��������������7��������(����������������� ������������� �$�������-��� ����� �������#��)����� ���� �������with life history traits such as clutch size and migration distance in stonechats (Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003), and we use it as �������� � �� � ����7��7,�����4������� �� �������� ���� �� ���7��������corticosterone response and six measures of constitutive innate im-munity commonly used in ecological immunological studies: Micro- ������� � ����"� ��������Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans ��� )����� ����� 5�������� ��� ���� 2005, Millet et al. 20071�� ����������������� ���������"���� � ����"� ��� �����$������(Matson et al. 20051�������$����� ���������� ��������� �����$������(Delers et al. 1983). We investigate how immune measures and cor-������� ���� �� �������)�������� ����� ����� ����)����� � ����� �����among or within systems at the individual level could have led to (� ���������������� �$��������(����There are many studies investigating seasonality in energy expendi-ture (for a review see McKechnie 20081�� ��� )����� � �� ���������"����� ��(�� �� �������� ��#� ������ ���� ����� ���� ������ � ��� �(���-
16
Ch
apter i | G
en
eral in
troduction
tion, is largely unknown. This is essential knowledge when trying to link seasonality in energy expenditure to life history traits. Most �������� ��(����������� ��������� �������� ������� ����� ������(�� ����performed in temperate regions and only compare two seasons (e.g. migrating-non migrating or winter-summer; Cooper and Swanson 1994, Cooper 2000, Kvist and Lindström 2001). There are a few studies that investigate variation in energy expenditure over more than two seasons (Piersma et al. 1995, Klaassen 1995, Zheng et al. 2008���>0�����������20111�� ����������� ��� �����#������������� ������-parison of annual cycles in energy expenditure among temperate and � �$����� � ����������$�� �3�)����(��������������������� �������������$�����"$���%�&� ����"�������������$���� ������9-���4�����$� ����� -cannual cycles of BMR among Kazakh, European and Kenyan stone-chats housed under the same conditions. Additionally we measured �� ���������"��������9-������" ��������� ��)���������� �$������5���� �&�1.21������(���������$�����"$���%�&� ����"����9-���)�����������-ured stonechats under different thermal regimes.�������"� ��� ����(�� ���� ����� ��(������������ ��� ����������"� ��� ��-�����"�������������"����$� �������� �������� ���� ����������������some ‘quiescent’ period (see Martin et al. 2008). Exceptions are Bue-hler et al. (2008c), who studied immunity during a whole annual cy-cle in captive red knots, and Pap et al. (2010��� 1�)������������ �����(-����� �����������������"����� ����$ ����������� ��� �����������������resource demands of many life cycle stages (e.g. migration (Owen and Moore 20061�� �������5�� �������������1998), moult (Martin 2005)). However, additionally environmental factors such as pathogen pres-�� �� ���� ����� �(���� ����"� ������ ����� ��%������ �������"� 5' �����et al. 2011, Horrocks et al. 20111��-� ��(� ����� ������ � ��� $������ ������� �������������(� ��������)�������"��� �� ������ ����pathogen communities (Møller and Erritzøe 1998). In chapter 4 we investigate variation in circannual patterns of indices of constitu-��(���������"��������������� �$�����������" ������������)���������chapter 3. Because of the different expression of life cycle stages and the differences in seasonality of the environments we would expect ���/������������ �� �������� �"������ ��� ������ ��� � ��7��(���� ������������Because we measured captive stonechats under standard conditions, �������� � (� �� ��� ���$� ��� ��� ����)������� ����" ����� ������� ����� �������$ �� ����)����������������������������� ��#� �����of circannual cycles in immunity.
17
The size of an organism influences BMR within individuals over ������ ������������������(�������� ��$��������������������� � �����-explained variation remains within and among individuals or spe-cies when size is accounted for. Chapter 5� �&$�� ��� ���� $���� ������ ������(� ������������� �"����� �������������)���7���� ������������some organs use more energy than others, and therefore organ size ���� ����$ �$���������&$�����(� ����������9-��������� ��������(Daan et al. 1990, Konarzewski and Diamond 1995). Yet, there are ����� � �������������������(���������������)��� ����������$� ��)����variation in BMR and organ size (Tieleman et al. 2003a, Russell and Chappell 2007). This leaves us with questions regarding the ������������ ��)����������� �$ ������������)������ ���������� �"��&$������ ���4������ ������� ��� �"����� ������ ��#��� $����� �����-tochondria (Rolfe and Brown 1997, Nichols and Ferguson 2002). 9-����������� ��� "��&"����������$��������������������������� -gy that is gained through the oxidative chain reaction in the mito-����� ���������������� �����"���� ��� ��$ �(���������#� ��)����the cellular processes and whole animal BMR. Mitochondria are maternally inherited, and we could study the nature of heredity ��� 9-�� ������ �)�� �" ���� ���� ���� � $� ������ �� �$������ 56��$-ter 51��9������������" ����)� �� ��������$��(��"������ �$���� ������known. Therefore we know to which population the mothers (and ����� �1� ���������
Evaluating sources of variation !��� ���(�����������(� ��������������� �$������������ ���������"�����of BMR and indices of constitutive immunity we will now look in more detail at variation among species and individuals. In the follow-ing chapters we will look at sources of variation in BMR among and within individuals. We will also investigate how complex and simple ������������������� �� �����������������"0������(����������������������that are used to measure immunity. �� �"��&$������ ������������������������(������������ �����5�����-sen 1995, Tieleman et al. 2003a, Wikelski et al. 20031��������� ����related to life history traits such as clutch size, which are known to ���� ��� ���5'� ��1988, Godfray et al. 1991). However, the direct �(��������������� �"��&$������ ������� ��� ������)���������� ���5�?�-ning et al. 2007). In chapter 6 we investigate whether BMR and total
18
Ch
apter i | G
en
eral in
troduction
evaporative water loss are individual characteristics, a prerequisite for �� ��� ����"��4���������(�����������)�������������)��������������������(������(� ����������� ���&$������� "��������&����� ��"������In chapter 2 and 4 we measured multiple indices of immunity. This stems from the fact that one immune index does not capture immu-nity as a whole. The immune system is a complex system, and can ����(����� ���������������(��������� ��������� ������:� ���� ����������������;�� ���� ��5������78��$������� � ��2003, Lee 2006). To capture the complexity ecological immunologists have started to measure multiple aspects of immunity (Martin et al. 2007, Buehler et al. 2008c, Pap et al. 2010��� 1�������$$ ��������� ������������&-�������$ �� ����� ���$ �(�������$$ �$ ������������������������������"0��the multiple indices is challenging. In chapter 7 we investigate how to use multivariate and simple statistics to meaningfully summarize multiple indices of immunity in an ecological context.Finally, in chapter 8�������� �0������/�������������������������)��have gained from this thesis. I indicate what we have learned and what unexplored areas there still are for future work.
19
Box 1.1Common garden setup
The Max Planck Institute for Ornithology had a successful history of keep-�������� ��������� �$��������������������� �������� ������(� �����������a common garden set-up. Common garden experiments have their origin ����(�������� "�$����� �����"�5� ������1922, Clausen et al. 19401�� ���� ����)�� �;�����"������ "�� �������������5�����')���� ��������1995a, Klaas-sen 1995, Martin et al. 2004��������� �)�=#��������2006). In common �� �����&$� �������� ����� � ���� 5�� 1�$������ � �� ������ ��� �� �������environment. This is a useful set-up for investigating what proportion of ����$�����"$���(� ������� ��)����5�� 1�$������� �� (����������/�������� ����� � ���������������� ��#� �����5<������ �����-��#�"�1996, Merilä and Sheldon 20011��8�)�(� ������� ����������������(������ � ���� �� (����������������� ����������� ����� � ��������������������� �������������-�-ternal effects (e.g. investment in the egg) and the environment of the nest may also play a role in the development of the chick (Falconer and Mackay 1996, Merilä and Sheldon 2001). By hand-raising chicks from different nests and species together, Gwinner and colleagues minimized the en-vironmental effects during development (Gwinner et al. 1987). Another point of caution is the fact that having a relatively small captive population �������������� ��������������� ������� "� ����� �"� �����������(�������� ��������� �$��������������������� �������)�������������$�$���������A common garden experiment has the requirement that the environ-������������������� ������� �$����������������������������������������)����� ���� � ��� � ��#�$�� � �� ���� �������-���� ���������������� ��� �����thesis were kept at 20°6� "�� � ����� ���� ��� �������"� %���������� �-ropean day-length. A common garden set-up also gives researchers the �$$� �����"� ���������������������$������� ��������������� ����� � ���� ��exposed to. I used this opportunity to look for the effects of temperature on physiology. I kept European stonechats under the standard condi-tions (20°C and European day-length) and under European day-length �����������"�(� �� ������$� ��� ����������$� ��� ��)��� ������������average temperature that free-living European stonechats are exposed to as derived from locations of ringing recoveries (Helm et al. 2006). We ��=���������$� ��� ��)���)��#�"��
20
Ch
apter i | G
en
eral in
troduction
Box 1.2Study species
Stonechats (Saxicola torquata �$$�1�� ��������$���� �������������� ���� ��(�������������������(����� �$������������������� �$���������� ���many environments over a wide range of latitudes in Eurasia and Af-rica (35oS-71oN; Urquhart 2002). All through their range their typi-������ ����� �������$��� �������$��� �������� �� ������������ ���� ���-������� (����"�� ������������� ���$���� ����������)���� ������ ���������� ����������������������������$��� ���������� ���������(� �� �������������"�� ����� �� ���� ���� ��� ���� � ���� )����� � ���� ����� ���������������������� ��������� ����$������� � �� �$������ 54�����������2008). However, I will refer to the stonechats from different locations ����� �$�������� ���������������������Until recently, the Max Planck Institute for Ornithology in Andechs, '� ���"���������$��(������������������ �������$ �� ������ ���� "� � �� ��')���� ������������������������� �"�1980s. The stonechats ������������������"� �������������� ��� �$�����*���0�#��� ��� � ����stonechats (S. t. maura), European or Austrian stonechats (S. t. rubi-cola), Irish Stonechats (S. t. hibernans) and Kenyan or African stone-chats (S. t. axillaris1��-��"� ����(�������)� �� � �� ��� ��$��(��"� ��������� ����������������)� ����#���� �������/����)������������"������ �hatching (Gwinner et al. 1987). �����(� ������������ ����������������� ��� �$����������� �������"������ ������������(� �������$� ��� ��� �������������� ����������������������������"��)�������� �%������������� ����������� "�� �����5')��-ner et al. 1995a, König and Gwinner 1995, Helm et al. 2009, Helm 20091����0�#�������������� ��$ ������������� �������� ������� ���short time, from early May to end of August, during which they lay a ��������������)��������(� ����/(�7��&������������ ��;�����"����� ���moult (Helm 2002). Thereafter they migrate over long distances to Iraq, Iran, Afghanistan, Pakistan, northern India, the Middle East, ����! � �������������������� ��7�����!� ����5� ;��� ��2002, Raess 20081��� �$����������������$������ �������������� �������� ������ ���-� ��� ��� �������$��� � ���� ����)����� ���"� ��"� �)�� ��� �� ������������)��������(� ����/(�������58����2002). After moult they mi-grate short distance to southern Europe and Northern Africa(Helm
21
2002, Urquhart 2002). Irish Stonechats are partly present on the �������� �����"�� 7 ���������$� ��"���� ����������� ������$� ���������$�$�����������$ ������� ���-� ��������$��� � �������� �����winter in Spain and northern Africa (Helm 2002, Urquhart 2002). � ������������������� ���"� ��"� �� ������������)����/(�����������"��������������� �� �������� � ����������� ���"� ������ ���� ���� ������rainy season, with the precise timing depending on the rains. They lay one clutch with three eggs per year (Helm 2002, Urquhart 2002). 4���������������� �$������� �� ����������#�$���������������� ����5���� �&�1.11����"����$��"������� ������ ������������������0������ � ������������������������ ���(�� �5')���� ��������1995a, König and Gwin-ner 1995, Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003, Tieleman 2007, Helm et al. 2009, Tieleman et al. 2009a, Helm 2009).
Hybrids!� �����(����������#��$��������� ������ �$�������������������������$-��(��"����������" �������� ��� ����������������������� �������� �����-zakh and European stonechats and European and Kenyan stonechats �����"� ����������� ������$��(��"�����$ �������� �������������������������" ���������� ��� ��������������� � ��� "�����������(���������������� ��������������������� ����� ��� ��� ��%�������������$���������������$�$���������< �������"�����" ���������� ��������)����$� �������� �$������������������ ��� ����������%������������������ ����$� ����������������� ���� ���������� ������������ ����������� ����"������"- ����������������(�� ����������������"�����#�� �)���5��� �#��������1995), moult (Helm and Gwinner 1999), clutch size (Gwinner et al. 1995a) and circannual rhythms (Helm et al. 2009).�������" ��������������(����������������� ����������������� ��#� �����of physiological traits. I will refer to the two different lines as Kazakh &�� �$��������� �$����&����"����" ������ ����������������-script. Only in chapter 5��� ��� �����" ������������!�����&�� �$��������� �$����&�!� ���������� �� ��������$� �������$������ �%���������sex of the parents in this chapter (e.g. Asian x European have Asian mothers, European x Asian have European mother).
22
CHAPTER II
D�������������������������������������traits fall on a single Pace-of-Life axis?
Covariation and constraints among physiological systems
-���#��!���� ����������� ������)� �����$������;��� �� B. Irene Tieleman
Abstract�� ������� ��� ����� �$���� ���� $�"����������� ��� � ����� ��� ����� ���-tory is thought to fall on one single axis, a phenomenon termed the ����7��7,�����!����)�����7��7,���������� ���� �0��� "���)�������� �$ �-������������������7�$���������)����� ����� ����������������7��7,���� "������$$��������� ���� ������������&���������������������&������� ������� � ������������� ������������$�"���������������������������� ��thought to restrict evolutionary potential. In that case, physiological traits should covary in the same fashion at the levels of individual organisms and species. We examined covariation at the levels of indi-(������������ �$����������� ���$�"������������"������5���� ��������-��� ��������������1���������� ������������� �$������)����������������������� "��� ���������������������� �������7�$��4������� ��� �-�������� ����� ��������������� ��������7��7,������� ������� �����������-� ��������� ���������&������ ����������������(���������"��-��� �����rate covaried with two indices of immunity at the individual level, and with corticosterone concentrations and one index of immunity at ������ �$��������(���� �������)�������� ������ ������������ ����$��-�� ��������(� �����������������(������������������� �$���������-onstrate that links among physiological traits are loose and suggest that these traits can evolve independent of each other.
23
Introduction�� ��������������� �$��������$�"�������������� � ������������������ "�strategies is thought to fall on one dominant slow-fast axis, with low �$ ������(�� ������ ����� �����$���� ���� ��)����� ����� ����� ��� ����end, and the opposite traits at the other end (Promislow and Har-vey 1990, Ricklefs and Wikelski 2002). This single dominant axis ���� ���� �$� ������������ ������(�������� ����0������� �������� ���studies that include a wide array of different species (Promislow and Harvey 1990, Ricklefs 2000) to those that investigate among-individual variation within a single species (Johnson 2000, Ricklefs 2000, Tieleman et al. 2005). Traditionally, most studies connecting ���������� "�����$�"������"������ ���������� ��0�����(���������� ��-ic rate (e.g. Pearl 1928, Drent and Daan 1980, Ricklefs and Wikelski 2002, Wikelski et al. 2003, Speakman 2005, Tieleman et al. 2006), ����� �� ������"� ���� ����� ���� �"����� ���� ���� ������� �"�������(�� ����������������������7�������@����7��7,����$� �$����(�.����)����5�������������� ������1996, Ricklefs and Wikelski 2002, Tieleman et al. 2005, Lee 20061���������� �����������(��)������������������ -����$�"����������� �"������ 5����� �������� ����� ���� �������� ����1�� ����� ��������"����#���5�������� �� �����-�)���1997, Lochmiller ������� �� � ��2000, Speakman 2005, Landys et al. 2006), in ad-���������������$��"���������)�� ����������� ������� ��)���� �$ ����-tive effort and adult self-maintenance that characterizes the Pace-��7,�����&����9�������$�"������"�������������� ����������$� ��)����organism and environment, Ricklefs and Wikelski (2002) suggest that the organization of physiological mechanisms may constrain ����(������ ��$���������������(� ����������� � "��������������������-ry variation. Constraints at the individual level would result in lim-ited evolutionary potential (Lande 1979, Schluter 1996, Duckworth 20101��A���������&���������������������� ������ ���������� �� �(�������This requires measurements of all three physiological systems in comparative contexts.When evaluating whether and how physiological constraints play a role in shaping life history variation, patterns of covariation of traits at different levels of organization can provide complementary in-sights. If the connections among physiological mechanisms have restricted the independent evolutionary potential of physiological traits, one might expect that these traits covary in the same way within and among species. Moreover, if physiological mechanisms
24
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
restrict the evolutionary potential of life history traits, one would �&$���������������� �������������������������������� ����(� �� �������(� "�)����������������������������7��7,�����&������� � ����� ���-��� �$������������ ������ ������8�)�(� �����$���� ��������(� �������among traits differ within and among species, then links among physiological mechanisms are unlikely to act as constraints on life ����� "� (� ������������� �$������� ���$� ������ �� ���� � ��������� �� -relations among traits at the individual level would strongly indicate that traits are not forced to covary through mechanistic connections. The presence, on the other hand, of a strong correlation among traits at the individual level does not necessarily confirm the existence of $�"���������������� ������������ �������(��������� �������������� �-f lect individual condition or quality. Finally, patterns of covariation among individuals can also stem from environmental conditions �������(��"���(� ������ �������� ������������� ������$���������"� �����-ing in different patterns of covariation within and among species (Lande 1986, Duckworth 2010). Therefore, in studies of the physiol-��":���������� "���&������� �������������(� ������������ ���&$������"�considered as well.Environmental conditions affect life history and physiology at dif-ferent evolutionary timescales, and as a result variation in life his-tory and physiology reflects a mixture of different evolutionary phe-nomena. These phenomena include phenotypic plasticity, genetic ����� ������ �����������$�������� ����������������� ������ ���������� �������� ������(�������� "�$���)�"������ ����� � ����������� ���at least largely, disentangled when raising organisms from differ-ent environments in a common environment (Falconer and Mackay 1996). Such a common-garden experiment minimizes environmen-tal components of variation, and highlights the genetic component of the adaptive response to different environments. When the ex-periment is restricted to closely-related taxa, effects of historical pathways are minimized.Stonechats (Saxicola torquata) are an ideal study system to address evolutionary questions related to variation in life history, physiol-��"� ���� ��(� �������� ������� ��� ���� � )����$ ���� ���� �$���� �������(� ������(� ���"������ ����������� �)���7�����������(� �������������������� "�����$�"������������ �����5� ���2.1), and their ease of handling and acclimation to captivity (Gwinner et al. 1995a, Raess 20051��4���� ����������#�$�� ����� ��������� ���������� ���� �� -
25
�$���������������������������������� ������������������0������ � ������������������ ����� ��������������� ���(�� �5')���� ��������1995a, König and Gwinner 1995, Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003, Tieleman 2007, Helm et al. 2009, Tieleman et al. 2009a, Helm 20091��!������ ������ � ������ ���� �������)������ �� �$�����.�� ���������(� �������������� ��� "��� ����"�������(� ��������� ����� �%��������dominant Pace-of-Life axis. However, the stonechat immune system ������ ������� ���� ��$�������(������ ���������������������$� �$��-��(�� "���� ��� �&������� #��)������ ��� ����������� ��� �����)���� ����common-garden set up allowed for a powerful integrative study of physiology and life history.In this study, we evaluate the hypothesis that variation in immune, ����� ���� ���� ���� ����� �"������ ������ ������ �� �������� �������������7��7,���� �&��� )������ ���� ������ ��� � �� �$������ ��� �����������kept in a common garden. We then explore if physiological con-�� ���������������(����������(������ � ��������&$�����(� ����������$�"�-�����"� ���� ����7����� ���� ��� ���� ��(��� ��� �� �$������� �$���������"��)�������)������������������� ��� �$����������������������)�������������������� ������� ���� ��$������������� ����� ����� �������������
sedentary partially short-distance
short-distance long-distance
()
0 0; 1200 1700 2600
year-round year-round; migrants February-September
March- mid October
early May- early September
1-2 3-4 2-3 1
3 5 5 6
related to rainy season
early April-August mid April-August late May/June
Table 2.1 – Life history traits of the studied stonechat subspecies. Kenyan stonechats have a slow Pace-
of-Life, Kazakh stonechats have a fast Pace-of-Life and Irish and European stonechats have intermediate
Pace-of-Life characteristics (after Helm 2003, Baldwin et al. 2010).
slow fast
26
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
)������������������� ��� �$��������������������������� ���������- ����� ������������������ �������� �����7��7,����54�#���#���������2003, Tieleman et al. 2009a).
MethodsBirds and measurement period
������������ ��������$���� �����)���������� �$�������� � ������ ���-ing from 71°N to 35°S (Urquhart 2002). We studied four geographi-����"���������������������� �$�����*��������"���S. torquata axillaris, the Irish S. torquata hibernans, the European S. torquata torquata, and the Kazakh S. torquata maura. Kenyan stonechats have a slow Pace-of-Life, Irish and European stonechats have an intermediate Pace-of-Life, and Kazakh stonechats have a fast Pace-of-Life (see Ta- ������; Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003). We took measurements from a total of 123�����7 ������ � ���5-�&������#������������� �+ -��������"��!��������'� ���"1��6�$��(�� ��� � ���)� ������5�B31), �)��5�B361�� ��� ���5�B23) generations removed from the wild. Wild � ���5�B331�)� ����#����������������� �������/�������(������������-stitute and hand-raised (Gwinner et al. 1987). All individuals were fully grown and ranged in age from 0-12 years; most individuals were 0-4�"�� ������5�B109). Birds were housed individually in cages. Eight to fourteen cages were placed in rooms that were maintained at constant temperature (20-22C61��������� ����� ��/����������*�� #��"-cle, which matched natural day length of the European population in winter at 40°N. We measured multiple innate constitutive immune ���������� �������������� ���7���������� ������� ����������� �������� ��"���������� ��������� ����� ���� 59-�1��� ����)���� � ��)�����������(�� � � ���� ����� <� �� "��4���� � ��� �� ;��������� $� ���� �� �������� ��� �$�����������$��(��"*������������� � ���)� �������������-� �������� � ��������4������� ������������������ �����$� ��-��� �� ���� ��"������ ���14 Kenyan, 16 Irish, 19 European and 15 ��0�#�� � ����<� ����$� ������������ ����� �������� ��"������������5���� ���)1�)������������� ����������26 European and 2 Kazakh ������������ ������� ���������5�� ��������������2008, Tieleman et al. 2009a) to the data set. We measured corticosterone concentrations in ���� �����������(�������512 Kenyan, 7 European and 12 Kazakh stone-�����D����� ��������������1� ������� ��"���0������������������������ ���������������������"� ����#���$� �����(�������
27
Baseline and stress-induced corticosterone levels������ ����� �������� ���� �� ���7�������� ��(���� ��� �� ������� ����)��� �)��)�� ��������$����$� � � ������/ ������$����)�����)�������������within 3������������� ����� �������� �������)����������� ���� � ���)� ����������)��������������� ����� ���������� ������� ����������� �������� ���� � ���)� �������$��������������� ������ �30 minutes, after which ���������������� ��������$���)�����#���������� ������� ���7���������� ������� ����������� �������54���/�����������1992). To minimize ef-����������� �������%���������������� � ���)� �����$���� ��)����13.00 and 14.30 hr (Joseph and Meier 1973). Blood was kept on ice and cen-trifuged within 90������������� ����$������<� ����� �����������$�����)�� ��� �����������������������)�����)���������� � ������������ �-�)�������� �������� �����������$�����������/ ��� ������ �)�Samples were analyzed using radioimmunoassay protocol of Goy-mann et al. (20061�� ��� �&� ������� ��/���������)� ��90% ± 4% for �������� ���$���� ���� 91% ± 5% for stress-induced samples. Each sample was measured in duplicate. Intra- and inter-assay variations were 3.1% and 18.8%, respectively; the detection limit was 0.06 ng/����� � ���� �������������� ���7��������������� �������
Indices of constitutive immunityMicrobicidal capacity�E�4������������ � �������� ����"�������������� �����against three microorganisms: Escherichia coli, Candida albicans and Staphylococcus aureus�� ��� ���� ����� ���$���� )� �� ���������� )�������� ������������������ ������ ����)���� � ����!���"��)� ��$� �� ��������������� �%�)������)������������� ����� � ��������$�����������)-ing Tieleman et al. (2005) and Millet et al. (20071����������� ��������#����������� ���� ����"� $ �������� �� ���� � ������� � ����"� ��������E. coli and C. albicans�� ������ � �������)�� ��5���������������2010). Micro- �������� ����"���������S. aureus��������� ���� �$� ������ ������������ ��� ���������������� ��������#�������������������"��� ����������)���4��reconstituted lyophilized pellets of S. aureus (Epower Microorganisms, ATCC #6538 MicroBioLogics #0485E7, MicroBioLogics, St. Cloud, -�����!D1� �����)������������� � .�� ���� ���������4�� ���#� �� ���-$��������"�� ����������������������#����)� #�������������������� � ������Tieleman et al. (2010). We added 30�F����������)� #����������������75 F�� �������&���)����225�F����������4����������� ���������������15 minutes (E. coli) and 240 minutes (C. albicans and S. aureus1�� ������������� ��� �����"���������������5�����������������$� �����������1�
28
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
Complement and natural antibodies� E� 4�� ���� ������� ����� ���-ples within one hour after collection to separate plasma and cellular fractions; we stored the plasma at -80°C until further analysis. We ;�����/������� ������� ��"��������$�����������(��"� �����)������������������������7�����"��������"����� � ��� "�-�������������52005) )���� ����/�������� ���� � ��� "� -���#� ��� ���� 52005). We scored hemagglutination and hemolysis titers as the last well at which the � ��� ��� �����������)� ���������������� ��"�����4�������������)���partial agglutination or lysis were assigned half scores. All scoring )�������� "����������$� ����5-!�1�
Haptoglobin�E�4������� �����$����� ���������� ����������$������with a commercial kit following the manufacturer’s instructions (Tridelta Development Ltd., Maynooth, Ireland). The kit colori-��� �����"�;���������� ���� ������� �����������$����� ����4����&���plasma and reagents in 967)����$���������� ��� ��������� �� �����at 630 nm after 5 minutes using a Molecular Devices Spectra Max 340 plate reader.
Body mass and metabolic measurements
Respirometry equipment and setup, measurement protocol and data ����"���� � �� ���� � ��� ����)�� �� 5�������� 2007�� �� ������� ��� ����20081��4������� ��� ��"���������� ��������� ����� ���� 59-�1�������������(����������5�B581���)��5�B281���� ���5�B21�� ���� �5�B1) times. 4�����������������7�$���/��9-�� "���(������9-�� "� ��"������
Statistical analysesWe used the program R 2.8.0 for all statistical analyses (R develop-ment core team 20081��4�� �� ��� �&������� ��$����� (� �� ���� �� ��� �����"����������$� �� �������-�� � �������� ����"���������E. coli was left-skewed and transformed to the power of seven. After trans-�� ������� ���� (� �� ���� )� �� �� ����"� ���� � ������ 4�� ����"0���transformed and untransformed data and found that transforma-tion of the data did not affect the significance of fixed effects. First )����������� ������ �������������� �$������������� ���������� ����corticosterone concentrations and indices of constitutive immu-���"�� �� � ����� � ���� ��$� ����"�� �� ��;�����"�� )�� ��(���������� ��)������ �������(� ������������ �$��������������������(��������������multivariate statistics.
29
Comparing each physiological trait separately among subspecies – For ���$� ��������������$�"����������� � ������������ �$�������)������� �� ������� ������� )���� �� �$������ ��� /&��� �������� <� � �� ������� -����������� ������������� � ������� � ����"�)����������� �� (������per individual and we used linear models (lm in R). For the other ����� �������)�����������$���� �� (�������$� �����(�����������)��used mixed effect models with individual as random effect (lme in R; package lme41��4���������������/&�������������&������������������� �$�����G ��&� ���� ������� ��� ���� ����"����� 4�� ����� ������� �����/-����������������� ����������G �� �$������ ������������������������"��������� �����5<�H�1.36����I�0.271���&��$���� ���� � �������� ����"���������E. coli 5<�B�3.50����B�0.02). Including or excluding this interaction for ����� ��$�����(� �� ���������������������������/������������� �/&������������4����� ��� ��������� �$� ���������� ��������������G �� �$������������� ��������-��������$��/�������)��� �������� ��#)� ���������-tion with P < 0.05 as selection criterion (Crawley 2007).Because immunological indices (Matson et al. 2006 ��9����� ��������2008�1������� ������� ����������� �������54���/�����������1992) can �������;���#�"���� ��$������������� ������)������������������ � ���������������$���� ��)�������� ������ �������� �������� � ����������(� ����������������"������������� ��$�����(� �� �����<� �������� �- �����������"��)������� ������������� 5��"�1���� ������� � �����������#�solution as a covariate. To determine if there was an effect of stress on corticosterone concentration, we used an additional mixed effects ������������������������(��������� ������������������� �$����������������$����������������� ���50 or 30��������1����/&������������4��$� �� ������&���������������������9-������ ��"7����7����-$�������9-���4����(����������9-������$���������� ��"������ "�����������7�$���/��9-��������� ��$�����(� �� ������� "����������� ��"�������������(� ���������������)����9-��������� ��$�����(� �-� ����!����������"��)��$� �� ����������� ���&����������������� ���-�� ����9-��)��������� ����� ���� ��"�����������(� ��������������from transformed and untransformed data did not differ and we only report results from untransformed data.
Covariation of physiological traits among subspecies – By correlating ��������������������� ������� ����������� ������)��������7�$���/��9-��� )�� �&$�� ��� �����7�� �$������ $���� ��� ��� ��(� ������� �-tween physiological traits and the Pace-of-Life. To reduce the num-
30
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
� ���� �������(� �� �������� ��� ��(�����������(� �������)���������-stitutive immunity, we performed a discriminant analysis on the six immune measures (lda in R; package MASS). Discriminant analysis �&$�� �������� �$���������� ���������������� "�$�����������$�"�������-����� ����������/&������ � ��������������5��������������� �������������� ����������� ��� �$�����1����#������(� �����������������(��������������������������/��������������� �������� ��������� ���������� ����� ����� ����������������������������������� ��������� �$�������8��������-ings on the same discriminant function indicate covariation (Craw-ley 2007). We correlated the resulting discriminant functions with ����7�$���/��9-������� ������������"������#������������������(� �-������ ��� � ����� ������ ����(�������� ��� ���� � �(�� ���� � ��� ����"����$� ������������&���$� ����"��)�����$� ��������� �$������������� �each trait separately, not taking into account how the values covary among individuals. This may lead to differences in the results of the two methods.
Covariation of physiological traits among individuals – To investigate ��(� ��������������������������������� ����� ��������������(���-�����)��������������"� ���(���(� ��������������� �$������� ���������� ����� "� ������������ ���� ��������� ��� ������ � ����� ������ �� ��������������)������ �$���������/&������������� ������������� � ������-�����(� �� �������������(�����������(� ������������������������-ces, we performed a varimax rotated principal component analysis (PCA) on the residuals of the immune indices (principal in R; pack-age psych). High loadings on the same principal component indicate ��(� ���������� ��;�����"��)���� ������� ������������7�$���/��9-��with the principal components with an eigenvalue larger than one. Corticosterone concentrations were measured in a different set of ����(��������������������� ���� ������������������(��������(���)��������7�$���/��9-��
ResultsWhen we compared each physiological trait separately among the ��� ������������� �$��������)������ ���$���� ������(� ���������� ���*�one that did not correspond with the stonechats’ Pace-of-Life varia-���������������� ������������������/ ������� ���$���� ���)���������not correspond to Pace-of-Life, included all immune indices except
% E
.col
ice
lls k
illed
−16
−8
0
8
16 14 16 17 13
ab b b a
A
% C
.alb
ican
sce
lls k
illed
−24
−12
0
12
24 14 16 16 11B
% S
.aur
eus
cells
kill
ed
−40
−20
0
20
40 14 16 16 12C
hem
aggl
utin
atio
ntit
er
−0.2
−0.1
0.0
0.1
0.2 12 13 19 14D
hem
olys
istit
er
−0.6
−0.3
0.0
0.3
0.6 13 16 17 13
a b b ab
E
hapt
oglo
bin
(mg/
ml)
KenyanIris
h
European
Kazakh
−0.04−0.02
0.000.020.04 14 16 17 12F
31
Figure 2.1 – Residuals of immune indices of four subspecies of stonechats. Microbicidal
capacity of blood against (A) E. coli, (B) C. albicans and (C) S. aureus (D) hemagglutination,
(E) hemolysis and (F) haptoglobin concentration in plasma. The residuals are calculated
from linear models with covariates and all significant fixed effects except subspecies. Bars
and whiskers refer to mean values ± standard error. Letters refer to significant differences
among subspecies. Numbers refer to sample sizes.
32
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
��$����� ���� ���"��� � � ��0�#�� ����������� ���)��� ���� ���������and Irish or European showed the highest or lowest values compared )������������ ��� �$����������$�������� �$��������������������7���)�Pace-of-Life continuum (Figure ���A-���E). Although the pattern )���;��������(��"�$ �����������������������������&��$����$����� ��������� ������ ��)������ �$������)� ��������������"����������������"��� ������������������ ������� � ������� ��$����"� ��������E. coli� 5� ������, Figure ���A and ���E). The second pattern, which did corre-spond to Pace-of-Life, consisted of a gradual change from Kenyan to � ��������� �$���������0�#������������������$����� ���5��� ������Figure ���F), stress-induced corticosterone levels (increase, Figure ���91�� ��"������ 5��� ������ <��� �����C) and mass-specific BMR (increase, Figure ���E). In other words, for these indices the Ken-"���������0�#���� �$����������� ��������� ������������ ������� ��������� �$������ �$������)� ������ ���������!����������$���� ��)���;��������(��"�$ ���������������������� �������� ������ ��)������ �$�-�����)� ��������������"����������������"��� � ��"��������������7�$�-������9-��5� ������).To explore patterns of covariation of physiological traits at the level ����� �$�������)���� ������������ �������������������� ���)��������7�$���/��9-����������������� ��������7��7,����5<��� �����). We �� ������� �� �$�����.� ������ ��� ����7�$���/�� 9-�� )���� ��������(��������� �������������� ���7���������� ������� ����������� ��������-���7�$���/�� 9-�� )��� ���� �����/�����"� �� ������� )���� �������� ����������(��������� ������� ����5��B�1.12�������B�1����B�0.47), nor, de-spite the positive trend, with residual stress-induced levels of corti-����� ����5��B�5.50�������B�1����B�0.11) (Figure ���A). When we used �)� (������ ��� �������� �� ������� ���� ������� ������� ���� �� ��������)��������/���������$�����(��5��B�25.85�������B�1����B�0.02). Discrimi-����� ����"���� ��� ���� ������������ ��� �������� ��� ���� �����/��������� �������� ��������� ���� �)�� ���7�����/����� ���� �������� ����-������5� ������1����������/�����/ ������� ��������������������)�������� ���"��� ���� ��0�#�� �� �$������ )� ������� ����� ���� ���� �����Irish and European stonechats had intermediate values, a result con-sistent with the Pace-of-Life hypothesis (Figure ���B). The correla-���������/������ ��)���� �����/ ��� �����������������7�$���/��9-��)����� ������"� �������/����� 5�� B�3.50�� ����� B�2�� �� B�0.07). Because �����������������)��������������(� �� ������������ � ����������"���� ����/ ��� ��������� ���� ������� ����� ���������)��� �����/������)��
33
SS
A
S
PF
d.f.P
Fd.f.
PF
d.f.P
Fd.f.
M
<0.00127.13
3, 84<0.001
14.091, 84
0.301.09
1, 340.06
2.503, 81
B
0.321.18
3,840.02
5.501, 84
0.580.31
1, 340.37
3.163, 81
B
0.0492.73
3, 850.31
1.041, 84
0.710.14
1, 330.13
1.923, 81
M-
<0.001
7.083, 84
0.171.92
1, 840.77
0.091, 34
0.013.87
3, 81
B a
0.580.56
2,220.08
3.431,20
0.790.07
1,190.40
0.962,17
S- a
0.132.21
2,260.60
0.291,25
0.035.42
1,260.63
0.482,23
H
a
0.072.51
3, 350.86
0.031, 55
0.122.53
1, 560.28
1.353, 32
H
a
0.033.21
3, 420.13
2.311, 56
<0.00114.61
1, 570.47
0.843, 39
H
a0.28
1.313, 55
0.770.09
1, 530.33
0.981, 54
0.740.42
3, 50M
:E.coli b
0.0016.24
3,500.74
0.111,50
0.680.17
1,490.01
4.153,50
C.albicans b
0.680.51
3,500.03
5.161,50
0.870.03
1, 490.99
0.043,46
S.aureus b0.51
0.783,51
0.034.73
1,510.72
0.131,50
0.710.47
3,47
a: Included as covariate in the model is the tim
e between entering the room
and completion of sam
pling.
b: Included as covariates in the model are tim
e between entering the room
and completion of sam
pling, and age of the microbicidal stock solution.
Table 2.2 – Results of the linear m
odels for the fixed effects subspecies, sex and age, and the interaction subspecies x sex on measures of
body mass, m
etabolic rate, imm
une function and corticosterone concentration of four subspecies of stonechats from different environ-
ments. Results are from
mixed effects or linear regression m
odels after backward elim
ination of non significant terms (P > 0.05).
base
line
cort
icos
tero
ne (n
g/m
l)
−0.6
−0.3
0.0
0.3
0.6 10 7 8A
stre
ss−i
nduc
edco
rtic
oste
rone
(ng/
ml)
−8
−4
0
4
8 12 6 12B
body
mas
s (g)
−1.0
−0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
a b b c
BMR
(kJ/d
ay)
−1.2
−0.6
0.0
0.6
1.2 14 15 45 15D
mas
s−sp
ecifi
cBM
R (k
J/day
/g)
Kenyan Irish
European
Kazakh−0.16
−0.08
0.00
0.08
0.16 14 15 45 15
a b b c
E
34
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
Figure 2.2 – Residuals of (A) baseline and (B) stress-induced corticosterone,
(C) body mass, (D) BMR and (E) mass-specific BMR of four subspecies of stone-
chats. Residuals are calculated from linear models with covariates and all signifi-
cant fixed effects except subspecies. Bars and whiskers refer to mean values ±
standard error. Letters refer to significant differences among subspecies. Num-
bers refer to sample sizes.
disc
imin
ant f
unct
ion
1he
mag
glut
inat
ion Kazakh
European
Irish
Kenyan P=0.07
B
disc
imin
ant f
unct
ion
2ha
ptog
lobi
n &
E.c
oli
−2
−1
0
1
2
3
Kazakh
European
Irish
Kenyan
P=0.66
C
mass-specific BMR (kJ/day/g)
disc
imin
ant f
unct
ion
3he
mol
ysis,
S. a
ureu
s & C
.alb
ican
s
−2
−1
0
1
2
3
1.2
Kazakh
European
IrishKenyan
P=0.83
D
resid
ual
cort
icos
tero
ne co
ncen
trat
ion
−0.4
−0.2
0.0
0.2
0.4
Kazakh
European
Kenyan
A
P=0.47P=0.11
−2
−1
0
1
2
3
1.4 1.6 1.8
35
Figure 2.3 – Subspecies level correlations between (A) residual baseline (black
circles) and stress-induced (grey circles) corticosterone and (B-D) the three discri-
minant functions of constitutive immunity and the indicator for Pace-of-Life, mass-
specific BMR. Residual corticosterone is calculated from linear models with covari-
ates and all significant fixed effects except subspecies. Dots and whiskers refer to
mean values ± standard error. P-values of the correlation are shown in the graphs. If
the correlation showed a trend (P < 0.1) a regression line was drawn.
36
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
���� $ ��� ����� ����������������/���������� ��������������������������������� �$�����������������/������������������� ������ ���������������������� � ������(� ������������������ �����������������������-���������"�������$����� ���������� � ���������$����"���������E. coli, C. albicans and S. aureus� 5� ������; Figure ���C and ���D). The �������������� �������������������������/�����"��� ������)��������7�$���/��9-�������������� �����������$ ���������� ��� �������������7��7,�������� ����� ��������"���������0�#���� �$������)� �������� ��� �the second and third functions. The principal component analysis at the level of individual revealed grouping of physiological traits that was different from the result at ������(�������� �$������5� ������ versus�� ������). The first prin-ciple component was highly correlated with hemagglutination and hemolysis. This principal component showed a significant negative �� ��������)��������7�$�������9-��5��B�72.45�������B�44����B�0.02) (Figure ���A). The second principle component explained most of ����(� ������� ������ � ������� ��$����"���������E. coli and C. albi-cans. The third principal component explained most of the vari-������ ������ � ������� ��$����"� ��������S. aureus� ������$����� ���5� ������). These two principal components did not significantly correlate with mass-specific BMR (t > -1.50�� ����� B� 44, P > 0.14) (Figure ���B-���C).
Discussion������������������� ������� ���� ��$��������� ��������� ����� ����did not fall on a single dominant Pace-of-Life axis in stonechats, nei-��� � ������ �� �$�������� � ������ ����(������� 5<��� �����, Figure ���). Our finding that patterns of covariation of immune, endocrine �������� ����� � ���������� ��� ��)���� ���� ��(������� �� �$��������������(������ � ��������������$$� �������"$���������������� ���������-��������� ��)���� ������ $�"����������� �"������ ����� ���� ���� �(���-����� ��� $�"����������� ���� ����� ����� "� ��� � ����� ��� ���� ����7��7,����(Ricklefs and Wikelski 2002). In our study, covariation among some physiological traits at the level of individual is present and points to potential� ����� ������� ������� ������� �������� 5���������� ���)1��however, find that these same traits can also vary independently of each other. Synthesizing results among studies, we therefore con-clude that the phenomenon of a single Pace-of-Life axis does not
37
F 1 F 2 F 3
H 0.757 -0.067 0.223H -0.097 -0.374 0.388H 0.101 0.290 0.131M
E. coli 0.125 -0.714 0.474C. albicans -0.071 0.249 0.905S. aureus -0.180 0.106 0.188
E 0.50 0.32 0.06P. (%) 56.94 35.93 7.14C . (%)
56.94 92.86 100.00
�2 29.72 13.45 2.44.. 18 10 4P- 0.04 0.20 0.66
Table 2.3 – Results of the discriminant analysis of six measures of constitutive immune function among
four subspecies of stonechats from different environments.
– The highest loading for each physiological trait shows to which function that trait contributes
the largest explanatory value (compare values within rows, highest value is bold). Significance of each
discriminant function indicates whether that function can be significantly discriminated among subspe-
cies. High loadings on the same discriminant function indicate correlation between physiological traits.
������ � ������(� ����$�"����������� ����� �������!�$���� ��� ���� ��-tive hypothesis is that environmental factors select sets of covarying physiological traits and life history characteristics, potentially lead-ing to constrained evolution. Other environmental factors might se-lect traits (e.g. immune and endocrine) which do not covary with life history characteristics.
Physiological variation among subspeciesWe found that only some physiological traits covaried with Pace-��7,������� ���� ��(������������������ �$�������������$ �(�������������������� ���� �� ���#� ��)���� ����� ����� "� ���� ���� ����� � ����� ��������������5� ������), we used mass-specific BMR as an index for Pace-of-Life (Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003, Tieleman et al. 2009�1��6� ������� ���� ������� ���������(�� �����"$������0��� ���
38
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
������� � ��� � ���)���� �� ���)� �����7��7,����� ���������� ������ -mone’s role in favoring self-maintenance over current reproduction (Wingfield et al. 1995, Wikelski and Ricklefs 2001). Our results do not support this prediction: concentrations of corticosterone were higher in fast-living Kazakh stonechats than in relatively slower-��(����� �$����5�� ���7�������1��������"��������������5 �������������� ���7�������1������� ��������� � � ������(� ������� ��������������������������(������� ��������5-� �����������2005, Bókony et al. 2009, Hau et al. 2010) or stress-induced corticosterone concentra-tions (Martin et al. 20051��������7��(�����$��������� �$������� �$�$�-lations. However, other studies, including one on free-living stone-�������� ���� ���� �������������� 54����������������1995, Silverin et al. 1997, Breuner et al. 2003, Goymann et al. 2006, Bókony et al. 20091������ � ��$$� �� �� � �����"$������0��� ���#� ��)��������� �corticosterone concentrations with a slower Pace-of-Life. A third set �������������������� ����������$� ��)������ ������� ����������� �-tions and Pace-of-Life characteristics (Breuner et al. 2003, Lind-ström et al. 2005, Hau et al. 2010). Therefore, we conclude that the corticosterone response does not overlay the single axis of variation fitting with the Pace-of-Life syndrome. 9� ���)���� ����� � �����$�������������)� �����7��7,���������� ���/��� ����� �� � ��������������������59���������9�)� ��2004, Lee et al. 2008, Horrocks et al. 20111�������������� �$���������)�(� �����)�no clear covariation among constitutive immunity and their Pace-of-,�����4�������������&�)�������"0�����$� ����"����$����� ���)�������only index that covaried with Pace-of-Life. When immune indices were collapsed in a discriminant analysis, only hemagglutination co-varied with Pace-of-Life. Earlier studies that measured constitutive �������"���� ���������������7��7,������� ���� ����������)��� �������$���� ����!��������� �$����� � �����$������)���������)�����7��7,������������� ���� � ������� � ����"� ��������E. coli than species with a fast Pace-of-Life (Tieleman et al. 2005). In contrast, a population of Garter Snakes (Thamnophis elegans) with a slow Pace-of-Life had ��)� ���� � ������� � ����"� ��������E. coli than a fast-living popula-tion (Sparkman and Palacios 2009). The slow-living population also had comparatively lower hemagglutination and hemolysis titers. In ������� �$���/������"������(���Peromyscus mice species life history �� ����"�)������������������)������� � �������� ����"�������� E. coli or with other immune measures (Martin et al. 2007). Investigations of
39
P1 P2 P3
H 0.836 -0.092 0.042H 0.849 0.168 0.093H 0.183 0.444 -0.625M
E. coli 0.268 0.720 -0.135C. albicans -0.213 0.822 0.130S. aureus 0.297 0.200 0.789
E 1.66 1.47 1.06P. (%) 28 24 18C . (%)
28 52 70
Table 2.4 – Results of principal component analysis after varimax rotation for constitutive immune
indices of individual stonechats pooled across the four subspecies.
– Loadings on the first three principal components (’s) had an eigenvalue larger than 1. Loadings
larger than 0.50 are bold. Variables are correlated if they have a high loading on the same .
induced immune responses in a Pace-of-Life context also show mixed results (Tella et al. 2002, Ardia 2005, Palacios and Martin 2006, Martin et al. 20071��+(� ����� ���� �� ������� $���� ��� � ������ � ���our study and previous studies suggest that variation in immune ��������� �&�� ����� "� ����� ���� ��&������� ������ ����� ���� ���� �"�align with a single Pace-of-Life axis.
Physiological variation among individuals!�� ���� �����7����(������ 5�����)������ �� �$�����1� ��(���� ���"������-glutination and hemolysis were associated with Pace-of-Life. That �������"�����/ ������������������������ ���� ���$ ����$������$���������(� ���� )��������7�$���/�� 9-�� 5<��� �� ����� � ��� ���). Studies ��(����������������� �������� ��)�������������������������(�� ����-nity and Pace-of-Life characteristics at the individual level are still ��� �������� �������� ����&����������� ����)������ ��� ����/��������Tieleman et al. (20051� �$� ���������� � �������� ����"�������� E. coli correlates with mass-corrected BMR in tropical house wrens (Troglo-dytes aedon1���� ���������������520081����)�(� ��/������ ����������$� ��)������(����������� �������������� �$ �&"��� �����7��7,���������
P=0.02
imm
une
PC 1
hem
olys
is &
hem
aggl
utin
atio
n
A
−3
−2
−1
0
1
2
3
P=0.25
imm
une
PC 2
E.
coli
& C
.alb
ican
s B
−3
−2
−1
0
1
2
3
P=0.14
resid. mass-specific BMR (kJ/day/g)
imm
une
PC 3
hapt
oglo
bin
& S
.aur
eus
C
−3
−2
−1
0
1
2
3
−0.4 0.0 0.2 0.4
KazakhEuropeanIrishKenyan
−0.4
−0.2
40
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
Figure 2.4 – Individual level correlations between the indicator for Pace-of-Life,
mass-specific BMR and (A) PC1, (B) PC2 and (C) PC3 resulting from the principal
component analysis on indices of immunity. The y-axes are labeled with the indi-
ces that had the highest loadings on the PCs. Mass-specific BMR was statistically
corrected for subspecies. Correlation coefficients are calculated with pooled sub-
species, but subspecies are represented by different symbols. Significance of the
correlation is shown in the graphs and if the correlation was significant (P < 0.05) a
regression line was drawn.
41
��� � �������� ����"���������E. coli������$� ���� ������5Lamprotornis superbus). Ots and Horak (1996) found that great tits (Parus major) )��������� ������� ��(����������(������� ����� �$���:�"�$���"��� ������������$� ������� ���������)������)� ���������(������������-gesting a decrease in health status. Investigations of induced immu-nity and Pace-of-Life characteristics at the individual level also lead to equivocal results (Nordling et al. 1998, Ilmonen et al. 2003, Apanius ������� ���20061�������� ���������� �$��������(���������� �������$��-�� ��$������� "�������(� ���"����������������� ��)�������������������and Pace-of-Life characteristics implies that at the individual level ���� ������ ������� ����$� ����D��������"�������������$�"��(� ��"�the Pace-of-Life axis. !���������� �������������� ������������� ����"������ ����������$� �-tween immunity and Pace-of-Life, the correlations among immune indices, which we identified at the individual level, may still rep-resent constraints within the immune system. Constraints could �&$���������������������� ��)������������������������������"����� ��)������� � ������� � ����"� ��������E. coli and C. albicans, and ��)������� � �������� ����"���������S. aureus ������$����� �������these correlations represent universal physiological constraints (i.e. ��� ������������������������������ ��)�����������1�������)��)�����expect to find the same correlations in other species. Red knots (Calidris canutus) and several species of waterfowl show the same �� ��������� ��)������������������������������"���� 5-���������al. 2006a, Buehler et al. 2008 ��2008c, 2011). Furthermore, these �� ���������� ����������)�����&$���������� ���������������� �"����$�"��������������������*� ���� ��� ���� ������� �� ���� ��� $��"� � ���hemagglutination, interact functionally with lytic enzymes, like ���$�������� ��� ������ �����"���� ��� (�� �� 5+����� ���� ���� J��#-ernagel 2000, Janeway et al. 2004). However, there are also two ������������� �$� ������������������ ��������� ��)��������������-nation and hemolysis (Mendes et al. 2006���� �=���������(��2009), �������������������� ������� �������������$�����������������$� -ate, at least partly, independently from each other. Of three studies ��� ���#��������� � �������� ����"���������E.coli and C.albicans are correlated in only one (Buehler et al. 2008 ��2008c, 2009). In previ-������������������� �������� ��)������$����� ���������� � �������� ����"���������S. aureus was consistently insignificant (Matson et al. 2006a, Buehler et al. 2009, 20111������$���$�"���� ������� ����
42
Ch
apter ii | D
o ph
ysiology an
d life h
istory covary?
�� ��� ���������� �������� ��������� ��� �������(��"���������� ����� ����correlations that we identified among immune indices at the level �������(������ � ���� ���������(� ������������ ��� �������#��"���� �-sult from physiological constraints.
Evolutionary consequences!��� � �&$�� ���� (� ������� ��� �� �����=� � $�"����������� �"������ ���determine the potential presence and role of physiological con-straints in explaining the Pace-of-Life phenomenon, we validate ����� ���� ����� ���� ��(� ���� )���� � ���������� ����� �$���� ���������� "� � ������ ��� ��������� ����� ���� ����� ���� ���� ������� �"�-tems do not. Therefore, if physiological constraints limit the evo-lutionary potential for variation in life history traits (Sheldon and �� ������1996, Ricklefs and Wikelski 2002, Lee 2006, Hau et al. 20101�� ������ ����� ������ ��(�� ��� �� ��� ������ $� ��"� �������� ��� �������� ����� �"������!��� ��� ���������� ����� ����� ������ ��������� ��� �������������� ������������������� �������������������� �������-lar mechanisms of aging (Speakman 2005, Dowling and Simmons 20091�� !��� ����(��� �� �� �����������"7 ����� �"$�������� ���� �����explain the covariation among traits that characterize the Pace-of-,���� �"�� �����6�� ��������� ��� ��(� ��������� ����� �� 5����� ������(���� ����"��$ �������� ��#��$��������$ ���� �1�$��"� ��������������������(�� �����������"� ������ ���$� ������ ���� ������������ � �����(Lande 1986, Duckworth 20101�������� �������� �����(� ���"������� ��������������(� ����������������(������� �����������$��&$�����)�"��������� ������"����������������������� ����������������"�-tems, covaries with a more general life history (slow-fast) axis. On ���� ���������� ��(� ��������� ����� �� ����� ��$���� ��� �"����� �-�����5��������$� ��� ��������� ���������(���� ����"�5���������������2003 ��2004)) might covary with factors that impact demographic � �����5����������������������(���� ����"�������$ ��������� �����������"�on clutch size or mortality (Ashmole 1963, Chalfoun and Martin 2007��' �� ��� ��������2010, Biancucci and Martin 2010)). In this ���������� �������������� �$���� � �������������(� "�)������� ����presence of constraints. On the other hand, environmental factors that impact immune system (e.g. pathogen pressure (Guernier et al. 2004, Buehler et al. 2008 ��8� ��#���������2011)) or endocrine ��������� 5����� ��(� ��������� $ ������ ����"1������� (� "� ��� �� ��� ��)�"����������� �������� ������������"� �������������� ������������-
43
mographic life history traits. We therefore advocate including envi- �������������� �������(����������������������#�� ��)�������������� "�and the immune and endocrine systems.
AcknowledgementsWe thank B. Helm, L. Trost, S. Kuhn, M. Trappschuh, W. Jensen, E. Koch and W. Goymann, in addition to the late E. Gwinner for support. E. Croese, S. Engel, A. Lohrentz, C. Muck, J. Partecke, M. �������6���������74����� � ���,�� �����!��4�����0����� �������A�-����������$�������������������,����� ���!��<����� �����-���� ����������$�������"0�� ���� ����� ���$�����4������� ����#�-������� � ���� ����� � ������ ����$��������������������9����� ��4��'�"���������-��-�����������-���#�$ �(�����(���� ������������������������� �$�������)� #�)��� ��$$� ���� "� ��������� ������+ ����0������ �� ����-����/������� ���5�����863.04.023��9�1��������7 � ��� ����5-!�1��
44
CHAPTER III
Annual cycles of metabolic rate result from genetic background rather than
����������� �!�������
-���#��!���� ��������9� � ��8���� � �� ��')���� ��9��� �����������
Abstract9� �����(����=���������� � ���������� "�����$�"����������� � ����� ��� ����characteristics of their seasonally changing environments. Annual cycles in physiology can result from phenotypic plasticity or from (� ������� ��� ���� �������� ������ !� #�"� $�"����������� � ���� ����� ���)�����������(� ���������� ��������� ����� ����59-�1��4����������������������$�����"$��� (� ������� ��� ���� ������� �"����� ��� ��"�������9-����������7�$���/��9-�� ��� �� ��� �� �$������ ��� ����������� � ������-����� �����(� ������������������ ��������������"����������)���" ���lines. Birds were kept in a common garden set-up, under annually (� �� ��� ��"� ������� ���� ��� ��������� ���$� ��� ���4�� ����� ��������whether stonechats use the proximate environmental factor tempera-�� ������������� ���������������� ����� ����� "�#��$���� � �������)������� �������$� ��� �� ��������4���������������������"�������� ��"�������9-����������7�$���/��9-������� ��������� �$������#�$����������������(� ��������$��������������������� ������� ���������������"������!������ (� ������� ������� ���������� ��� ����" ����)������-�� �������$� �������$����������/ �������������"���(������������ ������Temperature treatment did not affect the shape of the annual cycles ������� ����� ����� ������� ����� ����)�������� ���� � ���#�$������ �����(� �� ������$� ��� �� �������4������������������������"��������
45
��"�������������� ����� ������������������� ����������� �������� -������(� �������� ���#�$����������������(� ���������$���������-������ ��#� ����� ���� ������ �������� �����$�����"$�����"�%�&� ���response to proximate environmental cues.
Introduction��������� �������� ��� ���� ��(� ������� ��%������ ���� ����� ���� ��� � ���5-���������2008, Swanson 2010) and have repercussions for ���� � ���(�� ��$�"������"�����������"�����������(� ������� �������- ����� �������� ����)����"���������5�� � �(��)�����-���������2008), ������ ��)�����)����������5�����!� ��������9 �����)�1988, Coop-er and Swanson 1994, Kvist and Lindström 2001, Wikelski et al. 20031�� ������������������ ���������"�� 7 �����5��� �����������1995, Klaassen 1995, Zheng et al. 2008���>0�����������2011). The variety of patterns emerging from these studies indicates that annual cycles in ���� ����� ���� ����� � ������ ��(� �������� ���:� �)���� ����� ����� "��� ���������<� ��&��$���� �������� � ���������$� ����0��������� ���"���(��������� ����� ����� �������)���� �������������� �56��$� �����Swanson 1994, Cooper 2000, Dawson 2003). Temperate or arctic ���������� ����������������� ����������� ���"���(������)� �����- ����� �������)���� �������������� �5�� ������������1998, Kvist and Lindström 2001, Wikelski et al. 20031������� ������ ���������� � �$�-����� � �$����� ���� ���� �� � ��� � �� �������������� ���)���� ��� �������variation (Bush et al. 2008, Maldonado et al. 2008, Doucette and Geiser 2008), an increase (Chamane and Downs 2009), or a decrease ������� ����� �������)���� ����$� ���)��������� �5-�����#������Geiser 2000, Smit and McKechnie 2010). Whether variation in an-������"������������ ����� ������������� � ��� �������� ��������������-�� ������� �$�����"$���%�&� ����"������ ���"���#��)���� ���$� �� ����������"� ��� ��� �"����� ������ ���� ��� �� ���� ���-�� ���� ����� ��� ��� ���� ����� ����� ���������� ����� ���� ����� ����59-�1�� ����������� ����� ����� �/�������� ����� �����9-�������������������� ��0�������� �����/���������������������� �"��&$������ �������$���7� �� $��(��������������� ����� ���� ���� ����$����� 5�����19741������ ����������$��������(��"�5��� �� � ���������1998, Nudds and Bryant 20011�� ������(���� ����"����������5-��� �1988, Mueller and Diamond 20011��� ������0������� ��"����$�������5������������1990, Piersma et al. 1996, Tieleman et al. 2003a), and daily energy expend-
46
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
iture (Daan et al. 1990, Nilsson 2002, Tieleman et al. 2008) make it an interesting trait for researchers studying seasonal variation.9-�������%������� "����������"�(� �� �����(� �������������� ���������� ���$� ��� ������ ������(���� ����"� 5�)����������+��������1999, Tieleman et al. 2003a, Broggi et al. 2007, Swanson 20101�� ��� ����� "����������"�(� �� ���������"����� ���������$�"������"�5���������1995, Ricklefs and Wikelski 2002, Wikelski et al. 2003���>0�����������2007). �� ��� �� ��(� ����"$��������� ���� ������������������� �"���� ������=�����������9-�����������������"���������� ��������������������-��������!�������"��������9-����������(������������ ������������������������������"������������ ��������(���(��(������ �����$��������� �����environments and not to others (Piersma and Drent 2003, Hahn and MacDougall-Shackleton 2008). Alternatively, or superimposed on a genetically orchestrated pattern, annual cycles in BMR could result � ���$�����"$�����"�%�&� �����=��������� 5��� ��������� ����2003, Hahn and MacDougall-Shackleton 20081�� ���� )����� ����)� � ��������=�������� ��"��������9-�������� ���������������������������"���-vironmental conditions that they encounter. Whether annual cycles ������� ����� ������(������������ ������ � ������� ���$�����"$���%�&-� ����"����� ����(���������� "�$��������$������� ������������"������ ����environments in a common environment (Turesson 1922, Gwinner et al. 1995�1�����������������"�������(������������ ����������� �������������$������)���� ��������������8�)�(� �������������"������������ ������ ������� ���$�����"$���%�&� ����"�� � ���)������=�������� ����� ����������������������(� ������������������� �����)���� �����������������the species. Additional means to investigate genetic and phenotypi-����"�%�&� ��� ���$���������� ������� �"����� �������� ����"�����" ����� ������� ��� � ���)��������� ������������"������� ����� ������(� ��-���������������������)����� � ���� ��#�$���Stonechats provide an ideal study system to address evolutionary ;���������� ������������"������������ ����� ���� �������)������ �����on extensive knowledge from previous studies of their physiology and life history. Stonechats, widespread small passerines (Urquhart 20021������ ������(� �������������(� "�������� � �"��������������"����������(� ���������������������)�������� �%��������������������������"-cles and life history traits (Gwinner et al. 1995a, König and Gwinner 1995, Helm et al. 2009, Helm 20091����"�� �������"�#�$������ ��������$��(��"�������" ��������� ��)������ �$���������� ��� ����������-�� ������������������� "�� ����������������������� �$������ ������$ �-
amplitude A
shape B
shape + amplitude C
S MB A W S MB A W
47
Figure 3.1 – A schematic graph of how annual variation of a certain measure can
show differences in variability or shape or both. In panel (A) the gray subspecies
shows annual variation that has larger variability than the white subspecies, but that
has a similar shape; in panel (B) the grey and white subspecies show annual varia-
tion that has a similar variability, but they differ in shape; in panel (C) the subspecies
show annual variation that differs in both variability and shape. Letters refer to life
cycle stages. S=spring migration, B=breeding season, M=moult, A=autumn migra-
tion and W=winter.
48
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
�����)���� � ���� �� � ����������������$��(��"�5')���� ��������1995a, König and Gwinner 1995, Helm et al. 2009, Helm 2009). Studies of ���� ����� ����������$��(����������������)�������� �������������� -�$������)���� � ���)� ��#�$������ ������ ����$����$� �����5���������1995), or under common housing conditions (Wikelski et al. 2003, Tieleman 2007). In addition, repeated measures, inclusion of pedi-� ������� ������������" ���0�������������� �$��������(�� �(�����������9-���������������������� �$���� ������ ��� ������$������5�� -steegh et al. 2008, Tieleman et al. 2009a, 2009 1��!����������&�������������������������������������������(��������������������"������������ �-���������� � ������ � ��� � �������� ���� ��(� ��������� ���� �������� -�����������������"�������(������������ ������ � ������� ���$�����"$���responses to annual environmental and life cycle variation. 4��������������������������$�����"$��� ��#� �����������������"�������� ��"�������9-����������7�$���/��9-�������0�#���� �$�����������"����������������������� ��" ����� � �������������������-������(� ��������4�����$� ��� �������$������(� �� ����"��������-al cycles (Gwinner et al. 1995 1� ������������ ������ �$�����������$-regulate or downregulate BMR in different life cycle stages, resulting �������� �������$����� ����$��"������� ����$���� �������� ����(� �� ����"�5����� ����� ��)����������"�����������)��������������������������)����value; Figure ���1�������������"�������� ��"�������������� ����� ������(������������ ��#� ������)���&$���� ��������$�����:� �(� �� ����"������ ��������� �$�����������������" ������������)�(���������� ��-������������� �$� ����� ��$�������(���������)����� �$�����"$���%�&-� ����"��������5����������1�������������������"������)��#�$��� �$����stonechats under different temperature regimes, either at year-round ������������$� ��� ��� �����������"�%�������������$� ��� ���
MethodsBirds
Stonechats (Saxicola torquata) originated from three different loca-�����*���0�#������5�B17) (S. t. maura1��� �$��5�B61) (S. t. rubicola), �������"�� 5�B22) (S. t. axillaris). Kazakh stonechats migrate over ���������������������(������� �� ���������������� ����)��������"���"� �� ������� ������� )���� ��� �(� ���� /(�7��&� ������ � �$���� �����-chats are short-distance migrants that lay two to three clutches with ��� �(� ����/(�� ���������"��� ����������� � �� �������� � ��� ���� ��"�
49
generally one clutch with three eggs (Helm 2003). Birds were from / ���5�B301���������5�B481�� ���� ��5�B281����� ������� �����������7raised at the Max Planck Institute for Ornithology, Andechs, Ger-���"��� ����� ���� ��#���������������� � �������/�������(��� ��� ����������������������7 ������5�B32) (Gwinner et al. 1987). In addition to ������ ����� �$�������)�� ����������������" ���� ��)������0�#������� �$������ �$������5�B171����� ��)����� �$�����������"����� �$������5�B21). All individuals were fully grown, ranging in age from 0 to 12�"�� ��� ������������(�������)� ��0 to 4�"�� ������5�B128).
Treatments Birds were housed with 8-12 individuals per room and individuals were kept in separate cages. They were housed randomly assigned to �����)���� ��$��������� �$������������� �������������������� �����consisted of year-round constant temperatures of 20-22°C and day length following natural day length of the European population. In ��������� ��� ����� ������ �� � ���������)�������#�$������ �������� �-$���� � ���5�B14) under a weekly changing temperature regime, that mimicked the average natural temperature cycles of free-living Euro-pean stonechats (Figure ���).
Measurements 4��$� �� ��������� ��������� ����/(�� ������"������������ ��)����<� �� "�2005 and March 2006: Spring migration (27�<� �� "����24�-� ��1�� �������510 May to 2 June), moult (21 July to 19 August), autumn migration (30���$��� � ����7���(�� � 1�����)���� �524 No-(�� � ����14�<� �� "1���� ����������� ������$� ���� � ���� ������(��during the night (Helm et al. 20051��)�����)�������� ��� "������-��������� � ��������7 �����4����/����)���� ��������;���������$� �������� � ������� ��� ������ ���� ��� �� �$ ���� ��� ������� �����������)� ����$�� ����� ���� ���� ��������������� ��� ���"����$�"�������-����"�$ �$� ���� � ����������� ���������������(��"���������$ ������-� ���������$������� ��� ����������� ���5')���� ��������1995 ��8�������al. 2005). Birds were checked twice a week for moult.4������� ��� ��"����������9-�������0�#���� �$�����������"�����������������������)���" �������������$� ���� "������$������� �-�����$ ��������������������"����� ������ � �������)�� ��5��������2007���� ��������������2008, Tieleman et al. 2009a). Before and after �������� ���������� ������)������� ��� ��"����������)�������-
50
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
����������7�$���/��9-�� "���(������9-�� "������(� ������������)�� ��"���������4���� ����"������ ���6 to 17 individuals per life cycle ������$� �� ��$�#�$����������� ��������������9��������������� ���-�����)�������� ���������5�� ��������������2008, Tieleman et al. 2009a) ��������$�����0����� �)���� �� ���� �� �5� �$�������B�45, European &����"����" ������B�21). We measured 7 to 13 individuals per life �"�������������� �$���������������#�$�����(� �� ������$� ��� ���
Statistical analysisWe used R version 2.8.0 for statistical analyses (R development core team 20081�� �� �� ���� )� �� �� ����"� ���� � ����� 5������� �(7Smirnov D < 0.09, P > 0.10), and we used mixed effects models for ��"������� 9-�� ��������7�$���/�� 9-���4�� ����� ����"0��� 9-��)���� ��"�����������(� ������ ���)��������� �$� ������ ������� ����������"�������������� �� �����������"�����������7�$���/��9-���4����(��-��������)����� �������������"�������� ��"�������9-����������7�$�-��/��9-���������� ������ �$������5�����������" ��������1�� �� ��������� ��$������� ��� ��� ���$�����:� � (� �� ����"��4��/ ��� ����"0���(� ��-�����������������"����������������� �$��������� � ���#�$����������� �������������)����������������������� �$�������������"�������������&������������������ ��������������"���������G�� �$�������������"���������G��&������� �$�����G��&��4������"0������� ��$�����������$� ��� ������ �$�-an stonechats with models including treatment, life cycle stage, sex, ���������������� ��������������"���������G� ���������������"���������G��&������� �$�����G��&��9�������)������� ����������������(��������� -ing multiple life cycle stages, we included individual as random effect �������������������������� �������������"���������G�� �$������� �������"���������G� ��������)��������/�����)������������������/���������������"���������� ��� ����� �� �$������ � � � �������� � ��$� ��$� ����"�� ��� ����� �"����������)��������/����������������$� ��������"�����)���� ��;�����"��������$���7���� ����� ��� ���$� �� ���$������(� �� ����"���� ������� �"����� ��� ��"�������9-����������7�$���/��9-���!����������"����(�������������������� ���������(� �� ����"��������� ������)�����������������(� ���������� ���� �(� �����$� � ����� �"���� ������ �� � ����� �� �$������ � � � ��������group separately (Figure ���). We compared the variances in a pair-)�������������������� �$�������)���������7�������<7������4��/ ������-$� �����������"����������0�#���� �$�����������"����� �$������������(���������)����� � ���"� � �� ����� ��� �������� � � $�����"$��� ����� -ences. To further investigate genetic components of annual cycles,
−2
−1
0
1
2
3
resid
ual b
ody m
ass (
g)
Kazakh Eur x Kaz European Eur x Ken Kenyan A
−4
−2
0
2
4
resid
ual B
MR
(kJ/d
ay)
B
B
−0.6
−0.3
0.0
0.3
0.6
resid
ual m
ass−
spec
ific B
MR
(kJ/d
ay/g
)
C
S M A W BS M A W BS M A W BS M A WBS M A W
51
Figure 3.2 – Annual variation of (A) body mass and (B) BMR and (C) mass-spe-
cific BMR of Kazakh, European and Kenyan stonechats, and Kazakh x European
and European x Kenyan hybrid lines. Stonechats were kept at constant tempera-
ture and annually fluctuating day length. Bars represent means ± standard errors
of residuals of a linear model with subspecies as fixed effect. Letters represent life
cycle stages; S=spring migration, B=breeding season, M=moult, A=autumn migra-
tion and W=winter.
52
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
)�� ����� ���$� ����" ��� ����������� 5��0�#��x European or Euro-pean x����"��1�)�������� �$� �������� �$�������4�� �$� ���(� �������� ��"�������9-����������7�$���/��9-��$� ��� �$������� �� ��������� ��$� ���������������)��������������� ��������� ���������"����������x� �� �$������� � ������"����������x treatment. We visualized results of ����������������"���� "�$�������� ���������� ���������������������� -�$������� �� �����������/&����������
ResultsGenetic differences in annual cycles of mass and metabolism
!�������"�������� ��"�������9-����������7�$���/��9-������� ���������$�����)����������(� �� ����"��������� �$�����������" ���������of stonechats kept in a common environment (�2 >38.59��������B�16, P < 0.001D�� ������A; Figure ���).
Comparing subspecies in a common environment6��$� ������ �$��������������$�������������"�������� ��"������)��������� ������0�#���������"��������������� ���� �$�������(���������$������"�������� ��������������5<��� �����A, Appendix ���). Rela-��(����������� �$�����.��(� �������0�#���������"��� � ���)� ����$�-�����"����("���������)����� ������$� ���������������� ��� ���� ���-ing, moult and winter. European stonechats were also heavier in the ��� ������$� ���������������� ��� ����������� �������� ������������these life cycle stages were less pronounced and not significant (Ap-pendix ���1��8�)�(� ��������� �������$� ������ �$�����)� �� ���-tively heavy, unlike Kazakh and Kenyan stonechats. Despite the im-$ ������������������ ����������(� ��������������� �$���� � ��������(� �� ����"���������������������"������ ��������� �$������5� ������). !������ �"����� ��� 9-�� ����� ��� ��� ���$�� ������ �� �$������ 5<��-ure ���B, Appendix ���). Kazakh stonechats had a relatively high 9-���� ���� ���������������)�9-���� �������������� �������In contrast, in European stonechats BMR was not elevated dur-���� �������� ���� �����(��"� ��)� �� ���� ���������� ���� ���������� �������6��� � "���� ������0�#������� �$���� � ����9-�����Kenyan stonechats was especially elevated during moult. Although ������0�#�� � ����$$�� ��������(�������� �����(� �������������������"����������������(� �� ����"���������������������"������ ��������� -�$������5� ������)
53
Table 3.1 – Statistics for body m
ass, BMR and m
ass-specific BMR of (A
) Kazakh, K
azakh x European, European, European x Kenyan and Kenyan stonechats and (B)
European stonechats kept at constant and variable temperature. Results are from
linear mixed m
odels with individual as random
effect, after backwards elim
ination
of non-significant (P>0.05) terms. W
henever an interaction was significant, statistics of m
ain effects cannot be meaningfully interpreted, and they are not show
n.
B
BMR
- BM
R
..�
2P
�2
P�
2P
AL 16
38.590.001**
48.71<0.001**
48.89<0.001**
S 4
1.660.80
4.040.40
4.110.39
L 4
3.240.52
1.720.79
1.690.79
S4
--
--
--
L 4
--
--
--
S1
16.13<0.001**
1.730.19
5.580.02*
A
10.12
0.730.14
0.710.93
0.33
BL
47.01
0.1410.26
0.04*2.66
0.62
T
10.76
0.380.35
0.550.05
0.82
L 4
5.710.22
12.610.01*
4.280.37
T
10.95
0.33-
-6.31
0.01*
L 4
32.21<0.001**
--
10.010.04*
S1
15.21<0.001**
--
6.730.01
A
11.12
0.290.08
0.781.06
0.30
54
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
��� ���$�� ��� ������� �"����� �������7�$���/�� 9-�� ����� ��� �������� �$������5<��� �����C, Appendix ���) with for Kazakh stonechats low values during spring and especially autumn migration, and high (������������� �������$� ������ �$������������������)����������(� -��������������7�$���/��9-���� ������������"�� ��������"��������-������ ����7�$���/�� 9-�� )��� ���(����� �� ���� ������ ���� �������during autumn migration. The other life cycle stages did not differ � ��� ����� ���� �� ��� (� �� ����"� )��� �����/�����"� ����� ���� �������� �$�����*���0�#������������� �(� ������������ �$���������������(F
4,4�B�12.37����B�0.02D�� ������).
Comparing hybrids with parent lines4���� ���$� ���� ������� �"����� ��� �" ��� ������)���� ���� � ��$��-��(��$� �����������)������������� ��"�������9-����������7�$�������9-������" �����������������������)������� ��������(���������$�- �������� �$������������������ ��������� ���� ���������������$� ����lines (Figure ���D�� ������D�� ������). Body mass of Kazakh x Eu-ropean stonechats showed a annual cycle similar in shape to that of ��0�#���� ������#������������(��������������$ ������� ������$� �����������)������� �� ���$��� ������������� �� ���� ������ �$���� � ���5<��� �����!1���� ��)����������������������� ��������(� �� ��-��"���������0�#��&�� �$�����" ������������ �$� �������� �$������5� ������1��9��"������ ���� �$���� &����"����" ����)� �� ���� -����������� ����$� ����� ��$���� ���� ������������������ ���������� )���� �� ��� � �$���� &� ���"��� �" ���� ���)��� ��� ��� �������� ��"������ � ��������� ��� ���������� ������� ������ � ��� ���$�� ��������� �����������������$� ���)���������������"��������������(Figure ���!1�� ��� (� �� ����"� )��� ���� ���� �������� ���� �$$�� ����(������ ����)� ��������� �$����&����"����" ����������������� ��������$� �������� �$������5� ������). ������$�����������������"�������9-�������0�#��&�� �$�����" ����was similar to that of European stonechats, lacking the pronounced �����������)�(�������� ���� ��������������������� ������� ��$��-��(��"����� ������0�#�� � ��� 5!$$����&����A; Figure ���B). The vari-� ����"����������������"��������������9-��)��������/�����"���)� ������0�#��&�� �$�����" ��������������0�#�������������5<
4,4�B�7.27,
��B�0.04D�� ������1������ �$����&����"����" ����9-�� ���� ����European stonechats during spring migration, Kenyan stonechats �� ���� ��������������������� �����������)��� ���� �������� �-
55
B
()
BMR (/)
- BMR (//)
V
S
± ..
V
S
± ..
V
S
± ..
K
1.636a
13.8 ± 0.56a
4.120
a22.4 ± 0.73
a0.042
a1.63 ± 0.06
a
K E
1.104ab
14.4 ± 0.40ab
0.567 b
23.1 ± 0.51a
0.019 ab
1.63 ± 0.04a
E0.474
ab14.3 ± 0.47
a1.311
ab22.0 ± 0.60
a0.003
b1.54 ± 0.05
ab
E K
0.184 b
15.6 ± 0.52b
0.568 b
22.1 ± 0.67a
0.006 ab
1.43 ± 0.06b
K
0.967 ab
17.7 ± 0.58
c
1.249 ab
22.3 ± 0.74
a
0.013 ab
1.26 ± 0.06
c
B
()
BMR (/)
- BMR (//)
V
T
± ..
V
T \
± ..
V
T
± ..
C
0.474
a14.36 ± 0.43
1.311 a
22.0 ± 0.560.003
a1.54 ± 0.05
V
1.092a
14.74 ± 0.371.775
a23.37 ± 0.48
0.002a
1.60 ± 0.04
Table 3.2 – Variance of estim
ates over the five life cycle stages and overall subspecies means ± standard errors for body m
ass, BMR and m
ass-specific BMR of
Kazakh, European and Kenyan stonechat and tw
o hybrid lines. Different letters indicate significant differences (P < 0.05).
Table 3.3 – Variance of estim
ates over the five life cycle stages and overall treatment group m
eans ± standard errors for body mass, BM
R and mass-specific BM
R
of European stonechats kept at variable and constant temperature. D
ifferent letters indicate significant differences (P < 0.05).
56
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
tween parent lines during moult (Figure ���91�����(� �� ����"�)������� �����/�����"� ����� ���� ��)���� � �$���� &� ���"��� ������������������� �$� �������� �$������5� ������). -���7�$���/��9-�������0�#��&�� �$�����" ����)��������� ��������������0�#�� � ����� ���� ���������������������������� ������� ���close to values of European stonechats during spring migration and winter (Figure ���61��-���7�$���/��9-�������0�#��&�� �$�����"- ���� ���� ���� ����� � �����/�����"� ��� (� �� ����"� � ��� ����� ���0�#��� �� �$���� ������������ ��� ����� ����� ���� �)�� $� ������ �� �$������did differ from each other implies that annual variation of this hy- ��������������� �����������������������$� �������� �$������5� ������). ���� �$����&����"����" ��������7�$���/��9-��)���������� ����moult and low during autumn migration, a similar shape as Kenyan stonechats (Figure ���61�� �� ���� �$ ���� ��� ������� ������� ����)���� �����7�$���/��9-��(� ���� ������� ��� ����� �$����&����"����" ������������� �$� �������� �$����������(� �� ����"����9-������- �$����&����"����" ����������������� �� ���� �$�����������"��������������5� ������).
��������������������� �������������� ������������������response to temperature
When comparing European stonechats kept at constant temperature )����������#�$�����(� �� ������$� ��� ���)��������������������$����������(� �� ����"���� ������������"�������� ��"��������������7�$���/��9-��������������� � ��)����� ���������� ������������7�$���/��9-��)��� ����� � "�� 7 ����� ��� ���� (� �� ��� ���$� ��� �� � ��$� 5<��� �����B and ������� ������1��!��� � ���(���������������/��������� ��-������ � �������G����� �"���� ������ 5� ��� ���B), we found that mass-�$���/��9-��)������� ��"������)������������/�����"������ ���� �-�)����� ��������� ��$��5� ������B). The effect of life cycle stage was �����/������� � ���� ��"��������������7�$���/��9-��5� ������B). !(� ����� �(� � ���� /(�� ����� �"���� �������� ����������� #�$�� ��� (� �� ���temperature had a 8K������ �����7�$���/��9-������� � ���#�$�����������������$� ��� ������(� �� ����"������������"�������� ��"��������������7�$���/��9-���������������/�����"������ � ��)���������)��� ��������� ��$��5� ������)<� �9-���������������"���������� ��� ��)����� ��������� ��$��������-�������� "����������/��������� �������� �������G������"����������5� ������B; Figure ���61��4��/ ������$� ����������$�����������������"�����
tem
pera
ture
(ºC
) A10
20
Apr Jul Oct Jan Mar Jun Sep Dec Mar
−1.6
−0.8
0.0
0.8
1.6
resid
ual b
ody m
ass (
g) B
−2.4
−1.2
0.0
1.2
2.4
resid
ual B
MR
(kJ/d
ay) C
−0.2
−0.1
0.0
0.1
resid
ual m
ass−
spec
ific
BMR
(kJ/d
ay/g
)
D
S B M A W S B M A W
57
Figure 3.3 – (A) Annual variation in temperature in standard and variable tempera-
ture treatment groups. The dotted line represents the temperature birds were ex-
posed to, the solid lines the measurement periods. (B) Body mass (C) BMR and (D)
mass-specific BMR of European stonechats kept at standard and variable tempera-
ture treatments and measured during five life cycle stages. Bars represent means ±
standard error of the residuals of a linear model with treatment as fixed effect. Let-
ters represent life cycle stages; S=spring migration, B=breeding season, M=moult,
A=autumn migration and W=winter.
58
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
using post-hoc tests comparing life cycle stages with each other per treatment, and found that the difference occurred in the autumn mi-� ������$� ������� �������������� ������������������#�$�����(� �� ���temperature had a BMR close to the treatment group’s average, while stonechats kept at constant temperature showed a relatively low value (Appendix ���1��4����������#����������(� �� ����"����9-��� ������������������(� �������������������� �������� ��������� ��$��5� ������). Because different temperature regimes can also result in overall dif-�� ������ ���9-�� ��)����� ��$�� ��������� ����� ������"���� ��������)��also explored for each life cycle stage if treatment groups differed from each other. During spring migration (�2�B�3.87�������B�1����B�0.049) and autumn migration (�2�B�12.49�������B�1, P < 0.001) stonechats kept at ������������$� ��� �������������/�����"���)� �9-������������������#�$�����(� �� ������$� ��� �������������� �������"���������������� ��������groups did not differ from each other (�2�B�2.21�������B�1����B�0.14).
Discussion� ����� �$��������������������� ����������� �����(� ������������������ � ��� ����������"� ����������� ����� ���� ������� �"����� ��� ��"�������9-����������7�$���/��9-���)���� �� �������#�$����������-������(� ������������$��(��"����������������)���" ��������� ��� �-�)������ �$���������$��"�������� ������������"������)����(������������intermediate to the parent lines. Keeping stonechats at two tempera-�� �� �����������������������������(� �� ����� ������������"�� ������������������������$��� �(� �� ����"����������������"�������� ��"��������������7�$���/��9-���8�)�(� ������7�$���/��9-��)���8% higher �� ������������"�� �������� � ���#�$�����(� �� ������$� ��� ��������9-��)�������� ���� � ���#�$�����(� �� ������$� ��� �������)��������"-�����������������/����������)������(� �����������������$������(� �-� ����"������������"�������� ��"�������������� ���������� ��������� ���������������� ����������������$�����"$���%�&� ����"����� � �����modest variation superimposed on the genetic program.��� �������� ��#� ����� ��� ���� ����� ������ ��� ������� �"����� ������Kazakh, European and Kenyan stonechats indicates that these cycles � �� ���� ��������� �(���������(������������������ �"����� ��� ��"������� ����� ����� �������� ������ ���� ��$����� ��� ���������������(� ��-������� ����������� ����� ����� ���� �� �$������ �������� � �� ������������"�� �� ������������ ������������)����(� �������������� ����������� "�
59
characteristics (Daan et al. 1990, Ricklefs and Wikelski 2002). One �������&$������ ��(� ����������������������"������� � ��������������-ter larger environmental differences during the year or that vary their work levels more during the year. Because it is challenging to provide ���� � �.��$� �$����(�����������(� ���������������������������� ������$������"� "���� ���� � ����)��/ ����&$�� ���������������� "������ ������could explain the annual cycle differences among stonechats. Because ��0�#������������� �����������������������(� ����������"������� �-est clutch and migrate the longest distance (Raess 2008), we expected that they would experience the largest differences in energy expendi-�� ��������������"������������4���&$������� �$������������������ ������ ��������� ����������"� ����������$� ����������������(��������� -�����������������0���������� � ������������������������ �� ���� ������distance (Helm 2003). Free-living Kenyan stonechats may experience ����������(� �������������������"����������� ����������"����������� ����and only produce one small clutch per year (Dittami and Gwinner 19851���� ��� �����������(����������� ��"�������������� ���������-� �����������"���%������� "����������� "�� ������)��)������&$���������Kenyans would have evolved the least, Europeans intermediate and ��0�#��� ��������� (� �� ����"�� ������� ��� ���� � ��$����(����� ��� "����� �$ ������(����� ���� ��������8�)�(� ��)��/��������� �$���������������"�����������������)��������������(� �� ����"��������7�$���/��9-��� ����� ����� ������ ��� (� �� ����"� ������ �� �$������ � �� �� �� ������� ���0��� ���������� �$����������� ��� ���������"�����$���/��������"����stages, such as migration and moult. This may indicate that environ-������������ ��������������$� ��� ������������(���� ����"�������$���/��life cycle stage demands play important roles in the evolution of the ��������"��������������������� ����� ������ �������������� ���������� �� ��������������� �$������ ��� ������ ��"� ����� ���� ��� ������ 9-�� ���� ����7�$���/�� 9-��� �� �����$ ������� ������ ��"������ ��� ������� 9-�� ��� ������ �����0�#������� �$������������������������7�$���/��9-����� �����������-0�#����������������� ��������� ��"������=���� ��� �������� ������-gration periods are commonly found in many captive and free-living � �� �$������� ���� � �� ������� ��� ���� ��$�������� 5�����')���� �1996, ����� � ���� ������2000�� �>0���� ��� ����2007). The result of a lower BMR during autumn than during spring migration is also found in � ��7��(������� ������ "����)7 ��$��� )� �� �� 5�)������ ���������1999). In several waders BMR was lower during autumn migration
60
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
������� ����)���� ��������� �$����� �������� �������� ���� �������in the arctic (Lindström 1997, Kvist and Lindström 2001). BMR de-$����� ��� �� �� ��� �&����� ��� ��"� ���:� � � ���� ���$�������� 58��������9�� ����1996, Piersma et al. 1999, Dietz et al. 1999, Tieleman et al. 2003�1������ ��7��(���� � ����$ ������� �������������������� �5����more urgent) than autumn migration (Pearson and Lack 1992), and ��� �$ ��������� ���� � �������"� �� ��$� ����� ����� ��� ������� 5�����reproductive organs, see Bauchinger et al. 2005), leading to a differ-ence in BMR in the two migration periods.9-����������7�$���/��9-��������"��������������)��� ��� #� �"�������� ����������� ��/������ �����)��� ���#���� ��� �������� � �� �$�-cies. Klaassen (1995) showed that Kenyan stonechats had a higher total plumage mass, and a shorter duration of moult, than European stonechats. Related, Tieleman (2007) found that the insulation of ���"��������������)��� ���� � �������������� �$�����������0�#����9��������� ����� �������� �������)����� ���� �������)���������������of feathers produced per day (Dietz et al. 1992, Lindström et al. 1993). Therefore, our results support Klaassen’s (1995) hypothesis of a higher ��� ��������9-�� ��)������������������$ �����������������)���������cycle stages in Kenyan than in European stonechats. 9��"� ������ 9-�� ���� ����7�$���/�� 9-�� ��� ���� �)�� �" ��� ������)� ������ �����������$� �������� �$��������������������"������������ ������������������ ���� ���������������$� �������� �$������� ���(������� ��� ���������$������������������� ������� �������������"��������������� ������ �����������)��������������� �"������������������������ ���������$����-��� ����� ����������� ������ "� ��"����$���������������$�-�����"�������0������������� �������"����������(��� ��������������� ����density and mitochondrial function (Daan et al. 1990, Tieleman et al. 2003a, 2009����>0��������4��������2005, Zheng et al. 2008), that ������"���(�� �� �������� ������6������� ��� � ���� ��0������������ ����������"�� ���������� ���������������"����� � ����������������������������� ����� ����� 5��� �����������1999, Dietz et al. 1999, Tieleman et al. 2003a, Zheng et al. 20081��� �(�����)� #���������������" �������� ���)�� ��������� ����� ���� ��� ���������� $ ����� �"� �� �������-������� ���� ���������� "� ������&������������� ���� ������ 5���� ��������"� � ��� ��������� 1� ���������� ������� 5���� ����� � ��� ����$� -����1�������������������� ����� �������� ��)����$� ����������5��������et al. 2009�1��,�#�)����� ������ ��� ����"���� ���� ������������������ ��� ��"����$��������� ������������� ����������"�� ���$� ����������" ���
61
�������������"� �����$��&����������$���������������� ��#� ��������"���(�� ������������������������ ����$�������(� �� ���������������� -���� �����������������"�������������)���" ���������������$������(� �� ����"����������������"��������� �$���������������)� �������� ��� "����$� ��� ��� ��������������������� � ��"��������������7�$���/�� 9-��� ���� ����� ��� ���"� �� ���� ���� ��� ������ $� �-���� �� �9-���A���� ���� ����������� #�$�� ��� (� �� ��� ���$� ��� ������������� �����7�$���/��9-���������������"���������������� � ���#�$�����������������$� ��� ���������������������� �$�����������������=�������� ����� ����� ��������(� �� ����"�������������������������������/&���� ��� �������$� ��� ���������� ����� ���#�����#�$�����(� �� ��������������$� ��� ���������9-�������� ����)� �7���������������$���/����������� ������������7����������������$���/������)���� �5�>0�����������20111��!������ ��7��(�������$� ���� �������� � ���� �������������=�������� �9-�����:� �����7�$���/��9-������ ��������)���� ����$� �-tures (Swanson and Olmstead 1999, Broggi et al. 20071���>0�����������(20111�$ �$����������������=������������������������"����������� �-�������� ���#����������� ������������"�(� �� ����� ����������������(e.g. high and low temperatures) that knots face during the annual cycle, a fact that may also apply to temperate resident species (Swan-son and Olmstead 1999, Broggi et al. 2007). Free-living European stonechats may keep their thermal environment relatively constant �� ������������"�� �� ����������"� ����������� ���� �$������)��-ter in southern Europe and northern Africa, where winters are mild (Helm 20031�������������"����%�&� ����"����������������"��������9-������ ��"��������"� ��������� ������������ � ������������ ������$� �-�� ������������������ ��� ����������"�������"� ���� �� ������
AcknowledgementsWe thank the animal care takers and technical staff of the Max Planck Institute for Ornithology, especially Lisa Trost, Willi Jensen ���� ����������4��)�������#���������#�-� ��������� ����(���-��-������������������ ������ ����$�����������������9��)���/��������"���$$� ���� "���� ����� ����������� ������+ ������������� ������-��/������� ���5�4+�� ��������863.04.023)
62
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
Appendix 3.1A K K E
||- P ||- P
B – 4.335 <0.001** 1.418 0.61 – 0.062 1.00 1.265 0.71 - 3.748 0.002** 7.042 <0.001** – 5.012 <0.001** 5.571 <0.001** - 5.988 <0.001** 0.959 0.87 – 4.558 <0.001** 2.837 0.04* - 3.304 0.008** 5.11 <0.001** – 0.888 0.90 2.169 0.19 - 1.529 0.54 3.876 0.001** – 0.698 0.96 0.619 0.97
BMR - 1.300 0.69 0.421 0.99 - 2.348 0.13 1.472 0.58 - 1.869 0.33 0.302 1.00 - 2.014 0.25 0.589 0.98 - 1.109 0.80 0.991 0.86 - 0.880 0.90 1.119 0.80 - 4.016 <0.001** 1.828 0.36 - 0.107 1.00 0.224 1.00 - 2.486 0.09 1.481 0.57 - 2.733 0.047* 1.370 0.65
- BMR - 3.209 0.01* 1.305 0.69 - 2.298 0.14 0.591 0.98 - 3.837 0.001** 3.795 0.001** - 4.996 <0.001** 3.045 0.02* - 1.975 0.27 0.285 1.00 - 1.210 0.74 0.746 0.94 - 5.702 <0.001** 4.093 < 0.001** - 0.667 0.96 1.118 0.80 - 2.048 0.24 2.910 0.03* - 1.985 0.27 1.650 0.46
63
E E K K
||- P ||- P ||- P
0.676 0.96 0.354 1.00 1.807 0.372.799 0.04* 1.086 0.81 0.645 0.971.809 0.36 2.658 0.06 4.444 <0.001**1.244 0.72 1.978 0.27 2.854 0.03
2.348 0.13 0.516 0.99 0.631 0.972.572 0.07 1.308 0.68 2.452 0.100.942 0.88 1.572 0.51 3.8 0.001*0.988 0.86 1.128 0.79 2.105 0.220.435 0.99 1.027 0.84 1.993 0.272.524 0.08 0.14 1.00 1.385 0.64
0.642 0.97 2.373 0.12 1.045 0.832.903 0.03* 1.657 0.45 4.446 <0.001**0.195 1.00 2.187 0.18 4.397 <0.001**2.867 0.03* 2.176 0.18 1.578 0.511.288 0.69 1.387 0.63 0.452 0.99
3.998 <0.001** 0.915 0.89 3.401 0.006**2.633 0.06 0.530 0.98 0.048 1.003.219 0.01* 0.415 0.99 3.391 0.006**3.654 0.002** 2.840 0.04* 0.996 0.860.326 1.00 1.548 0.53 1.633 0.47
0.653 0.96 1.4920 0.56 0.625 0.970.078 1.00 2.2420 0.16 3.608 0.003**1.255 0.71 3.8760 < 0.001** 6.368 <0.001**
3.007 0.02* 3.5380 0.003** 3.252 0.01*1.264 0.71 0.3230 1.00 0.832 0.920.560 0.98 0.4780 0.99 4.232 <0.001**1.158 0.77 1.6350 0.47 2.760 0.045*1.564 0.51 1.0230 0.84 3.964 <0.001**1.967 0.28 2.9300 0.03* 2.136 0.201.674 0.44 1.6150 0.48 0.124 1.00
64
Ch
apter iii | G
en
etic backgrou
nd of an
nual cycles in
m
etabolic rate
Appendix 3.1 (continued)
B T
C V
||- P ||- P
- 0.642 0.97 0.492 0.99 - 2.903 0.03* 2.55 0.08 - 0.195 1.00 1.872 0.33 - 2.867 0.03* 0.758 0.94 - 1.288 0.69 2.375 0.12 - 3.998 <0.001** 3.644 0.002** - 2.633 0.06 0.745 0.94 - 3.219 0.01* 1.142 0.78 - 3.654 0.002** 1.431 0.60 - 0.326 1.00 1.473 0.58
Appendix 3.1 – Statistics of pair-wise post hoc tests between life cycle stages (A)
per subspecies and hybrid line and (B) per treatment group. The effect of the in-
teraction life cycle stage*treatment was not significant for body mass and mass-
specific BMR in European stonechats kept at different temperature treatments.
Therefore we did not perform post-hoc tests on these measures for birds kept at
fluctuating temperature.
65
66
CHAPTER IV
G������������������������������ �!��������of annual variation in constitutive immunity:
a common garden study with stonechats from different environments
-���#��!���� ��������9� � ��8�����,�0����"������� � �� ��')���� ��9��� �����������
Abstract9� �����$��)������(� ������7�$���/�����������(� �������������������������� �������������������(���� ����"��$��������$ ���� ���������$� �-�� ��� �� ����� ��=��������� ��� $�"������"� ���� ����� ����� "�� �������function, a physiological trait important in life history evolution, is ��(��(��� ��� � ���7����� ��)���� ���������"� ��������� ����� �"���� ������demands and environmental factors. We tested the hypothesis that constitutive immunity is adapted to environmental seasonality, re-sulting in different genetically encoded annual cycles in different en-vironments. We studied these annual cycles in continental long-dis-tance migrant Kazakh, temperate short-distance migrant European ����� �$����� �����������"��������������� �$���������������)���" ���lines, using a common garden set-up. Additionally, we investigated $�����"$���%�&� ����"� ��� ������� �"��������� ������ ���� ���$� ��� ��regimes. We measured annual cycles of hemagglutination, hemoly-�������$����� ������� ���� �������� ����"���������Escherichia coli and Staphylococcus aureus����������������� �������������� �$�������� ��������������&��$����$����� ����8" ��������� ���� ���� ���)� ��������)�"������ ������������$� �������� �$���������$� ��� ��� �����������"���%�������������������"�������������"�������� ���� �������� ��-
67
ity against E. coli. We conclude that annual cycles in constitutive im-�����"���(������������ ��#� ������������� ����"���������������)����-ple mendelian rules, and that some immune measures are relatively �����)��������� ��� ���� ��%�&� ���
IntroductionIn seasonal environments ecological factors such as temperature, ������(���� ����"�����$��������$ ���� ��� ���������"�(� �� ���5����-lay 1988, Lovegrove 2003, Altizer et al. 2006). The physiology (Klaas-sen 1995, Romero 20021�� ���(��� � 58���� 2009) and life history � �����5�� ������������,�(�����2007��' �� ��� ��������20101���� � ���� ����=��������� ����(� �� ����"���� ������(� �������� ���"� ��(�� ����!�-����� �������� ��� �� � ��.� $�"������"� ���� ���(��� � ���� ����� � ���$�����"$�����"�%�&� ��� ��=��������� ��� ���� �� ���� ��(� �������� � �can result from a genetic organisation (Piersma and Drent 2003, MacDougall-Shackleton and Hahn 2007). An important physiologi-cal system that relates to self-maintenance and survival, and that connects these life history traits with environmental factors is the ��������"�����5�������������� ������1996, Ricklefs and Wikelski 20021���������"���"� �������"������ ��������������� �"����� ���� �-es (Schmid-Hempel 2003, Klasing 2004), and having a high immune �������� �(� � ���� ���� �� ������� �"������"����� ��$���� ��� � � �����-�� "���������"����� �������)�����(� "���������������5�����-?��� ����al. 2003, Martin et al. 2004, Owen and Moore 2006, Buehler et al. 2008c, Pap et al. 2010��� ��-������7<������������2010). This variation ����������"$������0������ ������������������ ���7�����)�������������"�������������������� "���������5�������������� ������1996, Nordling et al. 1998��,�������� �������� �� � ��2000, Moreno-Rueda 2010), �����"� ����� �� ��%������� "� ���������"� ��������� ��(� �������������� ����������$��������$ ���� ���������(���� ����"��������$� ��� ��5,�������� �������� �� � ��2000��,=�������������2002, Martin 2005, Altizer et al. 2006, Marais et al. 20111��,���������#��)��� ���������&-tent to which annual variation in immunity stems from phenotypic plasticity or is genetically engrained. Yet, if annual variation in im-munity plays a role in the evolution of life history traits in different environments, one might expect that it has a genetic component.If immunity is traded-off against other resource demanding life cy-��������������(������5�������������� ������1996, Nordling et al. 1998,
68
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
,�������� �������� �� � ��2000, Moreno-Rueda 2010), seasonal (� ������� ��� �������"� ��� �&$������ ��� ������� � ��� � ��� ��(���� ����������"� �����"� (� �� ��� ��(� �������� ����� ��� � ��� � ��� ����-���"� ����� (� �� ��� ��(� ��������� 9� ��� ����� ��(�� �� �������� ������distance and large annual reproductive output, characteristics �"$�����"������������)�������$� ���� � ������"���(�����)� #��� �� ��� ���� ������$� ����� ����� � ��� ��������������� ���� ���:� ���(��a small annual reproductive output, characteristics typically asso-������� )���� � �$����� � ���� !�� �� ������ ��� � ���7������ �� ������ ��demanding seasons such as migration or reproduction, immune �����������"� ���� �� ��$ ������ 5��� �� � �� ��� ���� 1997, Nord-ling et al. 1998, Nelson et al. 2002, Martin et al. 2004, Owen and Moore 2008, Machado-Filho et al. 2010). If immunity is primarily ��������� "���(� �������������� �����������������(���� ����"�����-$� ��� �� ����$��������$ ���� �� 5,=������ ��� ����2002, Maizels and A�0��� �#����2003, Marais et al. 2011), predictions for seasonal $���� �����"� ������� �����+��������� �&$���� �� � �&��$������� �� � �����������"��� ����������� ������$� ����������� ��� "� � ���������� �����$������ ����������$�����(� ��������������� � ������ -ent pathogen communities, compared with residents that stay in the same environment year-round (Møller and Erritzøe 1998). Thus far, most studies linking environment, life history and immunity ��(����(���������� � ���������"������������������������������(� ��-ment (e.g. Bonneaud et al. 2003, Ilmonen et al. 2003, Tieleman et al. 2005, Martin et al. 20071������)����� ������� � ������������investigating variation in immunity in two or three seasons is in-creasing (e.g. Hasselquist et al. 1999, Møller et al. 2003, Martin et al. 2004, Owen and Moore 2006, Machado-Filho et al. 2010) few studies have included the perspective of the complete annual cycle (Buehler et al. 2008c, Pap et al. 2010��� 1��4�������$� ����(� �-����������������������������������������������� ����������� ������large variation exists among annual cycles of immunity.��������������(� �����������������"�� ��������������)����������-ies, can result from the fact that different indices of immunity have ���������5!�����2004, Lee 2006). The immune system consists of a complex collection of interrelated and overlapping pathways that $ ���������� ��"�� ������������������� ����(������������;�� ���������-������������"�������� ��(������������������(�����������������$�-������5������78��$������� � ��2003, Janeway et al. 2004, Lee and
69
Klasing 2004). In our study of seasonal patterns, we decided to focus �������������(������������������������� ������������$� �����������-������"�����$ �(������������7�$���/������7���� "� ������/ ��������of defense against general challenges (Janeway et al. 2004, Buehler et al. 2008c). We included different aspects of constitutive innate im-�����"*������ ����"����)����� �������������� ���� ����� �)������ �$���-� ��� � ���� ����� ����� ����� ��������� ��� ���� ����7��������� ��$�����of constitutive innate immunity (Tieleman et al. 2005, 2010, Mil-let et al. 20071D������ ����"����$��������������������������"����� �����cells (Matson et al. 20051����(��(���� �������� ������� �����������������$������� �"����� 5+����� ��������J��#� ������2000); and con-���� ������������$����� �������������$�����$ �������������� ���������������� ��������� ��$����������%���������� �����������5�� "�0"�#��1997���������6 �������#� ��������2010).Distinguishing phenotypic from genetic variation of a trait is typi-����"������ �)������(� ������������������������ ������ ������� �� ��&��$��� "�#��$���� � ��������$��(��"��4���� � ���� �������� ������(� ���������� ������� �)��������� �������������� "�� ������ �� ���and kept in a common environment, differences that one finds are ��#��"� ��� ��(�� �� �������� ��#� ����� 5� ������ 1922, Gwinner et al. 1995a). Stonechats are an ideal study species for such studies: They are widespread (Urquhart 2002), occur in environments that (� "�������� � �"�������������$���� ��������(� ��������������������(Gwinner et al. 1995a, König and Gwinner 1995, Helm et al. 2009, Helm 20091��� �������"�#�$������ ��������$��(��"�������" ��������� ��)������ �$���������� ��� ������������ ������������������� "�� ���������$�"������"������������������� �$������� ��)���7���� � ������� ������$ ������)���� � ���� �� � ����������� �����$��(��"� 5')��-ner et al. 1995a, König and Gwinner 1995, Klaassen 1995, Wikel-ski et al. 2003, Tieleman 2007, Helm et al. 2009, Tieleman et al. 2009a, Helm 2009). A study of immune indices of stonechats in a ������� �������� ���)��� ���������� �������������� �$������� ��$ �-sent when they are kept in a common environment, suggesting a �������� �����56��$�� ���1�We studied annual cycles in hemagglutination, hemolysis, hapto-��� ������� ���� �������� ����"���������Escherichia coli and Staphylo-coccus aureus of continental long-distance migrant Kazakh, temper-ate short-distance migrant European and tropical resident Kenyan �������������������� ��" ����� � �������������������������(� ��-
70
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
ment. Because of the differences in seasonality of the environments of origin and associated life history traits, we expected that seasonal (� ������� ��� ������� ��������� )����� �� �� ����� ��� ��0�#�� �����-���������������� ������"��� � ������������ �������� ���� �$�����������������"������������������(�� �������"���(������������ ��#� ������)���&$�������������$�����:� �(� �� ����"����������������"������������ ��������� �$����������������" ���������������)�(���������� ��������������� �$� �������� �$�����������(���������)����� �$�����"$���%�&-� ����"� ���� ��� 5����������1� ������� ��� ������� �"����� ��� �������"��)��#�$�� � ������������ �$������5� �$��������������1����� ��)������� -ent temperature regimes, one group at year-round constant tempera-�� ������������� �����������"�(� �� ������$� ��� ���
MethodsBirds and treatments
Stonechats (Saxicola torquata) originated from three different loca-�����*���0�#������5�B24) (S. t. maura1��� �$��5�B57) (S. t. rubicola), �������"�� 5�B15) (S. t. axillaris). Kazakh stonechats migrate over ���������������������(������� �� ���������������� ����)��������"���"�����������������)��������(� ����/(�7��&�������� �$���������������are short-distance migrants that lay two to three clutches with on av-� ����/(�����������"��������������� �� �������� � ���������"����� -ally one clutch with three eggs (Helm 2002). In addition to these �� �$�������)�� ����������������" ���� ��)������0�#������� �-$������ �$������5�B201����� ��)����� �$�����������"����� �$�-�����5�B211��9� ���)� ��� ���/ ���5�B331���������5�B421����� ��5�B22) � ���� ���5�B51����� ������� �����������7 �������������-�&������#����������� �� � + ��������"�� !�������� '� ���"�� � � ���� ���� ��#���������������� � �������/�������(��� ��� ���� ������������������7 ������5�B35) (Gwinner et al. 1987). All individuals were fully grown, rang-ing in age from 0 to 12�"�� ��5��B�1371�� ������������(�������)� ��0 to 4�"�� ������5��B�124). Birds were housed with 8-12 individuals per room and individuals were kept in separate cages. They were housed randomly assigned to �����)���� ��$��������� �$������������� �������������������� �����consisted of year-round constant temperatures of 20-22°C and day length following natural day length of the European population. In ����������������������� ��� ���������)�������#�$������ �������� �$�-
71
��� � ���5�B141����� ���(� �� ������$� ��� �� ������������������-perature each week to mimic the average natural temperature cycle of free-living European stonechats (Figure ���A).
Measurements of immune indices4��;�����/���/(�� ����������� ����������(�� ������� �������"��� ����/(��������"������������ ��)����<� �� "�2005 and March 2006: spring migration (24� <� �� "�E�30�-� ��1�� ������� 510 May – 2 June), moult (1 August – 17 August), autumn migration (11�+��� � 78 No-(�� � 1�����)���� � 524���(�� � �E�18�<� �� "1���� ���� ������-� ������$� ���� � ���� ������(���� ��������������58�����������2005), )�����)�������� ��� "��������������� � ��������7 �����4����/����)���� � ��� ����;���������$� ���� ���� � ���������� ������ ���� ��� ���$ ���� ��� ������� ����������� )� �� ��$�� ��� �� ���� ���� ��������������� ������"����$�"�����������"�$ �$� ���� � ����������� ������-���������(��"���������$ ������� ���������$������� ��� ����������� ���(Gwinner et al. 1995 ��8�����������2005). Birds were checked twice a week for moult.
Complement and natural antibodies�E�4������ ����������� �����)���-���������� ����� ����$����������$� ����$������� ��� ��� �����������and stored the plasma at -80C6��������� ��� �����"�����4��;�����/������� ������� ��"��������$�����������(��"������)������������������-������7�����"��������"����� � ��� "�-�������������52005) with modi-/������������ � ��� "�-���#� ��� ���� 52005). We scored hemaggluti-����������������"���� ���� �� ��� ���� ����� ���� � ���)����� ���� � ��� ��� �����������)� �������������������� ��"�����4�������������)���$� �����agglutination or lysis were given half scores. Scoring of all scans was ����� "����������$� ����5-!�1�
Haptoglobin�E�4������� �����$����� ���������� ������� ���$������with a commercial kit following the manufacturer’s instructions (Tridelta Development Ltd., Maynooth, Ireland). The kit uses a col-� ���� �������������;������"������������ �����������$����� ����4��mixed plasma and reagents in a 96�%��� ������)����$��������� ��������� �� ��������630 nm using a Molecular Devices Spectra Max 340 plate reader.
Bactericidal ability�E�4������������� ���� �������� ����"���� ��������������)���"$��������� � ��������� �$ ������������������������ ��7������(��
72
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
���� ���5Escherichia coli1������ ��7$�����(�� ���� ���5Staphylococ-cus aureus) (Millet et al. 20071���������� � �����(�� ������������� ����������"�� ��� �;�������������� � "�������0������$���������"�confounding effect of different antigen-exposure histories (Millet et al. 2007). In addition, they represent different response path-ways of the immune system: E. coli� ��� �������� ��� �� #������ ��$�-�����"� "�$���������$�������������� ���������������������$�������cascade, whereas S. aureus����#�������� ���"� "�$�����"������5-������et al. 20071�� ��� ���� ����� ���$����)� �� ��#���)������ �� ������-����� ��� ���� ���� �� ���� )���� � ���� !���"�� )� �� $� �� ���� ��� �������� � � ��)������)������������� ����� � ��������$������ �����)-ing Tieleman et al. (2005, 2010) and Millet et al. (20071����� �����we reconstituted lyophilized pellets of E. coli (Epower Microorgan-isms, ATCC #8739, MicroBioLogics, St. Cloud, MN, USA) and S. aureus (Epower Microorganisms, ATCC #6538 MicroBioLogics, St. Cloud, MN, USA) following manufacturer’s instructions. Every ��"�)�����#����� ���$���� �������������#����������������)������������� � ����� ��)� #���� ��������� ����� "������� � ����200 microorgan-isms per 70�F�����������7 ����7��� �� ����������&�� ������� �$������ 5���� ���)1�� ����#� ����)� #���� ���������� )� �� #�$�� ��� ����at all times. For the E. coli assay, we diluted 30� F�� )����� �����in 270�F��6+
27����$��������������5'� ��7��(�� ������6� �� ����
CA, USA) with 4mM L-glutamate. The assay was started when 30 F�����E. coli�)� #�������������)������������������������ ��������� ����7��� �� ���������&�� ��)��� ���� ������� �7.5 minutes. For S. aureus we mixed 75� F�� �����)����225F��������� ���� ������30F�� ���S. aureus�)� #���� ��������� ��� ��� �� ���� ����"�� ��� ����7S. aureus���&�� ��)��� ���� ������� �3 hours. We chose the incu- ������������ ������������� ��� �����"���������������5��������������� ��$� ������� ����1�� !��� ��&�� ��� )� �� ���� ����� ��� 41°C and ���#��������������"� ��� ��$�������70�F������ "$������"���� �$������(Fluka, St Louis, MO, USA), in duplicate. To determine the num- � ������� �� ����������������� �����0� ������ ���������� ���� ����� �)����)����������� ����)�������������(������� ����� ������������������ � ������!�� �$������)� ������ ������� �����5E. coli) or two (S. aureus1���"�� ��� �������"��� �����������)� �����������������������"������� �59�+���� �����$��1��(� "��)��)��#��)�������� ��������#����� ���� ���� ���������������
73
Statistical analysisWe used R version 2.12.1 for statistical analyses (R development core team 20101���� �� ����)� ���� ����"����� � �����5������� �(7Smirnov D < 0.07, P > 0.08), and we used mixed effects models for ������������������ �����"����� ��$����� ��� ���� ���� ������� � ����"�against E. coli and S. aureus. We investigated whether the annual cy-������������������������������� ������ �$������5�����������" ��������1�� �� ��������� ��$������� ���������$�����:� �(� �� ����"��4��/ ������-�"0���(� �������������������"����������������� �$��������� � ���#�$����������� �������������)����������� ������������ �$������� ������"����������� ��&�� ���� ���� ���� ���� �������� ����� �"���� �����G�� �$������� ������"���������G��&������� �$�����G��&��4�����������������(� ���������-$����������5�������������1����������#�����5������������ � ���� �������� ����"1��4������"0������� ��$�����������$� ��� ������ �$���������-chats with models including treatment, life cycle stage, sex, age and ���� ���� �������� ����� �"���� �����G� ��������� ����� �"���� �����G��&� ����� �������G��&�� 9������� )������� ��� ���� ����� ����(������� �� ����multiple life cycle stages, we included individual as random effect in ����������������������� �������������"���������G�� �$������� �������"���������G� ��������)��������/�����)������������������/���������������"-�������������������� �$������� �� ��������� ��$���$� ����"�����������"-����������)��������/����������������$� ��������"�����)���� ��;�����"��������$���7���������������$� �����$������(� �� ���"������������"������������������������������� �$������� �� ��������� ��$���4��/ ������$� �����������"����������0�#���� �$�����������"����� �$�-cies. To further investigate genetic components of annual cycles, we ��������$� ����" ��������������5��0�#��&�� �$����� �� �$����&����"��1�)�������� �$� �������� �$�������<�����"��)�����$� �����������"��������� �$���������������#�$������������������(� �� ������$� �-ture treatment.
ResultsGenetic differences in annual cycles of subspecies and hybrid lines
!�������"�������������������������������"�������� ���� �������� ��-ity against E. coli and S. aureus ����� ��������/�����"�������$�����)����������(� �� ����"��������� �$�����������" �����������������������#�$����� �� ������� ��(� ������� 5�� �$�����G����� �"���� �����*� �2 > 26.83,
74
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
H- a Ha
.. �2 P �2 P
AL * 16 30.48 0.02* 36.89 0.002**
S* 4 2.78 0.60 6.37 0.17
L * 4 5.21 0.27 8.47 0.08
S 4 - - - -
L 4 - - - -
S 1 0.27 0.60 0.02 0.90
A 1 10.35 0.001** 18.43 <0.001**
B
L * 4 3.80 0.43 12.20 0.02*
T* 1 0.11 0.74 0.34 0.56
L * 4 5.21 0.27 5.51 0.24
T 1 0.21 0.65 - -
L 4 7.12 0.13 - -
S 1 2.87 0.09 0.13 0.72
A 1 0.85 0.36 13.71 <0.001**
a Included as covariate in the model is the time between entering the room
and completion of sampling.b Included as covariates in the model is age of the microbicidal stock solution.
75
HaB
E. colia,b
B
S. aureusa,b
�2 P �2 P �2 P
14.29 0.58 59.96 <0.001** 26.83 0.04*6.94 0.14 5.08 0.28 7.87 0.101.51 0.82 3.35 0.50 6.69 0.15
3.91 0.42 - - - -8.70 0.07 - - - -2.79 0.10 2.03 0.15 0.38 0.541.50 0.22 9.60 0.002** 1.78 0.18
4.51 0.34 9.60 0.048* 4.42 0.350.13 0.72 0.28 0.60 1.56 0.214.92 0.30 3.58 0.47 5.86 0.210.72 0.40 - - 0.08 0.779.86 0.04* - - 34.89 <0.001**0.72 0.40 0.56 0.46 1.39 0.240.10 0.75 7.94 0.005** 2.50 0.11
Table 4.1 – Statistics and P-values of life cycle stage, sex, age, the interaction life cycle stage*sex
and (A) the interaction subspecies*life cycle stage, subspecies*sex and main effect subspecies,
and (B) the interaction treatment*life cycle stage, treatment*sex and main effect treatment in
analyses on hemagglutination titers, hemolysis titers, haptoglobin (mg/ml) and bactericidal ability
(% cells killed) against E. coli and S. aureus. When the interaction terms subspecies*life cycle or
treatment*life cycle stage are significant, significance of the main effects subspecies or treatment
group and life cycle stage is not meaningful and is not shown. Results are from mixed effects mod-
els after backward elimination of non significant terms (P>0.05).
76
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
�����B�16, P < 0.043D�� ������; Figure ���). Annual cycles in hapto-��� ���������������� ������/�����"��������� �$�����������" ���������5�� �$�����G�������"���������*��2�B�14.29�������B�16����B�0.58D�� ������; Figure ���61��!���������(���������/��������������������"����������-���������������� ���� �������� ����"���������E. coli�5� ������A). Older � ��� ���� �� ����� � ������������������ �����"���� ���� ���� �������� ����"���������E. coli.
Comparing subspeciesHemagglutination –� 6��$� ���� ������ �� �$������� ������� �"�����of hemagglutination differed among Kazakh, European and Ken-"��� ����������� 5� ������A, Figure ���A, Appendix ���A). Kazakh ��������������)������� ������������ ����� ���������������������� -ing autumn migration, European and Kenyan stonechats showed no �����/����� ����� ������ ������ ����� �"���� �������� ���������� �$����������������������� ���������"������ ��� ���� �������������� ����the other seasons (Appendix ���A). Also, during spring migration, Europeans seem to have a lower hemagglutination than the other two �� �$�������
Hemolysis –�!������ �"����� ��������"����)� �� ���$� � ��� ��� ���$����������0�#������� �$���������������� �������� ���� ������"�������������� 5� ������A, Figure ���B, Appendix ���A). Kazakh and European stonechats had a low lysis during spring and autumn mi-gration. The decrease is more pronounced in Kazakh than European stonechats. Kenyan stonechats showed less annual variation, with ���������$��� ������������ ���������������������"���������������� ��������/�����"�� ������������ �5!$$����&����A).
Haptoglobin� E� !������ �"����� ��� ��$����� ��� ���� ���� ����� � �����/-�����"� ������ �� �$������� ��� ���������� "� ���� �������/����� ���� ��-������� �$�����G������"����������5� ������A, Figure ���C). The large ������ ��� � ������������ �$������������������������"�������������� ��&��$�������������"��� � ����� �������������"������������������������(�������)� ����� ��������������������
Bactericidal ability against E. coli�E�!�������"�������� ���� �������� ����"�against E. coli������ ��������/�����"���������0�#���� �$�����������"��� ����������� 5� ������A, Figure ���D; Appendix ���A). Ka-0�#��� ��� ��� ������ ��)������ ���� ���� ���������� ������� ���)� ��
3
4
5
6
7
hem
aggl
utin
atio
ntit
er
A
1
2
3
4
5
hem
olys
istit
er
B
0.0
0.2
0.3
0.4
0.5
hapt
oglo
bin
conc
entr
atio
n (m
g/m
l)
C
0
25
50
75
100
E.co
lice
lls k
illed
(%) D
−100
−50
0
50
100
W
S.au
reus
cells
kill
ed (%
) E
life cycle stage
KazakhEuropeanKenyan
0.1
AMBS
77
Figure 4.1 – Annual variation of (A) hemagglutination, (B) hemolysis, (C) hapto-
globin concentration, (D) bactericidal ability against E. coli and (E) S. aureus of Ka-
zakh (black circles), European (grey diamonds) and Kenyan (white triangles) stone-
chats. Stonechats were kept at constant temperature and annually variable day
length. Dots represent means ± standard error. Letters represent life cycle stages;
S = spring migration, B = breeding season, M = moult, A = autumn migration and
W = winter.
78
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
high during the rest of the year (Appendix ���A). European stone-������������)���� � �������� ����"���������E. coli during spring mi-� ������� ������� �"���� �������� ���� �����������)� �������� ����Kazakh stonechats the rest of the year (Appendix ���A). The resident ���"��� � ���������)���� � �������� ����"����������������"�� 7 ����� ������ ���������������(�������������� ��)���� �$�������� ����)���� �(Appendix ���!1�����"�������)��������$ ��������� ��������� � ��)�(���������������� ������$� ���������������� ��)���� �$�������
Bactericidal ability against S. aureus – !�������"�������� ���� �������� ��-ity against S. aureus showed large variation among life cycle stages in ������ �$������������������$������� �����������0�#���� �$�����������"��������������5� ������, Figure ���E; Appendix ���A). Kazakh ����������������������� ����"� ���#����S. aureus �� ���� ���� �������period and a low score during autumn migration (Appendix ���A). The annual patterns of European and Kenyan stonechats had simi-lar shapes, with peaks during moult and lowest values during spring and autumn migration (Appendix ���!1�����"��� ���� �����������Europeans have a slightly higher value than Kenyan stonechats.
Comparing hybrids with parent lines4�������$� ����������� �"���������" ��� ������)���� ���� � ��$��-tive parent lines, we found that hemagglutination, hemolysis and ���� �������� ����"���������E. coli and S. aureus�����" ��������� ���� ���$� �������� �$������5� ������; Figure ���; Appendix ����A). �����������������������������������������" ������������)������� -��������(���������$� �������� �$������������������ �� ���� ���������������$� ������������ �)� ����������� ���� ����$� ����������5<��� �����; Appendix ���A).
��������������������� ������������Housing European stonechat under different temperature regimes affected two of the immune indices. The annual cycles of hemaggluti-����������$����� ������� ���� �������� ����"���������S. aureus did not ����� �������$�� ��)���������������#�$������ �(� �� �������������������$� ��� �� ����������� ���������� "� ���� �������/����� ���� ��������� �������G������"����������5� ������B; Figure ���B, D and F). How-�(� ��������������"�������������"�������� ���� �������� ����"���������E. coli�)� �������/�����"������ ���� ��)����� ��������� ��$��5� ���
3
4
5
6
7
hem
aggl
utin
atio
ntit
er
A
1
2
3
4
5
hem
olys
istit
er
B
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
hapt
oglo
bin
conc
entr
atio
n (m
g/m
l)
C
0
25
50
75
100
E.co
lice
lls k
illed
(%) D
−100
−50
0
50
100
W
S.au
reus
cells
kill
ed (%
) E
life cycle stage
KazakhKaz x EurEuropean
F
G
H
I
J EuropeanEur x KenKenyan
AMBS WAMBS
life cycle stage
79
Figure 4.2 – Annual variation of hemagglutination, hemolysis, haptoglobin con-
centration, bactericidal ability against E. coli and S. aureus of Kazakh (white circles),
European (white diamonds) and Kazakh x European (black triangles) stonechats
(A-E), and of European (white diamonds), Kenyan (white triangles) and European
x Kenyan (black circles) stonechats (F-J). Stonechats were kept at constant tem-
perature and annually variable day length. Dots represent means ± standard error.
Letters represent life cycle stages; S = spring migration, B = breeding season, M =
moult, A = autumn migration and W = winter.
80
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
���B, Figure ���C and E; Appendix ���B). Hemolysis of stonechats #�$�����(� �� ������$� ��� ��)����� ������������� ������������"�� �����������"������� � ���#�$�����������������$� ��� ����������)�����decrease during spring and autumn migration (Figure ���C, Appen-dix ���91��9���� �������� ����"���������E. coli showed an increase from �$ ������� ��������� ������� ������������������#�$�����(� �� �������������������$� ��� ��������������#�$�����(� �� ������$� ��� �������maintained this high level during the other life cycle stages, while �����������#�$�����������������$� ��� ����� ������ ���� �������� ��-ity against E. coli during autumn migration. As a result, spring mi-� �������������������/�����"������ �� ������������� ��������������-chats kept at constant temperature (Figure ���E, Appendix ���B)
Discussion4�����)� ����� �� ��� �� �$��������� �����������)��������� ���� ����� �"-cle stage demands and originating from environments that differ in seasonality maintained different annual cycles in hemagglutination, �����"�������� ���� �������� ����"���������E. coli and S. aureus, when �� �������#�$����������������(� ����������������������)���" ��������� ��� ��)������ �$���������$��"�����������"���������������"�that differed from parental stonechats. Some of these annual cycles ����" ����)� ������ �����������$� ����������5����������"���������0�#��&�� �$��������������1���������� ������ ���� ����������� ����$� ���������� 5����� ���� �������� ����"���������E. coli in Kazakh x European and European stonechats) and sometimes they were dissimilar to ei-��� ��������$� �������� �$������5�������������������������� �$����&�Kenyan stonechats). Keeping stonechats at two temperature regimes, ���������������������(� �� ����� ������������"�� ������������%���������� ���$�� � � (� �� ����"� ��� ���� ������� �"����� ��� ��������������������$����� ������� ���� �������� ����"���������S. aureus. However, he-molysis showed less variation throughout the year in stonechats kept ���(� �� ������$� ��� ���������� � ���#�$�����������������$� ��� ���9���� �������� ����"���������E. coli was lower during autumn migra-�������������������#�$�����������������$� ��� �������(� �� ������$� -��� ��������/����������)������(� ������������������"����������������������������� ���������������� ����������������$�����"$���%�&� ��-��"����� � ��������(� ���������$� ��$��������������������$ �� ������some immune indices.
10
20
Mar May Jul Sep Nov Jantem
pera
ture
(ºC
) A
3
4
5
6
7
hem
aggl
utin
atio
ntit
er
B
1
2
3
4
5
hem
olys
istit
er
C
0.00.1
0.20.30.40.5
hapt
oglo
bin
conc
entr
atio
n (m
g/m
l)
D
0
25
50
75
100
E.co
lice
lls k
illed
(%) E
−100
−50
0
50
100
W
S.au
reus
cells
kill
ed (%
) F
life cycle stage
VariableConstant
AMBS
81
Figure 4.3 – (A) Annual variation in temperature in standard and variable tem-
perature treatment groups. The dotted line represents the temperature birds were
exposed to, the solid lines the measurement periods. (B) Hemagglutination, (C)
hemolysis, (D) haptoglobin and bactericidal ability against (E) E. coli and (F) S. au-
reus of European stonechats kept at standard (white diamonds) and variable (black
circles) temperature treatments and measured during five life cycle stages. Dots
represent means ± standard error. Letters represent life cycle stages; S=spring mi-
gration, B=breeding season, M=moult, A=autumn migration and W=winter.
82
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
Continental long-distance migrant Kazakh stonechats show larger (� �� ����"� ��� ������� �"����� ��� �����"����� ����������������� ����S. aureus� ����� �������� � �$����� ���"��� ������������ �� �� ����"� ���environment, life history traits and physiology may underlie the ������� �"��������$� ���� �������� �� ��� ���� �0��� "� ��� �� ���-ing seasons and Kazakh stonechats generally produce large clutches ��������������� ��� �����"���� ���������)� ���59����������4��#� �2001, Helm et al. 20091�������������� �������������������(�� ����$ �$����� ��� �� � ����7���� �������� �������"� 5�L � �� ��� ���� 1998, Bonneaud et al. 2003, Martin 2005, Moreno-Rueda 2010, Pap et al. 20111��-� ��(� ����� ������ ��0�#�� ����������� )���� �� �&$����� ��������$�����(� ����������� �� ������(� ����������$�����������$�-sitions (Møller and Erritzøe 1998), and this may lead to changes in �������"��'���������"� ������������������=���������������������-dices of Kazakh stonechats may take place in anticipation of variation ���������"�������������������$��������$ ���� ������������(���� ����"�� �$������������������������ �������(��������� ����������������������not migrate (Dittami and Gwinner 1985, Helm 2009). The pathogen $ ���� ������������������� ���&$�����������$���������"������(� �� ���� ���(� ��� �� � �������� �������� ������ ������������ ������� ���"� �&$�-rience only one environment. However, tropical environments have ����� ���� �"$������0��� ��� �� �� ��� �� $��������� 5-?��� � 1998, Guernier et al. 2004, Martin 2005). If pathogen pressure experi-������ "����"������������������� ����� ���"�� 7 �������������"���(�� ����������������(� �� ����"�������� ������������� ����!������ ����(���"$����������������� �$�������(� ��������� �������$ ������ ���5�� ��-stein et al. 2008, Helm 20091������������������������������ �� �%�&-� ����"���������������� �������� ����������� �������"����������������������(���(��(�������%�&� ����"������=�������� �$�"������"���$���-ing on current environmental conditions. As a result, in a relatively ��� �����$��(����(� ��������)����������(���� �������� ��������������������������$��(�����"����������������"� �� �����(��"����������������� ����$��������$ ���� ������#��)������� ���)����$�$�������������test these scenarios in the future.8����������������������"�������� ���� �������� ����"���������E. coli )� ��������� ���� ������������������)���� ����$� ���)�����������migration in long-distance migrant Kazakh and short-distance mi-grant European stonechats. Spring migration shows similar dips in � �$������ ��������0�#������"�� ����������� ��+��� �����������(�������
83
reported changes in immunity during migration periods. Changes in organ sizes occur due to migration, also in organs related to immunity (Møller and Erritzøe 1998, Bauchinger et al. 2005, Bauchinger and 9�� ���� 20061�� ������ ������ %"������ �� 5Elaenia chiriquensis) het-� �$�������������� �������)������"�$���"������������� ������ ��� ����$� �� �� ��� ���� ������� � ������ 5-������7<����� ��� ����2010). In two species of migratory thrushes (Catharus ustulatus and C. fusces-cens1�������� �������������)����� �������������������� �������������-������� �������(������� ���������������� ������$� ��������$� ������ �������5+)�������-�� ��2006). These changes during migration in different indices in our study and the literature suggest shifts in immunity during these periods are a general phenomenon. However, when we consider all life cycle stages and restrict comparisons with other studies to the constitutive innate immune indices that we used, we encounter different patterns of annual variation in some species. A long distance migratory wader, the red knot (Calidris canutus), held in captivity, showed no variation in hemagglutination; hemolysis was ��)� �� ���� ��� ������� ������� ����������� ���� ���"� ��� ������ ��������)���� D� ���� �������� ����"���������E. coli was high during migra-������ ������������������������� �������� ����)���� �59����� ��������2008c). In free-living temperate house sparrows (Passer domesticus), ����������������� ���)��� ��� ������� (� ������� ���������� ��� ��� ��-������)���������� �����������������)��� ���� �����������)���� D���� ������&���������"�������� ���� �������� ����"�)� ��������� �������������$� ���)���� �����������)���� �5��$��������2010a). We found that ���� �������� ����"���������S. aureus increased in European and es-pecially Kenyan stonechats during moult. Few studies investigated ����������(���������"��� ��������������� ���������� ���� �������� ��-ity against S. aureus�� ���� ������*�����������$� �)���������� �$��-tern was found (Pap et al. 2010�1�� ��������$��(�� ���#����� ���� �������� ����"�)�����)������ ����������59����� ��������2008c). Therefore, we ��������������������� � ���(� ��������������$�������&����� �����������"�������� ���$� � ��� ����������(�� ������� ������� ���������������"������� ����$�����7�$���/����������&��$���/�� ���/������������������-munity versus other life cycle stage demands, and from the character-istics of the environments that different species occupy. !�������"������������������(���������������������" �������������� ���� ��� $� ������ �� �$������� ��� )� �� ���� ��)�"�� ���� ��������� ������$����� ����� ������� �"����� ��� ��(�� �� �������� ��#� ����� ��� �����
84
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
heredity of the indices does not follow simple mendelian rules. The immune system consists of many components, each having their own ���������� ���/���5����)�"��������2004). The immune indices that we ����� ���� ����� ���� �0��� "����� ������ ������������"�������� ����:� ����� ��� ���$������� ���� � ������ �$�����7�$���/���)�������#���them particularly useful for comparative ecological studies (Tiele-man et al. 2005, Millet et al. 2007, Lee et al. 20081��-�� � ���������-says are functional measures that integrate many components, which $ �(�����������&������)�)���� ��������� ������#������� � ���5��������et al. 2005, Millet et al. 2007). The hemagglutination-hemolysis as-��"����������� ��������� ������� ��"��������$�����������(��"��)�������(��(������"�$ �������5+����� ��������J��#� ������2000, Janeway et al. 2004, Matson et al. 2005). The integrated nature of these im-mune measures may also cause complexity of inheritance and may �&$���������(� �����������������$���� ��� ��)�����" ��������$� ��-������ �$������Temperature treatment did have an effect on the annual cycles of �����"�������� ���� �������� ����"���������E. coli, and not on those ��� ������������������ ��$����� ��� ���� ���� ������� � ����"� ��������S. aureus�� ��� ����� ����� ��)���� ������� �"����� ��� �����"���� ���� ���� �������� ����"���������E. coli in two temperature treatments is ����)���������� �������(��������������#�$�����(� �� ������$� ��� ��showed less variation in these indices than stonechats kept at con-stant temperature. Moreover, hemolysis was most dissimilar during ���������� �������)������ ��������$� ��� ��)���(� "������� � �-tween the two treatment groups. Our results suggest that in stone-������ ����������(�� ������� �������� � ������ ����������"� ��%������� "��� ���� ���$� ��� ��� ��� ����� ����� ������� ��������� ��#�$������������(���� �� ������������"�� � ��� ��$��������(� �� ����"���� ������-(� ������������%�&� ����"������������"���������������"���� ��$�����to temperature was not found in the only previous study that looked at this: Buehler et al. (2008�1� �$� ������������"�������� ���� �������� ����"� ��������E. coli ������������� � ��)���� ���#����� #�$������ �(� �� �������������������$� ��� �� ������������������ � ����������)�that annual cycles of some immune indices (i.e. hemagglutination ���� ���� ������� � ����"� ��������S. aureus) are rigid in stonechats, )����� ���� �� 5����� �����"���� ���� ���� ������� � ����"� ��������E. coli) � ���� ��%�&� ���
85
AcknowledgementsWe thank the animal care takers and technical staff of the Max Planck Institute for Ornithology, especially Lisa Trost, Willi Jensen and Er-ich Koch. Sophie Jaquier, Elsemiek Croese and Johan Leenders were a great help with collecting and analyzing samples. We would like to ����#�-� ���� ����� � ����������� ��� ���� �� � ���$���� �������������9�� )��� /��������"� ��$$� ���� "� �� � ���� � ��� ��� ����� ������+������������� ��������/������� ���5�4+7����863.04.023).
86
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
B E. coli
S-B
0.820.92
4.71
<0.001**
5.02
<0.001**
4.28
<0.001**
2.120.20
B-M
0.231.0
00.22
1.00
0.111.0
01.49
0.561.71
0.42M
-A
4.48
<0.001**
1.340.66
1.800.37
1.850.34
0.800.93
A
-W
5.09<0.001**
1.450.59
1.620.48
2.490.09
3.860.001**
W-S
1.990.27
4.84<0.001**
5.21<0.001**
5.95<0.001**
4.01<0.001**
S-M
1.170.76
4.97<0.001**
4.73<0.001**
2.710.05
0.490.99
B-A
3.32
0.008**0.96
0.871.73
0.410.58
0.980.95
0.87M
-W
0.490.99
0.091.0
00.46
0.994.20
<0.001**
4.31<0.0
01**S-A
3.120.02*
3.380.0
06**
2.360.12
4.15<0.0
01**1.17
0.77B -W
0.69
0.96
0.151.0
0
0.361.0
0
3.070.0177 *
2.84
0.03*
B S. aureusS-B
2.820.04*
1.24
0.73
2.220.17
0.28
1.00
0.16
1.00B-M
2.88
0.03*1.43
0.600.78
0.943.27
0.009**
2.530.08
M-A
3.470.0
05**
2.560.08
2.450.10
2.460.10
3.230.01 *
A
-W
2.500.09
0.540.98
0.470.99
1.810.36
0.321.0
0W
-S2.24
0.161.75
0.400.51
0.990.67
0.960.66
0.96S-M
0.60
0.970.29
1.00
2.960.03*
2.810.04*
1.910.31
B-A
5.73
<0.001**
0.830.92
1.750.40
0.430.99
0.900.90
M-W
1.18
0.762.18
0.182.30
0.144.52
<0.001**
3.270.0
09**S-A
4.36<0.0
01**2.04
0.240.09
1.000.55
0.980.85
0.91B -W
4.31
<0.001**
0.45
0.99
1.530.53
1.34
0.65
0.670.96
87
AK
K E
E
E K
K
||-P
||-P
||-P
||-P
||-P
H
S-B0.40
0.99
1.090.81
2.25
0.15
1.410.61
0.31
1.00
B-M
0.650.97
0.790.93
1.480.57
1.260.71
1.010.85
M-A
2.780.04*
3.97<0.0
01**0.91
0.892.03
0.250.98
0.86A
-W
3.62
0.003**3.68
0.002**
0.670.96
2.800.04*
0.251.0
0W
-S0.32
1.00
1.480.57
0.241.0
03.19
0.01*0.14
1.00S-M
0.39
0.992.18
0.180.59
0.982.54
0.081.33
0.67B-A
3.190.01*
2.780.04*
2.230.16
0.810.92
0.021.0
0M
-W
0.171.0
01.15
0.770.43
0.990.29
1.00
1.410.62
S-A
3.65
0.002**2.11
0.210.49
0.990.64
0.970.33
1.00
B -W
0.620.97
0.081.0
02.15
0.191.81
0.360.23
1.00
H
S-B
1.380.63
0.410.99
2.400.11
0.710.95
0.191.0
0B-M
0.30
1.00
0.101.0
00.52
0.990.35
1.00
0.171.0
0M
-A
5.95
<0.001**
3.120.02*
3.360.0
07**0.96
0.871.63
0.47A
-W
7.56
<0.001**3.90
<0.001**3.80
0.001**
2.380.12
1.820.36
W-S
2.150.19
0.840.91
3.95< 0.001**
2.240.16
0.131.0
0S-M
1.27
0.700.59
0.983.0
00.02*
1.010.85
0.021.00
B-A
5.51
<0.001**
2.710.051
2.820.04*
0.640.97
1.820.36
M-W
0.40
1.00
0.071.0
00.15
1.00
1.180.76
0.141.0
0S-A
5.51<0.0
01**2.81
0.04*0.99
0.850.12
1.00
1.670.45
B -W
0.021.0
0
0.181.0
0
0.450.99
1.63
0.47
0.331.0
0
Appendix 4.1
88
Ch
apter iv
| A
nn
ual cycles of im
mu
nity in
su
bspecies of ston
ech
ats
89
Appendix 4.1 – Statistics of pair-w
ise post hoc tests be-
tween life cycle stages (A
) per subspecies and hybrid line
and (B) per treatment group. In the com
parison among
subspecies the interaction term subspecies*life cycle stage
was not significant in haptoglobin and results are not
shown. In the com
parison between treatm
ent groups the
interaction life cycle stage*treatment w
as significant in he-
molysis and bactericidal ability against E. coli, and w
e only
performed a post-hoc test on these indices.
BT
C
V
||-P
||-P
H
S-B2.40
0.11
0.640.97
B-M
0.520.99
0.470.99
M-A
3.360.007**
2.130.20
A
-W
3.800.001**
0.400.99
W-S
3.95< 0.001**
0.710.95
S-M
3.000.02*
1.130.79
B-A
2.82
0.04*1.54
0.53M
-W
0.151.00
2.420.11
S-A
0.99
0.850.93
0.88B -W
0.45
0.99
1.580.50
B E. coli
S-B5.02
<0.001**
2.890.03*
B-M
0.111.00
1.910.31
M-A
1.790.37
0.400.99
A
-W
1.620.48
0.530.98
W-S
5.21<0.001**
5.05<0.001**
S-M
4.73<0.001**
4.79<0.001**
B-A
1.73
0.411.43
0.61M
-W
0.460.99
0.131.00
S-A
2.36
0.124.52
<0.001**B -W
0.36
1.00
1.950.29
Appendix 4.1 (continued)
90
CHAPTER V
Genetic modulation of energy metabolism in birds through mitochondrial function
9��� �������������-���#��!���� �������� !�����"�< �����9� � ��8���������������������������
8��,�����'� �������$��9��4�������
Proceedings of the Royal Society B. 276: 1685-1693 (2009)
AbstractDespite their central importance for the evolution of physiological variation, the genetic mechanisms that determine energy expendi-ture in animals have largely remained unstudied. We used quan-������(�� ��������� ��� ���/ �� ����� ���� ����7�$���/�� ���� )����7� -������� ��������� ����� ����59-�1�)� ���� ��� ����������$��(�7 ���population of Stonechats (Saxicola torquata �$$�1������������ � ���from three wild populations (Europe, Africa, Asia) that differed in BMR. This argues that BMR is at least partially under genetic con-� ��� "������$�����#��)�������� �����������)���������������������������� $�����"$���4�� ����� ������� �� � �� �������� ������� ���9-�� ����������������� ���7������ � �����$������� ������ �" ���� ��)���� ��-cestral populations with high and low BMR (Europe-Africa, Asia-� �$�1��)��������� ����$� ���������/�� �������5������
high – male
low
or femalelow
– malehigh
1�)�������������� �����������$�$����������8"- ����)��������� ����$� ���������/�� ���������(������(� ����������������&�� ������������ ���!�� �������� ������������� ������!� ����������������� ������ ������������ ����"��-���7�$���/��9-������� ��� �-�)�����" ����)��������� ����$� ���������/�� ����������$�"���������
91
������� �������������������� �������������� ���!��������������- ����� ������� ��� ����� �/���������$���������������� ������������������$� ����� ������� ������� �"����� ������������� ��������)���������� ����������� ��� ��������������� ����� ����������� � � ����� "�genetic differences in the mitochondrial genome, these results set the stage for further investigations of a genetic control mechanism ��(��(���� ������������� �������������� ����������� �����������- ����� �����������)����7� ���������(����
IntroductionThe genetic mechanisms that determine energy expenditure in ani-mals are largely unknown, despite the central importance of meta- ����� ������ � ���(�� ��������"��������������� "����� ���������������������� �$� ������ ��� ������$������5,��"�����,"����1979, Sadows-ka et al. 2005, Rønning et al. 20071���� ��������� ����� ����59-�1�������������� ����������� ����������� ������ ������������ ����$������and in the thermal neutral zone (King 1974), whereas others do not (Dohm et al. 2001, Nespolo et al. 2003, Nespolo et al. 2005), and only few demonstrate a direct response to selection on BMR (Ksiazek et al. 2004). These results imply that at least some within-species vari-���������9-���������������� �������������������������������������� ������������ �������������"��������� ��� ���������������������� �-�������������� ��"�������)����7� �������9-����������7�$���/��BMR in three populations of Stonechats (Saxicola torquata spp.) showed that these traits can evolve independently (Tieleman et al. 2009 1������� ������� ���������$���� ����"���������� ����� ���������%�-������ "������$��������������� 9-��� �������� ��� "� �&"���� ������$������ ��� �� $ ������ ���summed mitochondrial oxygen consumption, mitochondrial func-����� $ �(����� ��� ��$� ����� ���#� ��)���� ������� � $ �������� ����)����7� ����������� ����� �������������������������$���������������-ed set of candidate genes to impart genetic control. After accounting �� � ��"���0���(� ����������9-������ ������� � ������������� �����������0��������� �������"������"�����(��� �����5������������1990, Konarze-wski and Diamond 19951����������� ����������"�5��������8�� � ��19851������ ���������� ������� ������ ������ �������:� ���� ������������ ��������� ��$���� ������ ���������������$ �����$� ��� ����"�58�� � ����������20051��8�)�(� ����������������������������/ �������
92
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
organ size accounted for variation in BMR (Tieleman et al. 2003a, Russell and Chappell 20071��� ������(� ������������$���������� �����was associated with BMR (Brookes et al. 1997, Brzek et al. 2007), ���(�����)������$�� ����� ���������������������������� ��)�������-lular processes and whole-organism energy expenditure. -�������� ��� �������� � ���� 90% of respired oxygen during the production of ATP, the molecule that powers such processes as pro-tein synthesis, ion gradients, and actinomyosin ATPase (Rolfe and Brown 1997, Nichols and Ferguson 2002). The myriad of chemical reactions that supply electrons to the electron transport system in ��������� ��� $ ������ ����� ��� "$ ������ ����� ���� � ����� ��� ��� -moregulation in endotherms (Rolfe and Brown 1997, Nichols and Ferguson 2002). Within mitochondria, the electron transport system ��������� ��� �� ��� $ ������ ���$��&��� 5���$��&� �� �� ������1� ����� ��-quentially transport electrons and create a proton-motive force which drives ATP synthesis. The electron transport system contains 13��� -������������ "�������������� ������������������������������������70 nuclear encoded peptides that are imported into the mitochondria ��������� ����������� �)����������������� ����"����������� ������to produce functional complexes (Blier et al. 2001, Ballard and Rand 2005, Das 2006). Proteins containing mitochondrial DNA-encoded polypeptides play crucial roles in the regulation of mitochondrial res-$� �������������$��&�����������������������������$ ������������!��������$��&���5��(�"�����6�� #�1996, Bai et al. 2000). -��� ����"� ���� ������ ��������� ���� ��!� ���� � ����������"� ����used as neutral marker in phylogeographic studies (Zink and Bar-rowclough 20081�� ������ ��� ���������� � ���� ����������$$� �� ����idea that climatic conditions can provide a selective ecological gra-dient that alter mitochondria haplotype, potentially changing mito-chondria function and heat production (Matsuura et al. 1993, Mish-mar et al. 2003, Ruiz-pesini et al. 2004, Ballard and Whitlock 2004, Ballard and Rand 2005, Zink 20051�� ��� ���� 5����� ��� ���� 2004). Further, Fontanillas et al. (20051����)����� ����������$� ��)������-tochondrial haplotype and maximal nonshivering thermogenesis in white-toothed shrews from a lowland and an upland population, sug-gesting selection on mitochondria in these two populations.We exploited differences in inheritance of mitochondrial and nuclear ������ ��� � ����� ��������� ����� ��������������� ��� �������� ��%��������� ���� ����� ����� ������ �� ��$��(�7 ��� $�$�������� ��� �����������
93
(Saxicola torquata� �$$�1� ����������� � ���� ����� ������������)����$�$���������)��������� ���� ��������� ����� �����5������ �������� �� *�Asia, Europe, Africa (Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003, Tieleman 200711��)��/ ����$$�����;���������(���������������"��������(������������� ��� ��� ����� ��� 9-�� ��� �� � ����� ���� ��� ��� ����� ���� 7� ���� ��-� �$�$�������� (� �������� ��� �� ��� �������� ���� �������� �� ���������are compared with previous analyses for each of the three ancestral populations separately (Tieleman et al. 2009 1��4���������������� ����"$�������� � ��������������� ��� �������� ��%������ ���9-���������)�� �"$�������" ������ �$���7!� ���������!����7� �$����� ���-����)���� ���$ �����$� ������ ���/�� ��������� �$�
female – Africa
male
versus Africa
female – Europe
male and Asia
female – Europe
male versus
Eu-
ropefemale
– Asiamale
��!�$ �� ���)����(���������� ���$���� �����������*�(11��������� ����� ������� ����� ���� ��)�����" ����)���� ���� ���-���� $� ������ ���/�� ������� ���� �" ������� ����� ����� ���� ����-���� ��)���������� ���(�����������)����������������������� ����� ���� ������� $ ����������"� � ��� ������ � ��!7�������� $ �������� 52��-clear control”-hypothesis). (21�-��� ����� ��������� �� ��)�����" ����)�������� �������$� ���������/�� ����������� ���� ������������� .������ ����� ����� $�������� ��� ���������� ��� ������������� ������!7encoded components of the electron transport system in determin-�������� ������52-�������� �������� ��37�"$�������1��531�-��� ����� ���� ����� �� ��)���� �" ���� )���� ���� ������� $� ������ ���/�� �-�������������������� ���� ������������ .������ ����� �����$ �(�������(��������� �������$� ����������������� ��)������������� �������������� ������������ ������������ ����� ����52-�������� ���7������ �coadaptation”-hypothesis, (Rand et al. 2004)). Next, we added quan-titative genetics analyses to explore maternal and paternal effects on ���� ����� �����<�����"��)�����$� �����;����������������������� ����$ ������������������� ��)��������� �$��������!� �����$�$���������������/ ������$ ���������������7��������������������������� ������in the mitochondrial genome.
MethodsBirds and housing
������������ ��������$���� �����)������)�������� �$�������� � ������in Europe, Africa and Asia, ranging from 71°N to 35°S (Urquhart 20021��4�� �������� ����������� � ��� �� �������� ����$�$��������� �-
94
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
�������� ��� �� ��� ����� ���� �� �$������� � ��� � �$�� 5!��� ���� S. t. rubicola), Africa (Kenya, S. t. axillaris) and Asia (Kazakhstan, S. t. maura1�� ��� ��������� ��� � �$���7!� ����� �" ����� ���� � �$���7!������" ��������$�"���������� ����������$��������������$�$���-������������ �$��������(�� �������� � ��� ���������� ������� ��������� 5�20081��!���������� � � ��������� ������� �$������"���$� ��������-������� ���"�$ ������ �� ������" ����)���� ���� ������� ��� ��$��(��"��Our study design provided us with two independent tests of the ef-������������$� ���������/�� ������)�����������������������7�$���/��9-������" �����<� � ����� �$���7!� �������� ���������)������-ured 80 individuals of four different genotypic pairings including 45 pure Europeans, 14 pure Africans, 11��" ����)����� �$��������-ers, and 10��" ����)����!� ���������� ���<� ���������"����� �$�����and Asians, we measured 29 individuals in addition to the 45 pure Europeans: 15 pure Asians, 5��" ����)����� �$��������� �������9 �" ����)����!���������� ���9������� � ��������)������� ���(� ����in age from 8 months to 8 years, we incorporated age as a factor in the analyses. Individuals were kept in separate cages, in rooms with controlled temperature (20-22°61�������"��������&$� ������� "��- �$���� � ����������)���� �;�� �� ��540°N). We measured each indi-vidual one to three times during winter (total 131 measurements), in the periods 9-13�<� �� "�2005 or 24���(�� � �2005 - 13�<� �� "�2006���� ���������$� ���������������� � ���)� �� ����������������� ����)������� ��� "� ���������������������� �(� �/��� "� ��� ���������nighttime activity (Helm et al. 2005).
Metabolic ratesLaboratory setup and metabolic measurements� E� +��� ��� � ��� ��the start of experiments we removed water and food from cages, to ���� �� � ���)� ��$���� �� $��(�� 5���������$� ��� � ��1��4��$������ � ��� ��� 13.57,����������� ����� ���� � �� )���� ���&������ ����� �������������� 7������������������ ��������� � �� � ���$� ���������������)� ��$����� ��$�������(� �����"� ����$� ��/�������4�������������� ��������� � ������������������������ � �)������������������$� ��� �����35°C ± 0.5°C, a temperature within the thermoneutral zone of Euro-pean stonechats (Tieleman 2007). 4�� ����� ������ �� %�)7�� ����� ��$� ���� "� ��� ����� �� +
2-con-
sumption of stonechats (Gessaman 1987). Compressed air was pumped through columns of silica gel-soda lime-silica gel to remove
95
water and CO2���� ��������� �����5,�("�19641�����7%�)����� ���� ��
(model 5850��9 ��#���8��/������!����!1� ���� ���500 ml/min, and ������������������ � ��!� � ����� �&����� ���� ���� � � $������ �� ����� �������� ��� ������� ���7���� ���7������������ ��� ������ ��������&"��������"0� �5+&0�������� ����"�������,����������������!1� �������� �� ���� � ���������������� �-tion of oxygen of the air stream. A stream of dry CO
2-free air was
used as reference air. We recorded atmospheric pressure, air temper-��� ������������������ ��������� � ������������+
2 with a data logger
(model CR23M��6��$ �����������/���,�����������!1��!���������� ������ ������ � � ���)� ��$����������������� ���������- � ��� ���� )���� +
27������� ������ ���� ���� ��� ��� �� � ��� ������ ����
minutes, we calculated the lowest running average over ten minutes of data for BMR (Tieleman 2007). To calculate BMR from O
2-con-
sumption we used equation (2) from Hill (1972) using a conversion factor of 20.1 J/ml O
2 (Schmidt-Nielsen 1997). Birds were weighed
����������"� ��� ���������� ����� ���������� �������������(� ����weights are used in analyses.
Statistical analysis of metabolic rates – We analyzed data for BMR � �������� �$���7!� ������" ������������� �$���7!������" ������$� ����"��<� ����������������)����(����� � ����������� �� ��$��5$� ��� �$�������" ����)����� �$��������� ����" ����)����!� �����5� �Asian) mothers, and pure Africans (or Asians)) and tested differences in BMR among groups. We used a mixed model with individual en-tered as random effect to incorporate multiple measurements on one third of the individuals (using MLwiN 2.021��!������&����� ��"������)� �� ��������� ��� /&��� ��������� ����)�� ����� ��#)� �� ������������������7�����/�����/&�����������5��N�0.05) as our selection procedure (Crawley 19931��4��������������)�7)�"����� �������� ���������� �$� �����7�����/����� �������� !��� ������� �����/����� ������� ��� ��"� ��� ����models (all P > 0.29); we therefore omitted age from the models.
Calculation and interpretation of mass-specific BMR – We calculated ����7�$���/��9-�����)����7� �������9-����(����� "� ��"�������4������ $ ����������(������������$ ������������� �����������$ ����������� ��� �(� ���� � ��� ��� �������� ����� �(� ���� ������7�$���/������ �����rate (Speakman 2005, Tieleman et al. 20061��4�������������� ��"�composition and mitochondrial density are the same in the different � ��$����������������" ��������� ���� $ �������� ������ �������7�$�-
96
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
��/��9-����� ������� �������� ������������������ ��������������4��/����������#��"����������$� ���������/�� ��������������" ����)������������ ��"� ���$�������� � � ��������� ���� ������"�� ��� ��$����0�������)����(������������� ��"����$��������� ���������� ����������"��8�����������������$������ ��������� ���������
Quantitative genetics analysis with animal modelsPedigrees�E�4���7��������������������(�� ��������������� ���$��(��population over a 15-year period. For our quantitative genetics analy-ses, we assumed that wild-caught nestlings collected from different nests were not related to each other, and that nestlings collected from the same nest had the same genetic father and mother. In captivity, ����������� �������(�� ����������������������������$�� ��������� �����offspring the genetic father and mother were known. After hatch-���������#��)� ������ "���������� ��� ������ ���5 days and thereaf-ter hand-raised. We had a panmictic population of stonechats with #��)�� ����������$�� ������ � ���� ���������� � ������ ������ ���-erations and among populations. The resulting pedigree included 50 African, 127 European and 53 Asian individuals, in addition to 21�� �$���7!� ������" ���� ����14� � �$���7!������" �������� � ��������)������� ��� ��������������� �������0 (wild-caught) to 4, )���������� �������� � ��� ������� �������1 and 2. To indicate the �������� ������� �(� �������)������������$��(��$�$����������)�������-������������� � ��������(�������� �������)���������$ �����������/ ���generation of captive individuals: 20 African, 43 European and 18 Asian stonechats (Lynch and Walsh 1998).
Estimation of genetic parameters and statistical analysis – We estimat-���(� ���������$���������� ��� ���������������������� ���������)����restricted maximum likelihood ‘animal models’ (Falconer and Mac-kay 1996, Kruuk 2004) using the program ASReml 2.0 (Gilmour et al. 2006). We used these ‘animal models’ to partition the total $�����"$���(� ������5�
P1������� ���������������(����������(� ������5�
A)
���� ��������(� ������5�R). The model included sex as fixed effect,
������������� ������ ������ ��)������&������$�����"$��������������animal as random effect, taking into account repeated measures. 8� ��� ����"� 5h21� )��� ����������� ��� �
A:�
P (Falconer and Mackay
19961��4������� �(� �������������������������������������(������ �-sidual covariances, and correlations (r1�������������
A was significantly
97
larger than zero we compared the -2G�����#�����������������������������������
A with one that did not. To test if estimates of r
A were
significantly different from zero (or from 1 or –1), we compared the -2G�����#������������������)�����
A fixed, and r
A either fixed at
zero (or 1 or -1) or unconstrained. The corresponding significance levels were taken from a �27���� � ������� �� ����)� ���$� ������ ���additive genetic and residual variances across traits we calculated ����������������������(����������(� ������56�
A) and residual variance
56�R) following Houle (1992).
The maternal inheritance of mitochondria might lead to a maternal ����������������������$ �������� ������52��������� �������� ��3��"-pothesis). To estimate the maternal genetic effect, we constructed an animal model that included mother as additional random effect with ���� ����������� (� �����7��(� ��������� �&� ���� ������ "� ���� ����-tive genetic relatedness matrix (Kruuk 2004). Likewise, we tested ���� ���� ��(� ��������� ������� 5 "�/���������� ���� �������"� ��� ��-dom effect), paternal genetic and environmental effects, and perma-nent environment effects (following Kruuk 2004). We calculated the �27���� � ����� ����� ����� ��)���� ���� 72G�����#��������� ��� ��������)�����������������������)�������������� ����������������������/������
Mitochondrial DNA sequencesGeneration of mtDNA sequences – DNA was isolated from muscle tis-sue from two African and two European individuals using a stand-� ��$�����7���� ��� ��$ ����� ��5��� ��#��������1989). Sequences �� � ���� ������� ������ )� �� � ������� "� ��$���"���� ����� ������� ���roughly 500� $����������������$ ��� ����������� "�-���� �������� ���;������������!���� � ���5���� � ���������$*::$��$��� �����:��� -
en/primers.html1���$$���������)���������������$ ��� ����������� "�O. Haddrath and A.J. Baker. Both strands of each amplicon were se-quenced using a Big Dye (version 3.0) Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Cycle-sequenced products were cleaned using Sephadex columns and nucleotide sequences determined using an ABI 3100 Genetic Analyser.
Analyses of mitochondrial DNA – Because we were interested in dif-ferences among populations in mitochondrial proteins as functional components in the electron transport system, we focused on a com- ����� ����"���� ��� ������ ����� ���� � ���� $ ������� ��� ��� � ��� ����/(��
98
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
���� ����� ���$��&��� ��� ���� ����� ��� � ���$� �� �"����� 5��(�"� ����Clark 1996, Korzeniewski and Mazat 1996, Bai et al. 2000): Complex I (NADH 1-61��6��$��&�����56"���� ���� 1��6��$��&����56+�7���1������6��$��&��� 5!�6 and 8). We explored if the sequence differ-������ ��)���� ���� � �$���� ���� !� ����� $�$��������� �������� ����$���� �"� ������������ ����������� �$����������� � ������7������������synonymous, variation. We present results for individual mitochon-drial genes in Appendix "��.
Finally we looked for evidence of selection leading to divergence in mi-tochondrial DNA among stonechat populations using McDonald-Kre-itman (MK) tests (McDonald and Kreitman 1991) to compare the ratio of amino acid replacement variation to synonymous variation within �$������)���� ���� ����� ��� �$��������� ��� �"���"����� ��(� ������ �-�)������&������� ����� ����"��������)�� ������������� ���;����)�� ����under different types of selection this ratio should differ from one. The direction and degree of departures from this neutral prediction were ;�����/���)������������ ����"� ����&�����5��������������1996). As-suming that synonymous sites are evolving neutrally, NI < 1.0 indicates an excess of amino acid divergence, which is inferred to result from positive selection, whereas NI > 1.0 indicates an excess of amino acid polymorphism resulting from purifying selection.
ResultsHeritabilities and genetic correlations of body mass and metabolic rate
Estimates of h2� �� �����7�$���/��9-���)����7� �������9-������ ��"������(� ���� ��)����0.36 and 0.70, and all additive genetic var-�������)� �������/�����"� �� �� � �����0� ��5� ���"��). Furthermore, �������������� ���������)� �������/�����"������ ����� ���1 (or -1 for mass versus� ����7�$���/�� 9-�1�� ����������� ������ (� �� ���� �������(��(�����������$� ��"�����$�������"������������� �5� ���"��).
�������������� ������������������������� �� in metabolic rate
-���7�$���/��9-������" ��������������)��������� ����$� ���������-/�� ������������ ��� � ������������ � ��� ���� ����� �$���7!� ��������� ���� !����7� �$���� $�� ����� 5� ��� "��; Figure "��). Further, �� � ������� ���/ ��������� ������ �������7�$���/��9-���)����7� -
99
ATP
()V
A ()V
R ()h
2 ()
A
R
B ()
14.9 (2.29)3.277 (0.679) <0
.00
01
1.389 (0.253)0.702 (0.0
67)12.1
7.9
BMR (J
-1)22.2 (2.23)
1.857 (0.818) 0.0
033.345 (0.599)
0.357 (0.130)6.1
8.2
M- BM
R (-1
-1)1.51 (0.215)
0.035 (0.0077) <0
.00
01
0.015 (0.0029)
0.694 (0.073)12.4
8.2
Table 5.1– Q
uantitative genetics parameters for body m
ass, whole-organism
basal metabolic rate (BM
R) and
mass-specific BM
R in stonechats (combined from
Europe, Africa, and A
sia, including hybrids). A. Estim
ates of ad-
ditive genetic variance (VA ), residual variance (V
R ), heritability (h2), coefficient of additive genetic variation (C
VA ),
and coefficient of residual variation (CV
R ). P-values (written as exponents) indicate one-tailed significance of dif-
ference from zero for estim
ates of VA . Sex w
as included as fixed factor for all traits (see Methods). B. Phenotypic
correlations (in italics) and additive genetic correlations (rA ). Above the diagonal, P-values denote tw
o-tailed signifi-
cance of differences from zero (P
0 ) for estimates of rA , and one-tailed significance from
1 (P1 ) or -1 (P
-1 ).
B
B ()
BMR (
-1)M
- BMR
(-1
-1)
B ()
–
0 = 0.20
1 < 0.00
01
0 < 0.00
01
-1 = 0.001
(J
-1)0.294 (0.084)
0.264 (0.195)–
0 = 0.12
1 < 0.0
001
M-
(J -1
-1)-0.703 (0.048)-0.826 (0.073)
0.443 (0.076)0.291 (0.205)
–
100
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
�������9-������ ��"������ ������ ������������������� ����� �����5� ��� "��; Figure "��). Analysis of the European-African data set (Figure "��!1� ���)��� ���������7�$���/��9-��)��� �����/�����"� ��-������� "�� ��$�5�2�B�35.88�������B�3, P < 0.00011����� "���&�5�2�B�8.76, ����� B�1����B�0.003). Post-hoc analysis supported the mitochondria-nuclear coadaptation hypothesis and failed to support the mitochon-� �������� ������������� ����� ����"$�������*������)���" ���� ��$������� ��������/�����"�� ������������ ������� ������� ����� ����$� ��lines (African × European vs African × African, �2�B�19.18�������B�1, P < 0.0001; European × European vs European × African, �2�B�12.27, �����B�1����B�0.0005; European × African vs African × European, �2�B�5.96�������B�1����B�0.015). The analysis of European and Asian stonechats duplicated the group-��������������������� �$��������!� �������� ��������*�' ��$����-��/�����"��������������7�$���/��9-�5�2�B�9.56�������B�3����B�0.023), �����&���������5�2�B�2.80�������B�1����B�0.09; after deleting the interac-tion group × sex, �2�B�7.35�������B�3����B�0.062). Post-hoc analysis re-(�����������/���������� ������ ��)���� �����" ����"$���5� �$����× Asian vs Asian × European, �2�B�4.15�������B�1����B�0.04), and did not support a maternal effect that would indicate mitochondrial control (European × European vs European × Asian, �2�B�4.71�������B�1����B�0.03; Asian × European vs Asian × Asian, �2�B�3.53�������B�1����B�0.06).
No maternal and paternal effects on metabolic rate Maternal (or paternal) effects occur when the phenotype of the moth-er (father) affects the offspring phenotype in ways additional to the ������(��������������������������� ������� �����������"�� ���(� �����-tally determined, the latter for example through maternal invest-ments in eggs. We tested for a maternal genetic effect in analyses of the mitochondrial control hypothesis. Because visual inspection of results (Figure "��1�������������$���� ���$��� ������������)����������also to test the paternal genetic and environmental effect, maternal environmental effect, and permanent environment effect. None of ��������������)� �������/�����5� ���"��).
Mitochondrial DNA sequences differ between European and African populations
Comparing the mitochondrial DNA of European and African stone-������)���������� ������������ � �������������������� ������ �����-
101
A
P ( ) B 1 (g) W-
2 ( d-1)M- ( d-1 g-1) n, N
A A 18.0 ± 2.44a 22.3 ± 1.83 1.26 ± 0.144 19, 14
A E 15.0 ± 1.39b 22.3 ± 1.33 1.50 ± 0.191 18, 10
E A 16.1 ± 2.89c 21.9 ± 2.24 1.38 ± 0.166 22, 11
E E 14.3 ± 1.73b 22.0 ± 2.34 1.55 ± 0.184 72, 45
1 Body mass was significantly affected by group (�2 = 38.95, d.f. = 3, P < 0.0001) and sex (�2 =
16.52, d.f. = 1, P < 0.0001). Identical letters written as exponents indicate non-significant differ-
ences between groups, with a post-hoc test.2 Whole-organism BMR: Without including body mass as covariate, whole-organism BMR was not
significantly affected by group (�2 = 0.34, d.f. = 3, P = 0.95) or sex (�2 = 2.59, d.f. = 1, P = 0.11).
When including body mass as covariate, the model included the interaction sex x body mass (�2
= 5.90, d.f. = 1, P = 0.015), body mass (�2 = 11.22, d.f. = 1, P = 0.0008), sex (�2 = 5.56, d.f. = 1, P =
0.018), and group (�2 = 9.37, d.f. = 3, P = 0.025).
B
P ( ) B 1 (g) W-
BMR2 (d-1)M- BMR ( d-1 g-1) n, N
E E 14.3 ± 1.73a 22.0 ± 2.34 1.55 ± 0.184 72, 45
E A 14.0 ± 1.30ab 24.6 ± 2.77 1.76 ± 0.093 5, 5
A E 14.2 ± 1.30ab 21.7 ± 1.54 1.55 ± 0.201 10, 9
A A 13.1 ± 1.39b 21.8 ± 2.98 1.67 ± 0.223 18, 15
1 Body mass was significantly affected by group (�2 = 13.71, d.f. = 3, P = 0.003) and sex (�2 = 19.45,
d.f. = 1, P < 0.0001). 2 Whole-organism BMR: Without including body mass as covariate, whole-organism BMR was not
significantly affected by group (�2 = 6.92, d.f. = 3, P = 0.07), but significantly differed between
sexes (�2 = 5.73, d.f. = 1, P = 0.0017). When including body mass, the model that remains after
eliminating nonsignificant effects of sex (�2 = 0.72, d.f. = 1, P = 0.40) and group (�2 = 7.30, d.f. =
3, P = 0.063), contains only mass (�2 = 14.46, d.f. = 1, P = 0.0001).
Table 5.2 – Body mass, whole-organism and mass-specific basal metabolic rate (BMR) for
four groups of stonechats with different parental configurations, originating from (A) the
African and European populations and (B) the European and Asian populations. Values are
average ± 1 SD for all measurements per group. Number of measurements = n, number of
individuals = N.
102
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
��������������� ��������������������$��&�)����(������ �������� ���4 ��������������� ������ �����������������������6��$��&��������������to 35��� ����������6��$��&���5� ���"��). Results from the M-K tests and values for the NI index indicate that overall purifying selection acts on amino acid-altering mutations in stonechat mitochondrial DNA although our small samle size limits the power of our analysis $� ������ �"��� �-7���������������(������������5� ���"�� and Appen-dix "��1����������������/������������ �����)�������������� ��������5�1���:� �������� ������ ���5�1�������������� ����������������7 "7�����������(c.f. Appendix "��1�����������#���� ��)��������������������7 ����- ��������������� ������!��������
Discussion8" ������������������� ������� �������$� ���������/�� �������5��-male
high – male
low versus female
low – male
high1������ ��� ������� �����
�����(� �/�������)����$� ��������������)����� ��������������������)����� ������$�$���������� �����/������� $ �(���� �(������� ����� ������������������ ��)������������� ������!� ���� ������ ���!� ���������;������� �� ����� ����� ���� ��� � ����8" ����)�������� �������$� ���������/�� ���������(������(� ����������������&�� ������������ �DNA, and differ only in the mitochondrial DNA that they inherited � ��� ��������� �� �� ��� ��� �� � /������� ��$���������������� ������������������$� ����� ������� ������� �"����� ��������� � ��������� �� ����������� )���� ���� 2��������� ���7������ � �����$������3� �"-$������������2��������� �������� ��3��"$���������)��������a priori $ ������������������ ��������������������2������ ����� ��3��"$���������$ ����������������� ������ ��)�����" ����)���� ���$ �����$� ���������/�� �������� ����(������ ��$$� ��� ��� ��� ��������)���� ���� �� -����������� ��� �������� ������� ����� ����� ������ � � ����� "������ -ences in mitochondrial DNA sequences, these results set the stage for further investigations of the genetic control mechanism determining ���� ����� �������� �������� �����$������� ��)���� ��������� ���� ���� ������ ���!�� ��� ���� ��� � ����� � �������� ��������$ �(�����"� ���� ���)���������������� ����� �����������)����7� ���������(������������� ����Studies on copepods (Tigriopus californicus), however, have shown ����� ���� $�$���������" �����)������������������������ ���� ����nuclear genomes, have reduced mitochondrial function resulting
Eu x EuEu x Af
Af x EuAf x Af
mas
s-sp
ecifi
c BM
R (k
J/day
/g)
0.0
1.0
1.5
2.0* **
** * *
Eu x EuEu x As
As x EuAs x As
mas
s-sp
ecifi
c BM
R (k
J/day
/g)
0.0
1.0
1.0
2.0* * 0.06
a ab c
a ab b
103
Figure 5.1 – Mass-specific basal metabolic rate (BMR, kJ d-1 g-1) of stonechats with
different parental configurations, specified as mother x father. Origin is abbreviated
as Eu – Europe, Af – Africa, As – Asia. Bars are SE, for sample sizes see Table 5.2.
Identical letters indicate non-significant differences between groups, with a post-
hoc test. P-values for pairwise comparisons: *** = < 0.0001, * = < 0.05.
104
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
from loss of activity of those complexes in the electron transport �������������(��(�� ������������� �������������� ��� ������5�������and Burton 2006). In these copepods, impaired mitochondrial func-�����������(��"����������/����������� ��� "������������� � �� �� -(�(������������� $������������������/�����������;��������� ��(�����" �������)��� �������/��������)��������� ������������������������� ���������� �������� ������� ������5!(���������������1989, Hel- ����������1994��������������20071�������� �������$���� �������� ���&$������������������ ���������������������������� ��)��������-chondrial and nuclear DNA varies and affects the functional or evo-������� "������/�������������� ����)�"��+� �����"�)������$� ��� "�����$���� ����"������������ ������������������������ ������ ����������� ����� ���� �� �������������� ���� ���������� ����� � ����������$������"����� ���� ��������������" ���.���� �����rate to that of their father (Figure "��1�� ������ ����� �� �&$������� "�alternative mechanisms. Whereas the animal model analyses do not support paternal and maternal genetic or environmental effects the sample size is modest and as a result the power of these tests limited. Alternative explanations fall into three main categories: control by sex-chromosomes, genomic imprinting, and non-genetic maternal or paternal effects. Control by sex-chromosomes���� � ���������������������&7�$���/���������������� ����� ����)��������� ���� ���������� ��� ���� $���������� �)�� J7�� ���������� ���� ������� �� ���� ���������� ��� ���� $���������� �� ���� ���4J� �� ����������4��/��� ������������#��"��&$��������� �� ��� � �������� ������������������&������������/����������������� �����"������������� � ���$���������� ����� ����does not differ among sexes. In our stonechats the direction of the sex effect differs among populations, with females having a higher ����7�$���/��9-���������� �$��������!� �����$�$����������������lower value in the Asian population, when compared with their male counterparts. Genomic imprinting (Wilkins and Haig 2003, Keverne 20071������$ ������)�� � "�������������� ������ �������$� ��������-nates over its counterpart from the other parent, can occur on sets of ������������ ������������ ������������������������$ ����� ��������set of Z-chromosomes in male offspring. Applying these mechanisms to the results in this paper, the paternally inherited genes involved ��� ���� ����� ���� ������ ��������� �(� � ���� � ���� ����"� ���� ����������� $� �����������������$��� ������������������ ����� �����(��������� �����������$ ���������� � ������� �)����� ������ ��� �������������
105
M
LV
A (SE)V
E (SE)V
R (SE)�
2P
N
185.1990.0348 (0.0
077)-
0.0154 (0.0029)
--
M
185.1990.0348 (0.0
077)0.0
00
0 (0.00
00)
0.0154 (0.0029)
01
M
185.199
0.0348 (0.0077)
0.00
00 (0.0
00
0)0.0154 (0.0
029)0
1P
185.3730.0322 (0.0
089)0.0031 (0.0
061)
0.0154 (0.0029)
0.3480.56
P
185.2250.0340 (0.0
087)0.0
00
9 (0.0048)
0.0153 (0.0029)
0.0520.82
P
185.367
0.0296 (0.0117)0.0
044 (0.0081)
0.0149 (0.0029)
0.3360.56
Table 5.3 – Results of anim
al model analyses to test for m
aternal, paternal and
permanent environm
ent effects on mass-specific BM
R of a panmictic population
of stonechats, with individuals from
populations in Europe, Africa and A
sia and
crosses among these populations. Estim
ates of additive genetic variance (VA ),
variance of effect (VE ), residual variance (V
R ) are reported ± SE. Effects were test-
ed using the �2-distributed difference betw
een the -2*loglikelihood of a model
containing the effect with that of the sim
ple model w
ith no effects included.
106
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
�(���� ��� �����$����� ��� �������� ��� �������� ��$ ������� ������� �����rate. Finally, non-genetic maternal or paternal effects � �� $���� ����� �������(� ���"�������&$�� ���$���)�"������������� ���&�������� ������� (����������������� ����������������������� � ������#��)��at present. ��� ��$� ��������� ������������������ ��)������������� ������!����������� ���!���� �������������� ����� ��������" ����������������$$����� �� ��� � �(������� �������������� ������!� ��� �� =���� ��� ��-lection (e.g. Zink 2005, Ballard and Rand 2005). Our results imply that a co-evolutionary response of mitochondrial and nuclear DNA is ��(��(�����������������������7�$���/������ ����� ����5���������9��� ����al. 20011���������������)�������������������$$� ������2��� �������$-������3��"$������������������������� �����������(����������������� ����-������� �����$���"$��� "������������������� ������������5�����!�7production) and heat production (Matsuura et al. 1993, Mishmar et al. 2003, Ruiz-pesini et al. 2004, Ballard and Rand 2005, Zink 2005, Fontanillas et al. 20051������ �����2��� �������$������3��"$���������� �������� ��(���� �������� ���� ��� ���� ��(� ����������"� ������ ��� ���������������� �����������$������������������������ ������ ���-tutions in mitochondrial DNA have on heat production. Estimates of h2� �� � ������ )����7� ������� 9-�� ���� ����7�$���/��BMR, and of r
A� ��)����������� ������� ����������� �����������)����
�������������� �������������5� ���"��1���������� �������� �7�������-�� $�$��������(� ������� "�������������������" �����������������$�$�-lation separately (Tieleman et al. 2009 1�� ���� $���������"� ���������������)����������������$�$��������(� �������� ���� ���"�������� "���������� ��������������������4�� ������0�� ����� �� � /������ ��� )��#����������� ��������� ��)����������)����7� �������9-����������7�$���/��9-����������� �������(��5� ���"��), especially in light of the ���� ���"������/������������������������9-���������$�����"$�����(����However counter-intuitive these results might seem, the data indicate ������������ ����&���������� ����������������������%������������ �����In conclusion, we have shown that whole-organism and mass-specif-��� ��������� ����� �������������������� ������ ������������� ����!����$����� "�����;���������(���������������"��������� ��������� ��#��"����� �������������������$������������� ���������������" ������� �-ciprocal parental configurations demonstrate that mitochondrial-������ � ��7���$������� ��� ��� ������ $� ��"� ��$���� ��� �� � ����������mass-specific BMR.
107
AcknowledgmentsWe thank W. Jensen, E. Koch, L. Trost, the animal care takers, and other staff of the Max Planck Institute for Ornithology for technical support and animal care. We gratefully acknowledge D. Garant, A. '����� ������>����� ������������ �� � ��(�������������������� ����"-�����������0�����+��8��� ������ ����$�)������ �)� #���������9����� �and T. Piersma for comments on a previous draft. This study was /��������"���$$� ���� "���� ����� ������������ ������+ ������������� ��������/������� ��� ���9�� 5�4+�� ����863.04.023) and funds � ���+�������������(� ���"���94�)�����$$� ���� "���<�� �����9��0212587������)��� ��$$� ���� "� ��������� ������+ ����������� �� ��������/������� ���5�4+�� ����863.05.002).
N. C
F S
P S
F NS
P NS NI P (MK)
C I 2121 266 18 35 6 2.53 0.099C III 380 35 38 4 11 2.53 0.161C IV 1001 103 6 4 1 4.29 0.275C V 282 41 5 5 0 0.00 1.000C 3784 445 67 48 18 2.49 0.005
Table 5.4 – Numbers of codons, synonymous (S) and nonsynonymous (NS) substitutions, Neutrality
Index (NI) values and P values for MK tests for genes which make up metabolic complexes of mitochon-
drial subunits. “Combined” refers to a data set consisting of all genes combined across all Complexes.
See Appendix 1 for results per individual gene. Poly = polymorphic substitutions within populations;
Fixed = fixed substitutions between populations.
108
Ch
apter v
| M
odu
lation
of en
ergy m
etabolism
in
birds
Appendix 5.1
N. S
F S
P S
F NS
P NS NI P
ATP6 681 35 4 4 0 0.00 1.000ATP8 165 6 1 1 0 0.00 1.000COI 1539 52 1 0 0 NA NACOII 681 26 0 2 1 0.00 0.103COIII 783 25 5 2 0 0.00 1.000CB 1140 35 38 4 11 2.53 0.161ND1 975 33 3 2 1 5.50 0.283ND2 1038 33 1 6 1 5.50 0.315ND3 348 21 0 2 2 21.00 0.020*ND4-1 1377 60 7 7 1 1.22 1.000ND4L 294 11 2 2 0 0.00 1.000ND5 1815 85 5 13 0 0.00 1.000ND6 516 23 0 3 1 0.00 0.148
Appendix 5.1 – Numbers of sites analyzed, synonymous (S) and nonsynonymous (NS)
substitutions, Neutrality Index (NI) values and P values for MK tests for individual mito-
chondrial genes. Poly = polymorphic substitutions within populations; Fixed = fixed substi-
tutions between populations.
109
110
CHAPTER VI
Repeatability and individual correlates of basal metabolic rate and total evaporative water loss in birds: a case study in European stonechats
-���#��!���� ��������9� � ��8���� Niels J. Dingemanse, B. Irene Tieleman
Comparative Biochemistry and Physiology A 150: 452-457 (2008)
Abstract 9��������� ����� ����59-�1������������(�$� ���(��)��� ������54,1�� ���������������(���(��(���������=��������)�������������� "�� ���������� ������������������� ����� ���� ����������� �������������������"��-ological traits can show large intraindividual variation at short and long timescales, yet natural selection can only act on a trait if it is a ��� ���� ������ ����� �� ��� ��� ����(������� ��� �$���� ����"� ��� �� � ������������ �� ��� ���� $� ����� ��� (� ������ ����� ��� ������� "� ����� ������among individuals, indicates if it is a characteristic feature of an in-��(�������4������� ��� �$���� ����"����9-������4,����18 cap-tive European stonechats (Saxicola torquata rubicola) within the )���� � ����������$���� ����"�)���0.56 for BMR and 0.60 for mass-�$���/��9-���!������� ��"�����������������/���������������(� ��-tion in BMR. Also after accounting for this variation, BMR remained �$���� ����4,���������7�$���/��4,����)�����������/����� �$���� �����������0.11 and 0.12, respectively. We conclude that BMR is a characteristic feature of an individual in our population of Euro-pean stonechats, whereas TEWL is not. We discuss our results in the �����&������� �(��)���������� ����"��(���� ���������������� �$���� ����"����9-������4,��� � � ���
111
Introduction,�(���� ��� ��� �"� �&$������ �� ����)��� � ����� ��� � ��� (� "�)���� ��-vironment (Klaassen 1995, Tieleman et al. 2003 ��4�#���#�� ��� ����2003), season (Weathers and Sullivan 1993��4� ��� �����4����� ��2000) and workload (Wiersma et al. 2005). These physiological traits � ���������������(���(��(���������=��������)�������������� "�� �/��������� ���� ������������������������0�������� (�(���������� ��#��)����� ���� ��� ���5'� ��1988, Godfray et al. 1991). Several studies suggest that the variation in energy expenditure and water loss among species ����$�$����������������������� ��������)����5���������1995, Tieleman et al. 2003 ��4�#���#���������20031��8�)�(� ��#��)������������� �����for physiological variation among individuals within populations of )���� � ����������������$���������� ����������� ������� ������������(��-����$�"�������������� ���� ����������$� �� ����������/������59� �����et al. 2001���� �������������2006). Physiological traits can show large $�����"$���%�&� ����"�)����������(������������� ��5��"��� �)��#�1�����long (months or years) timescales (Piersma et al. 1996, McKechnie et al. 2007). Yet, selection of traits can only have evolutionary conse-quences if the traits are characteristic features of an individual that, in addition, display interindividual variation within the population.A common measure for the extent to which a trait is a characteristic ����� ������������(��������� �$���� ����"������&$ ������)�����$ �$� �����of the overall phenotypic variation, the sum of inter- and intraindi-(������(� ������������������ "����� ����(������(� �������5,������������Boag 19871������ ����(������$�����"$���(� ����������� ��$� ���������into environmental variation, arising from external circumstances that affect the animal permanently, and genetic variation (Falconer and Mackay 19961�� �� ��� �� �$���� ����"� �� ����"� ����� ��� �$$� ������������ ��� ����"�59��#��1989, Falconer and Mackay 1996, Dohm 20021������ 7�������� �����(������(� ���������"�(� "� ��)����$�$���-������� ������� ��� ��(� ��������� ���:� � �������� ����� �������8����� �$���� ����"������� ��� ����"�� ��$�$������������� ���9��������� ����� ����59-�1������������(�$� ���(��)��� ������54,1�are widely used as measures of energy expenditure and water loss ������� 7�� ���� ��$������������������ � ����������� ������(� ��������or at different times of the year. BMR is defined as the minimum ��� �"� �&$������ �� ��� �� $���� �� $��(�� ������������ ��� �� ����the rest phase and at thermoneutral temperatures (King 1974). It is related to overall daily energy expenditure in the field (Nagy 1987,
112
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
lDaan et al. 19901�����(��"�5��� �� � ���������1998, Nudds and Bry-ant 20011��������(���� ����"����������5-����� �������������2001, -��� �20031�� ���� ������ ������$� ��"��&$������� "�� ������0������� ��"����$��������5������������1990, Piersma et al. 1996, Tieleman et al. 2003�1��6��$� ���(�������������)��� � ������������������(�$�-rative water loss (TEWL), the sum of cutaneous and respiratory wa-ter loss, as yardstick (Dawson 1982, Williams 1996, Tieleman et al. 2003�1�����)��� � ���������"� ���� =������������� ��������(��$ ��-�� ��������� �"��&$������ �����$������"���� � ����&$� ��������������� ��������$� ��� ���� ���� ���"����� ��#����)��� �������������� ���or during migration����������� �$���� ����"����9-��59�����������1999, Hõrak et al. 2002, Tieleman et al. 2003 ���>0��������4��������2005a, Rønning et al. 2005) and especially TEWL (Tieleman et al. 2003�1� ��� � ��� � ����� ����!� ����������7����"������� �$���� ����"�������� ������������-ed 6 estimates for avian BMR (Nespolo and Franco 2007). The study ���������� ����� �$���� ����"� ��� ���� ������ ������ �� ���� ���0����� ������&����������� ��� ���������)� ���������� �������������������-� ����%������������������ � ��������������$��������< �����52007) �����������������)���$������ �$� ���� "����������������52003a), that ���)������ �$���� ����"����9-����� �������"� "��>0��������4��������(20051��<� ��� �� ��� �$���� ����"������$�$������������� ������$ ��-ence and magnitude can differ among populations. Compiling all �(���� ���������������� �$���� ����"��� �9-����� � ����)�������������values ranged from 0.00 to 0.87 and 22K�������� �$���� ��������)� �����7�����/������6��$�����������(���� ���������������� �$���� ����"��� �4,���� � ����)�������������(������ ������� ���0.00 to 0.73 and 60K�������� �$���� ��������)� �����7�����/������5� ���#��). This vari-��������� �$���� ����"��������$����������$�$��������������������������� ��� ��������� � �������� ������ ��� �����&����� ���)�����9-������TEWL are characteristic features of an individual, and hence for the $���� ����"�������� ������������������������������ �����4���������� �$���� ����"���������(������(� ����������9-������4,�in captive European stonechats (Saxicola torquata rubicola) during the )���� ���������9������� �$���� ����"���$������������ ����(������(� ��-tion as well as intraindividual variation, we explored factors that poten-�����"���%���������������$������*��������&������������������������ ��"��������� � ����4�������������(� ����������9-������4,�)��������single season to determine whether these traits are characteristic fea-
113
P
C
V
BMR
S18
0.560.0
02BM
R7.7
This studyS
180.60
<0.001
msBM
R8.4
This studyZ
18-200.41-0.52
<0.001
mcBM
R4.5-6.3
Rønning et al., 2005
Z 19-37
0.29-0.63<0.0
01m
cBMR
6.6-13.5Vézina and W
illiams, 20
05K
8-190.35-0.52
0.01-0.03m
cBMR
11.4-14.4Bech et al., 1999
G
280.65-0.87
<0.01m
sBMR
Horak et al., 20
02S
14-0.17
0.79BM
R18.2*
Tieleman et al., 20
03aW
14
0.170.29
BMR
23.0*Tielem
an et al., 2003a
S- 20
0.660.0
01BM
R16.7*
Tieleman et al., 20
03aD
’ 16
0.480.03
BMR
9.0*Tielem
an et al., 2003a
H
140.57
0.02BM
R8.0*
Tieleman et al., 20
03a
TEWL
S18
0.110.53
TEWL
9.6This study
S18
0.120.51
msTEW
L10.8
This studyS
140.73
<0.001
TEWL
26.8*Tielem
an et al., 2003a
W
140.22
0.09TEW
L28.0*
Tieleman et al., 20
03aS-
10-0.04
0.56TEW
L19.1*
Tieleman et al., 20
03aD
’ 16
0.500.03
TEWL
33.9*Tielem
an et al., 2003a
H
14-0.10
0.64TEW
L19.7*
Tieleman et al., 20
03a
* Coefficients of variation are based on m
ass-adjusted values of BMR and TEW
L. Mass-adjusted values w
ere calculated as the residual of the regression
of BMR on body m
ass. Two values for repeatability represent m
ultiple measurem
ents for repeatability. Some studies distinguish betw
een sex, others
report repeatability measurem
ents on short and long time scales. A
ll measurem
ents were done on non-breeding individuals except Bech et al. (1999).
Table 6.1 – Literature overview
of repeatability (r) and interindividual coefficients of variation (CV
) of whole-organism
, mass-adjusted (m
cBMR)
and mass-specific (m
sBMR) values of BM
R and whole organism
and mass -specific TEW
L (msTEW
L) of birds.
114
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
ltures of a given individual at a given time of the year. This knowledge ���� ������)�������� $ ����������$���� ����(�������� "��������������-derlying physiological differences among environments and seasons.
MethodsBirds
������������ ������ $���� ����� )���� �� )���� ���� �$���� ���� � ������(latitudinal range 71°N to 35°S) (Urquhart 2002), are ideal organ-isms to study evolutionary questions related to seasonality and en-vironment (Gwinner and Scheuerlein 1999, Helm et al. 2005). We measured BMR and TEWL of 18 stonechats from a central Euro-$����$�$���������)��(�� ����(�������)� ��/ ��� 5��B�61�� ������� 5��B�21�� ���� ��5��B�41����� ������ � ��� ����������-�&������#�����������for Ornithology, Andechs, Germany, and six were taken as nestlings � �������/�������(����������������������������7 ������5')���� ��������1987). Their ages were 1�5��B�7), 2�5��B�6), 3�5��B�1), 4�5��B�3), and 5 (n B�1) years. Individuals were kept in separate cages, in rooms with con-trolled temperature (20-22°C) and under wintering day length (48°N 11C1������������������������� ����������Free living European stonechats normally migrate in March and Oc-�� � ������$��������)���� ��������-����� �������4������� ����� ���$��(������(��������)��5�B141�� ��� ���5�B4) times during the winter $� ����� ��)����7������ � �2005 and 13�<� �� "�2006. Average ����� ��)��������� ��������;������24.7 days (range 12-41 days). Winter is a quiescent period for stonechats (Helm and Gwinner 19991*������������� � ���)� �������������� �������� � �������������-chats are nocturnal migrants, and show nighttime activity during the migratory periods even when kept in captivity. To verify that we ����"������ ��� � ����������;���������$� ����)�� ��� ��������������activity with a passive infrared sensor.
Laboratory setup and measurements!��������������� � ��� ��)����� ���������&$� �������)�� ���(���)�-�� ������������������ � �����$�"����� ��������(��� �����4����(��� � ���into 13.5� ������������ ��������� � ��)�������&���������������������� ����������� 7������������������������������������� � �)���������������temperature of 35°C ± 0.5°C, within the thermoneutral zone of Euro-pean stonechats (Tieleman 20071������������� ��������� � ���������
115
)� ��$����� ��)���$�������(� �����"� ����$� ��/�������������&��������water evaporating from feces from the measurements. 4������������� ��%�)7�� ����� ��$� ���� "����������������� ��+2-consumption and H2O-production of stonechats (Gessaman 1987). Compressed air from a tank was pumped through the system, caus-������$�����(��$ ���� ������������� ��������� � ���!� �$�������� ������������ ���7����� ����7������� ���� /��� �� ��� ���(�� )��� � ���� 6+2 and �� ��;�����"��� ��������� ���������7%�)����� ���� ��5������5850E, 9 ��#��� 8��/����� �!�� ��!1� ���� ��� 500 ml/min. Before experiments ��� ����)���������� ��������� ������ "7$�������������� ��������� � ��through a dewpoint hygrometer (model M4-DP, General Eastern, Fair-/�����6����!1���������� ����)$������������� "������������ ���� ��-;�����"������� �)��������� ������������� ��������� � ���The outgoing air passed through the dewpoint hygrometer to measure ����)��� ������������ ��;�����"�6+2 and H2O were removed using sil-�������7���� ���7�����������/��� ����������+2-content of the air was meas-� ���)��������&"��������"0� �5+&0�������� ����"�������,��������������USA). A reference stream of dry air without CO2��)����� "7$�������������� ��������� � ���)�������������"�������������&"��������"0� ��4�� ��� ���������$�� ���$ ���� ����� ����$� ��� ������������������ ��������� � �����$� ��� ����������"� ����� ����)$��������������� ��������O27�������� ��)�������$������� ��� ������� ��� �����)��������������-ger (model CR23M��6��$ �����������/���,�����������!1��All BMR and TEWL measurements were done during night. We only ���������� �������� ������������������ ������ ������ � � ���)� ��$������ ���� ���� ����� ���� � ��� ���� ���"� )���� +2-consumption and ��)$��������� ������� ����� �����������������������������������9-��from O2-consumption we used equation (2) from Hill (1972) using a conversion factor of 20.1 kJ/ml O2 (Schmidt-Nielsen 1997). TEWL was calculated following Tieleman et al. (20021��4��)������� � �������������"� ��� ���������� ��������� ���������� ����������������the average of these two measurements for further analysis.
Statistical analysis and repeatability calculationWe performed multilevel random effects analyses in MLwiN 2.02, with 2 levels: level 2 was individual and level 1 was measurement. 4����������������/&��������������������� �������������������&��������������������5)����� ���$��(�1����� ��"�������9�������)�����������$ �� ���&$������������/���������� � �������� ��)������������9-��� �4,��
116
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
l)�� � ���������� ���"�� ��������� ����(� �� ����4��/ ��� ����������� ���� �$���� ����"� ����������������)�������/&������������4������������-������ ���� �$���� ����"� ���������������� ����� �������������/&�����-�������9��#)� ��������������������7�����/�����/&�����������5��N�0.05) was used as model selection criterion. We used the likelihood-ratio test and �27��������������(������������������������/������������������(� ������� ��"������ ��)��������(�������� �������� ��)����measurements on the same individual. Understanding the effects of ��"���������(� ����������9-������4,�����������)����������-(������� �;�� ��������$� ��������������(� ���������� ��"���������������������� 7� ���� ��� �����(������ ���$��������8������)��/ ��� �&$�� ��� �������� 7� ���� ��� �����(������ (� ������� ��� ��"��������������������� ���� �$���� ����"���� ��"������$� �����4���������(������������)����� 7�������� �����(������(� ���������� ��"���������������9-������4,����-�� ����"� "�$� ���������� ��"����������(� ���� ��"�������������(�������5-O�(P1�������(�������� ����(� ���� ��"�������������(����������������"��������� ������5-O��(P1�5����������������� ������2006). Because nat-� ���������������"�����������������7�$���/��9-������4,�5�$��#-man 2005, Tieleman et al. 20061��)����������������������7�$���/��(��-���� "���(������9-������4,� "� ��"��������$���� ����"� )��� �����������)���� ���� �;������� �$���� ����"� B� 5��-terindividual variance)/(intraindividual variance + interindividual variance) (Lessells and Boag 19871��4��� ������� ���� ���� 7� ���� ��-traindividual variances from the multilevel models. Standard errors were calculated following Becker (19841���� ��� ���������$� ��(� �-ation in BMR with variation in TEWL, and with variation reported in the literature we calculated interindividual and intraindividual ����/������� ��� (� ������� 56�1� ��� 6�� B� 5������ �� ��(������1:���������� ����(������6��)���� ������� "�/ ����������������(� ����(������per individual and then calculating standard deviation and mean of ����������(�������(� ��������� �����(������6��)���� ������� "������-������������(� �����������(������6�.���)�����)� ��� ������� "���#����standard deviations and means per individual. We compared the in-�� ����(������6�.�����9-������4,������)����J� �51996) and the ��� �����(������6�.��)������4����&��������5�����14). We repeated all statistical calculations using log-transformed values for BMR, TEWL ���� ��"�������9����������������������$ �(������/��������� �� ������������ �� �����9-������ ��"������ 5 2B0.16 vs. r2B0.18) and TEWL ���� ��"������5 2B0.07 vs. r2B0.05), we do not report the results.
117
ResultsBody mass
��$���� ����"� ��� ��"������ ��� �����������)���0.23 ± 0.21, and not �����/����� 5�2
1B1.136�� �B0.291�� ���6�.�� ��� ���� ���� 7� ���� ��� ���-
dividual level equaled 7.9 and 6.4, respectively. This indicates that ���� ��� �7� ���� ���� ����(������ (� ������� ��� ��"������ ����� ��� ��considered when evaluating variation in BMR and TEWL.
Basal metabolic rate4����7� �������9-�������� �����/����� �$���� ����"����0.56, indi-cating that intraindividual variation was relatively small compared )�������� ����(������(� �������5� ���#��; Figure #��A). Inter- and in-� �����(������6�.��)� ��7.7 and 4.8, respectively.4���&$�� �������� �������$���������"���%�������(� ����������9-�����the interindividual (age, sex, hatching location, M[av]) and intraindi-(������5-O��(P1���(����������#��������������������������/���������� ��� ���������������� �$���� ����"����)����7� �������9-���+����������� ��$���������"����� � ������������� ����(������(� ����������)����7� ���-����9-�����������-O�(P������������/������������5<��� ��#��) while ��&���������������������������������(���������/������������5<���#��; � ���#��!1��!��������� �����(��������(����-O��(P������������/�������-fect on variation in BMR (Figure #��D�� ���#��!1���������/�����������)���� �����-O�(P� ����-O��(P�� �$���� ����"� ���9-��)���0.47 ± 0.17 (�2
1B6.057���B0.013).
-���7�$���/��9-��5�����9-����(����� "� ��"�����1������� �����/-����� �$���� ����"� ���0.60� 5� ���#��). Interindividual variation was �����/�����"� ��������� "� ���� 5�2
4B12.696�� �B0.0131� ��� ���� "� ��&�
(�21B0.304���B0.58) and hatching location (�2
1B0.784���B0.38). When
��������� �����)�����������������������������7�$���/��9-�������� �$���� ����"����0.33 ± 0.19 (�2
1B2.676���B0.11).
Total evaporative water loss��$���� ����"����)����7� �������4,�)���0.11 ± 0.21, indicating that intraindividual variation is relatively large compared with inter-����(������(� �������5� ���#��; Figure #��B). Inter- and intraindivid-����6�.��)� ��9.6 and 11.3 respectively.����������������� ���������&�������������������������(� ���� ��"������(M[av]), which could affect interindividual variation in TEWL, and ������ �$���� ����"�������������/�������������������������5� ���#��B;
118
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
lFig 31��-O��(P��)�������������%��������� �����(������(� �������������� ��� �� �$���� ����"�� ������������ �����/����� ������� ��� ����������5� ���#��B; Figure #��). 4����(�����4,� "� ��"�����������������������7�$���/��4,��!���� ��&� ���� ��������� ��������� �������� ��������/����� ����� ��(age: �2
4B5.510�� �B0.24, sex: �2
1B0.460�� �B0.50, hatching location:
�21B2.310���B0.131������ �$���� ����"��������7�$���/��4,�)���0.12
± 0. 21�5� ���#��).
Difference in repeatability between BMR and TEWL���&$�� ��)�"� �$���� ����"������������� �9-������� ���� ���������for TEWL, we compared the interindividual and intraindividual vari-��������$������� ��)����9-������4,��������� ����(������6�����9-��������������� ������/�����"� � ������� ���� ����(������6�����4,�56�����9-�B7.7��6�����4,B9.6��JB0.662���B0.53). How-�(� ��������� �����(������6�����9-��)��������/�����"���)� ������������� �����(������6�����4,�56�����9-�B4.8��6�����4,B11.3, JB�73.027���B0.0021��8������������)� �$���� ����"��� �4,�)�����-� � ��� �������� �����(��"��������� �����(������(� ��������������������relatively low interindividual variation, compared with BMR.
Discussion���������������9-��)����� �$���� ���� ������������� ���� ����������� ����� ��� ����(������� ����� �� �������)���� ��"������ ���� ����� ��� ����with hatching location and sex. In contrast, TEWL was poorly re-$���� ������������������(� "�)���� ��"������������������������������� ���&��9��"�������������)���$�� �"� �$���� ���������������������$�$�-lation as well, indicating that it varied more within than among in-dividuals. In the following section, we will compare our results with /������� � ������� � ��������� �%���� ���$���� ������� �"���������-nisms, and discuss repercussions for the evolutionary potential of these physiological traits. +� �������������� �$���� ����"��� �9-���������������������)���������� �����$ �(�����"� �$� ������ � � �������� ��������������������8 out of 10 $�$������������)�����9-����� �$���� ���5� ���#��). The interindivid-��������/���������(� �������56�1��������������9-��)������� ����� "�)�������$� ���)�������� � � ��$�$������������ $ ������"�� ���� �)��$�$����������� �)��������� �$���� ����"����9-��)������7�����/�����
16 20 24 28
BMR(kJ/day)
A
0.8 1.2 1.6
2.0
TEWL(ml/day)
B
individual
119
V�
2..
P
AA
4.557
10.03
D
14.1051
<0.001H
0.803
10.37
A
12.7644
0.01S
0.300
10.58
BA
0.512
10.47
D
0.0731
0.79H
0.878
10.35
A
4.0944
0.39S
2.3421
0.17
�2-Values are based on a m
odel including all significant factors.
Table 6.2 – Values of �
2, degrees of freedom (d.f.) and P-values for factors
which possibly explained variation in (A
) BMR and (B) TEW
L.
Figure 6.1 – Variation in m
easurements of (A
.) whole-organism
BMR
and (B) whole-organism
TEWL per individual. Sym
bols with error
bars represent means ± S.E. G
rey symbols depict separate m
easure-
ments on the sam
e individual. Individuals are listed in random order.
120
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
l������������������������� ����(������6����������������������������)��$�$��������� ���� ���"� ���� (� ������� ������ ����(������� ��� ����� ����(� �������)������ ����(�������)��� �� ������$���� ����"����4,�)���also within the range of reported values, resulting in 2 out of 6 avian $�$������������)�����4,���� �$���� ���������������������� �����-(������6�����4,��&������� ���������9-���8���� ��� �����(������(� ����������4,�)��� ��$���� ����� ���)�������������� �$���� ����"����$���� ����"�������������������� ����������� �7����(������(� �������5����� �(�1��8������������ �����(������(� ����������������� ��������� ���"�high, the power for detecting individual consistency is low, unless in-terindividual variation is very high as in some species of larks shown ���� ���#��������������������������� ����(������6�����4,�)�������lowest reported so far, and the study has consequently low power for concluding that TEWL is inconsistent within individuals. Body mass ���)��� ��)� �������7�����/����� �$���� ����"�� ��� ��$��(��� �$����������������)������������������� ����������� ��"����������������"��"-������� ����5$� ������� �� (�����1�������� �����(���������� ������������� ������������� � �"����)�������� ���������������������&$� ��������� ���� ����(������ (� ������� ��� 9-�� )��� �� � �� ������� � ��� $� ���&$������� "������)�� ����4,�)������� �����/�����"� ��������� "�this factor (Figure #��). Older stonechats had a higher BMR. This result is in contrast with the only three other studies that investigated ���������������� ��)������������9-����� � �����)�����)�������������� ������������ ��)����9-�� ���� ���� 59���#�� � ��� ����2005, Moe et al. 2007) and one found a decrease with age (Broggi et al. 2007). ������������������ �������������������������� ��)��������������-�� �����������(� ������������������58� $� �1998, Even et al. 2001, Speakman et al. 2002, 20041��!������������ ��)���������������� -������ ��� ������ �������� � �� ��� � ����� ��� ����� �� ����� ��� ���7 ������������������ ��"����$�������������������������(��"�� �����������(���� �"���������� ����(�������)��������� �������� ����� ������ ��� � �� �����-$�����"����� ���������� ���$���� ��� ����� ����� �$�$�����������7 ��������������(������������ ����� � ���)������)����� ����� ����Body mass did not correlate with TEWL at the inter- or intraindivid-ual level in our stonechat population; yet, it did correlate with BMR. ���(� ���������� ��"����������9-��)����������(���������"� ����-� � ��� ����������������� ��"����$���������������$������"����������0������ �����)���� �����(��"������ ��(����������� ������� ��������#����"�and liver (Kersten and Piersma 1987, Daan et al. 1990, Piersma et
16
20
24
28 A
1.0
1.2
1.4
1.6 B
age
0 1 2 3 4
TEW
L (m
l/day
)BM
R (k
J/day
)%
varia
nce
1.0
BMR TEWL
Explained by age and
body mass
Explained by body mass
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
121
Figure 6.2 – (A) BMR and (B) TEWL in relation to age. Triangles represent average BMR and
average TEWL of individuals.
Figure 6.3 – Partitioned variances of BMR and TEWL and the factors that significantly ex-
plained part of the variances. White is the variance among individuals, grey is the variance
within individuals. 39% of the within-individual variance and 14% of the among-individual
variance was explained by body mass, and 50% of the among individual variance of BMR was
explained by age.
122
Ch
apter v
i | R
epeatability of bm
r an
d tew
lal. 19961��8�)�(� ��)������� ��������������������)����������&������(additional) changes at the tissue level, such as mitochondrial density and function, to explain variation in BMR.<� ����� �������������������������� �������������� ��(� �� �����������-��(�������� ������� ���� ����������� ������������(�������������(������-������ ��#� �����5<������ �����-��#�"�19961��!������������/ ����)��of these criteria are met for BMR in most avian populations studied, including the stonechats of this study, and for TEWL in a third of �����(����$�$�������������������&�����������������������5� ���#��). The next step in understanding the potential for selection in these $�"������������ �������� � ����������"������ ��� ����"��)���������� ����� ��������������������58�"����������1998, Johnson 2000, Nespolo et al. 2003, Ksiazek et al. 20041��������"����� � ���$������5�?������et al. 20071��!��������������������������� �������������������� ������� �9-������ ���&� �$���������� � ���������� ���5����������?���������al. 2005), we can conclude that an evolutionary interpretation of the mechanisms underlying variation in BMR, for example among sea-sons and populations, is appropriate. TEWL is as yet a less studied � ������� � ��������� �� �$���� ����"����������������� ����$�$��������������(� ������ ����������$����)���� ����������������� ���� ��(�������-ary understanding of this trait.
AcknowledgementsWe thank the technical staff, especially W. Jensen and E. Koch, and the animal care takers of the Max Planck institute of Ornithology. E. Croese was a great help with the planning of all the measurements. 4������#�������$������ ���$$�"������������������� �������� ���������������������������� ���������7����"�������������"�)�����$$� ���� "������7� ����� ������������ ������+ ������������� ��������/����-search to B.I.T.
123
124
CHAPTER VII
O�������������������������$������������������approaches help unravel the complexity of the
immune system in an ecological context
�� � ���-��9����� ���-���#��!���� �������, Kevin D. Matson, B. Irene Tieleman
� ���������� ������ � ������;����"���������)� #��
PLoS ONE 6: e18592 (2011)
AbstractThe immune system is a complex collection of interrelated and over-��$$���������������������$ � �����������������������)������������-plexity, researchers have devised multiple ways to measure immune ��������������������"0������ �����������������������)�"� ����� ���-��������� ���� ��� ����$��"����"��������� ������(�������$��&�$ � -lem. One challenge facing ecological immunologists is the question �����)����������"����������������������������������� ���"����-sized to facilitate meaningful interpretations and conclusions. We ���#��� ����� ���������� "� ��$��"���� ���� ���$� ���� ��(� ��� ��������-�������������)�����)��������������������$������� ������)������$���aspects of immune function are related at different organizational levels. We analyzed three distinct datasets that characterized 1) spe-cies, 21� �� �$������� ����3) among- and within-individual level dif-ferences in the relationships among multiple immune indices. Spe-��/����"�� )�� ����� ������� $ ����$��� ���$������� ����"���� 56�6!1�and two simpler approaches, pair-wise correlations and correlation circles. We also provide a simple example of how these techniques
125
������ ������� �������"0������� � ��������$��� ���������+� �/�������lead to several general conclusions. First, relationships among indi-���� ��� ������� �����������"� �� ����������� ������ ����� � ����0�-�������� ��$��5�������������(� �������������"���1� ����������� ��5������$�����1D���� ��� ����"������$������������������"� �;�� ����������� �-fore further analyses. Second, simple statistical techniques used in ���=��������)������ �����$��&������(� ���������������(�������� � ������� �� � ���� $���� �� ��� ������� ��������� ����� ������ ���$��&�statistics alone. Moreover, these simpler approaches have potential �� � ����"0���� ���$� � ��� ����� � ��������$��� ��������� ��$������"� �������/���������������������������"���(�����)� ���� ���� ��������-logical standardization.
IntroductionBackground: One problem, many solutions
The immune system is a complex collection of interrelated and �(� ��$$���� ���������� ��� ���� $ � ���� ��� ��������� ��� ���� (� �� ����immune system these solutions include relatively general and con-������"������������ 5������� (� �� ��1� ��������� ����� ��� �� ������������#��"��������������� � ����$ �������5����������(���������������-�"1������ ��� ����������� ��$����������������(� ��������#����� ���(-iours (induced innate immunity), and more specific and induced ��$������������������$ ���������������� ������ "�97������5��������acquired immunity; (Murphy et al. 2008)). Organisms employ these multiple mechanisms to prevent and limit the effects of disease. Im-���������������$��&��"����)�(� ��$ ���������$ � ������ � ���� ��-ers interested in studying immune function in an ecological con-��&�� �������(� ��������������������������������� �������������"�captured using a single measure (Adamo 2004, Martin et al. 2006, Matson et al. 2006a, Lee 2006). Furthermore, incongruence is of-���������� ��)��������� ���������������������(���)���������������study. For example, in house sparrows (Passer domesticus) phyto-���������������5�8!1���������)����)� ��)����������$�����(��"��� - �������)������ (�(����)������$����������� ������ �������$� ��� �����cell challenge (SRBC) are negatively correlated with survival (Gon-zalez et al. 1999, and see Buehler et al. 2010 for a review of other �&��$���1�� ���� ������ ������ ������ ��� $���� ��� � ���7����� )������the immune system (see examples in (Lee 2006)). Over the past few
126
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
"�� ��� ����������� �������������� ��(�� �����$���� ��� ���� � ���� -�����������������������$��&��"� "���(���$�������������������$���methods to measure immune function and to analyze the resulting ������ ����� ������� ���� ���� ��� ��� ���� � �������� �� "��$$�"���������$���������������������$��&�$ � ����������$$ ��������� ������������&�������$ �� ����� ��������� ��0��������"���������� ���������function and providing appropriate statistical tools to analyse these data have proven difficult. To understand how ecological immunology achieved its current sta-tus, it is useful to review why ecologists study immunology and what led them to devise multiple ways to measure immune function. First, ecologists are interested in understanding natural variation in im-�������������������(��������������(� �������� ���������7 ���/��$� -spective within an ecological and evolutionary context (Sheldon and �� ������19961���������� ���������������"������� ���������������-sional, ecologists often want or need to quantify multiple aspects of immune function to fully answer a research question. Furthermore, for practical and philosophical reasons, ecologists are interested in )���������������������5�����"1����� ���&�������������� �������������(� �� �������)��������������(� "�����$�������"���������� ������-ured separately (Matson et al. 2006a). Third, ecologists are interest-ed in whether relationships among aspects of immune function are �����������)�������������� ���0� �������������� ����� ����0��������levels (e.g. from one individual, species, time point or environment to another). Some researchers suggest that selection or constraint may result in consistently correlated axes of immune defence (sensu Piersma 1997, Ricklefs and Wikelski 2002), while others suggest that %�&� ����"���"� ��$� ����������������$���/���"$������$������������� �� �� ��������������� ������$�������� �������������������� �������in different circumstances (Lee 2006, Buehler et al. 2010). In this paper, we explore the usefulness of several statistical approaches for ��� ������������������������� ��$������� �(���������$$ �����������������$������� ������)������$�����$������������������������� �� �-lated among different organizational levels.The field of ecological immunology needs analytical tools that can simultaneously summarize variation in multiple measures of im-mune function. Few studies have empirically examined relation-���$���������������������������������������� ������������"������"�� ������ ���� � ���7����� � �� ������ ����� ��� ���� ��� ������-
127
logical knowledge from humans, domesticated animals and other model systems (reviewed in Lee 2006, Clark 2008, Murphy et al. 2008, Buehler et al. 2010) or rooted in life history hypotheses (e.g. Ricklefs and Wikelski 2002). When undertaken, multivariate stud-ies in ecological immunology often apply different statistical ap-proaches and include different immune indices. For example, sim-$��� �� ��������� ��(�� ���� ����� ��� �&������ ����������$�� ������aspects of immune function (Mendes et al. 2006, Sparkman and Palacios 2009) and among measures of immune function and an-tioxidants (Hõrak et al. 2006, 2007). Principle component analysis 5�6!������� ���%����� �������� "����� �(�������1����� ���������to examine relationships among immune indices within an axis of immune function (e.g. constitutive immunity Matson et al. 2006a, Buehler et al. 2008 �� 2008c, 2009) and among multiple axes of immune function (Martin et al. 2007). Thus, the field of ecologi-cal immunology lacks a statistical protocol for analysing and sum-marizing variation in multiple measures of immune function. This ����"������ ��$� ��� "� ��������� ���;��� ��� ����� ������� ������ � ��$����(�� �����������(��"� ��������� ��&��$���)���� �������������$���morphological traits (e.g. Ackermann and Cheverud 2000, McCoy et al. 2006) and when relating multiple genotypic and phenotypic (� �� ����5�����8�����2009).���������������$�)� ����������������������;���������$���� �������������������"0���������$������������������� ���� ������� ��������������$$����-tion of multivariate tools. For example, PCA and structural equation modelling (SEM, Tomarken and Waller 20051����� �����������&��-ine how immune indices are correlated within a single group, and common principal components analysis (CPCA, Flury 1988, Phillips and Arnold 19991����� �����������&������)����� ����������� ������in the same way among multiple groups. However, in order to employ these methods across multiple studies, the same aspects of immune ����������������� ������� ����<� ��� �� �������6!�� ��-�� ����� �������)���������������� ���������������5����� � ��1������������$������������� ����� ��$��5������$�����1���������� ��������������� ����������$��among immune indices are the same in the different groups. To our #��)�������-��������� "��� ��������� ��� ���������&����� �����������immunology, and although ecological immunologists have used PCA; the next step – using CPCA to test whether immune indices �� ������������������)�"�������� ��$��E���������"��� ������#����4��
128
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
explore the usefulness of CPCA in this paper, and we illustrate the value of statistically simpler methods, such as pair-wise correlations, as complements to complex multivariate techniques. Although we do ���������-��)����������$�$� �)������ �������������������������� ��$����������� ���(��������/������ )� ��
Principal component analysis (PCA) and its assumptions� ����$������$����������"����������������������� �(�������� ���� �-���������������� �������(� �� ������������������������� �0��(� �������(Quinn and Keough 2002��! ��� ����4��������20101���6!����� ���������� ���������"�(� �� ���� ��� ��)� ��� �(���(� �� ���� 5$ ����$������$������� � � �6�1�� )����� ���� ����� �� ����� ��� �� ��� � ����"������6!���������� �����������������"���(� ��������������� ��������)��(� �� ����� ���������� �������������� ��(�� ������6!� ��� ����� �0��data taken from multiple measures of immune function and to ex-amine how the PCs vary over the annual cycle (Buehler et al. 2008c), ��)��������(�������� �� ���������5-�������������2006a, Buehler et al. 2008c, 2009), and among species (Matson et al. 2006a, Martin et al. 2007). However, determining relationships among indices at these different organizational levels often requires pooling data from different groups (e.g. individuals in different months). PCA provides a multivariate description of data structure within a single group, not among multiple groups (McCoy et al. 2006). Previ-����"����������������������������� ����������)���� "�$� ����������(� ��-tion into different levels (i.e. among species and among individuals (Matson et al. 2006a), or among individuals and over time (Buehler et al. 2008c). For example, variation in indices of immune function ���� �������� � ���������������5���������(�������� �������1� �����-ing to multiple groups (i.e. species (Matson et al. 2006a) or individu-als (Buehler et al. 2008�11� "�$��������� ����� ��$������������������� -����� ��$���/���������8�)�(� �� ����� �$$ ������������� ����� ����������(� "������� �"������������ ��$���������#���$������ ��������������our knowledge this assumption remains untested in the context of ecological immunology. Testing this assumption will provide new in-sight into immunological covariation. Consistent relationships may ��������� $�"����������� ����� ������� )����� �� ���� ����������$�� ������have different interpretations depending on the organizational level 5������$�����7�$���/������������$ ���� ��������(�����7�$���/����������� ���������������7�$���/�� ��$�����1��
129
Testing this assumption��(� ��� �������� � �� �(���� ��� �� � �������� ����� �����$������ <� ����6�6!� ��� ��$ ����� �� ����� ������)����� � (� �� ���� ��(� "� ����� ����-lar way in different groups. CPCA determines whether the variance-covariance matrices among groups are structurally similar, and the method differentiates among degrees of matrix similarity. Immune indices could covary in a similar way among groups (i.e. the matrices � ���;���1�������������������������(� "������������ �)�"�� ���)����the strength of covariation differing among groups (i.e. the matrices are proportional). Some immune indices could covary in a similar way while others covary differently among groups (i.e. the matrices ��� ������� ������������6�1��<�����"��������� ����������� �����$�����"�unrelated (Flury 1988, Phillips and Arnold 1999). CPCA can serve ��� �� $�)� ���� ������������ ������ ��� ��(� ��� ��(����� ������� �� ��#��������������� ������)������#���� �������������� $ ��������� ��������CPCA (Houle et al. 2002). CPCA, like PCA, assumes that relation-ships among the PCs are orthogonal. However, in ecology it is often unrealistic to assume that the underlying causes of the data struc-ture are completely independent. For example, covariation in indices ��� ������� �����������"� �� ��������� "� �� ����� ������� ��������)����� ��"� ��� �� �� �� �� ������� )���� ���� ������ �� <� ��� �� ���when CPCA determines that PCs are not common among groups, the analysis does not identify which or how particular relationships � �(� �� ����� ���������������58������������2002). In light of the limitations of CPCA, it is also useful to employ simple pair-wise correlations. To summarize correlations, we plot correlation ����/��������������������� �&$����������������� ������������/�������individually allows for visual evaluation of whether particular groups � �� ������ ��� � �)���7������ ������������������ ��� �&$����� ����)�� �� �a simple visual examination of how pairs of indices are related in general (the mean correlation) and whether correlations are consist-����������� ��$��� ��(� ������5����)������������ �&�������)���#� �1�!� /���� �$$ ����� ��� ��� �� "� ���� ��$� ���� �6!�� ���� $���� ��$� ������ �������� �� ����� �� � ����� � ��$�� �� � �&��$��� �$������� �� �$�������individual or time points. In a correlation circle, all of the original (� �� ���� ��������� ��� �� �6!� � �� $������� �������� �)�� ��� ���� $ ����-pal components, which are represented as the x- and y-axes. Using a simple, hypothetical dataset with only two immune indices and two groups, Figure %���������� �������)� ���������� �������� �� ���� -
130
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
$ ���������5�1� ���� ����������$�� ��)��������(� �� ����� �������� � ��������)��� ��$������5 1����"������ �����)������������5�1����"�� ���$-posite. The fourth panel of Figure %�� highlights how important pat-�� �����"� ����������5 1�� ��������5�1�)����� ��$��� ��$�������6� -relation circles allow for graphical examination of the relationships among indices, and the consistency of these relationships among groups and over time. This approach can supplement the pair-wise correlation approach. While that approach allows simultaneous eval-���������� �(� ����� ����������$���������$� �����6!�������� ��������circles allow for simultaneous examination of covariation among multiple immune indices. We used these three methods to test the assumption of consistent ����������$�������������������������������$��������� �$������� ��-��(�������������$� �����(�����4������"����������$� ������������)��$ �(�����"�$� ������������(� ����������������� ���������������*� 51) multiple species of waterfowl at a single time point (Matson et al. 2006a), (21������$����� �$�����������$���� ����5�� ������������������$-ter 2) during a single season and (3) multiple individuals of a single ��� � � ���$�������(� �������������"����59����� ��������2008c).
MethodsDatasets
Matson et al. (2006a) measured 13 indices of immune function in 10��$���������)��� ��)��������/(������ ���$ �������*���� � ���������-tivity, leukocyte concentrations, hemolysis-hemagglutination titers, ��$����� ��7��#��������� ����������������&��������$����"�����-������et al. (2006�1����������)� ���$���������$�����7 ���������������� �����-����� ����������$�����0���)������������$������������������)��� ��6!���������������(� �� ��������������������"�����������������"�)�� ��� �������� �����"���� ���/(�� �������� ������������������ �(��� � ���$���������$���*� ��� � ������� ��$����"� ��� $������ �������� Escherichia coli and Staphylococcus aureus (anti-E.coli and anti-S. aureus capaci-����1D������"����������������������������� ���������� � ��� ��� ����������D�������$����� ��7��#��������� ������5����� ���%����� �� �(��-tions). We omitted hemolysis and hemagglutination titers against � ���� ���������������� ���� ��� ���������"� � ��� ��������� �������� �������� � ��� �������(��(� "������� � �������5-�������������2006a). We omitted antioxidant capacity in order to limit the examined indi-
131
S T
PCA Principal components analysisCPCA Common principal components analysisSEM Structural equation modeling
W
ALCG Aleutian Canada gooseNABD North American black duckCHPT Chilean pintailSGPT South Georgia pintailLATE Laysan tealMUSC Muscovy duckNENE Nene or Hawaiian gooseWWWD White-winged wood duck
S
KXE Cross between Kazakh and European stonechatsEXK Cross between European and Kenyan stonechats
I
H Heterophil concentrationE Eosinophil concentrationL Lymphocyte concentrationM Monocyte concentrationMCS Microbicidal capacity against S. aureusMCC Microbicidal capacity against C. albicansMCE Microbicidal capacity against E.coliL Complement mediated lysisA Natural antibody mediated agglutinationH Haptoglobin-like activity
Table 7.1 – Abbreviations used in the text, tables and figures.
132
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
ces to those with a primarily immunological function. We excluded �)��������������$������ ����������$�����0���5�B2������B1) were not �� ���������� ��� ���)�����7�$�������6!���� ��� ��� ����/��������-set included eight species: Aleutian Canada goose, Branta canaden-sis leucopareica� 5!,6'�� �B71D� �� ��� !�� ����� ���#� ���#�� Anas rubripes� 5�!9��� �B6); Chilean pintail, Anas georgica spinicauda 568����B8); South Georgia pintail, Anas georgica georgica (SGPT, �B8); Laysan teal, Anas laysanensis� 5,!�� �B8); Muscovy duck, Cairina moschata� 5-��6�� �B5); nene or Hawaiian goose, Branta sandvicensis�5�����B8); white-winged wood duck, Cairina scutu-lata� 5444����B8��� ���%��). Although we also analysed the cel-lular indices of immune function, these results are presented in the supplementary material only.�� ��������������5���$�� �2) measured six indices of immune function ������ ��� �$�����������)���" ���$�$��������������$��(���������������������� ������� ���$ �������*���� � ���������$����"���������E. coli, S. aureus and Candida albicans, hemolysis-hemagglutination titers ������$����� ��7��#������(��"��!�������(�������)� ������� ����� ����a single quiescent period in the annual cycle (winter). The geograph-�����"7��������� �� �$������ � ��������� � ��� ��0�#������ 5Saxicola torquata maura���B10), Europe (S. t. rubicola���B15), Kenya (S. t. ax-illaris���B13) and Ireland (S. t. hibernans���B161������" ����)� ��� ������ ��)������0�#������� �$���������������5��0M� ���B12) ����� �$�����������"��� ����������� 5� M������B20��� ���%��). 8" ���� ��$��� ��������� ��� ��� ����������� �$�������� ����$�����"��Buehler et al. (2008c) measured 14 indices of immune function in red knots (Calidris canutus1��������� ������� ���$ �������*���� � �������capacity, leukocyte concentrations and hemolysis-hemagglutination titers. We restricted our analyses to the 27� � �������� ����(� �����entire study period of 11 consecutive months. We also restricted our analyses to eight indices of immune function: a single time point in �� ����� ������� ���� � ���������$��������5E. coli after 10 min, C. al-bicans after 60 min and S. aureus after 120 min); concentrations of heterophils, lymphocytes and monocytes; and hemolysis and he-������������������� ���������� � ��� ��� ��������������������#��"���concentrations were excluded since they are the sum of the differen-tial concentrations; eosinophil concentrations were excluded due to a �� ������ � ����0�(�����D��� �� ��"���������� �������)� ���&������� ������� ������������� �������������"�;�����/��� "�������������4��
Group 1Group 2
AIn
dex
2Group 1
PC2
Group 2 Combined
B
Inde
x 2
PC2
C
Index 1
Inde
x 2
PC1
PC2
PC1 PC1
133
Figure 7.1 – Simplified scenarios illustrating how correlation circles can be inter-
preted when relationships between variables among groups are similar (a), dissimi-
lar (b), or opposite (c).
The first vertical panel consists of a scatterplot showing the correlation between
two indices in two groups (e.g. species, individuals or months). The next two panels
show the resulting correlation circles for the two groups separately. The fourth pan-
el shows the relationship given when the two groups are combined, and highlights
how important patterns may be diluted (B), or missed (C). In the correlation circles,
vectors are loadings for the two indices of immune function. The angle between
two vectors gives the degree of correlation (adjacent = highly correlated, orthogo-
nal (90°) = uncorrelated, and opposite (180°) = negatively correlated).
134
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
used the transformed leukocyte concentration data to ensure nor-mality and to maintain consistency with Buehler et al. (2008c).Anti-E. coli and anti-S. aureus capacities were measured in all three ���������� ��� ���� ������� � ������ ���� ��"� ���$� � ����-������ ��� ����(2006�1� ����� $�������)����� ���������� ������� � ������� ��$����"� ������� ��� ��������$��������������9����� ��������52008�1������� �������et al. (chapter 21������)����� ������)�����$���������"� �%������������� "� ����������� �5�����$�����"�����1��������� ������$�������
Statistical methodsCommon principal component analysis (CPCA): A statistical test of matrix similarity. Common principal component analysis is an ex-tension of PCA that compares the structure of two or more covari-�������� ����� ��� �� ��� � ������� ��������� ���� ��� � ��"� ��� ����� ���the recognition that any two matrices can relate to one another in a complex fashion and that the two are not simply equal or unequal. CPCA determines whether matrices are equal, proportional, share �� ��� � � ��� $ ����$��� ���$�������� � � � �� �� �������� ��� ��� � �of principal components shared can range from one to p-2, where p ��� ������� � ���� (� �� �����6�6!� ��������� �)���$$ �������Q����������7 �������� �$$ ����� ���� ���� ���$7�$� �$$ �����Q� ��� �������"������������#��"� ����������$����������� ������������������� ���������$$ ���������� �����������������������)����������)����!#��#������ -mation criterion (AIC). In the step-up approach, a null-hypothesis is iteratively compared to an alternative hypothesis. The compared ������� � �� ������� � �������� � ��"��)����� ������)���� �)���� �-lated matrices, and progresses through matrices that share one PC, that share more than one (up to p-2) PC, that are proportional, and, /����"�� ����� � �� �;����� ��� ����������� ��� ��)�"�� ������� �������� ������� ����(���������������$������ � ��� ������� � ��"��!������/������7(���������������� ��������������� ���� ����� � ������������5������$��and Arnold 1999).We used the program CPC (Phillips 2000), which performs the anal-"���� ���� � ��� "�<�� "� 5<�� "�1988), to carry out CPCA. We used �� ����������� ����� ���� ��������(� ��������� ����� �������)��)� ������ ������ ��� ���� ����������$� ��)������������ ����$���������� ���� �� �������(�������4��������������� ����������� ������� �������$��������� �$�����������(�����������������<� ��������$� ����������������-(���������������������������������������)� �������� ��������� �-
135
���������� �����)� ������� ������$� � � ��� �$� ������� ��$����(��"����� 6�6!� ��� $������ �������� �� � )��� ��)�� �$������ )��� ����� �����(������ �����)������&����������� �� (�������$� ���� �&�5����-��6��$������)����&�������������� ��)���(�������(� �� ����"� �������� ��� �������������&1D�����6�6!���������������� �$������)��� ����������&�matrices with 12 to 20� � �� (������� ����D� ����6�6!���� ����(������ ���#�����)��� ��������27 matrices with 11�� �� (�����������D�����the CPCA of ���#������(� ������)��� ��������11 matrices with 27 � �� (������������
Pair-wise correlations and boxplots – We calculated Pearson correla-���������/��������� �����$�� �������������������������� ������������-/�������� ��$ ����������� �&$������� ������$�� �����������������$� ����-�� ���(����������"����5������$��������� �$�����������(����������������1��<� ��&��$������������$��������(��������� �&�)����)���#� �� �$ ����������� ���� � ������ ��� ������ �$�����7�$���/�� �� ��������� ���� ����� �� - �������� ��� ��������5 to 8 individuals. Furthermore, we calculated 95K����/���������� (��������$� �� �����7����������&������)����� ������������ ������������/��������� ������$�� 7)�������$� ��������-�� ��������/�����"�� ���0� ��5���� �������������� ������$������$� �-sons using a sequential Bonferroni correction (Rice 1989)). Because �� ������������/�������� �������� ����"����� � ������)��� ����� ����the correlations into z-scores (Sokal and Rohlf 1995, page 5781� �-fore carrying out the t-tests. For waterfowl and stonechats, sample ��0��� ����� ��� ������ �$������ � � �� �$������� �� ��� ���)�� ��������-���)������� �����������$��� ��0��� ��� �������)�"� ����� ����� ��$� 5� �groups) with the largest sample size were given a weight of 1 (adapt-ed from Sokal and Rohlf 1995, page 42). We multiplied the z-trans-�� ������ ������������/�������)����������)����������� �����)��������correlations. Using these weighted correlations, we calculated means ���� (� ������� ����$� �� ���� �7������ 5�� B� ������� � � ��� � ��$�� ���the analysis). T-tests performed on weighted and unweighted correla-������ ����������������� �������������� �&$����������� ��������)�����������7����������)��������������� ������������������"���������� ���-������5)���������� �&:)���#� �1�����)����� �� ������������ �������������� ��������/�����"�� ���0� ���<�����"���� ������������/�������)� ��$�����������(������"�������$��������������� "��$��������� �$�������� �2�� $�$�������3�5������ ��������� ��$�� ����������������������#�����(Buehler et al. 2008c)). These dotplots were examined for clustering
136
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
���$�������)����� ����)������ ��� �&$�� �� ����$���� ����"� ��� ������������� ����������������� ��� ���� ������<� ��&��$������������� ������������/��������� �0� ��������)���� �&�����)���#� �������� �� ���� �-����� ��� �)�� �������� �����$�����(��"� �� ������� ��� ������ ��$�� ����negatively correlated (or consistently uncorrelated) in other groups. Pearson correlations, plots and t-tests were performed using R (R de-velopment core team 2010).
Within-group principal component analysis (PCA) and correlation circles – We carried out separate PCAs and plotted a separate cor-relation circle for each group at each organizational level (species, �� �$������� ����(������ � � �����$����1�� ��� ����� ����"� �&������ ����relationships among indices and among groups. This analysis allows the examination of multiple dimensions at once (i.e. immune indi-���1�� �������$��������������������������������������������� ������� ���in all groups. PCAs were performed and correlation circles were generated using the ade4 package in R (Dray and Dufour 2007). In every correlation �� ��������������� ���(� �� ���������)�������(���� ��)�������������������� ������� ������������� ����������$�� ��)������������� ���(� �� ��� ���� �)���6�� 5(���� � ������1� ����)����� � ������ �������-���$��� ��$�����(��� �������(��5(���� ��� ������1����������� ��)�����)��(���� ����������������� �������� �������� ��)�����)������� ���(� �� �����!� ���������������������������)��(� �� ����� �����$�����"�uncorrelated; zero or 180���� ���� ��)�����)��(� �� ��������������complete positive or negative correlation. Consistent relationships among groups at a particular level (i.e. species, individual, month) � ������������ "������� ������������������(���� ���������� ������ -relation circles. While we only show correlation circles with PC1 and PC2��)���&��������� ���������� ����� �� ����� ��� ������������PCs 1 to 4 (not shown). Unless otherwise stated, all correlation cir-cles resulted in the same conclusions as those showing PC1 and PC2 alone. 4�� ����� �����6!����� ���� ����� �� ����������� ���������� �� � ����CPCA. Unlike Matson et al. (2006a) and Buehler et al. (2008c), we ���������� ������ �� (� ���&� �������� �������)��)������ ��� ��������������$� ����� ��)���� ���� �6!�� ���� ����6�6!�� 5)����� �$� ���� ����� �������(�����1����(� ���������)��������������������&��� ������������ ��$7�$���/���� ���������� �������� �%���������6�� ���������� ���
137
H
H L �2 .. P AIC
E P 0.570 6 0.9969 126.0P CPC 62.021 24 <0.0001 137.4CPC CPC(3) 4.524 6 0.6062 123.4CPC(3) CPC(2) 19.496 12 0.0772 130.9CPC(2) CPC(1) 15.393 18 0.6348 135.4CPC(1) U 23.977 24 0.4629 156.0U --- 180.0
Table 7.2 – Common principal components analysis (CPCA) of covariance matrices among
waterfowl species for plasma-based indices of immune function.
The Table shows Flury’s Decomposition of Chi Square using step-up and model building
approaches (Flury 1988, Phillips and Arnold 1999). In the step-up approach at each step
in the hierarchy the hypothesis labeled “higher” is tested against the hypothesis on the
step below, “lower”. The hierarchy is built in a step-wise fashion starting with no relation
between the matrices (Unrelated) and rising to CPC(1), then CPC(2), etc, through CPC,
Proportionality, and Equality. The likelihood that a particular model is valid is given by the
P-value, thus low P-values indicate a low probability that the higher model is better than
the lower model (Phillips and Arnold 1999). The best solution can also be evaluated using
the model building approach where the best model is indicated as the “higher” model in
the row with the lowest Akaike information criterion (AIC). Both methods indicate that the
matrices share all PCs in common but have different eignevalues (CPC)
138
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
the previous varimax-rotated PCA performed with all species, indi-(�������� ����������� ������!�������������� �$������ �$ ���������������������$�����"����$� � ��� ������� ��������������������6����$�-��������������� ��)����(���� ��������������� ����������$� ��)��������(� �� ������� ���� ������������� ��������6!����� ��� ����������$ �(�-ous analysis and the current analysis are in agreement, then indices ��(���������������������������� �������� ���������� �5���$�����(��"�correlated) or in opposition (if negatively correlated), at least in the ��=� ��"�����������
ResultsCommon principal component analysis (CPCA)
!����� )��� ��)�� �$������� ���� 6�6!� �$$ ������� ���������� ���-$�������� ����� ���� ��)��������� ���������(�������� � ������ �$������56�6D�� ���%��1������������ ����$�������56�6D�� ���!%��). Among ������������ �$������������)���$$ ������������������������"������ ����structures for plasma components. The step-up approach suggested complete shared structure with differing eigenvalues (CPC), and the ������ �������� �$$ ����� ���������� �;�����"� ��������� ����� 5�- ���%��). Among red knot individuals, the two approaches to CPCA �������� ��� ���� ����� �&� ���� $���� ��� ���� ���������� ��� ���$7�$�approach suggested that the matrices were unrelated, whereas the ������ ���������$$ ��������������������������� �����)� ���;����5�- ���%��). Finally, among months in individual red knots, the step-up �$$ ��������������������������� �������� ��������6�� ������������ ���������(������56�61���������������7 ���������$$ ��������������������������� �����)� ���;����5� ���%�").
Pair-wise correlations and boxplots9�&� ���� )���#� � $����� ��� )��� ��)�� �$�����7�$���/�� �� ������������/������� )� �� )���� 5������� �R�� B� 0.471�� �&� )������ (� ����(0.14<IQR<0.711�� ���� ���� �� �)���� �&� �&�� ����� ��� ������ � 5<��-ure %��D� ���� � ��� %��� �� � ������� ����&� � �(�������1�� <� ��� -more, 95K����/���������� (���������7���������������������������������������� ������������/������������ ��������/�����"�� ���0� ��5� ����A%��1��6�� ������ ������ ������� �������� ����� ��� �������������$�� �����immune indices are weakly and inconsistently correlated among )��� ��)�� �$������� ��� 7)���� �� ��������� ������ ���������� �� �$�-
139
H
H L �2 .. P AIC
E P 1.015 5 0.9614 103.7P CPC 47.044 25 0.0048 112.7CPC CPC(4) 8.443 5 0.1335 115.6CPC(4) CPC(3) 4.514 10 0.9212 117.2CPC(3) CPC(2) 10.241 15 0.8043 132.7CPC(2) CPC(1) 13.959 20 0.8326 152.4CPC(1) U 18.464 25 0.8221 178.5U --- 210.0
Table 7.3 – Common principal components analysis (CPCA) of covariance matrices
among stonechat subspecies.
The step-up approach (where a low p-value indicates a low probability that the higher
model is better than the lower model) suggests that covariance matrices among sub-
species share all PCs, but have differing eigenvalues (CPC), and the model building
approach (where the lowest AIC value indicates the best model) suggests that the
matrices are equal (see Table 1 for a complete description of the step-up and model
building approaches).
Table 7.4 – Common principal components analysis (CPCA) of covariance matrices con-
taining indices of immune function among individual red knots.
H
H L �2 .. P AIC
E P 6.978 26 0.9999 1464.2P CPC 281.317 182 <0.0001 1509.3CPC CPC(6) 33.538 26 0.1471 1591.9CPC(6) CPC(5) 64.881 52 0.1083 1610.4CPC(5) CPC(4) 88.281 78 0.1998 1649.5CPC(4) CPC(3) 152.434 104 0.0014 1717.2CPC(3) CPC(2) 214.075 130 <0.0001 1772.8CPC(2) CPC(1) 304.889 156 <0.0001 1818.7CPC(1) U 317.835 182 <0.0001 1825.8U --- 1872.0
140
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
����� ���)��� �������"� ����� (� �� ����"� ����� ������ )��� ��)�� �$������(0.12<IQR<0.49�� ������� �R�� B� 0.32; Figure %��1�� ��� �� ��� �&���had outliers. Furthermore, only one of the 15 mean correlation coef-/������������ ��������/�����"�� ���0� ��5!��7,"�D�� ���!�%��). Pair-wise correlations among knot individuals showed a similar ��� ��� ��� (� �� ����"� ��� )��� ����� ������ �$������ ���� �� �$������(0.20<IQR<0.61����������R��B�0.41; Figure %��a). The most posi-tively (lymphocytes-monocytes) and negatively (hemolysis-anti-E.coli capacity) correlated pairs had whiskers that did not include zero, ����(���������$�� ������������ �������� ������0� ���8�)�(� �����������the 28 relationships had mean correlation coefficients that differed significantly from zero (Figure %��������� ���!%��a). Within indi-vidual knots over 11��������� �&�����)���#� �$�����)� ���� �)� �than at any other level (0.09<IQR<0.55����������R��B�0.25; Figure %�� 1��<� ��� �� ���6 of the 28 relationships were significantly dif-�� ���� � ���0� �� 5� ���!%�� 1�������� ����6 significant pairs, only one had whiskers that included zero and none had outliers. Thus, some indices were consistently correlated, either positively or nega-tively, over the year.Dotplots of individual correlation coefficients (not shown) indicat-������������ ������������ ��������)��� ��)�� �$������� � ������������ �$�������<� ��� �� ��� ��� ���#�����)�� ��������������� ���� "�� �������� 5�����)� ��������� ����(� �� ��1�� � "� ������� 5��� �������moult, wintering).
Within-group principal component analysis (PCA) and correlation circles
���������� ��)����(���� ����������$�����7�$���/���� ���������� �����differed widely indicating that relationships among plasma (Fig-ure %�") and cellular (Figure A%��) indices were generally inconsist-ent among waterfowl species. For example, anti-E.coli capacity and hemagglutination were uncorrelated (perpendicular) in ALCG and highly correlated (parallel) in CHPT. An exception is the uncorre-������ ����������$�5$� $�������� 1� ��)������$����� ������������"-�����)�����)���������������������$������5����� �%������ "����� �)� �&����<��� ��%��1���������(� �� ����� �������<��� ��%�" indicated that immune indices that were related in the previous analysis (Matson et al. 2006a) were not related when the PCA was performed on each species separately.
141
Table 7.5 – Common principal components analysis (CPCA) of covariance matrices con-
taining indices of immune function among 11 month within individual red knots.
H
H L �2 .. P AIC
E P 2.189 10 0.9947 362.8P CPC 122.267 70 0.0001 380.6CPC CPC(6) 17.194 10 0.0702 398.3CPC(6) CPC(5) 22.560 20 0.3109 401.1CPC(5) CPC(4) 18.012 30 0.9583 418.5CPC(4) CPC(3) 29.036 40 0.9004 460.5CPC(3) CPC(2) 50.667 50 0.4471 511.5CPC(2) CPC(1) 47.340 60 0.8823 560.8CPC(1) U 53.495 70 0.9286 633.5U --- 720.0
Lys−
MC
Ec
Agg
−Hap
Agg
−MC
Ec
Hap
−MC
Ec
Lys−
Hap
MC
Sa−A
gg
MC
Ec−M
CSa
Lys−
MC
Sa
Hap
−MC
Sa
Agg
−Lys
0.5
Cor
rela
tion
coef
ficie
ntPlasma, waterfowl species
0.0
-0.5
-1.0
1.0
142
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
Figure 7.2 – Boxplots showing correlation coefficients for pair-wise Pearson cor-
relations between plasma-based indices of immune function among waterfowl
species (n = 8, see Table 7.1 for abbreviations).
Solid lines indicate the median, boxes the inter-quartile range, whiskers the
range and open circles outliers. Lower variation (smaller boxes, whiskers and few
outliers) indicates more consistent correlations among species.
Hap
−MC
Ca
Lys−
MC
Ca
CC
a−M
CEc
Agg
−Hap
CC
a−M
CSa
Hap
−MC
Ec
Agg
−MC
Ca
Lys−
MC
Ec
Agg
−MC
Ec
Hap
−MC
Sa
Hap
−Lys
Agg
−MC
Sa
Lys−
MC
Sa
CEc
−MC
Sa
Agg
−Lys
−1.0
−0.5
0.0
0.5
1.0
Cor
rela
tion
coef
ficie
nt
Stonechat subspecies
*
143
Figure 7.3 – Boxplots showing correlation coefficients for pair-wise Pearson
correlations between indices of immune function among stonechat (Saxicola
torquata) subspecies (n = 12 to 20, see methods for sample size details and Table
7.1 for abbreviations).
Solid lines indicate the median, boxes the inter-quartile range, whiskers the range
and open circles outliers. Lower variation (smaller boxes, whiskers and few outli-
ers) indicates more consistent correlations among subspecies. Asterisks indicate
weighted mean correlation coefficients (Sokal and Rohlf 1995) that differed sig-
nificantly from zero after sequential Bonferroni correction (Rice 1989, see Table
A7.3 for statistics).
Lys−
MC
EcLy
m−M
CC
aLy
m−L
ysH
et−L
ysLy
m−M
CSa
MC
Ca−
Mon
Agg
−Lym
Lys−
MC
SaLy
s−M
onA
gg−M
onA
gg−H
etM
CC
a−M
CEc
MC
Ec−M
CSa
MC
Sa−M
onA
gg−M
CSa
Agg
−MC
EcA
gg−M
CC
aLy
m−M
CEc
Lys−
MC
Ca
Het
−Lym
Agg
−Lys
MC
Ca−
MC
SaH
et−M
onM
CEc
−Mon
Het
−MC
EcH
et−M
CC
aH
et−M
CSa
Lym
−Mon
−1.0
−0.5
0.0
0.5
1.0C
orre
latio
n co
effic
ient
Red knot individuals
*
* * * * **
*
A
144
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
Lym
−MC
SaA
gg−M
onLy
m−M
CEc
Lym
−Lys
MC
Ca−
Mon
Lym
−MC
Ca
Agg
−Lym
MC
Sa−M
onM
CEc
−MC
SaLy
s−M
CEc
Lys−
MC
Ca
Lys−
Mon
MC
Ca−
MC
EcA
gg−H
etA
gg−M
CSa
Lys−
MC
SaH
et−L
ymA
gg−M
CC
aA
gg−M
CEc
Het
−MC
EcM
CEc
−Mon
Het
−Lys
Agg
−Lys
Het
−MC
Ca
Het
−Mon
MC
Ca−
MC
SaH
et−M
CSa
Lym
−Mon
−1.0
−0.5
0.0
0.5
1.0
Cor
rela
tion
coef
ficie
nt
Red knot months
*** * **
B
145
Figure 7.4 – Boxplots showing correlation coefficients for pair-wise Pearson correla-
tions between indices of immune function (see Table 7.1 for abbreviations) in red knots
(Calidris canutus) among individuals (A, n = 27 birds), and over time (B, n = 11 monthly
measurements).
Solid lines indicate the median, boxes the interquartile range, whiskers the range and
open circles outliers. Lower variation (smaller boxes, whiskers and few outliers) indi-
cates more consistent correlations. Asterisks indicate mean correlation coefficients
that differed significantly from zero after sequential Bonferroni correction (Rice 1989,
see Table A7.4 for statistics).
146
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
Figure 7.5 – Correlation circles for unrotated principal component analyses (PCA) on
plasma-based immune indices among waterfowl species (see Table 7.1 for abbreviations).
Vectors are the loadings on PC1 (x-axis) and PC2 (y-axis). Vector length indicates the
strength of the relationship and the angle between two vectors gives the degree of cor-
relation (adjacent = highly correlated, orthogonal (90°) = uncorrelated, and opposite
(180°) = negatively correlated). Shading indicates how the indices of immune function
were grouped in a previous varimax rotated PCA performed with all species combined
(Matson et al. 2006a). Indices having the same shading were associated with the same
PC in the previous analysis.
147
Figure 7.6 – Correlation circles for unrotated principal component analyses (PCA)
on immune indices among stonechat subspecies (see Table 7.1 for abbreviations).
Vectors are the loadings on PC1 (x-axis) and PC2 (y-axis). Vector length indicates
the strength of the relationship and the angle between two vectors gives the de-
gree of correlation (adjacent = highly correlated, orthogonal (90°) = uncorrelated,
and opposite (180°) = negatively correlated). Shading indicates how the indices of
immune function were grouped in a varimax rotated PCA performed with all sub-
species combined (see Table A7.5). Indices having the same shading were associ-
ated with the same PC in the combined PCA. Anti-C. albicans capacity correlated
equally across two PCs in the pooled analysis (Table A7.5), therefore it has darker
grey shading with white lettering.
148
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
�� �$�����7�$��������� ���������� ����������������������������������������)� �������������"� ������������������������� �$�����D����� ���������)� �������������"� ���������������� ������������� �$�����D�����"��� ���� � �������� )� �� ���� �����������"� ������� ������ �� �$������(Figure %�#). For example, hemolysis and hemagglutination were $�����(��"��� ���������������� �$����������������� ��)��������(��-�� �������������������)� �������������(�����������&��� �$������5<��� ��%�#1D� ���� ��� ��0�#�� � ���� ��������� ���� ������ )��� $� $�������� �the vectors were short, indicating that they were not strongly cor-related with PC1 or PC2. Examination of the first four PCs showed that they were positively correlated with a high loading on the third PC (not shown). Anti-E. coli and anti-S. aureus were positively cor- ���������������� ������������� �$����������������� ��)��������(��-�� �������������������)� �������������(�����������&��� �$������5<��� ��%�#1�� ���� M��0� �� �$������ ����������)���$� $�������� � ���� ����vectors were short. Examination of the first four principal com-ponents showed that these two indices were negatively correlated ��� ���� ��� ���6� 5���� ���)�1�� <�����"�� ��$����� ��� ������������-tination showed completely different relationships in the different �� �$���������"�)� ��$�����(��"� ����������� ���� � ������ ����������� M�����" ���� ����������(��"� ������� �����0�#�� � ���� �������(� �� ����� ����5<��� ��%�#) indicated that immune indices that were ������� �����(� ���&� ��������6!���� ���������� �� �$������ 5� ���A %�", see Matson et al. 2006a for method) clustered in some (e.g. � �$���1� �����������5�������0M� 1��� �$������)���������6!�)���$� �� �������������� �$��������$� ����"������(�����7�$���/�� �� �������� �� ����� ���������� ����� ����������$��among some indices were consistent among most red knot individu-als (Figure A %��a). However, not all indices were consistently related ������� ����(��������<� ��&��$���� ����������� ��)���������"���������"�$���"����� ����������������� ����������� � ���5���� � ���19 and 24, Figure A %��a). In this way, the correlation circle results supported �&$���� �������������������&�$�� ��)������ �)� �&���5<��� ��%��) are the same indices that group together in most correlation circles 5����� �"�$���"�������������"���1���������(� �� ����� ���� ���<��� ��A %��a indicated that immune indices that grouped together previ-����"�)�������� � ���)� ����� ���������������������"����59����� ����al. 2008�1�� ����� ������ ������ � �������� � ��� 5����� �"�$���"���� ���������"���1�� ����&��$������ ������5���� � ���19 and 24).
149
<�����"�������7�$���/���� ���������� �������������������� ����������$��among indices were relatively consistent through the year (Figure A%�� 1��<� ��&��$�������������� ��)�����"�$���"�������������"�����������������������������������(� �� ����� �������)���������������indices that grouped together previously (Buehler et al. 2008c) again clustered fairly consistently when all months were analyzed separate-ly (i.e. lymphocytes, monocytes; heterophils and anti-C. albicans and anti-S. aureus capacities, Figure A%�� 1��
DiscussionTo deal with the complexity of the immune system, ecological im-munologists have devised multiple techniques to measure differ-ent aspects of immune function in wild animals. In this paper we address the question of how multivariate immunological datasets ���� �� �����������"� ����"0��� ���� ���� $ ����� ������ ���������groups at a particular organizational level (e.g. species or popula-tions). Previously, researchers have applied multivariate methods to data that are pooled after statistically neutralizing any group-ef-fect. However, the implicit assumption is that relationships among the assayed immune indices are similar in all groups. We tested this assumption using CPCA, and then employed pair-wise corre-lations and correlation circles to delve deeper into the consistency and inconsistency of these relationships among groups. These statistical analyses range in complexity and in novelty, at least in terms of their use with multivariate datasets concerning immune function. Nonetheless, when packaged together and treated as a statistical protocol, these methods can serve as an important new ������)��������� ���$$����� ��� �� (� ���"������������� ����� ����0�-tional levels.
Fresh insights provided by this novel statistical approach��� �� ���� ������������ $ ������� ��(�� �������� ����� )��� ��������� ���when using previous analytical approaches. As a result, the presented protocol facilitates more-detailed conclusions than were previously $���� ���5�����-�������������2006a, Martin et al. 2007, Buehler et al. 2008c) and, thus, acts as a foundation for new hypotheses. We high-��������������)���������� "����$� ������������ ��������� ��������prior results at different organization levels.
150
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
Overall, the extent to which multivariate patterns are consistent among groups at different organizational levels varies. For example, relationships among immune indices differed from species to spe-������ ��� ����������$�� ������ ������� �������� )� �� ��� �"� ������ �� �����������������������(� �� ����"���������$�������;������������������������������ ����0����������(����� � �����+����������������������� �������$��"���������������������$ ����������$���� ��)������� ���������)����� ���"����� ��������� �����$���/��� ����0�������� ��(�������� ��made. For instance, patterns among immune defenses might typi-����"� �������� �������$�$��������� �������� �����������$����������fact, our results suggest that relationships among immune indices ��������������������������������$��&��"��������� ����0����������(������ ������5������ �������(������������ �$����������$�����1����������$��-tern holds as additional datasets and analyses come to light, then it �������� (������� ������� ���)��"$���������<� ��&��$�����(� ���� �� �timescales physiological mechanisms might limit plasticity and vari-� ����"������)����������������� ������������������� �� ����(� ������ �time scales selection pressures might gradually reshape physiology and lead to decoupled and reorganized immunological relationships (Duckworth 2010).����� ����$ �����������)����� ����� �7�&�������������� �/�������of previous multivariate analyses of immune function. Matson et al. (2006a) pooled individuals across species and reported a general among-individual pattern, which parallels assay category. The cur-rent approach, however, revealed that this use of pooling individu-���������������"���%���������� ������������������"����������������7����(������$���� �������� ��� "��$�������9����� ��������52008c) pooled their data in two ways: 1) data points from a given individual were $������ "�������������"��� ��������� �����������&�����������7����-vidual patterns 2) data points from a given month were statistically corrected for individual to examine among-month patterns. Our �� ���� �$$ ����� ���������� ����� ���� ����� ����"� ��� $������������ ��� ��)���� ������ �)�� �������+�� ���� ���� ������ ������������"� �� ��������� ������� �(����������������(������$���� ���������$$�� ���� ��)���7supported since we demonstrate that relationships among immune indices were consistent from one month to the next. On the other hand, statistically correcting for individual to examine annual pat-�� ��� ������ ���$$ �$ �����"� ���$�� ���� ��� ��� ����������$�� ������immune indices since we demonstrate that these relationships varied
151
from individual to individual. To summarize, if correlations are con-��������������� ��$��������� ����0����������(��������� ������ ���(���approach and the approach of pooling data across groups give simi-lar results. However, if correlations are inconsistent across among � ��$�� ��� ��� � ����0�������� ��(���� ����� �� ������� ��� ����� ����"��������� ��� ��$���� �������� ������ ��)���������)���$$ ������������������������������� ��-ference space and sample size. The general patterns derived from ��������"�������$����������"��� =���������$���������"����� �� ���� ���-ference (e.g. the order Anseriformes as opposed to the species Anas platyrhynchos). One caveat is that in pooled analyses disparities in sample sizes among groups can affect patterns: a well-represented � ��$�)������ ������� �������)�����&� ��� ���� � ��%��������� ������� ��� $���� �� ����� ��$�� �"� �$ �������� � ��$�)���� ��)������ �-ments. While the groups we compared were generally similar in sam-ple size, checking the consistency of correlations among groups is particularly important when sample sizes vary in such a way that one or a few groups dominate over many others. In the latter case, any �(��������������� ���$���� ���������� ��$ ������� "�� ��$7 "7� ��$�evaluations. Another caveat is that the value of a general pattern ����������$����������"���� ������������ "�������(� ���"���� ���� �$ �-�������(��� ��$������������"�����������������������������$�����0����� ������������� ������������ � ����� ��$�������$$��������������� � ����measurements per group.
Immunological consistency and inconsistency among groups The statistical protocol outlined in this paper provided insights into consistencies and inconsistencies in the way that immunological in-dices interrelate among groups. The usefulness of the protocol, how-�(� �� �&������ �"���� ������ $� ������ � ���������� ��� �� ����"7���-�"0���� ����0����������(����� ������������&��$���"������$$���� ����"���������$ �������������� �� ����0����������(��������$���� �"��(���������� �multivariate datasets unrelated to immune function. Nevertheless, ���$ �(������ � ����������������� ��������� ��������������$ ��������)���������� ��%"����� �������������������"0�����(���Among waterfowl species, the CPCA indicated complete common principal component structure. This result suggests that covari-ance matrices are not statistically different among species. That is, immune indices interrelate similarly among species, and therefore
152
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
pooling individuals into a single PCA is valid (Matson et al. 2006a). +���������� � "��$�� 7)������ �������� �&$����������$�����7�$���/��correlation circles provided no evidence for consistent immunologi-���� ����������$���������$�������������%������� ������������������� ���������)�����7�$���������$�����0���5��B�6-8 individuals), which can increase the likelihood of recovering shared covariance structure with CPCA even when little similarity actually exists (Steppan 1997). Consequently, we cannot unequivocally conclude that immunologi-cal relationships are consistent within the tested species, and, the results seemingly invalidate the approach of pooling individuals of different species into a single PCA.!����������������� �$�����������6�6!���������������� ��;�����"�� �complete common PC structure. That is, immunological relation-���$�� � �� ����������� ������ �� �$�������8�)�(� ��$�� 7)���� �� ���-����� �&$����� ���� �� �$�����7�$���/�� �� �������� �� ����� ����� �������� ���������� �������4�������������������������)� �������������"� ������� ������ �� �$������� ���� ��)� �� �����6����������� ������ � ��������� ��� ���� �$������ ��(��� ���� �� � �)��� !�������� ����6�6!� ����-cated shared PCs, the other methods cautioned against pooling all ����(��������� ������ �$���������������������6!�����"����Among individual red knots, the two CPCA approaches gave highly divergent results. The step-up approach indicated that relationships among immune indices differed among individuals; the model- ��������������������������;�����"�����$�� 7)������ �������� �&-plots and the correlation circles showed that some immune indices � ��$�����(��"�� �������(��"��� ���������������� ����������������(������������� ������������� ����������$��� ������������� "� �� ��������������(� �������5�����)���� �&�������)���#� �1�������� �&$��������� "����-�� ����������� ��)����(���� �$�� ���������� �"������ ���������� ������These inconsistent relationships, apparent upon graphical examina-������������������%�������������$7�$��$$ �������������"���"��&$�����why this approach resolved that the matrices were different. Overall, ���� ����� ����� ��)���� ���� � �$������ �$$ ������� ���� ����6�6!�step-up approach suggested that immunological relationships were inconsistent at the individual level.Among months, the two CPCA approaches and the two graphical ap-proaches suggested that immunological relationships were consist-ent. Furthermore, immunological relationships that were previously ������/��� (��� �6!� ��� ����� $������ ������������� 59����� � ��� ����
153
2008�1�)� �������� �"�������/����������(������������������� ������������������������������� ���������(����������������������� ��%�&� ���over the annual cycle (Buehler et al. 2008c), relationships among ������ ��������� �� �����(��"�������������<� ��&��$���� ����&�!����� ������� ��� �(� ���� ��� ���������� ���� ��)���� �(� ���� ��� ������ �� ���within each month, indices A and B always correlate without regard ���� ���������(�����
Future analyses: opportunities and challengesThe datasets we analyzed focused on indices of constitutive levels of innate immunity. Conducting similar analyses on datasets that in-������ ����������� ������� �������� )���� �� ���� ����(��� <� � �&��$����Martin et al. (2007) present a dataset that includes indices of consti-tutive innate immunity, acquired immunity, and induced responses. ����������"�������� �"������������������ ����������� ��&��������)����-er relationships among types of immune defences, which represent $�����(��2� ��3����������������"������� ��������������������$�������However, application of the protocol presented here requires separate �$�����7�$���/���6!��� ��� ���� ������� ������������� ������� ��� ���the same individuals within each species. Unfortunately in Martin’s dataset different individuals were used (Martin et al. 2007).Our analyses demonstrated the value of graphical examination of pair-wise correlations. In addition to serving the overall statistical protocol, the graphical examination of pair-wise correlations may also serve as a starting point for meta-analysis and the synthesis of sev-� ���$� �����������������+�� ������������������������)��$ �������$�������� $�� 7)���� �� ��������� � �� ���� ������� �������7����"�������� ���� �������;����56�6!������ ��$7�$���/���� ���������� ����1� �;�� ������������������������ ������� ��������������(�������� �� ��$������������particular challenge in ecological immunology. Oftentimes, the num- � ��������� ���������������� ����#���� ������������(����������������� "�����(��������� �������������� ������������� ���������"��� =������������� ��"���0���-� ��(� �����"�����������������$��"������ ��������"��or at least different protocols to measure immune function. We illustrate the potential value and pitfalls of graphical examina-����� ��� $�� 7)���� �� ��������� �� � ����7����"���� "� ��� ������ ����three datasets presented in this paper (Figure %�%). In this case, we $�������������� ������������/����������(������"� ���� ������ �0���������(� ����(� �������)������ �&$����������������#���� ������������ ����
Hap
−MC
Ca
Lys−
MC
Ca
Agg
−Hap
Agg
−MC
Ec
Lys−
MC
Ec
Hap
−MC
Ec
MC
Ca−
MC
Ec
MC
Ca−
MC
Sa
Hap
−Lys
Agg
−MC
Sa
Agg
−MC
Ca
Hap
−MC
Sa
Lys−
MC
Sa
MC
Ec−M
CSa
Agg
−Lys
−1.0
−0.5
0.0
0.5
1.0
Cor
rela
tion
coef
ficie
nt
WaterfowlStonechatsRed knot
Datasets combined
**
154
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
Figure 7.7 – Dotplot showing correlation coefficients for pair-wise Pearson correlations be-
tween indices of immune function (see Table 7.1 for abbreviations) in an analysis combining
waterfowl, stonechat and knot datasets.
Each correlation coefficient for each species or subspecies is shown as a dot with its dataset
of origin indicated in the shading. Waterfowl correlations are based on 5 to 8 individuals,
stonechat correlations are based on 10 to 20 individuals, and knot correlations are based
on 27 individuals. Asterisks indicate where weighted mean correlation coefficients (Sokal
and Rohlf 1995) differed significantly from zero after sequential Bonferroni correction (Rice
1989).
155
��������)� �� ������ ���� �����"�� ��� ����"���� ���/ ���� ����� ��� ��was very little consistency in relationships among immune indices �����������$������5����1��������������������5�������1��7�������������� �� �������� ����/��������)�������� �� � ���$��� ��0�� 5��#��� ����Rohlf 1995), demonstrated that only two relationships (hemaggluti-nation and hemolysis, anti-E. coli and S. aureus capacities) differed �����/�����"� � ���0� �D� �����(��� ������ ����������$��)� ������ ���-sistently positive (e.g. in the hemagglutination and hemolysis pair, ����)��� ��)���$�������������� ������������/���������0� ��5�'�1�����another of -0.6 (ALCG)). ����������������������� ����������$�� ��)�������������������������-/��� "� ����� �&� ����� �� ��� � ��$����0�� �������������� ���$��&��"��8�)�(� �������������������� $ ���������� ���������� "����� ������ ���(��������������� ��$��������������)�����)� ������������ "���������� ���(� ��$$ �&������"���/(�7"�� �$� ��������#������$����������������-��������� ���"��<� ���� �������������� � ���������$����"�)�������� ���differently in waterfowl (plasma only) versus stonechats and knots 5)����� ����1��6��$�������������� ���� ��� ������������"�)������-��������)���� ��&����"Q������ � �$������)� ������� ��������� �"���������$������������)�(� �� �%��������� �����"�������� ���� �������-ical immunology community, in which research groups often focus on particular study species and customize immunological assays in one way or another. Second, recall that for the knot dataset we have multiple samples from each individual over an annual cycle. Because Buehler et al. (2008�1������������/�����(� ��������������������)��selected only measurements that were recorded during a quiescent )���� � $� ����� )����� )��� ����� ���$� � ��� ��� ���� ���� � ����������Intra-annual patterns demonstrate the importance of explicitly stat-ing when in the annual cycle samples were collected, if independent ��������� ����� ����� ������������7����"�����Overall, the need for and utility of multivariate statistical methods ��� ���� ��6� ����"���������� ��#�� ����$ �������)������ � ��� �������useful and informative when applied within individual studies. Ana-lytical integration among datasets remains a challenge; meeting this ���������� )���� �;�� �� =��������� ������ ��0������ ��� ��������������related to the collecting, processing and assaying of samples.When considering the future of ecological immunology analyses, the potential importance of methods that can unite several multivariate datasets also comes to light. Additional datasets might, for example,
156
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
��������$�������� �����(� �� ����� ��������������(� �� �����������-(� ���������5 ����������� �����1�(� �� ������������ ���� ����;�������modelling (SEM) is a potentially powerful analytical method for ����������� ���������"����������������� �����������&������ ���-�������$�� ��)���� ������� (� �� �����)����� ���$ ���������$�������-� ���(� �� �����!� �������(� �� �����"� ������� ��������� ���5� ��(�����7����� � ��D�5��� #�������4���� �2005)). For example, multiple ������� �������� 5����� ��������� ��� (� �� ���1� ������ �� ����� ��� ��-������� ������� ��������� 5����� �� ������� (� �� ��1� � � ��(� ��� ����� ����2� ��3��������������������5����� �����������(� �� ������ �����������-;�� ���� ����1��-���� ������$�������� ������������� �������������� �������� �"������������������$��������$ ���� ����-��&���������)����������� ���(� �� ������� � ��������������������(� �� ���5��������-� �����������1� ������)� ���� ������� (� �� ���� ������ ������� ������ �5������ ���� ��������1��8�)�(� ������/���������������������������"�)����$ � � �"���(�������(���$��� ��� � ��� �������������� ��������� ����������$����������-�������������� ���$���/���a priori�� ����� -rent limitations on our knowledge mean specifying a model for even ����������������(� �� ����������������������������� ����� ����������� ������)�����$����������������������������� ���� ���������������� �������� �������������$$�������������-������� ��������� ����(�� ���� ���� �=���� "��� ���������������������"�
Acknowledgements4������#�!�8�����������6�8� ��#������� ��������� � ��������C Both for helpful discussions and comments on earlier drafts of the manuscript. We also thank editor Frederick Adler and anonymous reviewers for improvements on earlier drafts.
157
H
H L �2 .. P AIC
E P 0.43 6 0.9986 102.5P CPC 64.23 18 <0.0001 114.0CPC CPC(2) 8.33 6 0.2152 85.8CPC(2) CPC(1) 16.27 12 0.1792 89.5CPC(1) U 13.21 18 0.7789 97.2U --- 120.0
Table A7.1 – Common principal components analysis (CPCA) of covariance matrices
among waterfowl species for cellular indices of immune function. The Table shows
Flury’s Decomposition of �2 using step-up and model building approaches (see Table
7.2 for details). Both methods indicate that covariance matrices among species share
all PCs, but have differing eigenvalues (CPC). This CPCA is based on five matrices
with six to eight observations per matrix because two species (NABD and MUSC)
were excluded due to low levels of variability in one or more immune index.
Appendix 7.1
158
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
V M T .. P 95% C
AL-MCE -0.227 -1.697 7 0.1336 -0.503 to 0.091L-MCS -0.037 -0.187 7 0.8568 -0.469 to 0.409A-MCE -0.015 -0.131 7 0.8992 -0.279 to 0.251L-H 0.038 0.809 7 0.4454 -0.073 to 0.149H-MCE 0.040 0.261 7 0.8017 -0.314 to 0.385MCS-A 0.041 0.193 7 0.8528 -0.430 to 0.494A-H 0.045 0.374 7 0.7196 -0.237 to 0.321H-MCS 0.113 0.599 7 0.5682 -0.324 to 0.511MCE-MCS 0.280 1.729 7 0.1274 -0.105 to 0.592A-L 0.510 2.122 7 0.0715 -0.064 to 0.831
BEos-Mon -0.273 -1.491 6 0.1866 -0.629 to 0.178Eos-Lym -0.043 -0.392 6 0.7084 -0.303 to 0.223Lym-Mon 0.012 0.053 6 0.9593 -0.480 to 0.497Het-Lym 0.064 0.344 6 0.7426 -0.373 to 0.478Het-Mon 0.219 0.869 6 0.4184 -0.383 to 0.690Eos-Het 0.416 1.158 6 0.2907 -0.456 to 0.881
Table A7.2 – Mean correlation coefficients for pairwise Pearson correlations be-
tween plasma-based (A), and cellular (B), indices of immune function (see Table
7.1 for abbreviations) among species of waterfowl (n = 8 for plasma-based and n =
7 for cellular immune function). No mean correlation coefficients were significantly
different from zero after sequential Bonferroni correction (Rice 1989, see text for
statistical details).
159
V M T .. P 95% C
H-MCC -0.115 -0.837 5 0.4407 -0.439 to 0.235L-MCC -0.058 -0.601 5 0.5742 -0.296 to 0.187A-H -0.040 -0.536 5 0.6150 -0.230 to 0.152A-MCC 0.038 0.448 5 0.6726 -0.176 to 0.248H-L 0.085 0.711 5 0.5092 -0.219 to 0.374H-MCE 0.096 1.288 5 0.2543 -0.096 to 0.282MCC-MCE 0.101 0.893 5 0.4128 -0.187 to 0.373H-MCS 0.114 1.345 5 0.2365 -0.104 to 0.322A-MCE 0.118 0.886 5 0.4162 -0.222 to 0.433MCC-MCS 0.119 1.353 5 0.2341 -0.107 to 0.333L-MCE 0.160 1.582 5 0.1744 -0.101 to 0.400A-MCS 0.196 1.810 5 0.1301 -0.083 to 0.446L-MCS 0.243 2.077 5 0.0924 -0.059 to 0.503MCE-MCS 0.396 3.395 5 0.0194 0.101 to 0.627A-L 0.627 5.272 5 0.0033 0.360 to 0.798
Table A7.3 – Mean correlation coefficients for pairwise Pearson correlations of
indices of immune function (see Table 7.1 for abbreviations) among six stonechat
subspecies. P-values indicating significant difference from zero after sequential
Bonferroni correction (Rice 1989) are bold (see text for statistical details).
160
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
V M T .. P 95% C
ALys-MCEc -0.466 -7.477 26 <0.0001 -0.568 to -0.351Lym-MCCa -0.177 -2.950 26 0.0066 -0.294 to -0.054Lym-MCSa -0.179 -2.130 26 0.0428 -0.342 to -0.006Lym-Lys -0.143 -2.868 26 0.0081 -0.242 to -0.041Het-Lys -0.082 -1.286 26 0.2096 -0.211 to 0.049Lys-Mon -0.080 -1.409 26 0.1708 -0.195 to 0.037Agg-Lym -0.070 -1.071 26 0.2939 -0.202 to 0.065MCCa-Mon -0.066 -0.835 26 0.4112 -0.225 to 0.096Lys-MCSa -0.023 -0.369 26 0.7152 -0.152 to 0.106Agg-Mon -0.003 -0.052 26 0.9590 -0.124 to 0.118MCSa-Mon 0.007 0.105 26 0.9168 -0.133 to 0.147Agg-MCSa 0.046 0.556 26 0.5827 -0.124 to 0.214Agg-Het 0.046 0.735 26 0.4691 -0.082 to 0.172MCCa-MCEc 0.079 0.923 26 0.3646 -0.096 to 0.249Agg-MCEc 0.064 1.091 26 0.2852 -0.056 to 0.182Lys-MCCa 0.072 0.880 26 0.3869 -0.095 to 0.234Agg-MCCa 0.106 1.627 26 0.1157 -0.028 to 0.236MCEc-MCSa 0.129 1.666 26 0.1078 -0.03 to 0.281Lym-MCEc 0.129 2.301 26 0.0297 0.014 to 0.242Het-Lym 0.192 2.904 26 0.0074 0.057 to 0.321MCEc-Mon 0.226 3.104 26 0.0046 0.077 to 0.364Het-MCEc 0.266 3.424 26 0.0021 0.109 to 0.411Het-Mon 0.257 4.083 26 0.0004 0.130 to 0.376Agg-Lys 0.273 3.912 26 0.0006 0.132 to 0.403Het-MCCa 0.291 4.041 26 0.0004 0.146 to 0.424MCCa-MCSa 0.320 4.035 26 0.0004 0.161 to 0.462Het-MCSa 0.424 8.711 26 <0.0001 0.333 to 0.507Lym-Mon 0.679 9.849 26 <0.0001 0.574 to 0.761
161
V M T .. P 95% C
BLym-MCSa -0.0709 -1.023 10 0.3302 -0.222 to 0.083Lym-MCEc -0.0481 -1.090 10 0.3013 -0.146 to 0.050Lym-Lys -0.0342 -0.677 10 0.5136 -0.146 to 0.078Lym-MCCa -0.0154 -0.198 10 0.8471 -0.186 to 0.156Agg-Lym -0.0076 -0.169 10 0.8690 -0.107 to 0.092Agg-Mon 0.0188 0.264 10 0.7975 -0.140 to 0.176MCCa-Mon 0.0529 0.702 10 0.4984 -0.115 to 0.217MCSa-Mon 0.0808 1.061 10 0.3137 -0.089 to 0.246Lys-Mon 0.0987 1.898 10 0.0870 -0.017 to 0.212Agg-MCSa 0.1205 2.858 10 0.0170 0.027 to 0.212Agg-Het 0.1331 1.777 10 0.1059 -0.034 to 0.293MCEc-MCSa 0.1359 1.740 10 0.1125 -0.038 to 0.302MCCa-MCEc 0.1405 2.156 10 0.0565 -0.005 to 0.280Agg-MCEc 0.1525 2.337 10 0.0415 0.007 to 0.292Lys-MCCa 0.1712 2.859 10 0.0170 0.038 to 0.298Agg-MCCa 0.1768 3.571 10 0.0051 0.067 to 0.282Lys-MCSa 0.1834 3.197 10 0.0095 0.056 to 0.305Lys-MCEc 0.1875 3.974 10 0.0026 0.083 to 0.288MCEc-Mon 0.2076 3.815 10 0.0034 0.087 to 0.322Het-MCEc 0.2143 3.908 10 0.0029 0.093 to 0.329Het-Lys 0.2545 3.563 10 0.0052 0.097 to 0.399Het-Lym 0.2614 3.180 10 0.0098 0.080 to 0.426Het-MCCa 0.3198 6.520 10 0.0001 0.215 to 0.417MCCa-MCSa 0.3199 4.453 10 0.0012 0.164 to 0.460Het-Mon 0.3591 5.940 10 0.0001 0.231 to 0.475Agg-Lys 0.3677 4.101 10 0.0021 0.174 to 0.534Het-MCSa 0.4366 9.823 10 <0.0001 0.347 to 0.518Lym-Mon 0.5419 6.989 10 <0.0001 0.391 to 0.664
Table A7.4 – Mean correlation coefficients for pairwise Pearson correlations of
indices of immune function (see Table 7.1 for abbreviations) among 27 individuals
(A), and over 11 monthly measurements (B) in red knots (Calidris canutus). P-values
indicating significant difference from zero after sequential Bonferroni correction
(Rice 1989) are bold (see text for statistical details).
162
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
PC1 PC2 PC3
H (2) 0.83 0.15 -0.16H (2) 0.86 0.10 0.10H (/) -0.13 0.20 0.86E. coli (. ) 0.12 0.78 0.00S. aureus (. ) 0.27 0.74 0.19C. albicans(. ) -0.24 0.55 -0.55E 1.59 1.53 1.10
Table A7.5 – Loadings and eigenvalues for a varimax rotated
principal component analysis (PCA) on indices of immune func-
tion measured in stonechat subspecies. The analysis was per-
formed on data combined from six subspecies combined after
statistically accounting for subspecies effects (see Matson et al.
2006a for method).
163
Figure A7.1 – Correlation circles for unrotated principal component analyses (PCA) on cellular
indices of immune function among species of waterfowl (see Table 7.1 for abbreviations). Vec-
tors are the loadings on PC1 (x-axis) and PC2 (y-axis). Vector length indicates the strength of
the relationship and the angle between two vectors gives the degree of correlation (adjacent
= highly correlated, orthogonal (90°) = uncorrelated, and opposite (180°) = negatively corre-
lated). Shading indicates how indices of immune function were grouped in a previous varimax
rotated PCA performed with all species combined (Matson et al. 2006a). Indices having the
same shading were associated with the same PC in the previous analysis.
164
Ch
apter v
ii | Statistical solu
tion
s for ecological im
mu
nology
A
165
Figure A7.2 – Correlation circles for unrotated principal component analyses
(PCA) on indices of immune function (see Table 7.1 for abbreviations) measured
in 27 individuals (A) and over 11 months (B) in red knots (Calidris canutus). Vec-
tors are the loadings on PC1 (x-axis) and PC2 (y-axis). Vector length indicates the
strength of the relationship and the angle between two vectors gives the degree
of correlation (adjacent = highly correlated, orthogonal (90°) = uncorrelated,
and opposite (180°) = negatively correlated). Shading indicates how the indices
of immune function were grouped in a previous varimax rotated PCA performed
with all individuals (A) or all months (B) combined (Buehler et al. 2008c). Indi-
ces having the same shading were associated with the same PC in the previous
analysis. Among individuals (A), monocytes correlated nearly equally across two
PCs in the previous analysis (Buehler et al. 2008c), therefore it has darker grey
shading with white lettering.
B
166
CHAPTER VIII
The interplay between energetics and immune function in avian life histories: a synthesis
-���#��!���� ������
Overall conclusions and outline of this chapter���� ������� ���)�� ����� ��� ������������ ����� ����� "�� ���� ����� �����corticosterone and immunity, do not correlate in the same way ������ ����(������� ���� �� �$������� ���� ����� ����� ������ ������these physiological traits have not limited the evolution of life his-�� "� � ������ <� ��� �� ��� (� ������� ������ �� �$������ ��� ����� �"������������������������������"������������ ����� ���������������"�are partly correlated. This may indicate that life history evolution ������� �������� "�$�"����������� ���������������� �����$����� ��� ������������������������ "���� �����������"� ���������� "���������� ��������physiological function that a population or species requires during ����"�� ��-� ��(� ������� ����������������� ����������$�)�����������-sonal demands of different life cycle stages leaves room for alternate �&$����������������������������������������� ����� ���������������function. For example, environmental factors, such as food avail-� ����"� ����$��������$ ���� ���)����� ���� (� "�)������ ���� ������"�� �����"����� � ����������������$���� ������$�"���������������������In contrast with a factor like day length, this type of environmental (� ���������"� �������$����� ���������"�������������������������� ��may interact synergistically or antagonistically with the demands of a life cycle stage. Life history traits and annual cycles of physiology ��"� ��������� "����� �"��������� ����� ��� ������������ ��������environmental factors.
167
��� ����� �"�������� �� �� ��� $ ������ �� ���$�� 7 "7���$�� � ����� "�� ��then integrate the findings of chapters 2, 3 and 4 using methods presented in chapters 6 and 7. Next, I investigate whether immune �������� �&�� ��� "�� 7 ����� ����������"� )������ ����(������� "� ���-��������� ���� �$���� ����"� ��� ���� ����(������� ����� )� �� ����� ���in multiple life cycle stages. I also investigate whether the among-����(�������� ��������� ��)������� ������������������������� �����are consistent over the annual cycle using data form chapters 3 and 4. Finally, I offer several potential avenues for further research that address some of the most exciting and promising questions that re-main unanswered.
Adaptations of physiology to different environments: a summary��"����������� ����� ������ ��� ����� ����� "� � ����� ��(�� ���� $ �$�����to have led to the Pace-of-Life axis (Ricklefs and Wikelski 2002). In chapter 2 we investigated whether constraints among physiological �"���������� ��"�(� ��������������������"��������������� ��� �$�-cies of stonechats. If constraints among physiological traits and life ����� "����������(������������������ ������)��)������&$�������/������������ �� ��������� ������ ����(������� ���� �� �$������� -��� �����rate correlates with life history traits in stonechats (Klaassen 1995, Wikelski et al. 2003) and we use it as an indicator of Pace-of-Life. We �� ����������� ����� ����)��������� ������ �������� �� ������� �����stress-induced corticosterone, and constitutive immune function. �����=� ��"������ ���������)� ������������ � ��)����������(���������-��(������������ �$����������������� �������� ����"�����������������-straints among physiological systems are not a driver of Pace-of-Life ��(� ��/����������������������-� ��(� ������������� ��������"�������-fy a need to take environmental factors into account when mounting similar studies in the future.In chapter 3�)����(����������������%��������������������(� �������������� �� ����������"�� ��� ��������� ����� ���� 59-�1��9� ��� ���)� ���-������ ����� ������ ������� ����� ���� 5����� ���������1995, Kersten et al. 1998, Wikelski et al. 2003, Bush et al. 2008���>0�����������2011). 4�� ��(���������� ���� �������� ��#� ����� ��� ������� �"����� ��� 9-�� "� ����"���� �� ��� ����������� �� �$������ ���� �)���" ��� �������� -����/(��������"����������������$��(��"������� �$���������$��"������ ����life history traits and originate from environments with associated ����� ������ �������������"��4������� ��������� �$�����������" ����
168
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
in a common garden setup under a constant temperature regime, and we measured an additional set of European stonechats under an �������"�(� �� ������$� ��� �� ������������ ������ �$���������)�������� ������������"�����������" ��������������� ���������)�"����&-�� ����� (������ ����� )� �� ���� �������� ��� ���� $� ������ �� �$���������$� ��� ��� ������������������(� ����9-����(��� ������������������pattern. The results of this chapter show that annual cycles in BMR ��(���(��(�������� ����"������������� ������ �$��������������������������������"������ �� ���� � �������������%������� "����$� ��� ��In chapter 4�)����(������������������"��������/(���������������������-��(�� �������"� ��� ���� �� ��� �� �$������ ��� ���� ����� ���7�$� ��� ���$-ter 3�� �������� ��� � ��7��(���� � ��� ��������� ����� ������� (� ������� ���immunity exists (Hasselquist et al. 1999, Møller et al. 2003, Owen and Moore 2006, Machado-Filho et al. 2010). Immune function ��������� ������ ��� �� ��������� ���������"� ������"���� ������� ��������migration and reproduction (Møller et al. 2003, Machado-Filho et al. 20101������(� ������� ��� �������"����� �����&$���������� � ���7offs with other life cycle demands and/or variation in the pathogen pressure in the environment (Møller et al. 2003, Martin 2005). But )����� ��������(� ��������������������� ��#� �������������� ��������������(��(���� ������ �������� ���������$�����"$���%�&� ����"������ ���"�unknown. Because of the variation in life cycle stage demands and ��������� ������(� ������������ �������������������� �$������)���&-pected variation in annual cycles in immunity. Keeping stonechats in a common garden setup allowed us to investigate whether annual cy-���������������"���(������������ ��#� ����������������������(��(���� ��������$���� � ������� ������ ������� ����� �������������)�����������(��������� ����$�����"$���%�&� ����"������������"����� ��� �������"��4������������� �������������� �$���������������������"����������� ���� ����/(�� �������� ��� �������"��4�� ����� ����������� ������ �������" ��������$� �������� �$������� ����" ����)� ��������)�"������ -��������������������#�$�����(� �� ������$� ��� �����)���������������(� �����������)���������/(���������������������������������#�$�����constant temperature. These results indicate that annual cycles of in-������������"������(������������ ���������������� ����"�������$��&��!�������"���������������"�������$� ��"� �� ����������������"����������demands. Differences in environmental factors (e.g. annual variation in pathogen pressure) among locations of origin are likely candidates to have caused additional selection pressures.
169
In chapter 5 we investigated the mechanism that determines energy �&$������ �����������������4����������� "���(�����������������%��������������� �������������� �����������������7�$���/��9-����� ��������������7�$���/��9-������ ���� ��� � ����� �������� ������ ��� ��0�� ������� �������"� �����"� ����(�� � ����� 5����� ��� ����1990, Konarzewski and Diamond 19951����������� ����������"�5��������8�� � ��1985), ���� ���������� ������� ���� �� ����� � ��� ���:� � ��� ��� ��� ��-���� ������ ��� ��$���� ��� ��� ����� ���������� $ ����� $� ��� ����"�58�� � ����������2005). Mitochondria are important organelles for storing energy and thermoregulation (Rolfe and Brown 1997, Nich-ols and Ferguson 2002). In the process of storage of energy peptides � �� ����������)������ �������� "�������������� �����������������-dition to nuclear-encoded peptides (Rolfe and Brown 1997, Nichols and Ferguson 2002). A characteristic of the mitochondrial genome is that it is only inherited from the mother. To investigate the role ��� ������ � ���� ��������� ���� ������ ��� ���� ������� ����7�$���/��9-���)��/ ��� ����������� �� ��� ����"� �������7�$���/��9-��)�������� ����� �$������ 5��0�#���� �$�����������"��1� "�������;�����-tative genetic methods (Falconer and Mackay 1996, Kruuk 2004). 4������������ ��� ����"����0.69�� ��������������������7�$���/��9-�����$� �����"����� ������������� ����4���������(��������������7�$���/��9-��� ���$� �������� �$�����������" ����)��������� ����$� ���������/�� ������� 5����� ��0�#�� &� � �$����)���� ����� ���0�#�� � � �-ropean mothers, and European x Kenyan with either European or Kenyan mothers). If mitochondrial genes play an important role in ����7�$���/��9-��������)��)������&$�����" ������� ���� ������� ������ �.��� �$�������������"������� �������$��"��� �����������7�$���/��9-��)��)������&$�����" ����)��������� ����$� ���������/�� �������������)��������� �����7�$���/��9-���4�����������������7�$���/��9-����� �" ����)���� ����� ���� $� ������ ���/�� ������� ���� ���� �-��� ��� ���� ������ �� ��� �����)� ������ ���� �������� ��� ����$� ������ �$����������� ������ ��$������������������� ���$��"��� ��������������� ����������7�$���/��9-����������� ����� ��)�����" ������������ ������ �.��� �$������������ ��������� "������������ ��)����nuclear and mitochondrial genes. In chapter 6�)����(����������)�������� � ����������������(������(� �-ation of mass, BMR and total evaporative water loss (TEWL). We took repeated measurements of BMR and TEWL of European stone-���������)���� ��4����(����������)����$� ���������(� ������������� ��
170
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
�&$������� "� ���� ����(������ "� ������������ �$���� ����"� ��� ���� �)��measures (Lessells and Boag 1987). We also investigated sources of (� �������)��������������������(�������������� "������ �����������&��������������(� �������)��������������������(�������������� "�(� �-������ ��� ��"�������4�������������9-����� �$���� �������� ����� ���an individual characteristic in stonechats. Sex did not and age did have an effect on variation in BMR among individuals. Body mass �����������������(� ����������9-�� ��������������)����������(���-�����4,�)������� �$���� ������������������ �������� ��������"� ��������� "�������)�(� �����������������(���������� ����������4,�����������)����������(�������)���������%������� "������ �����������&������� � ��"�������In chapter 7 we investigated the usefulness of simple and multivari-ate statistics to study relationships among immune indices, using �)�� $ �(�����"� $� ������� ��������� ���� ���� ���������� ��������� ���immune system is a multidimensional system and ecological immu-������������(����� ���� ����$$ ������� ����� "� ��#���������$��� ��������of immunity (e.g. Matson et al. 2006a, Martin et al. 2007, Buehler et al. 2008c, Pap et al. 2011). The interpretation of these multiple ��������������������$���������-����(� ������������������(�� ������������summarize the outcome of these studies. We found that in the ana-lysed datasets immune indices are relatively consistently correlated )����������(�������� ���� �����������������"��� ��������������� ���(����of organization (e.g. species). Furthermore, we argue that often sim-ple correlations are helpful in addition to more complex multivariate techniques for understanding what causes the variation in the often relatively small datasets at hand.
Life history and physiological traits in seasonal environmentsI will now use the methods of chapter 6 and 7��������"�������� ���-tion of the data from chapters 3 and 4. First, I will calculate repeat-� ���������� ���������������� ����������������� ��������������� ����������"����������������)����$ �(�������� �������� ������������������"�of immune indices within individuals over a whole annual cycle. Sec-�������)������(�����������������������"������ ��������� ��)����$�"��-ological traits. In chapter 2 we had found correlations among certain $�"������������ ���������������(�������� ��������������)� �� ��� ������to the winter season. In chapter 7 we showed that in red knots (Calid-ris canutus1�������� ��������� ��)�������������������)� ���������-
171
�� ��������� ������������9"���� ���������������� ������$�� �3 and 4 (annual cycles of BMR and immunity), I can investigate the correla-������ ��)����9-��5����������� �������������� "�� ����1������������indices in different life cycle stages in stonechats as well. We have repeatedly measured the same individuals over the annual cycle. This gives me the opportunity to investigate the consistency �������������������(� ������)����������(����������/ ����������������� �$���� ����"��������/(�����������������������������������(������������0�#���� �$�����������"����� �$����������������������"�������� -tain within and among individual variance from a model including ������"������������� �$��������������� �������������"���������� "��� �$�-���������������(� ���������/&��������������������(��������� ��������-�����5� ���&��; See chapter 6��� �����������&$������������ �$���� ����"�������������1���� ��;�����"������������������ �$���� ����"�����������indices in Kazakh, European and Kenyan stonechats separately 5� ���&��1����� �����)��������������������(������(� �������� ����������� ���������� ����� �"���� ������ ���� ���� ��(� ������ ���/&��� ������������� ����(������ ��� ������ �������� �����0�#�� ����������� �$���� ��-��"������������������������ ������ �����(��"���)��������7�����/������This means that in Kazakh stonechats the indices are not consistent within individuals. In European and Kenyan stonechats the repeat-� ����"���������"�������������)�� ���� �������� ����"�����"�����)��� ��-���(��"���������������/����� �$���� ������������������� �$���� ���������������������� ����(������������������ �$������� ����������������������measures over long time-spans (i.e. a year). Furthermore, the fact that )����������� ���/��������/�������������� �$���� �������������������-mune assays over short (i.e. weeks) and long (i.e. a year) time spans shows that they are individual characteristics (Buehler et al. 2008c, Tieleman et al. 2010D��� ���&��).����)�)���� ��(���������)�������� ���������� � ������$�� �3 and im-mune data from chapter 4��)����� ������� ��������� ��)��������7�$���/�� 9-�� ���� ������� �������� � �� ������ � ������ ����� �"����������������� �$�����������)����$ �(������ ��� ��(�������)����� �� �not life histories and indices of immunity are constrained. If con-�� �������&�������&$�������/����� ����������������/(��������"�������������� �������� ������������� ��������������� �����������������������$-ter 2�����$� ������ �����&$�������/�������7�$���/��9-������� ������negatively with hemagglutination and hemolysis, the strongest cor-relations in chapter 2. Furthermore, I can compare the correlations
172
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
��������������� ������ �$������������������������"���(���(��(���differently in response to selection pressures of different (pathogen-ic) environments (Horrocks et al. 2011). This potentially could have �������������� �����������"������ �$������� ����������� �������� ������(� �������������� ���� �� ��������� ������ �� �$��������"� ��� �-�� ��������������� �����%���������������(� ���������������(�����������the immune system. I investigate how hemagglutination, hemolysis, ��$����� ������� ���� �������� ����"���������E. coli and S. aureus are �� �������)��������7�$���/��9-�������������(��������(�������������������/(��������"�������������$� ����"�5<��� ��&��). I also investigate the ������ ��"� ��� �� ��������� ������ �� �$������� ���� �� $������� �� ���-������ ������ ����(������� �� � ���� �� �$������ ��$� ����"� 5<��� ��&��). The results of this analysis show that correlations of the immune in-������(� "� ����)������������"������������������� �$�����������)�������� �$������������������"������������<� ��&��$������ �����$ ������-� ������ ���� (������ ��� ���� �� �������� ��)���� ����7�$���/�� 9-������ ����������������� (� ���� ��)���� 70.33 (European x Kenyan stonechats) and 0.53 (Kazakh stonechats). Also within other life cycle stages, and within other immune indices, correlations are not con-���������������� �$����������� ��������$$� ����� �/������������$�� �2�����������(��������������������� "�� ����������������� ������ "������������� ����!�����������"�����������)�������� �$������������ ���������are also not consistent. Within Kazakh stonechats, the correlation ��)��������7�$���/��9-�� ���� ����������������� (� ���� ��)����-0.41�5 ������1�����0.53 (spring migration). Similar variations can �� ������ ��������"���� ���� �������� � ������� �������� 5<��� ��&��). �������/ �������/�������������$�� �2 that immune measures and ����7�$���/��9-��� ������#��"���� ������� ������)�������� �$������and that environmental factors can select physiological traits, to a certain degree independent of each other.
Future directions: uncovering connections between physiology, �� ������������������������� ��������������
Life history traits (e.g. clutch size and mortality) are limited to a sin-�����&������������$�"������������ �����5��������� ����� ���1������)������axis (Tieleman et al. 2004, Williams et al. 2010). The role of other physiological systems (e.g. the immune system) in the evolution of life history traits is still unclear. Physiology mediates the internal organi-0����������� � ��5����� ���(�� ��������������� "�� ����1�����������(� ��-
173
R,
PR, K
P
R, EP
R, K
P
H
0.090.30
0.100.47
0.240.14
0.00
1.00
H
0.440.0
00.20
0.120.46
0.040.55
0.00
H
0.0
01.0
00.0
01.0
00.0
01.0
00.13
0.56B E.coli ,
0.580.0
00.24
0.150.68
0.00
0.430.01
S.aureus ,0.36
0.00
0.330.0
60.51
0.00
0.330.04
Included as covariate in the model is the tim
e between entering the room
and completion of sam
pling Included as covariate in the m
odel is age of the microbicidal stock solution
Table 8.1 – Repeatability of im
mune indices calculated for K
azakh, European and Kenyan stonechats
taken together and separately for each subspecies. Repeatability was calculated over the five life cycle
stages with variance com
ponents of a mixed m
odel including subspecies and/or life cycle stage and
covariates as fixed effects and individual as random effect.
174
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
ment (Ricklefs and Wikelski 2002). Therefore, selective forces caused "� ��(� ��������� ����� �� ��� ����� �$�"������"�� � ���������� "� � ������are likely to also affect the other (Figure &��). However, the evolution of life history traits may depend on a multitude of environmental factors and constraints among different physiological systems. I will give an example of how environmental factors and physiological sys-�����������%�����������(��������������������� "�� ����������������"��For simplicity, I will assume that pathogen pressure and immunity �������"� �������� ���)�������������$��/���)� ������ � ����(����������� �������(� �������)�����������$��������$ ���� ��$ � � �"�������a high investment in immunity to reduce the chances of sickness ������� � "��� �����"���������"���������"�������� ��� �������)����� ������ ���� �����(���� ����� ����� ����������� "�� �������������� �$ �-���������!� � �� ��� ��� ��(� �������)���� �� ������ �"������$��������pressure that would invest little in immunity would have a reduced life expectancy (see also Figure &�� in Horrocks et al. 20111� �������������;������)�������(���� �� ���� �����(���� ����� � �$ ���������������������� � � ��)�������(��������������������"������ ����� � �������than diseases (e.g. as a consequence of cold temperatures in winter 5��(� ������1�� � �����������������$ ������������� ��7 ��������5$�"��-����"D����� ���)11��������� ����"���"� �� ���/���������(����������-munity depends on pathogen pressure in the environment (Horrocks et al. 20111�� ��� �������� ���� (�������� �� ���� �$ ��������� 56�����S�1997). In this example immunity and life history are constrained, ������#�� ��)���������� ����%������� "���(� �������������� ������other physiological systems. �����������)���$$ ������������)�������������� ���� ����� ���������������� �������$�"������"���������(��������������������� "�� ���������/ ���approach is to include measurement of environmental factors -such ���������(���� ����"��$ ������ ����"��$ �������� ��#�����$��������$ ��-sure- in evolutionary studies on physiology and life history traits. -���� ���������� ������(���� ����"� 5�����������"�1988, Doxon et al. 20111�� $ ������ ����"� 5����� J������� ���� -���� � 1985�� �� ��������and Lovette 2007), and predation risk (e.g. Page and Whitacre 1975, Martin et al. 20111���(�������������� "������������ ���������������-�������� ��� ���������� ������ ���/������4���� ��� �� �#����"� ���� �$ �-������������������ ��� ���������� �������������/�������$����������������������������������������� ��������������� ���������������-�����"����� �������� ����� ���� ��� ��� ��(�� ���� �������� ������������
02468
10he
mm
aggl
utin
atio
ntit
er
sping migration breeding moult autumn migration winter
0
2
4
6
8
hem
olys
istit
er
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hapt
oglo
bin
(mg/
ml)
−40
0
40
80
120
E.co
li k
illed
(%)
0.5 1.5 2.5−200
−100
0
100
S.au
reus
kille
d (%
)
mass−specific BMR0.5 1.5 2.5 0.5 1.5 2.5 0.5 1.5 2.5 0.5 1.5 2.5
175
Figure 8.1 – Correlations between mass-specific BMR and the hemagglutination, hemoly-
sis, haptoglobin, and bactericidal ability against E. coli and S. aureus in subsequent life cy-
cle stages for three subspecies of stonechats and two hybrid lines. Kazakh stonechats are
represented by solid circles, Kazakh x European by grey squares, European stonechats by
white diamonds, Kenyan x European stonechats by grey triangles and Kenyan stonechats
by black triangles.
176
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
has the potential to evolve in response to its immune defence (Hor-rocks et al. 20111����� �������� ���������� 7 �$ ��������������$ � -� �"� ����� ����������� ���������"� 7���� �������/��/���� ����������� ��������� "������#��)�����7������ �����(��"�"�����/�����8�)�(� ���&�������$ �� ���� ��� �����������(� � ���� ����� ��)�"�� ��������;��������� ������ � �����"�������� � �������������"� �� ������ ������� � �������������������� �� ��������$������������� "������������ ��������-gists (e.g. cultivation, PCR, DGGE; West et al. 2008���������������Boersma 2011, Horrocks 2012D� ' �0� �� ��� ���� ��$� ������� ����1��+���)�"��������� ����$������������� � ��� ��� ������(� ������� ����������� ������)�������� � ���������������"������������ ����$�� �(West et al. 20081�����$������������ �� ���(����������� � ��5����������������1��8�)�(� ��������������������������������/�������������������� �-�)����$������������ ��������� � ���������������������������$-����������������� ������������������������$� �������������������� � ���is pathogenic in different environments. This is a crude assumption �������������� ����������!��������)����������������"�����$��������������������������� ��������� � ������ �����$���������� ���� ��������(�� �$���/�� $ ������ ���$��&��� ����� ���7$���������� ���� ��� ���#�(Troisfontaines and Cornelis 2005). These complexes, called type ������� �������"���������� ��� ���� ��������=���������������)������&����(for a review of its function see Troisfontaines and Cornelis 2005, 9���#����������� ��$�"�2010). Type III secretion systems occurs ������"�$���������� ���� ��������� ������������� ��"�������"� �������(Troisfontaines and Cornelis 20051��-���� ���� ���� ���)�����"$������secretion systems can help us compare pathogen pressures among ����� ������(� ���������+����� �������������� �����������������-�����������"� ���� ���� ����� ���� � ����-����7������� �$� ������� 5�������������������#��������1�����(� ����������������� ������������������-� ������������������� �����58� ��#���������2011). Once we have measured environmental factors, such as pathogen pressure, we can link them to physiological measures and life history traits. Also we ��������&$� ��������)� #�� "���������� ������(� ��������� ����� ���e.g. changing the pathogen pressure (Graham et al. 2011), and meas-ure the physiological and life history response of individuals. !���������$$ �������������� ���� ����� ���������������������������� ��)����$�"������������ ������������������� "�� �����)����� ���������-� ��$�"������"������ �������������������������)����������/���������� � ����������$� ��)���� ����������(�� ������� �������� ���� ����� ����� "�
Biotic factors -Food availability-Competition-Pathogen pressure-Predation risk-Etc.
Envi
ronm
ent
Org
anism
Constraints
Abiotic factors-Predictability-Temperature-Precipitation-Etc.
Life history traits -Clutch size-Longevity-Migration-Development time-Etc.
Physiology-Immune system -Metabolic rate-Endocrine system-Antioxidants-Etc.
177
Figure 8.2 – schematic representation of how environmental factors can shape
physiology and life history traits over evolutionary time scales. Environmental fac-
tors can select for physiological traits, which in turn constrain life history traits. For
example, in environments where food availability is generally low (e.g. deserts),
birds that have evolved a low metabolic rate, thus requiring little food, will survi-
ve better. However, having a low metabolic rate may constrain birds from having
a large clutch. Environmental factors can also select life history traits directly. For
example, in environments with high food availability, birds that have evolved a large
clutch size may have a higher fitness. However, spending a lot of resources on off-
spring may limit the resources that can be spent on self-maintenance, e.g. immunity.
Physiological systems also can constrain each other. For example, hormones can
influence immunity. Also, biotic environmental factors can evolve under selection
pressures from abiotic and biotic factors (including the organism itself).
178
Ch
apter v
iii | Syn
th
esis
� ����������������������� �$�������8�)�(� ��)������/�������� ����������������"������������������� �$����������(�����$�������$���� ��-ity that immunity and life history traits are somehow constrained. ��������������� ������&�������� ��$�"���������������� �����"� ����-(��(����<� ���������������� �����������"��� �� ����"����������$����understand the trade-offs and constraints within the immune system (Lee 2006), and the complexity of the immune system (Norris and Ev-ans 20001��!������������/���������������������������"�������� �����������"�������;������(�� �������$������ ������������/�������� ��� ��������������������������� ���������������"� �����������������$������(Demas et al. 2011). As a consequence, many methods are not easy to �$$�"�������7�������$��������� ��&��$��� ����������������������$�������$���/������ ������5�����,��!D�����������������2008). The methods we used in this thesis to measure constitutive innate immunity are $� ������ �"�������� ����������"����� �������)�������������$�������-������� ��� ���� /����� ���� � �� ���� ��$������� ��� �$�����7�$���/�� �� -stances. However, the constitutive innate immune system consists of many more cells, proteins and peptides (Janeway et al. 2004), many of which are still unexplored in non-model species. Recently, new ����������(�� ������(���$����������� ����������������$ �����������peptides. For example, Horrocks et al. (20111���(������ � ����������"��������� �������������$ �������(�� ����� ����+(�� ����� ��� ��������� �������������������� ������� ���� � ���5�#�� �2010). Besides clear-������$� �������� �������� ���� � ��������������� ���� �������$ �$� -����� 5� ������������19981��+(�� ����� ����������� ���� ��"������������������� "� � ��� $�����(�� ���� � ��� ������(�� ���� ���� ������ ����(� �����5���������������1983, 1985, Giansanti et al. 2007). The method ��������"�$� �� ����)������������ �����$���������$�������� ������7�$���/������$���������� ���� ��������������#�����$� ������ �"���� ����(��to (comparative) ecological studies. 9������� ��������� ��������� ���������� ������� �������"�� ������-ing measurements of the acquired immune system can give us new insights in the constraints within the immune system, and among physiological systems and life history traits. A recent study compares certain signaling proteins of the acquired immune system, the cy-tokine interleukin-6 (IL-61�� ��� �)��)���� � ��$�$��������� 5!�������et al. 20101��6"��#������ ���������������������� �������� "��������cells, and are involved in fever and sickness response (Janeway et al. 2004). Adelman et al. (20101����$�����������"��������� ���������,76
179
��$�������� �)������������5����+� ���������1988). IL-6 is released in the plasma upon infection, and concentrations of the molecule can �������(��� ��� in vitro with this assay, using only a small plasma sample. IL-6� ��� ��(��(��� ��� ���� ������ $����� ��$������ ��� ����� ��-� ������ �$ ������(���� ��������� ����������������%������� ��������-�� "� 5��(�� ����������1990). These properties of IL-6 make it likely ��������"�$��"��� ����������� ������� ��)���� �$ �����������������-�����"������������ ��������� ���������� �����������������;�� ���immunity will give us insights in how different arms of immunity are organized. This can help us understand how immunity and other physiological systems are constrained. Measurement of other physiological systems, especially those that $���������"� ���#����� ����� ���� ���� �������"�� ���� �����$�������������&�������"��������������������"�����������$���������"����#����� �-�������������"��������������� "�� ������!����&�������$ ���������� ��"�� ���� ��7 ���������������������������������������������� ����(��(���in aging and mortality, an important life history trait (Harman 1956, Beckman and Ames 1998). Free-radicals are produced during me-�� ������������(�� �����"$������0�������� �������$� ��������#� �-�)�������� ����� �������� ���������� "� � ����� 5�$��#����2005). Also �� ���� ��%���������� ��� ��$� ����� ������� �������� ��� ������������&�����(������������������(���� ��������59��#��������!����1998). Some antioxidants (e.g. carotenoids, vitamin E; Puthpongsiriporn et al. 2001, Hughes 2001, McGraw and Ardia 2003) and free-radicals (e.g. nitric oxide; Sild and Hõrak 2009) are involved in the immune system as well. At the same time, some indices considered as part of ���� ������� �"��������(�� �����&������ $ �$� ����� 5����� ��$����� ��D�Gutteridge 1987). These properties of the antioxidant system make ����� ��#��"����������� ���$ �(���� ��������� ��� ���#�� ��)�������� �����rate, immunity and life history. Measuring a wider range of immune indices and/or a multitude of physiological systems in closely related �$������)��������� �������������� "�� ������������"������� ��������)����measurement of environmental factors, will increase our understand-ing of how physiology and life history traits are connected.
180
REFERENCES
A! ����8������,�����4���������2010. Principal component analysis. Wiley Interdis-
ciplinary Reviews: Computational Statistics 2:433-459.Ackermann, R. R. and J. M. Cheverud. 2000. Phenotypic covariance structure in
tamarins (genus Saguinus): A comparison of variation patterns using matrix correlation and common principal component analysis. American Journal of Physical Anthropology 111:489-501.
Adamo, S. A. 2004��8�)�������� ���(��� ������������������ $ �������� ����������immunity? Animal Behaviour 68:1443-1449.
!���������������'����9�����"�� ���6��4���/�����,��9��-� ��������-��8����2010. ��$������������� �����������(� ��������#����� ���(�� �������)����$���� ���*�!�role for cytokines. Journal of Experimental Biology 213:4099 -4109.
!���0� ������!���� ��������8������������8�������-�������������������������2006. Seasonality and the dynamics of infectious diseases. Ecology Letters 9:467-484.
!� ���������������������9 �����)��1988�����)��� ���������� ��"������� ��������� � ��7 �������� ���� ��$��(��4����79 �)��� �� � ) �����Sericornis fronta-lis (Acanthizidae), from arid, semi-arid and mesic environments. Australian Journal of Zoology 36:29-51.
!$�����������������6������� ����2006���� ������������ �����'���(����� ��$���-��(��"� ���������� �$ ������(��$� �� ����������� ����7��(������ � ��� ����6��-mon Tern (Sterna hirundo). Oecologia 147:12-23.
Ardia, D. 2005. Tree Swallows trade off immune function and reproductive effort differently across their range. Ecology 86:2040-2046.
Ashmole, N. P. 1963�� ��� ���������� ������ � �� ��� � �$����� �������� � ���� � ���103 *458-473.
Avise, J. C. and W. S. Nelson. 1989. Molecular genetic relationships of the extinct Dusky Seaside Sparrow. Science 243:646-648.
BBai, Y., R. M. Shakeley and G. Attardi. 2000����������� ������ ��$� ������ "��!�8�
dehydrogenase ND5� �� ����� ����� �&$ ������� ���-�������������� ����-�-lecular and Cellular Biology 20:805 -815.
181
Baldwin, M. W., H. Winkler, C. L. Organ and B. Helm. 2010. Wing pointedness as-sociated with migratory distance in common-garden and comparative studies of Stonechats (Saxicola torquata). Journal of Evolutionary Biology 23:1050-1063.
Ballard, J. W. O. and D. M. Rand. 2005�����$�$�������� �����"������������� ����DNA and its phylogenetic implications. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics 36:621-642.
Ballard, J. W. O. and M. C. Whitlock. 2004. The incomplete natural history of mitochondria. Molecular Ecology 13:729-744.
9�������� ���������8��9�� �����2006�� ��������� ��)����������������� ���������������7������������ ��� "�$���� ���*�� ����%�&� ����"��������!� �����)���� ����area. Journal of Ornithology 147:266-273.
9�������� �����������.��8�������8��9�� �����2008. Migratory stopover conditions �������������(���$�������������������������������'� ����4� �� ��5Sylvia bo-rin). Hormones and Behavior 54:312-318.
9�������� ������!��4������������8��9�� �����2005��<��&� ��� �������������� -������0���� �����$ ������� �������������'� ����4� �� ��5Sylvia borin). Zool-ogy 108:97-106.
9�����6������,������������'��4��'� ��������1999����$���� ����"���� ��������� �-�������� �������������������)�#���Rissa tridactyla. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 266:2161 -2167.
Becker, W. A. 1984. Manual of quantitative genetics. Academic Enterprises, Pull-man, USA.
Beckman, K. B. and B. N. Ames. 1998. The free radical theory of aging matures. Physiological Reviews 78:547 -581.
9���#�����������!���������6��'����� ��$�"��2010. Bacterial secretion systems with an emphasis on the Chlamydial type III secretion system. Current Issues in Molecular Biology 12:17-41.
Benson, A.-M. and K. Winker. 2001����������� ������� ���������$���"�������high-latitude passerine migrants. The Auk 118:513.
Biancucci, L. and T. E. Martin. 2010. Can selection on nest size from nest preda-tion explain the latitudinal gradient in clutch size? Journal of Animal Ecology 79:1086-1092.
Blackmer, A. L., R. A. Mauck, J. T. Ackerman, C. E. Huntington, G. A. Nevitt and J. B. Williams. 2005��&$�� ��������(������;�����"*� ��������� ����� ��������reproductive performance in Storm-Petrels. Behavioral Ecology 16:906 -913.
Blier, P. U., F. Dufresne and R. S. Burton. 2001. Natural selection and the evolu-tion of mtDNA-encoded peptides: evidence for intergenomic co-adaptation. Trends in Genetics 17:400-406.
Boake, C. R. B. 1989����$���� ����"*����� ��������(�������� "������������������� �-havior. Evolutionary Ecology 3:173-182.
9T#��"������!��J��,���(����!��,�#� ��<��!������ �����6��4���/��������+��6��������2009���� ���� ��$�������������(�������� �$ ��������*�� �� � ���$ ������$� -ents? American Naturalist 173:589-598.
Bonneaud, C., J. Mazuc, G. Gonzalez, C. Haussy, O. Chastel, B. Faivre and G. Sorci. 2003. Assessing the cost of mounting an immune response. American Naturalist 161:367-379.
182
Referen
ces
Boots, M. and R. G. Bowers. 2004. The evolution of resistance through costly ac-quired immunity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 271:715 -723.
Breuner, C. W., M. Orchinik, T. P. Hahn, S. L. Meddle, I. T. Moore, N. T. Ow-��7!����"��������$� "��������6��4���/�����2003. Differential mechanisms for regulation of the stress response across latitudinal gradients. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 285:R594 -R600.
Broggi, J., E. Hohtola, K. Koivalu, M. Orell, R. L. Thomson and J.-Å. Nilsson. 2007�� ��� ���� ��� (� ������� ��� )���� � ��������� ����� ���� ��� ���� ' ���� ����Functional Ecology 21:528-533.
9 ��#�����������!�����8�� � ������-�����9 �����1997�����$ �����$� ��� ����"������$������������� ������������ ��� ���� ���� ����$���$����$���*������-fect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomem- �����1330:157-164.
Brzêk, P., K. Bielawska, A. Ks��ek and M. Konarzewski. 2007. Anatomic and mo-������ ��� ������������(� ����������������� � ��������� ����� ��������� � ��� "�Mice. Physiological and Biochemical Zoology 80:491-499.
9����� �����-������ 9���������� � #��9� =�#�� �(��4��'�"������ ��� ���)� ��� 9��I. Tieleman and T. Piersma. 2008a. Constitutive immune function responds �� �����)�"��������������� ����������� ������� ������������ � � �����"�������-cal and Biochemical Zoology 81:673-681.
9����� �����-���<��������7������-���������<���>0�����9���������������������� �����2009. Limited access to food and physiological trade-offs in a long-distance ��� ������� � � �����������������(�������������������������������7$����� �-sponse. Physiological and Biochemical Zoology 82:561-571.
Buehler, D. M., T. Piersma and B. I. Tieleman. 2008 ��6�$��(�� ���� � ��7��(����Red Knots Calidris canutus� �&�� ��� ����� ������ ��� ���7�������� �������"�that suggest different immune strategies in different environments. Journal of Avian Biology 39:560-566.
Buehler, D. M., T. Piersma, K. D. Matson and B. I. Tieleman. 2008c. Seasonal re-���� � ��������������������������������� ������� � � �*�������7�"�������������(� ������=��������������� ���� �������!�� ��������� ������172:783-796..
Buehler, D. M., B. I. Tieleman and T. Piersma. 2010. How do migratory species stay healthy over the annual cycle? A conceptual model for immune function and for resistance to disease. Integrative and Comparative Biology 50:346 -357.
9����� �����-���-�� !�� �� ��������������-������ ����9�� ��� ���������2011. One $ � ��������"����������*����$����������������$$ ����������$��� �(����������-plexity of the immune system in an ecological context. PLoS ONE 6:e18592.
9� ������'���������6��A��� � ���������4��8������#���2001����"��������������� ��-����������� ���������� ������0��������� �"��&$������ ����� ����)����)���Journal of Experimental Biology 204:1491 -1501.
Bush, N. G., M. Brown and C. T. Downs. 2008. Seasonal effects on thermoregula-tory responses of the Rock Kestrel, Falco rupicolis. Journal of Thermal Biol-ogy 33:404-412.
183
CChalfoun, A. D. and T. E. Martin. 2007��,�����������(� �����������(�������� ������
attentiveness and a test of the food limitation hypothesis. Animal Behaviour 73:579-585.
Chamane, S. C. and C. T. Downs. 2009�������������������������� ������������� -�� ���������� � �������� ��� �������7)������ ��� ����� 5Onychognathus morio). Journal of Thermal Biology 34:337-341.
Charnov, E. L. 1993. Life history invariants. Oxford University Press, Oxford, UK.Cichon, M. 1997. Evolution of longevity through optimal resource allocation. Pro-
ceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 264:1383-1388. Clark, W. R. 2008. In defense of self: how the immune system really works. Oxford
University Press, New York, USA.Clausen, J., D. D. Keck and W. Hiesley. 1940. Experimental studies on the na-
ture of species I. Effects of varied environments on western North American $�������6� ���������������������4������������ ����������520:1-452.
Cody, M. L. 1966. A general theory of clutch size. Evolution 20:174-184.Cooper, S. J. 2000. Seasonal energetics of Mountain Chickadees and Juniper Tit-
mice. The Condor 102:635-644. Cooper, S. J. and D. L. Swanson. 1994. Seasonal acclimatization of thermoregula-
tion in the Black-Capped Chickadee. The Condor 96:638-646. Crawley, M. 1993. GLIM for ecologists, 1st edition. Wiley-Blackwell, Oxford, UK.Crawley, M. J. 2007������7 ��#�4���"�����������6�������� �����
DDaan, S., D. Masman and A. Groenewold. 1990��!(���� ��������� ����� ����*���� �
������������)���� ��"����$��������������� �"��&$������ ��������� ���!�� �-can Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiol-ogy 259:R333 -R340.
Das, J. 2006. The role of mitochondrial respiration in physiological and evolution-ary adaptation. BioEssays 28:890-901.
Davey, G. P. and J. B. Clark. 1996. Threshold effects and control of oxidative phos-$�� "��������������"��$�������� ������������� ������� ���������� �����-istry 66:1617-1624.
Dawson, W. 2003. Plasticity in avian responses to thermal challenges - An essay in ���� �������� �-� �� ���� ������� �������J�����"�49:95-109.
Dawson, W. R. 1982��(�$� ���(������������)��� � "� � ����6��$� ���(��9��������-try and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 71:495-509.
��� �� � ���6������! $����������������������9����1997. Reproductive effort de-� ���������� ��"� ��$����(�������� �������������������"���������"�9*�9������-cal Sciences 284:1021-1029.
��� �� � ���6���'�����<��+(� #��$��'��8������� ��������������1998. Compensa-����� ��� ����������� ������ �� ��&$� ��������"� ��� ����������(��"�� ��� �������Comparative Physiology B 168:507-512.
���� ��� <��� ���-��;�� ���-���������� ����6�� ,�� � ���1983. Characterization �����6���#���������� ��7 �������$ �����*�!���(�����$����� ����6��$� ���(��
184
Referen
ces
Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 74:745-748.
�������'��������!��J"�������9�����9������ ��-�����-������ ��������������< ������2011�� 9�"���� $�"����������������*� ���������� (� �� ���� ������� ���������across ecological contexts. Journal of Animal Ecology 80:710-730.
��� �� ��<������9��-�)����1997. Acute stress enhances while chronic stress sup-$ ����������7����������������"����(�(�*�!�$��������� ������ ����#��"���� ��/�#-ing. Brain Behavior and Immunity 11:286-306.
Dietz, M. W., S. Daan and D. Masman. 1992. Energy requirements for molt in the Kestrel Falco tinnunculus. Physiological Zoology 65:1217-1235.
Dietz, M. W., T. Piersma and A. Dekinga. 1999�� 9��"7 ��������)������� $�)� �� ������*�����������"� ���������$���� �����������"$� � �$�"� ��� ���/������� � � ������� �������&$� ��������9�����"�202:2831 -2837.
Dittami, J. P. and E. Gwinner. 1985. Annual cycles in the African Stonechat, Saxi-cola torquata axillaris, and their relationship to environmental factors. Jour-nal of Zoology 207:357-370.
�� "�0"�#���4�� 1997�� 9���������� ���������� ��� ��$����� ��7��)� $������ ��� ���old puzzle. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Bio-chemistry: Journal of the Forum of European Clinical Chemistry Societies 35:647-654.
Dohm, M. R. 2002����$���� ����"��������������������)�"�� ��������$$� � ������ ����� ��� ����"��<���������������"�16:273-280.
Doucette, L. I. and F. Geiser. 2008. Seasonal variation in thermal energetics ��� ����!��� ������+)���7�����=� � 5Aegotheles cristatus). Comparative Bio-chemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 151:615-620.
Dowling, D. K. and L. W. Simmons. 2009. Reactive oxygen species as universal constraints in life-history evolution. Proceedings of the Royal Society B: Bio-logical Sciences 276:1737-1745.
Doxon, E. D., C. A. Davis and S. D. Fuhlendorf. 2011. Comparison of two methods �� ����$�������(� �� ����*�������������)��$7�������$��������� �������<�����Ornithology 82:60-67.
Dray, S. and A.-B. Dufour. 2007. The ade4 package: Implementing the duality dia-gram for ecologists RID B-4107-2010. Journal of Statistical Software 22:1-20.
Drent, R. H. and S. Daan. 1980�����$ ������$� ���*��� ��������=��������� ����(���� ��������! ����68:225-252.
Duckworth, R. A. 2010. Evolution of personality: developmental constraints on ���(�� ���%�&� ����"�����!�#�127:752-758.
EEllison, C. K. and R. S. Burton. 2006. Disruption of mitochondrial function in
���� $�$���������" �������Tigriopus californicus. Evolution 60:1382-1391. ��������������������<��'��8��9�� �����2011. A review of molecular methods to
����"� ������� � ����� ��� ����� ���� �����"���$�� ���� �$���� ��� ���� ��������Biology 47:77-87.
185
��������,������!�����8�� � ���1985. An allometric comparison of the mitochondria of mammalian and reptilian tissues: The implications for the evolution of en-dothermy. Journal of Comparative Physiology B 156:3-11.
���������,������-��� � �����������8�)�����2004. Comparative genomics and the evolution of human mitochondrial DNA: assessing the effects of selection. The American Journal of Human Genetics 74:229-238.
(�������6����������������������������76��9�������� �����������>��2001. Predic-�������� ��������� ������� ���� ������0�� ��� �������*� ����������$� ��� �� ������������������������ ����"��!�� �������� ���������"������"�7��������� "������-grative and Comparative Physiology 280:R1887 -R1896.
FFalconer, D. S. and T. F. C. Mackay. 1996. Introduction to quantitative genetics.
Longman., New York, USA.Flury, B. 1988. Common principal components and related multivariate models.
Wiley, New York, USA.<����������������!���>$ �0��-�����'�� ������������ ����2005. Nonshivering ther-
mogenesis capacity associated to mitochondrial DNA haplotypes and gender in the greater White-Toothed Shrew, Crocidura russula. Molecular Ecology 14:661-670.
GGadgil, M. and W. H. Bossert. 1970. Life historical consequences of natural selec-
tion. American Naturalist 104:1-24. Gessaman, J. A. 1987. Energetics. Pages 289-320 Raptor management techniques
manual. Institute for Wildlife Research, National Wildlife Federation, Wash-ington D.C., USA
Giansanti, F., M. F. Giardi, M. T. Massucci, D. Botti and G. Antonini. 2007. Ovo-� ����� ����&$ ����������� ������� "�6���#�����������������������)����-� �#.��disease virus. Biochemistry and Cell Biology 85:150-155.
'� ���8��,��1988��8� ��� ����"��������������������������0������� )��.���������ground Finches (Geospiza fortis). Evolution 42:750-762.
Gilmour, A. R., B. J. Gogel, B. R. Cullis, S. J. Welham and R. Thompson. 2006. ASreml reference manual, 1�������������������� ���������,�����8�����8��$-stead UK.
Godfray, H. C. J., L. Partridge and P. H. Harvey. 1991. Clutch size. Annual Review of Ecology and Systematics 22:409-429.
Gonzalez, G., G. Sorci and F. de Lope. 1999. Seasonal variation in the rela-�������$� ��)����������� �������� ��$��������� �������0����������8������$� �)�� 5����� � ����������1�� 9���(�� ��� �����"� ���� ����� �����"�46:117-122.
'�"������4������'����� ������)� ���8��<���#���������������8�����)� ��������Gwinner. 2006��������� ���������� ������� ������ �������� ��������"�������equatorial and European Stonechats (Saxicola torquata axillaris and S. t. rubicola). Hormones and Behavior 50:779-785.
186
Referen
ces
Graham, A. L., D. M. Shuker, L. C. Pollitt, S. K. J. R. Auld, A. J. Wilson and T. J. Little. 2011. Fitness consequences of immune responses: Strengthening the empirical framework for ecoimmunology. Functional Ecology 25:5-17.
' �� ��� �� �� -��� �� 6�$ ���� ���� ��� 9U�����7'������ 2010. Evolution of avian clutch size along latitudinal gradients: Do seasonality, nest predation or �������������������������� V���� �������(�������� "�9�����"�23:888-901.
'�� ��� ������-����8��� � ��������7<��'�>�����2004. Ecology drives the world-)�������� � ��������������������������,���9�����"�2:e141.
Gutteridge, J. M. C. 1987����������&����������(��"������$����� ��� ��)� ������-����� ��7�������������$���$� �&���������9�������������9��$�"�����!����599!1�7�,�$��������,�$���-��� ������917:219-223.
Gwinner, E. 1996. Circadian and circannual programmes in avian migration. Journal of Experimental Biology 199:39 -48.
Gwinner, E. and A. Scheuerlein. 1999. Photoperiodic responsiveness of equatorial and temperate-zone Stonechats. The Condor 101:347-359.
Gwinner, E., S. König and C. Haley. 1995a. Genetic and environmental factors ��%�������� ������� ��0�� ��� �;���� ���� ���� ���$� ���� 0��������������� 5Saxi-cola torquata axillaris and S. t. rubicola): An experimental study. The Auk 112:748-755.
Gwinner, E., S. König and M. Zeman. 1995 ���������������������,8���������� �"��������� �$���������������*����������$�� � �������$� �������$������������pattern of circannual cycles. Journal of Comparative Physiology A 177:73-79.
')���� �������������� ����������������1987. Haltung, Zucht und Eiaufzucht Afrikanischer und Europäischer Schwarzkehlchen Saxicola torquata. Gefed-erte Welt 111:118-120, 145-147.
HHahn, T. P. and S. A. MacDougall-Shackleton. 2008. Adaptive specialization, con-
ditional plasticity and phylogenetic history in the reproductive cue response �"��������� � �����������$������ ��������������������"���������"�9*�9����������Sciences 363:267-286.
Harman, D. 1956��!����*�!����� "� ��������� ��� ����������� ���������������� "��Journal of Gerontology 11:298-300.
Harper, E. 1998. Changing perspectives on aging and energy requirements: Ag-����� ��"�)���������� ��"����$�����������8����������������6�������� ����of Nutrition 128:2627S-2631S.
Harvey, P. H., M. D. Pagel and J. A. Rees. 1991��-������������� ���������������histories. American Naturalist 137:556-566.
8�����;�������������!��-� �������4����� �����������6��4���/�����1999. Is avian ���� ��� ���������$������� ��$$ ������ "� �������� ���V� 9���(�� ��� ���-��"���������� �����"�45:167-175.
Hau, M., R. E. Ricklefs, M. Wikelski, K. A. Lee and J. D. Brawn. 2010. Corticoste- ������������� ������������7����� "��� ����������� � ����� �������������������"���Society B: Biological Sciences 277:3203 -3212.
187
Hayes, J. P., T. Garland and M. R. Dohm. 1992������(������(� �������������� �-lism and reproduction of Mus: Are energetics and life history linked. Func-tional Ecology 6:5-14.
8�"��������6��9� ����������9������1998����$���� ����"��������������$�"������"*�Evaporative water loss and oxygen consumption of Dipodomys merriami. Journal of Mammalogy 79:475-485.
8�� ����!���������9� �������'��-�� ��������R�� �� ��1994. Inheritance of a novel migratory direction in central European Blackcaps. Naturwissenschaften 81:184-186.
Helm, B. 2003. Seasonal timing in different environments: comparative studies in Stonechats. Ludwig-Maximilian Universität, Munich, Germany.
Helm, B. 2009. Geographically distinct reproductive schedules in a changing world: Costly implications in captive Stonechats. Integrative and Compara-tive Biology 49:563 -579.
Helm, B. and E. Gwinner. 1999�����������$���=�(�������������!� �����5Saxicola torquata axillaris ) and European (Saxicola torquata rubicola) Stonechats: Effects of genetic and environmental factors. The Auk 116:589-603.
Helm, B., W. Fiedler and J. Callion. 2006. Movements of European Stonechats Saxicola torquata according to ringing recoveries. Ardea 94:33-44.
Helm, B., E. Gwinner and L. Trost. 2005��<��&� �������������������������� ��� "� ���(�� *���������� ������������� �������$ �� �����!���������������)�A� #�Academy of Sciences 1046:216-227.
8�����9���������)� ��������')���� ��2009��6� �������� ������������ �$������"���������� � ���������������� �������&$� ��������9�����"�212:1259 -1269.
Hill, R. W. 1972������ �������������&"����������$����� "������������$� ����-netic oxygen analyzer. Journal of Applied Physiology 33:261-263.
Hõrak, P., L. Saks, I. Ots and H. Kollist. 2002����$���� ����"���� ���������� ����-���������$��(��' ���/������5Carduelis chloris). Canadian Journal of Zoology 80:636.
Hõrak, P., L. Saks, M. Zilmer, U. Karu and K. Zilmer. 2007. Do dietary antioxi-dants alleviate the cost of immune activation? An experiment with Green-/����������!�� ��������� ������170:625-635.
Hõrak, P., M. Zilmer, L. Saks, I. Ots, U. Karu and K. Zilmer. 2006. Antioxidant $ ������������ ����������������������������������������������' ���/�������Journal of Experimental Biology 209:4329 -4338.
Horrocks, N. C. P. 2012. The role of disease risk and life history in the immune function of Larks in different environments. University of Groningen, Gron-ingen, The Netherlands.
Horrocks, N. P. C., B. Irene Tieleman and K. D. Matson. 2011. A simple assay for ����� ����������(�� ����� ���E����� #� ������%�������������������������� � ����-���������������"�����(�������2:518-526.
Horrocks, N. P. C., K. D. Matson and B. I. Tieleman. 2011. Pathogen pressure puts immune defense into perspective. Integrative and Comparative Biology 51:1–14.
Houle, D. 1992��6��$� �����(��(� ����"�����(� �� ����"����;���������(��� ������'�-netics 130:195 -204.
188
Referen
ces
Houle, D. 2009����� � ����������� ������� ������*������� �����������������$ ������of phenomics. Proceedings of the National Academy of Sciences 107:1793-1799.
Houle, D., J. Mezey and P. Galpern. 2002. Interpretation of the results of common principal components analyses. Evolution 56:433-440.
Hughes, D. A. 2001. Dietary carotenoids and Human immune function. Nutrition 17:823-827.
8�� � ���!������������,�������2005��-�� ��������������������������� �"���������Journal of Experimental Biology 208:1593 -1599.
8�� � ���!������������$���������9���������������4��!��9������ ��2007. Life and �����*����� ����� �������� �������$�������������������$�����������������"�-iological Reviews 87:1175 -1213.
8���������������8��9�� �����1996. Digestive tract function in the long-distance ��� ��� "�'� ����4� �� ��Sylvia borin. Journal of Comparative Physiology B 166:388-395.
I� ������8�������� �)��� ���A�����������������!�#���1998�� ������/���������� ��
������������� ���� �����������)�����������7�� ������(�� ����� ����9����������et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1401:289-303.
Illera, J. C., D. S. Richardson, B. Helm, J. C. Atienza and B. C. Emerson. 2008. ��"���������� ����������$��� ������ �$�"������$��������� ��� �����(����������Saxicola. Molecular Phylogenetics and Evolution 48:1145-1154.
Ilmonen, P., D. Hasselquist, A. Langefors and J. Wiehn. 2003. Stress, immuno-���$������� ���� ���#��"��� $ �/���� ��������<�"������ �� ��� �������� ��� ����size manipulation. Oecologia 136:148-154.
JJaneway, C. A., P. Travers, M. Walport and M. J. Shlomchik. 2004�������� ���-
ogy: The immune system in health and disease, 6������������'� ������� ����-ing, New York, USA.
Johnson, M. D. 2000. Evaluation of an arthropod sampling technique for measur-����������(���� ����"��� ��� �����������(� ���� � ������� �������<�����+ ������-ogy 71:88-109.
Johnson, M. S., S. C. Thomson and J. R. Speakman. 2001. Limits to sustained ��� �"�����#�����,������������������ � ��� "�-�����Mus musculus. Journal of Experimental Biology 204:1925 -1935.
Joseph, M. M. and A. H. Meier. 1973. Daily rhythms of plasma corticosterone in the Common Pigeon, Columba livia. General and Comparative Endocrinol-ogy 20:326-330.
KKersten, M. and T. Piersma. 1987��8���7��(���������� �"7�&$������ �������� � � ���
7����� ��������$���������! ����75:175-187.
189
Kersten, M., L. W. Bruinzeel, P. Wiersma and T. Piersma. 1998���������� ��������� ����� ���������� ��� "�)��� ��)���� ���������������!� �����! ����86:71-80.
����� ����������� ��������� � ���-�� ���6�)��� ��� ���'�� �� #� � ����6�� J����������1996. Phenotypic engineering: using hormones to explore the mechanistic ��������������� ��������$�����"$���(� �������������� ���� ���138:70-86.
Keverne, E. B. 2007. Genomic imprinting and the evolution of sex differences in mammalian reproductive strategies. Pages 217-243. Genetics of sexual dif-�� ���������� ���� ��&����"� ���� $���� ���(�� �� 5������� A�������1�� ���(�� �Academic Press Inc, San Diego, USA.
King, J. R. 1974������������������������������������� �"� ���� ������� � ����������4-85�!(������� �������5������!����"��� 1���������+ ��������"�6�� ��6�� �����MA,USA.
Klaassen, M. 1995��-��������� ��������� ������������������������)���� �$���������Stonechats: the European Saxicola torquata rubicula and the East African S. t. axillaris. Oecologia 104:424-432.
Klasing, K. 2004. The cost of immunity. Acta Zoologica Sinica 50:961-969.Konarzewski, M. and J. Diamond. 1995�� (�������� ��� ��������� ����� ���� ����
� ���������������� � ��� "�-�����(��������49:1239-1248. König, S. and E. Gwinner. 1995��< �;����"����� ������������������(�� ����� ���
captive African and European Stonechats Saxicola torquata axillaris and S. t. rubicola. Journal of Avian Biology 26:247-254.
Korzeniewski, B. and J.-P. Mazat. 1996. Theoretical studies on control of oxidative phosphorylation in muscle mitochondria at different energy demands and oxygen concentrations. Acta Biotheoretica 44:263-269.
Kruuk, L. E. B. 2004. Estimating genetic parameters in natural populations us-���� ����2������������3���������$������ �������������� ������"���������"�9*�Biological Sciences 359:873-890.
Ksi���#��!���-������ 0�)�#���������9��W�$���2004. Anatomic and energetic corre-�����������(� ����������������� � ��������� ����� ��������� � ��� "�-�������"��-ological and Biochemical Zoology 77:890-899.
Kvist, A. and Å. Lindström. 2001��9��������� ����� ���� ������ ��� "�)��� �*� ��-� �7����(���������� ��$���/������� �$���/���������������(� ��������<����������Ecology 15:465-473.
LLack, D. 1947����������/���������������7��0���� ���89:302-352. Lacy, R. C. and C. B. Lynch. 1979. Quantitative genetic analysis of temperature
regulation in Mus musculus������� ��������������� �������'��������91:743-753.Lande, R. 1979. Quantitative genetic analysis of multivariate evolution, applied to
���7 ��"���0��������� "��(��������33:402-416. Lande, R. 1986. The dynamics of peak shifts and the pattern of morphological
�(�������������� �����"�12:343-354. ,���"���-��-���-����������#"��������6��4���/�����2006. Actions of glucocorticoids
��� �� ��������� �������� ��� ���$� ��� ��� �� ���7 ������� ��(���� ��� ���� �������������periodic life processes. General and Comparative Endocrinology 148:132-149.
190
Referen
ces
,���"���-��-���-����������#"������� ����������#�����������6��4���/�����2002. Baseline and stress-induced plasma corticosterone during long-distance mi-gration in the Bar-Tailed Godwit, Limosa lapponica. Physiological and Bio-chemical Zoology 75:101-110.
Lee, K. A. 2006. Linking immune defenses and life history at the levels of the in-dividual and the species. Integrative and Comparative Biology 46:1000 -1015
Lee, K. A. and K. C. Klasing. 2004��!� ���� �� � ���������"� ��� ��(������ �����"��Trends in Ecology and Evolution 19:523-529.
,�������!���-��4�#���#���4������� �������������� �������������6�����������2008. 6���������(�������������������� ������)��������7����� "�(� �� �������� �$����� � ������� �������!�����������"�77:356-363.
Lessells, C. M. and P. T. Boag. 1987���� �$���� ��� �$���� �������*�!�����������-take. The Auk 104:116-121.
Levy, A. 1964��������� ��"���� ���� � ������� �������� �� �����%�)������ �-���������� ��������������/������ �������41:449-453.
Lindström, Å. 1997��9��������� ����� ����� ������ ������)��� �� ��� ����� ������Arctic. Journal of Avian Biology 28:87-92.
,����� U���!���'��8������� ��������������1993. The energetic cost of feather syn-������� ���$ �$� ������� ��� ��������� ����� �������"�����������J�����"�66:490-
510. Lindström, K. M., D. M. Hawley, A. K. Davis and M. Wikelski. 2005. Stress re-
sponses and disease in three wintering House Finch (Carpodacus mexicanus) populations along a latitudinal gradient. General and Comparative Endocri-nology 143:231-239.
,=����������������+�����������,��!��4������������2002����� �7�� ��%��������������cellular immunity of Tree Swallows feeding nestlings. Oecologia 130:185-190.
,�������� �����,������6����� �� � ���2000. Trade-offs in evolutionary immunol-��"*�=����)��������������������������"V�+�#���88:87-98.
Lovegrove, B. G. 2003�� ��� ��%������ ��� �������� ��� ���� ��������� ����� ���� ����������������*� �� ���)7��������� ����� ����������� ��� ���� ���6��$� ���(��Physiology B 173:87-112.
Lynch, M. and B. Walsh. 1998. Genetics and analysis of quantitative traits. Sinau-er Associates Inc., Sunderland, USA.
MMacDougall-Shackleton, S. A. and T. P. Hahn. 2007. Adaptation and evolution of
$����$� ���� ��$������"��������� � ������� �������+ ��������"�148:219-224. Machado-Filho, R. A. N., G. M. Balsamão and M. Â. Marini. 2010. Seasonal differ-
����������������$ �/�������� ��"������������������ ��� "�����$� �������resident neotropical Flycatchers. The Condor 112:579-590.
Maddocks, T. A. and F. Geiser. 2000. Seasonal variations in thermal energetics of Australian Silvereyes (Zosterops lateralis). Journal of Zoology 252:327-333.
-��0��������-�� ����-��A�0��� �#�����2003�� ������� ���������� "�8��������parasites: cellular and molecular mechanisms. Nature Reviews: Immunology 3:733-744.
191
-����������������'��6�(�� ����6����������-��6��������������� ����2008. Physi-ological responses in Rufous-Collared Sparrows to thermal acclimation and seasonal acclimatization. Journal of Comparative Physiology B 179:335-343.
Marais, M., S. K. Maloney and D. A. Gray. 2011��!� ��������$� ��� ������������the magnitude of LPS-induced fevers in Pekin ducks. Journal of Thermal Bi-ology 36:121-127.
Martin, L. B. 2005�� ���7����� ��)������������������������(��"�����)��$�$���-tions of House Sparrows (Passer domesticus). Canadian Journal of Zoology 83:780-787.
Martin, L. B., J. Gilliam, P. Han, K. Lee and M. Wikelski. 2005. Corticosterone ��$$ ��������������������������������������$� ���� �������� �$�����8�����Sparrows, Passer domesticus. General and Comparative Endocrinology 140:126-135.
-� �����,��9���-��������� ����(� ��������-��4�#���#���2004. Immune activity in temperate and tropical House Sparrows: A common-garden experiment. Ecol-ogy 85:2323-2331.
Martin, L. B., Z. M. Weil and R. J. Nelson. 2006����/������$$ �������������(� -sifying directions in ecoimmunology. Integrative and Comparative Biology 46:1030 -1039.
Martin, L. B., Z. M. Weil and R. J. Nelson. 2007. Immune defense and reproduc-tive pace of life in Peromyscus Mice. Ecology 88:2516-2528.
Martin, L. B., Z. M. Weil and R. J. Nelson. 2008����������������������(� �� ���������������(��"*����������� "�$�"������������ ���7�������������$������ ���-actions of the Royal Society B: Biological Sciences 363:321-339.
Martin, T. E., P. Lloyd, C. Bosque, D. C. Barton, A. L. Biancucci, Y. Cheng and R. Ton. 2011. Growth rate variation among passerine species in tropical and ���$� ���������*��������������������� ������� ��)����$� �����������$ �(�����-ing and nest predation risk. Evolution 65:1607-1622.
Matson, K. D., A. A. Cohen, K. C. Klasing, R. E. Ricklefs and A. Scheuerlein. 2006a. No simple answers for ecological immunology: relationships among ��������������������������(��������(��� ��#���)����������$��������(������)�-terfowl. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 273:815-822.
Matson, K. D., R. E. Ricklefs and K. C. Klasing. 2005. A hemolysis-hemaggluti-nation assay for characterizing constitutive innate humoral immunity in wild ���� ��������� � ������(���$������� ����6��$� ���(�� ���������"�29:275-286.
Matson, K. D., B. I. Tieleman and K. C. Klasing. 2006 ��6�$�� ���� ������������ ���� ����������$���������� ���������$���������/(���$���������� �$����� � ����Physiological and Biochemical Zoology 79:556-564.
Matsuura, E. T., Y. Niki and S. I. Chigusa. 1993. Temperature-dependent selec-tion in the transmission of mitochondrial DNA in Drosophila. The Japanese Journal of Genetics 68:127-135.
-���#�� ��� !��� ������-������� ��� �����$� � �� ������� �� ���#������2005. Increase in the constitutive innate humoral immune system in Leach’s Storm-Petrel (Oceanodroma leucorhoa) chicks is negatively correlated with growth rate. Functional Ecology 19:1001-1007.
192
Referen
ces
-�6�"��-��4���9��-��9��#� ��6��4��+��� � ���9��'��-��� �������������������2006. Size correction: Comparing morphological traits among populations and en-vironments. Oecologia 148:547-554.
McDonald, J. H. and M. Kreitman. 1991. Adaptive protein evolution at the Adh locus in Drosphila. Nature 351:652-654.
McGraw, K. J. and D. R. Ardia. 2003. Carotenoids, immunocompetence, and the information content of sexual colors: An experimental test. The American Naturalist 162:704-712.
McKechnie, A. E. 2008�� ������"$��� %�&� ����"� ��� ��������� ����� ���� ���� ����changing view of avian physiological diversity: A review. Journal of Compara-tive Physiology B 178:235-247.
McKechnie, A. E., K. Chetty and B. G. Lovegrove. 2007��������"$���%�&� ����"�������� ��������� ����� �������,����������(��*����$������������ �7�� ����� ����acclimation. Journal of Experimental Biology 210:97 -106.
-��� ��9�����1988��<������ ������������ ����� ����������� ��������� � ����+���-logia 77:343-349.
-��� �� 9�� ��� 2003�� -��� �����*� �����"� ���$��� � �� ����� �������� ���� ��426:620-621.
Mendes, L., T. Piersma, D. Hasselquist, K. Matson and R. Ricklefs. 2006���� ��-�������������������������;�� ���� ������������������"�����������/(����� �- � ���$���������� �������&$� ��������9�����"�209:284-291.
Merilä, J. and B. Sheldon. 2001. Avian quantitative genetics. Pages 179-255 6� ���� + ��������"�� ���)� � !�������:������� �� ����� ��� ��)� A� #��USA.
Millet, S., J. Bennett, K. A. Lee, M. Hau and K. C. Klasing. 2007. Quantifying and comparing constitutive immunity across avian species. Developmental and Comparative Immunology 31:188-201.
-����� �����������07�����������'���#�����-������"��!��'��6�� #�����8���������-��Brandon, K. Easley, E. Chen, M. D. Brown, R. I. Sukernik, A. Olckers and D. C. Wallace. 2003. Natural selection shaped regional mtDNA variation in hu-mans. Proceedings of the National Academy of Sciences 100:171 -176.
Moe, B., F. Angelier, C. Bech and O. Chastel. 2007����� ��������� ����� ������%�-������ "��������������7��(������ � ����������)���� ��V���� �������&$� ��������Biology 210:3407 -3414.
Møller, A. P. 1998. Evidence of larger impact of parasites on hosts in the trop-ics: Investment in immune function within and outside the tropics. Oikos 82:265-270.
Møller, A. P. and J. Erritzøe. 1998��8�������������������������� ��������� � ����Evolutionary Ecology 12:945-953.
Møller, A. P., J. Erritzøe and N. Saino. 2003. Seasonal changes in immune re-sponse and parasite impact on hosts. American Naturalist 161:657-671.
Moreau, R. E. 1944. Clutch size: A comparative study with reference to African � ����� ���86:285-347.
Moreno-Rueda, G. 2010��&$� ������������������� ���7���� ��)����������������-mune response in House Sparrows Passer domesticus. Journal of Evolution-ary Biology 23:2229-2237.
193
Mueller, P. and J. Diamond. 2001��-��� ����� ����������(� ���������$ ������(-ity: Well-provisioned animals evolved to run and idle fast. Proceedings of the National Academy of Sciences 98:12550 -12554.
Murphy, K., P. Travers and M. Walport. 2008������)�".�������� �����"��7th edi-tion. Garland Science, New York, USA.
NNagy, K. A. 1987��<��������� ����� ������������� �;�� �������������������������
���� � ��������������-���� �$���57:112-128.Nelson, R. J., G. E. Demas, S. L. Klein and L. J. Kriegsfeld. 2002. Seasonal pat-
�� �������� ����� ������������������������������6�� ��������(� ���"�� �����6�� ���������
Nespolo, R. F. and M. Franco. 2007��4����7����������� ����� ��������� �$���� ���trait: A meta-analysis. Journal of Experimental Biology 210:2000 -2005.
Nespolo, R. F., L. D. Bacigalupe and F. Bozinovic. 2003��8� ��� ����"������� ���-ics in a wild mammal, the Leaf-Eared Mouse (Phyllotis darwini). Evolution 57:1679-1688.
Nespolo, R. F., D. M. Bustamante, L. D. Bacigalupe, and F. Bozinovic. 2005. R���������(�������������� ����� ������� ����� �)��7 ������� � ����� ��� ����)����mammal, Phyllotis darwini. Evolution 59:1829-1837.
Nichols, D. G. and S. J. Ferguson. 2002. Bioenergetics III. Academic Press, Lon-don, UK.
Nilsson, J.-A. 2002�� -��� ����� �����;������� ��� �� �� )� #�� � ���������� ��� ����Royal Society B: Biological Sciences 269:1735-1739.
������� �)�=#��!������<����������9��8�������6�$$��#���������������8����������!��8������ U���8�� �������6��-� ��������!�������������������> �07 ����2006. A � ���)� #��� ���������"������������(� ������������� ��� "� ���(��� ����� ����of Ornithology 147:221-233.
Nordling, D., M. Andersson, S. Zohari and L. Gustafsson. 1998. Reproductive ef-�� �� ��������$���/��������� ��$���������$� ������ ������������ ����������of the Royal Society B: Biological Sciences 265:1291-1298.
Norris, K. and M. R. Evans. 2000. Ecological immunology: Life history trade-offs ���������������������� � ����9���(�� ��������"�11:19 -26.
Nudds, R. L. and D. M. Bryant. 2001. Exercise training lowers the resting meta- ����� �������J� ��<��������Taeniopygia guttata. Functional Ecology 15:458-464.
O+����� �����!��<���������-��J��#� �������2000������ ������� �������������$��-
ment link innate and acquired immunity. Immunology Today 21:624-630. ����+� ���-��8������!��!�����!��-�������� �8�"��������,��!��!� �����1988. Inter-
leukin 6 (IL-6) in serum and urine of renal transplant recipients. Clinical and Experimental Immunology 71:314-319.
Ots, I. and P. Horak. 1996. Great Tits Parus major trade health for reproduction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 263:1443-1447.
194
Referen
ces
Owen, J. C. and F. R. Moore. 2006. Seasonal differences in immunological condi-tion of three species of Thrushes. The Condor 108:389.
Owen, J. C. and F. R. Moore. 2008. Swainson’s Thrushes in migratory disposition �&�� ��� ��������������������������� �������������"�26:383-388.
pPage, G. and D. F. Whitacre. 1975����$�� �$ �����������)���� ������� � � �������
Condor 77:73-83.Palacios, M. G. and T. E. Martin. 2006������ ������$� �����������������������*�
!����$� ���(��/��������"����������&������� � ����+���������146:505-512. ��$�����,���'��X��60� =Y#��6������Y�Y����J��9� ����������8�����;������2010a. Sexual
dimorphism in immune function changes during the annual cycle in House Sparrows. Naturwissenschaften 97:891-901.
��$�����,���6������Y�Y����'��X��60� =Y#��!������������!����������'��+�(Y����!��<Z�U$�and Z. Barta. 2011. The effect of coccidians on the condition and immune $ �/��� �����������8����� �$� �)�� 5Passer Domesticus). The Auk 128:330-339.
��$�����,���6������Y�Y�������U#U�"���'��X��60� =Y#�����J��9� ����2010 ���� ����������haematological indices and immune function during the annual cycle in the Great Tit Parus major. Ardea 98:105-112.
�� �=����������������(���2009���������"�����/�����������)����$�$������������ -asian Kestrels Falco tinnunculus. Naturwissenschaften 96:1193-1202.
Pearl, R. 1928. The rate of living. Alfred A. Knopf Inc., New York, USA.Pearson, D. J. and P. C. Lack. 1992��-�� ������$���� ��������� ��������� "�$���� -
����������� 7$���� ������� ���� � ����������� ��!� ������ ���134:89-98. Phillips, P. C. 2000. CPC: Common principal components analysis program.
http://www.uoregon.edu/~pphil/programs/cpc/cpc.htmlPhillips, P. and S. Arnold. 1999. Hierarchical comparison of genetic variance-co-
variance matrices. I. Using the Flury hierarchy. Evolution 53:1506-1515. Piersma, T. 1997�������� ���$���� �������� ���������������� �������� ����������7
evolve with relative investments in immunocompetence due to spatial varia-tion in parasite pressure? Oikos 80:623-631.
Piersma, T. and J. Drent. 2003��������"$���%�&� ����"����������(������������ ���-ismal design. Trends in Ecology and Evolution 18:228-233.
��� ��������,��9 ���0��������� �����-���� �������������� -�� ��������4�� �����1996���� �� ����"���� ��������� ����� �������������7������������ ������� � � ��(Red Knot, Calidris canutus1� �%���������������� ������0������"�����������J���-ogy 69:191-217.
��� �����������6��>���������������1995������������"���� ��������� ����� ����������� �������������������������7������������ ������� � � ������������5Calid-ris canutus). Journal of Comparative Physiology B 165:37-45.
Piersma, T., G. A. Gudmundsson and K. Lilliendahl. 1999. Rapid changes in the size of different functional organ and muscle groups during refueling in a ����7������������ ������ ��� � � ��� ��"����������� ���� 9����������� J�����"�72:405-415.
195
Promislow, D. E. L. and P. H. Harvey. 1990. Living fast and dying young: A com-parative analysis of life-history variation among mammals. Journal of Zool-ogy 220:417-437.
Puthpongsiriporn, U., S. Scheideler, J. Sell and M. Beck. 2001. Effects of vitamin E and C supplementation on performance, in vitro lymphocyte proliferation, and antioxidant status of Laying Hens during heat stress. Poultry Science 80:1190-1200.
QQuinn, G. P. and M. J. Keough. 2002. Experimental design and data analysis for
�����������6�� ��������(� ���"�� �����6�� ���������
RR development core team. �''&���'�'. R: a language and environment for statisti-
�������$������������<������������ �������������6��$���������������!��� �����L � ��� ,���-��' ��������8�����;����� ������ �(��������1998. On the adaptive
�����/����������� ���7����������������$$ ��������� �������������������"���Society B: Biological Sciences 265:1637-1641.
Raess, M. 2005. Annual timing and life history variation in free-living Stonechats. Ludwig-Maximilian Universität, Munich, Germany.
Raess, M. 2008. Continental efforts: migration speed in spring and autumn in an inner-Asian migrant. Journal of Avian Biology 39:13-18.
Rand, D. M. and L. M. Kann. 1996. Excess amino acid polymorphism in mito-chondrial DNA: contrasts among genes from Drosophila, Mice, and Humans. Molecular Biology and Evolution 13:735 -748.
Rand, D. M., R. A. Haney and A. J. Fry. 2004. Cytonuclear coevolution: the ge-nomics of cooperation. Trends in Ecology and Evolution 19:645-653.
Rice, W. R. 1989��!���"������� ��������������������������(��������43:223-225. Ricklefs, R. E. 1980��'��� �$������(� �������������������0��������$���� ���� � ���
- Ashmoles hypothesis. The Auk 97:38-49.Ricklefs, R. E. 2000. Density dependence, evolutionary optimization, and the di-
(� ��/�����������(�������������� ��������6���� �102:9-22. Ricklefs, R. E. and M. Wikelski. 2002. The physiology/life-history nexus. Trends
in Ecology and Evolution 17:462-468. ��(�� ��6������4��������1990��6"��#���������)���������� ����������� ����������0����
hormone secretion and ovulation in the Rat. Endocrinology 127:849-856. �� �������4������-��8�������6�����������-��4�#���#���������9 �)������8��!�������
C. Tarwater and R. E. Ricklefs. 2010����(� ��/���������� ���������� ���������)�)� ��� � �������!�#�127:253-262.
Rolfe, D. F. and G. C. Brown. 1997. Cellular energy utilization and molecular � �������������� ������ ����� ������������������"�������������(��)��77:731 -758.
Romero, L. M. 2002. Seasonal changes in plasma glucocorticoid concentrations ���� ��7��(����(� �� ������'��� �������6��$� ���(������ ������"�128:1-24.
196
Referen
ces
Rønning, B., H. Jensen, B. Moe and C. Bech. 2007��9��������� ����� ���*�8� ���- ����"��������������� ���������)������ $����������� ������������J� ��<������Journal of Evolutionary Biology 20:1815-1822.
Rønning, B., B. Moe and C. Bech. 2005�� ,���7�� �� �$���� ����"���#��� ��������� ����� ��������#��"��� ��� ���� �����������J� ��<����������$"�������������Journal of Experimental Biology 208:4663 -4669.
�� ��������� ��� ��� ���� ��� ��� ,�(������ 2007�� ��$� ��� ��(� ��������� (� �� ����"�� �(��������(��������������$� ���(�� ���������� � ����6� ����9�����"�17:1414-1419.
�� ����������������!��<���� ��)��6�����8���������,��9��-� ��������2008. Environ-������������� �������� ���������������������(��"���������$� ���(��"� ���-����� �$����� � ���'��� �������6��$� ���(������ ������"�159:10-15.
���07��������������-����� ��-��9 ����������� ���������������6��4��������2004. Effects of purifying and adaptive selection on regional variation in human mtDNA. Science 303:223 -226.
Russell, G. A. and M. A. Chappell. 2007�����9-�� �$���� ��������� �-���V�+ ����mass correlates and the effects of cold acclimation and natal altitude. Journal of Comparative Physiology B 177:75-87.
S����)�#������-��,� ���������9�������!��������0��!��4 � ��)�#���4���������#�����
�������=���2005��'��������� ��������� ��)���� �����������&��������� �����rates in a wild rodent: Consequences for evolution of endothermy. Evolution 59:672-681.
Sapolsky, R. M., L. M. Romero and A. U. Munck. 2000. How do glucocorticoids ��%�������� ���� ��$�����V������ ������$� �����(�����$$ ����(������������ "��and preparative actions. Endocrine Reviews 21:55 -89.
����� ��-������,���������2000. Body mass of six long-distance migrant passerine species along the autumn migration route. Journal of Ornithology 141:441-460.
Schefold, J. C., D. Hasper, S. von Haehling, C. Meisel, P. Reinke and H.-G. Schlos-ser. 2008. Interleukin-6 serum level assessment using a new qualitative point-of-care test in sepsis: A comparison with ELISA measurements. Clinical Bio-chemistry 41:893-898.
Schluter, D. 1996. Adaptive radiation along genetic lines of least resistance. Evolu-tion 50:1766-1774.
Schmid-Hempel, P. 2003���� ������������������������������;������������(�������-ary ecology. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 270:357-366.
������78��$�������������� � ���2003��+�������(�������� "�������"�����$���/��immune defence. Trends in Ecology and Evolution 18:27-32.
Schmidt-Nielsen, K. 1997���� �"����� �������������169-216 Animal physiology: ���$�������������(� ��������6�� ��������(� ���"�� �����6�� ���������
���������9��6����������� �������1996. Ecological immunology: costly parasite de-fences and trade-offs in evolutionary ecology. Trends in Ecology and Evolu-tion 11:317-321.
197
�� �"�����-���,��,�������������6���)��1991�������������7�"�������� "� "����$��� �simulation-II. Bet-hedging revisited. Computers in Biology and Medicine 21:357-367.
Sild, E. and P. Hõrak. 2009����� ����&����$ ��������*�!�������"������ � ��������-���������&��� �(� �� ������9���(�� ��������"���������� �����"�63:959-966.
���(� ����9���9��! (��������������4���/�����1997. The adrenocortical responses to �� ������� �������4����)�4� �� ��Phylloscopus trochilus in Sweden: Effects of latitude and gender. Functional Ecology 11:376-384.
Skaar, E. P. 2010����� �������� �� ��� ��)���� ���� ����$����������������� �(� ��- ������������,�������������6:e1000949..
Smit, B. and A. E. McKechnie. 2010��!(����������������� �����(� �������������� -� �$����� ���� �*� 9��������� ����� ����� � �� ��)� � ���)���� � ����� ��� ����� ��Functional Ecology 24:330-339.
Sokal, R. R. and F. J. Rohlf. 1995. Biometry: the principles and practice of statis-�������� ���������� ���� ����3rd edition. Freeman, New York, USA.
Song, Z. G. and D. H. Wang. 2006�������������$�� ��)�������� ����� ��������� ��"� ���$�������� ��� ����-���������'� ���� 5Meriones unguiculatus). Acta Zoologica Sinica 48:445-451.
Sparkman, A. M. and M. G. Palacios. 2009. A test of life-history theories of im-mune defence in two ecotypes of the Garter Snake, Thamnophis elegans. The Journal of Animal Ecology 78:1242-1248.
Speakman, J. R. 2005��9��"���0������ �"����� ���������������$������� �������&-perimental Biology 208:1717 -1730.
�$��#���������������!���� ����6���������������� ���������-�,� �����������������Krol, D. M. Jackson, M. S. Johnson and M. D. Brand. 2004. Uncoupled and �� (�(���*�����(������-����)������������� ��������(��� ���� ���������� ����uncoupling and live longer. Aging Cell 3:87-95.
Speakman, J., C. Selman, J. McLaren and E. Harper. 2002. Living fast, dying )���V�������#� ��)����������������� ����������� ���������� ������132:1583S-1597S.
Starck, J. M., S. König and E. Gwinner. 1995. Growth of Stonechats Saxicola torquata from Africa and Europe: An analysis of genetic and environmental ���$��������� ���137:519-531.
Stearns, S. C. 1992. The evolution of life histories. Oxford University Press, Ox-ford, UK.
Steppan, S. 1997. Phylogenetic analysis of phenotypic covariance structure 1. Con-trasting results from matrix correlation and common principal component analyses. Evolution 51:571-586.
Swanson, D. L. 2010��������������� �����(� ���������� � ��*�<������������������-anistic correlates. Current Ornithology 17:75-129.
Swanson, D. L. and K. L. Dean. 1999. Migration-induced variation in thermo-genic capacity in migratory passerines. Journal of Avian Biology 30:245.
Swanson, D. L. and K. L. Olmstead. 1999�� (������� �� � �� $ �&������ ��%���������)���� � ���$� ��� ��������� ������ ���$���� ���� � ������"����������� ����Biochemical Zoology 72:566-575.
198
Referen
ces
TTella, J. L., A. Scheuerlein and R. E. Ricklefs. 2002. Is cell-mediated immunity
���������������(���������������7����� "��� ����������� � ��V�� �����������������Royal Society B: Biological Sciences 269:1059-1066.
Thiollay, J.-M. 1988��6��$� ���(���� ������������������������(� ���� � ������� �$�-cal and temperate forests: Ecological implications. Oikos 53:17-30.
Tieleman, B. I. 2007. Differences in the physiological responses to temperature among Stonechats from three populations reared in a common environment. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integra-tive Physiology 146:194-199.
���������9��������6 ������9��8��������-��!���� ��������2010����$���� ����"���������(������ �� ������� ��� ��� � ������� ��$����"� ��� � �� ������ 6��$� ���(��Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 156:537-540.
���������9�� ������8����=#�� ������6�����������'��8������� � ���� ���9��4���������2008. Effects of experimentally increased costs of activity during reproduc-tion on parental investment and self-maintenance in tropical House Wrens. Behavioral Ecology 19:949 -959.
���������9��������8����=#�� ���������,��#"�����!��-���#��'��8������� ��������9��4��-liams. 2006����"��������������� ���(��� ����� ��������������7����� "�(� ������*�!����$� ����� ��)����� �$������������$� ����0����8�����4 �����<����������Ecology 20:491-499.
���������9������-��!���� ��������!��< �����9��8�����������������������8��,��'� ��and J. B. Williams. 2009���'������������������������ �"����� ��������� � ���through mitochondrial function. Proceedings of the Royal Society B: Biologi-cal Sciences 276:1685-1693.
Tieleman, B. I., J. B. Williams and M. E. Buschur. 2002�� ��"����������� ��=���-ments to arid and mesic environments in Larks (Alaudidae). Physiological and Biochemical Zoology 75:305.
���������9���������9��4������������'��8������� ��2004���� �"�����)��� � �������of Larks in a life history perspective: Parental effort varies with aridity. Ecol-ogy 85:1399-1410.
Tieleman, B. I., J. B. Williams, M. E. Buschur and C. R. Brown. 2003a. Phenotyp-���(� ����������,� #������������ ����"�� ������*�� ������ �� � ����� ��%�&� ��V�Ecology 84:1800-1815.
Tieleman, B. I., J. B. Williams, R. E. Ricklefs and K. C. Klasing. 2005. Constitu-tive innate immunity is a component of the pace-of-life syndrome in tropical � ����� �������������������"���������"�9*�9�������������������272:1715 -1720.
���������9������-��!���� ��������9��8��������������������������2009 ��R���-titative genetics parameters show partial independent evolutionary potential �� � ��"� ����� ���� ���� ������ ��� ����������� � ��� ����� ���� $�$����������Journal of Zoology 279:129-136.
Tieleman, B. I., J. B. Williams P. Bloomer. 2003 ��!��$�������������� ����������evaporative water loss along an aridity gradient. Proceedings of the Royal So-ciety B: Biological Sciences 270:207-214.
199
Tomarken, A. J. and N. G. Waller. 2005. Structural Equation Modeling: Strengths, limitations, and misconceptions. Annual Review of Clinical Psychology 1:31-65.
Troisfontaines, P. and G. R. Cornelis. 2005. Type III secretion: More systems than you think. Physiology 20:326 -339.
Turesson, G. 1922����������"$����� ��$�������� ����$������$������ ��������� ������Hereditas 3:211-350.
UUrquhart, E. 2002. Stonechats. A guide to the genus Saxicola. Christoffer Helm,
London.
��������������'��!���������6������8������������������������+ ��� ������!���������
1983�� �������� ��� ���� ������� � ���� ����(��"� ��� �(�� ����� ���� ���� ���������Journal of Tissue Reactions 5:97-105.
��������� ���� ����������'��!�������� �������+ ����1985. Antifungal activity of ovo-transferrin towards genus Candida. Mycopathologia 89:169-175.
�������6 �������#� ������������6��8� ��#���-��!���� ����������������� ��9�����Tieleman and K. D. Matson. 2010. Effects of immune supplementation and ���������������������&�����(�������������$�"������"������������ � �*���$��-cations for ecologists. Journal of Experimental Biology 213:3527 -3535.
������������-����������� �������2006. Age-dependent traits: A new statistical mod-��������$� ����)�����7����� ��)���7����(������������������!�� ��������� ��-ist 167:766-773.
������ ������ �(������ ��� �� <� ������-��9��8=� �;������ !��R(� ��� U������ !�� ��8=� �;������ ��� [�������-������������2007���������� ����������" �������-� � �������$���70"�������������������<�"������ �V�� �������������������"�������-ety B: Biological Sciences 274:707 -712.
�� �����������-�7���8��(��#����������� ����2006. Long-term effects of manipulated ������ ������0��������� ����� �������J� ��<��������9�����"�,���� ��2:478 -480.
�� ��������-��!���9��8��������������������������9��������������2008. Repeat-� ����"� ���� ����(������ �� ������� ��� ��������� ����� ���� ���� ������ �(�$� �-��(��)��� � ����� ��� � ��*�!� ����� ����"� ���� �$����������������6��$� ���(��Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 150:452-457..
�>0�����<�����������4���������2005������ ������� ��)����� ���������������� �����"�����������(��"��������������� �������������&������&�����(����$����"���� ���-����� �$������� �����*���$������������ ����� ����� ��������� ��������� ���-tionships. Functional Ecology 19:119-128.
�>0����� <��� !����#����� ������ ��� �����2011�� ��� � � ��.� ��������� ��=������������ ��� �������� ��$����"� � �� �%������ "� �������� ��� ��"�����*�8�)� $ �-programmed and instantaneous acclimation work together. Integrative and Comparative Biology 51:394-408.
200
Referen
ces
�>0����� <��� ��� -�� ���(������ !�� ��#����� ���� �� ��� ����� 2007. Thermogenic ����� �������� ��� ��� ��� "� $ ����$�������� ��� ��� � � ���� !�� ����� ��� -nal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 292:R1287 -R1297.
WWeathers, W. W. and K. A. Sullivan. 1993. Seasonal patterns of time and energy
����������� "� � ������"�����������J�����"�66:511-536.4� ��� ��-���������4��)��4����� ���2000. Seasonal changes in energy and wa-
�� � ���� "� �� ������ �������� �������. Journal of Experimental Biology 203:3333 -3344.
4������������������!�#��������� � ��������9�����,��<�����2008. PCR to predict risk of �� � ������������ ��������-�� � �����"�16:380-387.
Wiersma, P., A. Muñoz-Garcia, A. Walker and J. B. Williams. 2007�� �$����� � ���have a slow pace of life. Proceedings of the National Academy of Sciences 104:9340 -9345.
4�� ���������8��-�� ��������� ��������� �������2005��-��� ����� ��=��������� ���increasing foraging costs of Starlings in a closed economy. Journal of Experi-mental Biology 208:4099 -4108.
Wikelski, M. and R. E. Ricklefs. 2001. The physiology of life histories. Trends in Ecology and Evolution 16:479-481.
Wikelski, M., L. Spinney, W. Schelsky, A. Scheuerlein and E. Gwinner. 2003. Slow $���������������� �$������������ "� � ��*���������7�� �����&$� ������������ �stonechat populations from different latitudes. Proceedings of the Royal So-ciety B: Biological Sciences 270:2383-2388.
Wilkins, J. F. and D. Haig. 2003. What good is genomic imprinting: The function ���$� ���7�$���/��������&$ ������������ ����(��)�*�'��������4:359-368.
Williams, G. C. 1966������ ��������������������������� �$ ���������������� �/��-ment of Lack’s principle. American Naturalist 100:687-690.
Williams, J. 1996��!�$�"����������$� �$����(������(�$� ���(��)��� � ����� ��� � ����The Auk 113:457-472.
Williams, J. B., R. A. Miller, J. M. Harper and P. Wiersma. 2010. Functional link-������� �����$�����������������7����� "��������(� ���������� � ��������� ���(������Comparative Biology 50:855 -868.
4���/����� ���6��������8��������,�(����������8���"��1992. Environmental pre-����� ����"� ���� ���� ��� ��� �������� �"����� ��� � ���� ��� ���� ��� &$� ��������Zoology 261:214-231.
4���/����� ��� 6��� ��� ,�� -���"�� 6�� 4�� 9 ���� �� ��� ��� ���� ��� ��� ,"���� -�� ��-manovsky and R. D. Richardson. 1998������������ ���������� ����7 ���(�� ����� �������*����2�� ����"� ���������� "������3��!�� �����J���������38:191 -206.
4���/����� ���6������-��+.�����"� ����,��9�� !������� ��1995. Modulation of the �� ����� ������ ��$����������������� �������� ����� � ��*�!�$���� �������������� ������!�� �����J���������35:285-294.
201
Woog, F., M. Wink, E. Rastegar-Pouyani, J. Gonzalez and B. Helm. 2008. Distinct taxonomic position of the Madagascar Stonechat (Saxicola torquatus sibilla) �(������ "��������������;������������������� ������!����� �������+ ������-ogy 149:423-430.
ZZammuto, R. M. and J. S. Millar. 1985���(� ���������$ ������ ����"��(� �� ����"��
and Spermophilus columbianus life history over an elevational gradient. Ecol-ogy 66:1784-1794.
Zar, J. H. 1996. Biostatistical Analysis, 4th edition. Prentice Hall, Upper Saddle River, USA.
Zheng, W.-H., M. Li, J.-S. Liu and S.-L. Shao. 2008. Seasonal acclimatization of ���� ������ ��� � ������ ��� �$� �)�� 5Passer montanus). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology 151:519-525.
Zink, R. M. 2005. Natural selection on mitochondrial DNA in Parus and its rel-evance for phylogeographic studies. Proceedings of the Royal Society B: Bio-logical Sciences 272:71 -78.
Zink, R. M. and G. F. Barrowclough. 2008. Mitochondrial DNA under siege in avian phylogeography. Molecular Ecology 17:2107-2121.
202
NEDERLANDSE
SAMENVATTING
Fysiologie en levensloop eigenschappen�����������(�������� ��������� ������ ����������� ���#�����(�������)�� ���)� ��� �$�������� �������������������=������)�������$ ���-��� �����0�=����(���������� ��������������#����������)�������=���������������� ��������� ���$ ����� ���� �0�=��(������ ������\��)�� �$�� ���������������������#�������$�������� ���������0���� ������\��worden gekenmerkt door variatie in zogenaamde levensloop ei-�������$$����,�(������$����������$$���0�=������������\(����� ���eigenschappen, waaronder fysiologische, anatomische en gedrag-seigenschappen, die in meer of mindere mate een directe invloed �� ��� �$� �(� ��(���� ��� �$ ��������� ��� ������� (��� ��(������$����������$$��� 0�=�� ��(���(� )������������� ������� =������)��� =�� -��=#�� ��$ ������ ��)� ��� ������� ������� �������)��� �����#��)� ���$� �=�� �� �0�=��(������ ������\����������������(� �������4��#���� �-tegie de hoogste fitness oplevert, en dus een evolutionair voordeel ������ �(������� ���� ������\���)� ���(�� ������ ��������� �$�������� � ������������� �������������(��������� ����9�(�������#������fysiologie, gedrag en demografie de variatie in levensloop eigen-����$$��� �$� #����-� �������,��#�)� ���������=� ���]^�(������(� �������)�����(�������� ��������� ���� �(����������� ����� �=#����(������$����������$� �=�(������������������ �������������������� ������ �����������������=������������ ����������_�� ���� ��������� ���(���������� ����� 0��#������ ���������������8���)� ���������=#������������������������ �������maar ook andere levensloop eigenschappen - zoals levensverwachting 7�����"���������������������$$���7�0��������� �������7��� ���� �������� ��� ������ ����)�� �$� (������ �������9�(�������)� �����-����=#������������������ ��������(�����(������$����������$$���������
203
����� �(�� #��������������(� ����������������� ��������(����=������$� � =�� � # �=���� ���� ����� ��(���(� )���������� ��� ��� ��� ��������)������=������$� �=�� �# �=���������������(���(� )���������� ����
Roodborsttapuiten���� � ����$������5Saxicola torquata1�0�=��#������0���(�����=������������ ����� ����������(� )���� ������ �������(� �� ����������(���� �0�\����!� �#���� �����#��� ��������$ ������ ������ ��#������#��(��� (�� � (� ����������� $�$�������*� ��� �� � ������ ��� ��0��������-��� ��� � ����$���� 5S.t.maura1�� ��� � �$���� ��� � ����$����(S.t.rubicola1������� ������9 ����� ��� � ����$����5S.t.hibernans) en de ���������� ��� � ����$���� 5S.t.axillaris). De verschillende popula-ties worden soms gezien als verschillende soorten, en verschillen van elkaar in morfologie, gedrag, fysiologie en levensloop eigenschappen 5� ���`��<���� � 1��������=#������(���������(�����$0��������$���#�� ����$ ����� ������(� �����������$�$��������( ���� � ����#����������wanneer ze worden gekruist. Daarom worden ze ook wel gezien als ���� ��� ��������������$ ������ ����(� )�=���#���#��$���������� ���� �0�������� � ������ ��� � ����$���� �������#����������� � �#���(� � ���������������� (��� 0�=�� ����� ������ �����0�#��������� ���� �(� )��-�� ������ ������ ��� � �#�� � ����!��������������#������� ��� �� �������
K I E K
T niet trekkend gedeeltelijk, over korte afstand
korte afstand lange afstand
T () 0 0; 1200 1700 2600
A
het hele jaar deels hele jaar; deels februari-september
maart-midden oktober
begin mei - begin septem-
berA
1-2 3-4 2-3 1
A
3 5 5 6
U
afhankelijk vanhet regenseizoen
begin april tot augustus
midden april tot augustus
eind mei/juni
Tabel 1 – life history eigenschappen van roodborsttapuiten uit verschillende gebieden.
204
Nederlan
dse sam
en
vattin
g����-������+�����������! � ���������� ������������� �������!� �#���J�=�� ������0�������� ��#� ���)�� �����=�>>���������(�������������a���� ������������� �$���� ��� � ����$���� ��������� ����������(���� �$������ �#����� �0����� �$�������� ��!� �#��������)���� ��8�=������b����c���������(�����#�����������d���� ��������� ��� ��� � ����-$���� ���������� �������������������������(������$�$�������� �#��������)���� ���� ������ � ���������� ������������� ��!� �#���������������(������$�$��������(� )���� �������� ����� �������9 ����� ���- � ����$�������������c�����]���������(�����#�����������d���� ������-�������� ��� � ����$������0�=������� ��������� ���������������=�� ���� ������� ����� �������J��$ ����� ���`��������$� �=�� �������b�als het eerste legsel mislukt, en leggen gemiddeld 3 eieren per legsel. +�#�������� �������(� ���������������� ��� ����������0����������� ��� � ����$�������������������������� �������$� �� �����������-�������� ��� � ����$���� ���� ���������+$� ����-�&� �����#� ����������voor Ornithologie in Andechs, Duitsland, hielden ze deze vogels onder zogenaamde common-garden omstandigheden. Dit houdt in ���������(���������� ���0���������������������0�=���$��� �����������������)� �����8�� ��� �#��� =�� ������������� ����� (� �������������=���������������� ��� ����(������������������������� � ������ - ���� ����� (��� ��� (� ��������� ��� ��(������$� ��� �"������������ �����-����$$�������#���� #����0�=��(�� �( �=7��(����� ��� � ����$������populaties, komen ook tot expressie onder common garden omstan-������������� ��� � ����$�����������������$ ������ ������ ��#��0�=��0�������������� �=������������ �����$� ���� �(���b^�6����� �=�����(� �\ ����������������0�����( �=���(������ �$���� ��� � ����$������die ondervinden.
Fysiologie en levensloop eigenschappen: de aanpassingen van roodborsttapuiten aan verschillende omstandigheden.
���������"���������������������$$������������� ���������� ��� �����#����� ������ �����������������(������$����������$$������� ���-������������������� ���������"�����������(������$����������$$������(�������� 0������+ �����������������#� ��� ��(���(� )���������� - ������(����=������$� �=�� �$ ����� ������ ����(� ��������������������������� �������5@�������(����.���� ��1��+ ������������������������(���(� )�������� �� ��� ��� )������ =������ $� � =�� � $ ����� ������ ����(� ��������������������������� �������5@����0������(����.���� ��1��9�=����$ ��������(������ ����#��������� �=$ ������( �=�� ���-
205
������( �=��������������=#�0�=��(�� ��������������� �������(������(���� ������=�������������� ������������������������ ��������������� ����(� ��#����� ������� ���������������� ������"������5�� ������������corticosteron) en het immuun systeem met levensloop eigenschap-pen is minder goed onderzocht. Koppelingen tussen deze twee sys-������������� �������0����������� ��=#��(� �����������������(������#������������ ������0��#�$$��������0������0����� ��������(������systemen en van levensloop eigenschappen die in de natuur voorko-���� #������ �$� #���� 8��� �� ����� �� ������� ���� �=(�� ������)� ���)��������� ������ ������������������������ ����� �� �����- �=#� �=�#��0����������(��������(�� ���(�� �������(� ���������(�������������6� ������� ����$��������� ����� �=#�� ��� �=������ ���������(������ ���� ��� �_�(����� ������=#� ��=�� ���� ������� �"�������4����� �koppelingen tussen fysiologische systemen de evolutionaire potentie �$� #����0��� =��(� )�������������� ������� ���������0���"��������������(������ 5��� �(��������� �� $�������1� ���0������ $�� ���� ���� �=���als de relatie in (onder) soorten (het evolutionaire product).
Figuur 1: Gebieden waar roodborsttapuiten voorkomen, weergegeven in grijs. De pijlen geven de
trekafstanden weer van de ondersoorten die in dit proefschrift onderzocht zijn.
206
Nederlan
dse sam
en
vattin
g�����������#�b��� ���)�=�0���������(�� ���������� � ���������-�"�������������� ������(�� � ��� � ����$�������� ��� ���*������$�-�������(��� ��� � ����$����� ��������� ������ �7� ���������Esche-richia coli, Staphylococcus aureus en Candida albicans te doden, hemagglutinatie en hemolyse van plasma en de concentratie hap-����� ���� ���$���������� ������ �� ���)�� �� ������� ��� ��� ���������� ������� 59-�1����������8��� ���������� ������� ��� ����/��-�� ������������� ����(� ��#�(�������� ����������� ���������=�������� ���������(�� � ��� � ����$�������������.�7��������������������)� ����gedaan in de thermoneutrale zone wanneer de vogel niet verteerd. ���� ���������� ��������������������� �������(�� ���� ����(� ��#�������0���&$� ��������0�=����������������������� ������)���� �� ���� �������$� �����(�� � ��� � ����$���������� ���������������������#�b�staan in contrast met wat we zouden verwachten vanuit de theorie dat �$� #��������������"���������������������$$�������(���������� (��������� �$� #��� ��� ������ �������� ���� ��� �$� #��� ��� �������� (��� ��-vensloop eigenschappen die we terugvinden in de natuur: correlaties ��������� ������� �������������(�� �������������"������������� �-lische eigenschappen op het niveau van individuen verschillen van de correlaties op het niveau van ondersoorten. Dit doet ons vermoeden ��������(��������� ���)������������ ����� �=#�� �������(�������(�������������7����������� ����7������������ ���������"�������$�������������(� (������� 0��#� �� ���)����� �����#�#������ � ��� ��(����� (���omgevingsfactoren op fysiologie en levensloop eigenschappen.�����������#�c����]����� 0�������)�=�)��������(�����(������0����-(� ����������� ����� �=#������(��������� ������$����� ���������������������"�������8������ ����(� ��#�(���(������(� ��� ������������(� ��������������0���������������(������=�� �"�����5 �(��)���� ����0�-�� 1�������������#�c��� ���)��������������������� � ����(�����0��seizoensvariatie onderzocht, door BMR van Kazachstaanse, Europe-��� ������������� ��� � ����$������ ��� �)����" ����� ��� ��(�����-����$�������������� �����(�=��������(������=�� ��=#����"����*�)���� ��(�� =�� �� �#�� ������� ��� �����=�� �� �#��9����(�� ��� ��� � ����-$������ ���� �=� ������� �� ��������������� 0����� 5b^�6�� (� �\ ��������������1���� ���)����#� ���� ����� �$���� ��� � ����$��������-���������� �=�0�)���(� �\ ��������$� ���� �����(� �\ ���������������0������������$� ���� �(�����0�� ��� � ����$������)�������=#�����������$� ���� �����( �=� ��(������ �$���� ��� � ����$���������� (��-�����9-��(���������� ��� ����(� ��������������0����$�� �����8" �-
207
�������������������� ����������=���)�� ������������������)�� ����van de twee ondersoorten waar ze van afstamden inlagen. Tempera-��� � �_�(�������)�������������(���9-����� ����������$�� �������seizoensvariatie. De resultaten van dit hoofdstuk duiden erop dat er een genetische achtergrond is in seizoensvariatie, maar dat deze niet ������ ��(� � ����9�(���������=#�����0����(� ������������� �������� �-���������(��������������������������)� ���� �_�(�������� ����$� ���� �������������#�]��� ���)����� ���0����(� ������ (������� ����� � ����������"������ ���� 0����� ��� ��0������ ��� � ����$������ ���� �����������#�c������������� ������������"���������( �=���(�����(�����������0��������� ����0����(� ������ �����������#�)� �����(���������������������"������(� 0)�#�� ��� ��=����������������� =�� �"�����)����� �(������� �������� �\������������ �����$ �������������)� ���� �-steed aan veeleisende levensloop eigenschappen zoals reproductie of trek. De verklaring van dit fenomeen wordt wel gezocht in trade-offs �������� ��(�����������=�� �"����7���������$$������� �#�����#���-0�����)� �������(� ������������$����������� �#��+�����=�� ��=#���(� �-atie in het immuunsysteem ook een genetische achtergrond heeft, en dus in een evolutionair perspectief gezien kan worden, is niet �#����� ��� ���� ��� ���� (��� ��� ��� � ����$���� #����� ���� 0�� �(� ����������� ����(������� ��� �� ��� (� ����������� ��(������$� ��-genschappen. Als het immuunsysteem een genetische achtergrond 0����� ���� (� )�������)��������� ���� ��� ���� (� ��������� ��� ���-0����$�� �����)����� �0���$��� �����0�=������������������ �����4���� ���(�=��������5����������(���E.coli en S.aureus, hemagglu-��������������"��������$����� ����������� ����1�(������������ � ����������"��������������������� ������� ��� ������)����" ��������� �=����(� ��������������$� ���� � ��������������� ��� ���� ��#������(� ���������������0����(� ���������(�� �(������(�=����������������4���� �����#�(� �����������(����������������� ��� ��������" ��������� � (��#� ���������)�� ���� (����" ���������� ����������)�� ������� (������ ���� ��� ����)�� ���� ���� �� �=� ��� �������� ��� � ��-��$������ ���� �=� ���� (� �\ ����� ���$� ���� � 0����� ������� ��� �)���(������(�=�������������������� �(� ������������� ��� � ����$���������� �=��������������$� ���� �0��������0�� ��������������� � ����������0����(� ������(����������� ���������������������������� �����heeft, maar dat de overerving complex is. De complexe overerving ��������0��(� �����������=�� ����#���������������������������������)�=��� ��#���� ����������$��&��������(�������� ��� �$ ������� ���
208
Nederlan
dse sam
en
vattin
g4�� ����=���=#�0�=�� �=������0������� �������� ����������������� �� �#-#������ �� � ��������� ��� � ����$���������� �(� � ��� �������� ��������trekken de grootste verandering in immuun maten zien, en de rood- � ����$������������������� =�� ��$���0������$��#� ��=(���(� �\ ������������� �����0�� ���������������������#������)�� ����=���=#��������=�� �"����� (������� ������� �"������ �_�(������)� ��� ��� � �"�����-���������� ��(������$����������$$��*�9�(������� �������������=#�����=�� �"��������������$�����0�=���$�(� )�������(� �������������(�������-toren, zoals pathogenen druk. �����������#�d��� ���)�����������������(��� ��������� ���(� - ��#� �=� ��� � ����$���������� 0������4���� ����������������� �indirect de invloed van nucleaire en mitochondriale genen op BMR te ���� 0��#������ ���������9-��)� ���)����������� �(�������(� ���������� ������(������� ������������(��� ��������������������(�������-����� �\��������� ���������(� ������������)� #����(��������������-� �\���-�������� �\��0�=�� ����� �=#��� ���������(�� ������$���������genereren van energie. In het proces van opslag van energie worden $�$�������� ��#��)�� (���������� ����0�)������������������� �����als in het nucleair DNA liggen. Het nucleair DNA wordt doorgegeven ��� ����(��� ������������ ���� )�=��������������� �������!����0�=���������(�������� ��$�#�����(� � ����+����� �$��������9-������� - ���� ��(�� �����������)������ �_�(�����)� ������ �������� ������-������� �������!��� ���)���� �������� ��� ����"�(���9-�� �$��������� ����$�(���#)���������(����������������� ��� ����"�(������������-����$�������������(������������"$���������������$�)��� �$�����)� ������ ��(� � (��������(� ������������������������� �$�����)� ������ ��������(�����+��������� � �#������� �=������������� ������� ��������-�����(� ����������� ��������(����������(����������=��������-��� ����$�(������������������ ������� ����(������ ��� � ����$�������� ���)������� ��� ����"�(���9-�� � �#���������0��)���ae�K���� (��������� ��� )�� ����������)�����7���� ���� �� 9-�� �������� (��� �"- �������������������������� �$���� ��� � ����$�������������������0��������������� �$���� ��� � ����$����������(�����0��� �����-�� ��� ���������" �����)� �������� (� ���������(�� �(� ������������ ��$����)�� (���������/�� �����(���������� ��(� ���������5 �(������" ���������������0������������������� �$�������� �)� ������-derverdeeld in een groep met Kazachstaanse moeders en een groep ���� � �$��������� �1�� !��� ������������ �\�� ���� ����� �=#�� ����$������������ �$�����(�������9-��0������)��(� )�����������������-
209
chaamsgewichts-gecorrigeerde BMR van de nakomelingen het meest ��=#���$����� (����������� ������ ����������������� ���!������ ����invloed heeft op het lichaamsgewichts-gecorrigeerde DNA, zouden we verwachten dat het BMR van nakomelingen tussen dat van de ou-ders in zou liggen. Onze resultaten lieten zien dat lichaamsgewichts-gecorrigeerd BMR niet tussen dat van de oudersoorten lag en ook niet op dat van de moeders leek, maar in plaatst daarvan het dichtst �=����)�� ����(������(��� �������������$����� ���������������������� ���!�������������������� �������!��������(� ���)�� ����=#����(�� �9-���4�� ����=���=#�� ������������ ������������� �������!������� �=�����9-��������������� ��������" ����������������������������twee soorten DNA. �����������#�a��� ��� ���� �=(���)��)��������(��������(�������(�-duele eigenschappen op variatie in BMR en verdamping (Total Eva-$� ���(��4��� �,�����4,1��4���� ���������)���� �������������������(������ ��� �� �� #� ��� 9-�� ��� 4,� ���������4�� �� ������� 0�����)��� ��� ��(����� (��� ������=��� ��#���� ��� ��)����� �$�9-�����4,�)����+�#��� ���)������ 0�����)��#������(������(� ������verklaard kon worden door het individu, met andere woorden, welk ����� ��0����#���)� �������� ���� ����(������� ���������$���� ������ ���9-�������������(������)� ��� �_�(�������� �������=������ ��������� ���#������ ������ ����������(������0�)������������������(������)� ��� �_�(�������� ���)������ccK�����a^K�(������(� ���������9-��)� ���(� #��� ����� �(� ��������� ������� ����(�������,�����=��� ��#��������-)������� ����������(������$�(� ���������4,���������������������-(����������������$���� ��� � ����$���������� ��������#� f� �� ��� )�� ���� 0����� ���� ��# �� � ���$���� ������$��&� �����������#�0�=��(�� ��������� 0��#���(������ ���������������immuun maten. Het immuunsysteem is een multidimensionaal sys-�������������������_��� ����� ��0�=�����������������0�=����� �� ������������������������������� �������0������ ��� ���� � ���-�� � ����� ��� # �=���� (��� ���� �������"���������� ��(� ������� ��� ��-�������������#���������� $ ������������ �������=#��+����������0�������� ������ ��� (������)� ��� (��#��� ��#������#�� (��������(� �-ate statistische technieken, die relaties tussen meer dan twee maten ��� � (� ���#������ ���������0�� �������#���)� ���� (���� �� ��#�����$��������������������������)��������$$����(�#�� ������)�� ����� ������������##���=#�������� ��������#$ ��(������(� # �=�����������������(���������0������ �����#���(��#��� ��#�(���(����#����� ������-
210
Nederlan
dse sam
en
vattin
gsets, en dit zorgt ervoor dat voorzichtig omgegaan moet worden met de interpretatie van de resultaten van deze multivariate technieken. 4���� ����)����� �� ���$� ����� �����������(���-��������������-����5b^^a1����9����� �������������5b^^g1�������� ��� � ����$��������������(�����������#�b��$����)�������"��� ��������������� �����-�������� ���� (� ����=#��� (��� (� ����������� ��� ����� ���� ��� ���� ���=�� ��=#���(� ������ ����������(�������4�����#������ ��#�(������-tivariate technieken en met simpele statische technieken zoals cor- �������� ���)���� ������ ������������� (������� ��#�� � (� ����#����4��(����������������$�����������#��� �=� ������������� ��� � �� �$�van hoe de immuun maten op verschillende niveaus met elkaar ver- ������0�=����� �� ��� ���)����(����������������������� �����=#�consistent correleren met elkaar op individueel niveau, maar dat deze �� ������������� ������������0�=���$����� ����(�����(���� ���������������#�=#���5 �(�������������(����������� ��� ���������� ���1��
Onderzoek naar fysiologie en omgevingen�������$ ������ ������ ���)��(� ����������������� ����������������������"���������� 0���������)���� ��� ������0�=������ =�� �"��������"���������������������$$����������������������� � ������ �����Gedetailleerd onderzoek naar hoe fysiologische eigenschappen zich (� �������������#�� �0���#������ �=� ������������� �� �$��(� �����0�� ��� �(������� (��� ��(������$� ���������$$��� �_�(�������� ��� ����$ ������ ���� �� � �#� ���� ����� (��� ���� ����� � ��� �������"������gemeten, maar het immuunsysteem is veel groter. Zowel het aange- � ��� �������� (� )� (��� �������"������#��� (���� ��� � ��������worden in mensen en inmiddels in sommige dieren. De technieken ������� (�� ��� ��#��)� ����0�=������� �(��#���� �7�$���/�#��)���(� -����=#�������� 0��#�0������#���������� � �������=#���+�#�0������)������ ���"�������������"���������� �#������ �� �##�������������� -0��#��9�=(�� ������ �����&�������� 0������ ���� ���#�#������ (� �������������� ���(� ��#����������������"���������� �������������������������"������������ ��������������������� ��� ���������-tingen van antioxidanten zouden we verder kunnen komen in het �� �=$���(���������0�����������$$���0����������#�� �(� ���������������0����\(����� ��0�=������)�����0������)����� �������(�������(��������� ���0�������� �-����# �� �����(���(�����������$ �������� �#�������$����������� �#��met de evolutie van fysiologie en levensloop eigenschappen kunnen
211
���� 0��#����9�����# �� �����(���(����������$ �������� �#�0�=���������(� ��������� ������� ������ ��=�������(��#�������=#���������������-������������#���������������� �#��������� ����������(��#���$ � �� ������������������#� ��)� ����� ���������� �� �������#����� ��#�� ���de immuun-ecologie, waarmee de verscheidenheid aan micro-or-ganismen in omgevingen gemeten kan worden. Dit wordt gedaan ��� ���� (� ����������� ����(������ ��� ������� ��� ��� 5���� ����$�van technieken zoals PCR en DGGE) de hoeveelheden verschillende ��� ������!�������������� ��������#�� ����(� ����=#����8������(��#�������=#����$����������������� ���������(��������������������-��������=#����� �7� ������������� � ��������$����������#�������� #����)� �������� �$��������)������5�"$��������� �������"�����1��Metingen aan meerdere aspecten van het immuun systeem en/of een verscheidenheid aan fysiologische systemen in gerelateerde soorten of ondersoorten met verschillende levensloop eigenschappen, ideaal ��0���������� ����������������������������(��������� ����0������� �� �$�(������ ���(����"����������$�����(�������(�����(������$������-schappen vergroten.
212
DANKWOORD
8��)����#�������(���(����������� 0��#� ������)���(� ����=#���������(�������0��������������� ���� �����������������=#������������$ �-�����7���� 0��#������� ������0���� �������$�(����������.��� ������-ders, vrienden en familie.����� ����)����#�� ���� ����#��*��#� �������������#� ��$ �=���=���)�������$�� ���������0����� ������� � ��� �=�=������=������ 0��#� ��=(���$��##������� ��������(������ ��������� 0��#� �������#�#�������#�)������ ���� �=�=�������$ ������7���� 0��#����������)����#��)�=����������#����$���������������)���(�� ����)��������$$���=#��)� �������������������� �����=�� �0�=�������������=#���)�����(�� �=������(�� ���=����� ������������$�� ����������� �������(�� ���=�(�� ������ �����������-����� �������� �#��� � � �� �������� (������ ����������)� #��� ���� ������������#� �=�=��������������#� ������# �� �(�� �=������ ��������� ��#������(� �� �#���#�=#����������������� ����� ��#���������5���������1�������=���������#)������+�#�)����#�=�� ����#���(�� �=����0�����������-�������������� )�=��=���������=#�����0��#�)������ ������������������(�� ����=���������#�����0���������������5����=�� ��# �� 1���������� ��� ������ �����#� ��� ��=������#�����������=�=������=�������)� #������ �������)���� ������ �)������)�� ��������� 0��#����� ������������ �������� ���� ����� =�� ����� � ����� ������ �)��� 0�=�� � � ���� �����������)������������ ��� ���(� (���������������=�=��� �������-���$�������2(� (������� �������� 3�����#���� (�� ���#� ������� ����������������� ����##���=#� ��� ��� ������� ��� ����������)����� ���� -0��#������$���� ������=������������ 0��#���#� ��� ��=�����=�������#��)������������������������� �=���=��$ �������#����0�=�������������#�(�� ����������0� ��������)�������=����_��� ����� �����)����#�������������)���=���������/��\��� ������������=�� ������������#)���=���������� ���=��#����� ���������������(� ���=������ 0��#�������)�����(���vragen hoe het ging.
213
-� ��������� ���#���� ���=���#������������#�� ���)�#����$�������++�#)���������� ��$� ����� ������#�� ����0�����������=������=�� ���-�� � ����������������( ������(� �������������=��������� ��$� ����� �(� 0����������( ����=������������������������� �=(� �=�������#����-)�� ��� ���� ���� ����� 0��)��� (������� 0��� =�=� ���� �#���� � ����)��#=������)������ �������++�������#����������0���=�=����)����(�����������$����� ���=��#������(������������ �=��������������( �������=#������$����� ���=��#�����4� #����$�������++��������������������=�=��� ���������$��0�� ������=��$ ������7���� 0��#�)�� ��� �������(�������#�=��)��h
4��������� ����� ��������=������ ���������� 7� ��$�52������ #�� ��$3�� �2���� �������� ��$3�� ��� ��� ��������)���������� �� �2���������-man”). Although Irene is the engine of team Tieleman, it consists of �� ��$��$���������������(������ � ���������"���������������)�"�� ��������� ���� ���)��������&$� ����������7���������������� ��$�����������������������;��������)���������"��� ������������"�������� �� �������!�+.���6�����<���������������"�������� ������������)��"������������thanks for writing an article together, that is now a chapter in this �������5���������� ������������$�$�����1������=�"�����������7���������conversations on skype and your visits to Groningen. You are always )�������������"�����"�������5�����������"��� �����������$����" �$1��,������"���)� ������2������� 3�����#���� ������������/��������������in Groningen and on Schier, and for the Portuguese marmelada (my favourite). Nick, Arne and Liz, you started as PhD-students at more or less the same time as me. It is good to have people around you that � ����� ������������������"������������(����=�"���)� #���� ������� ��������������������/����5�����������)��������������/���������1������������"�� 7������� #�$ �=����)����! ������ ������(� �����������������=�"��������(����������� 52� ��#���31����� ��������� �������,�0�� ����$��"�����=�"� "�� ����7$ �=���� ���6����������#�� ����#�� �� � ���� ����� �$� ���It was nice to know that I was not the only one working crazy hours, and struggling with the last hurdles. I am really proud that we can defend on the same day, and am looking forward to the defence (and ���� $� �"� ���� )� �1��8�� "� ���� ���$������� ���� �)�� 2��)� ����3�� ����$����������� �����"����)���8�� "������=�"���"�� �(�������������(����you as a part-time roommate. Stephanie, I am looking forward to ����������� ����������"�� �J� ��<�������$ �=�������(����������� �)������ ����"���)� ���"� ���������� ����� ���$� ������"����7$ �=�����
214
Dan
kw
oord
����"���)� ��������������9������� ������������ ��������"���������������� �)�������� �������������� �����������������/����"���)� ���������@ ���.�����#���� �����������0���������������� �$����������������or further away (Hilvesum, Paris, Bermuda, Riga, Berlin), good food 5��������� ��������/���� �� �� ������$���������)��)������� ��������������>��)����(� "��������#�1�������������������� ���������� �5�� ����� �-diso, End of the Road). !������ ������"� 5���� 9�+1� ��� ���� � ����� ���� �� � ��$�� 9� � ��������� 6�������� 6� ���� -� ��=��� ��"���� 8������ 5������ � ����� ����7� 1�������� ������/�����-� ���������#���������5���������#���� ��������$�)���������(� ��������������������� ���������7����� 1��6� ��������!���������#���6��������� ������������#���5 �� �������1�A(������Almut, Götz, Jildou, Sander, Jan K., Jan vd B., Christiaan, Maurine, Jeroen, Joyce, Richard and Marion (if you need a house- and garden-����� ��"���#��)�)�� �����/�����1��-� ����,������-��#����������5������������$��$������� ���1*�����#���� ������������/����$������������������������ ����������� ��#���������� � � �����
'��� ��������������$���=� ����� ��#���� �� ��#� �������$ ��������van de cursus ecologische interacties gegeven. Hoewel het strikt ge-0��������� �=���=��$ ������7���� 0��#���� ���������������� ����� �=#���)�����(�� ���=�����)�##�����������#��� �� �� ��(��������� ���-��- ���� ��� ������� =������ �� ������ � �� �����$��� ������� ������ ������ �#��� �� 0�#� ������� �#�������)����� ������ � ����� �� ��� �#� ��0������ �����=�������������������� ��=#����/��� ��=#������������)����$��(����)�� �� ������# ����� (�� ����� =�=� ���������� ���������������#�� (�� ���� ������������ �����$ ��������0�=��(���������������������(�� ������������������)����#� ����#������������� ����=�� �)�����������-��=� �������� �=���������������� �$�(��������=� ���)�������-� ��=���8���������-$���=�� �����������#���������$�������#�=������)����9�=�����$ ������������ ���#�(�� ������� ��#�(������ ��$� ����� ��)�������������������-�� ��������� ��#� ����� �� ����� �=#��'� ����������������8� �� � ���'� � ��+(� #��$���#� ����#�=������(�� �����������#� ���������� ��$� �-meter stuk was, en ik snel een oplossing nodig had. Gerard, dank ook (�� �=���&$� ��������������� ��#�(�������$$� ���� �(������ ��� ���
����� ����)� #���������������������$ �=�������'� ���"�������)�����������#�����$��$���� ���!������*�9� � ���4��������������-��������!�� >��8������ �����4����� ���� ���� ����� ���#� "��� 9� � ��� "���
215
)� ����� ������$$� ��� ������ ��������$ ��������)� #�������� ����-�������������� ������ ����) �������$������)�"����=�"�����������"���at conferences, and getting your (always positive) emails. I wish you ��(� "��������������'�����)�� ��������4����������������#��Z �������������������� ��Z�0����5���������� ���� ��������� ��������1��Living in the guesthouse was a lot of fun. Thank you Elli for all the midnight conversations, Irish coffee in Herrsching and drinks in ���������� ������$��)�����"���������h����#��!�� >��-� �����-��������Sophie, Maude, Dieter (your Reh und Hase were always spiced with �������� ���1���"�(�������8��#��������������$��$��������)� ��=����$���-������� ���#���������������������$����������)��������=�"� ������ ���������$� ����������������������#����$� ����� �������$ �=����)�����������(���&������)����������*� ��')���� ��!������������(� �����him I think I would have liked him.
� ������7���� 0��#� ����� ��� ����� ����=�� ����##���=#� ��� �#� �� � (����gehad aan de mensen die me lieten zien dat er ook andere dingen )� �������)��������$��������#��=�=��� ����#�������=�=�����!���������0��������##� �$�$��� �������=����� ����#����� ���=���������������-���������������������������������8����������=��������������=��� �� �=��������������� ��#���������$ ������(� �)� #��������(����#���=������#���=����muziek of op reis gaan. Ik hoop dat we nog veel dingen doen samen. -�0��#���#��������� ������%������������#�#��� ����#�������0�#� �����=���������������������������#�=��)���< >���� ������< ��#=��5�������� ��-���1�����#������-� =������6� "����� �������������#��(�� �������-������0��#����$��0�� ���#�������-���������(���=���5��������(���-=��1�����������#����(������������-� =�����)� �����#�����=�����������(�������)������� �� ������#�������#� =��)�����#�(�� ���� ���#��)�����(�#�������6� "��!�#�����<� ��������� ���������/=��������)�-���������#�����=�� �=�=��#������#��$$������ ������<���&��=������)� ���5���0�=�1���=����(� �����(�#������ ���������������#����$������#�����(��#�����������#�����������#� ��� ��=�����=�����)�� ������������ �=�)�������>�����#�(�� ��������#� ��������#����!���� ���� �=�=�������� ��=(���slapen als ik vroeg in de ochtend een vliegtuig moest halen. Bert en ,������������#�(�� ��������� ��#������#����4����������������0�=���-���������)���/=�������#�����=���(��� �=�=��������#���������$�)���(���)� #���� ��������������#������#�=��)���(�� ��������)� $���(�����=�� ��#=���������� �##����=����#�(���������������������� )�=������������������ �#����������#�������� �=����� ������#� ��� ��=������#�������������� "�
216
Dan
kw
oord
�� ������������� ��)��������)����������������������#���� ������� ��#��� ���#�����������( ��������� ���#������������#����� ������������)��������������)�����#�������#����$�����)����#�� �����(��#� ��=(���zien, ondanks dat we iets verder van elkaar wonen.-�=�� ���� �� �� ������ ����=�� ���� ��(���� ����(��� ����� )��� �#� ��#����������������)�������#�=������)������#�(�� ���������=��(� � ��)����� ��� ���)��� �#��������� "����� �#�)�� ����������� ��=���������������#� )�� � ����� �$� �0��#� #)������� )� #� �����=�� $ � ������� ���)��#���� ���8�� ��� 0� ��� � � ����=�� (�� ����� �#� ����$���� 0�#� � �������(�� =�� ��-� ��=������������������ ��=#�9 ����=����������/=������=������0������� �=�)������-� ��=������#�(�� ���������$�����=�����������$��� �=� ����� ������� �������� ��$ �� ����.������� �(������������$���������$��$�����#��0�����������)�##������7�� �$������$��� �� �=$�������#�=��)��h���������)����������$���#���� �������=�� �����#�=������)���(�� �� ���)����0�=���8���������$���=�� �)� ������#� ��������#��$�9 ����=��$���������)� �������(��� �����!���0�=�� �)���#����#���)���������)� #����������)��������$ ����������#�=��)�������=��0�.��( ���=#�������������=�� ����9 ����=��
<�����"���)�����������#��� ����������(����� � ������"�$� ��"�$����You two are the people I want to have around me when I am very �� (���������)���������� ������� ��������� �
217
218
LIST OF AUTHORS
�� � ���-��9����� *����(� ���"����� �����������"���+��� ���-�-seum, 100 Queen’s Park Circle, Toronto, M5S 2C6, Canada.
������ ��� ����������*�-�&� �����#� ���������� �� �+ ��������"�� � -hard-Gwinner-Straße, Haus Nr. 7, 82319 Seewiesen, Germany
Anthony Fries: Ohio State University, Department of Evolution, Ecol-ogy, and Organismal Biology, 318 W 12th Avenue, 43210, Colum- ������!�
8��,�����'� �*�+�������������(� ���"����$� ���������(������������-ogy, and Organismal Biology, 318 W 12th Avenue, 43210, Colum- ������!�
� �� ��')���� †*�-�&������#������������� �+ ��������"�����7�� 7Tann-Strasse 7, 82346 Andechs, Germany.
9� � ��8���*����(� ���[���������0��<��� � �����9����������778457 Konstanz, Germany. University of Glasgow, Institute of Biodiversity, Animal Health and Comparative Medicine, Graham Kerr Building, G12 8QQ, Glasgow, UK
��$������;��� *�-�&������#������������� �+ ��������"�����7�� 7���7Strasse 7, 82346 Andechs, Germany.
,�0����"�����*����(� ���"����9 ������6���� ����4200-6270 Univer-���"�9�(����������(� ���6T 1Z4, Canada.
Kevin D. Matson: University of Groningen, Centre for Ecological and Evolutionary Studies, Centre for Life Sciences, PO Box 11103, 9700 CC, Groningen, The Netherlands.
��� ��� ���)� �*� -�&� �����#� ���������� �� � + ��������"�� � �� �7Gwinner-Straße, Haus Nr. 6, 82319 Seewiesen, Germany.
219
B. Irene Tieleman: University of Groningen, Centre for Ecological and Evolutionary Studies, Centre for Life Sciences, PO Box 11103, 9700 CC, Groningen, The Netherlands.
-���#��!���� ������*����(� ���"����' ���������6��� ���� �����������and Evolutionary Studies, Centre for Life Sciences, PO Box 11103, 9700 CC, Groningen, The Netherlands.
Joseph B. Williams: Ohio State University, Department of Evolution, Ecology and Organismal Biology, 318 W 12���!(������6���� ����43210, USA.
220
LIST OF PUBLICATIONS
Buehler, D. M., M. A. Versteegh, Matson and B. I. Tieleman. 2011. +���$ � ��������"����������*����$����������������$$ ����������$���-ravel the complexity of the immune system in an ecological context. Plos One 6: e18592
Tieleman, B. I., E. Croese, B. Helm and M. A. Versteegh. 2010. Re-$���� ����"� ���� ����(������ �� ������� ������ � ������� � ����"� ��� � �� ������Comparative Biochemistry and Physiology – Part A 156: 537-540.
���� ��� 6 �������#� �� ���� ��� ��� 6�� 8� ��#���M. A. Versteegh, J. Komdeur, B. I. Tieleman, K. D. Matson. 2010. Effects of immune enhancement and immune challenge on oxidative status and physiol-ogy of Homing Pigeons (Columba livia): implications for ecologists. Journal of Experimental Biology 213: 3527-3535.
Tieleman, B. I., M. A. Versteegh, A. Fries, B. Helm, N. J. Dingeman-����8��,��'� ������9��4���������2009. Genetic modulation of energy ���� ��������� � ����� �������������� ���� ����������Proceedings of
the Royal Society B: Biological Sciences 276: 1685-1693.
Tieleman, B. I., M. A. Versteegh, B. Helm, N. J. Dingemanse. 2009. Quantitative genetics parameters show partial independent evolu-����� "�$����������� � ��"�������������� ��������������������� ���different populations. Journal of Zoology 279: 129-136.
Versteegh, M. A., B. Helm, N. J. Dingemanse, B.I. Tieleman. 2008. ��$���� ����"� ���� ����(������ �� ���������� ��������� ����� ���� �����������(�$� ���(��)��� ��������� � ��*������������"����� �$���������-chats. Comparative and Biochemical Physiology – Part A 150: 452-457.
Reneerkens, J., M. A Versteegh, A. M. Schneider, T. Piersma, E. H. Burtt Jr. 2008. Seasonal changing preen-wax composition: Red Knots’ (Calidris canutus1�%�&� ������������������������� 7��� ������ ���� ��V�The Auk 125: 285–290.
Versteegh, M.A., T. Piersma, H. Olff. 2004. Biodiversity in the Dutch 4���������*������ ��������;�������������� ���������(�������������-��������������������� ����/��������� ��De Levende Natuur 105: 6-9 (in Dutch with English Summary)