Grupo de MicrobiologGrupo de Microbiologíía de la a de la U. Nacional de Colombia. U. Nacional de Colombia.
Uso de inoculantes microbianos aislados de manglar.Uso de inoculantes microbianos aislados de manglar.
Javier Vanegas Guerrero Javier Vanegas Guerrero (Bi(Bióólogo, MSc en Microbiologlogo, MSc en MicrobiologííaaEst. Doctorado BiotecnologEst. Doctorado Biotecnologíía).a).
Jimena SJimena Sáánchez nchez (U. Nacional, sede Bt(U. Nacional, sede Btáá))
Tania Galindo Tania Galindo (U. Nacional, sede Bt(U. Nacional, sede Btáá))
Jaime PolanJaime Polaníía a (U. Nacional, sede Medell(U. Nacional, sede Medellíín).n).
Gina HolguGina Holguíín n (CIBNOR).(CIBNOR).
FFiinnaanncciiaacciióónn
�� Universidad Nacional de Colombia.Universidad Nacional de Colombia.
�� Proyectos CONACYT: Proyectos CONACYT: ““DiseDiseñño de inoculantes bacterianos mixtos que o de inoculantes bacterianos mixtos que promueven el crecimiento de plantas de manglarpromueven el crecimiento de plantas de manglar”” y y ““Estudio de la mitigaciEstudio de la mitigacióón del estrn del estréés salino en plantas de s salino en plantas de chile utilizando composta y bacterias promotoras de chile utilizando composta y bacterias promotoras de crecimiento vegetalcrecimiento vegetal””. .
�� Programa de Movilidad de Investigadores MPrograma de Movilidad de Investigadores Mééxicoxico--Colombia CONACYTColombia CONACYT--COLCIENCIAS.COLCIENCIAS.
�� Centro de Investigaciones BiolCentro de Investigaciones Biolóógicas del Noroeste de gicas del Noroeste de MMééxico (CIBNOR), La Paz xico (CIBNOR), La Paz -- Baja California Sur.Baja California Sur.
INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓN.N.
�� ProblemProblemáática: 1. Suelos salinos.tica: 1. Suelos salinos.2. Reforestaci2. Reforestacióón de manglares.n de manglares.
�� Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal.Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal.
�� Mecanismos de AcciMecanismos de Accióón.n.
�� Antecedentes.Antecedentes.
�� Resultados.Resultados.
Suelos salinos.Suelos salinos.
�� Regiones Regiones ááridas.ridas.
�� Crecimiento vegetal y Crecimiento vegetal y Productividad.Productividad.
�� 20%20% salinizacisalinizacióón n secundaria*secundaria*11..
Colombia Colombia **22 ::
Costa AtlCosta Atláántica.ntica.2.500.000 ha.2.500.000 ha.
Valle del Cauca.Valle del Cauca.(120 mil ha.)(120 mil ha.)
Valle del magdalena.Valle del magdalena.
Cundinamarca.Cundinamarca.
Llanos orientales.Llanos orientales.
1. Mayak et al., 2004 2. Universidad del Valle, 2005
EstrEstréés salinos salino
�� Factores osmFactores osmóóticosticos No disponibilidad No disponibilidad de agua.de agua.
�� Factores iFactores ióónicosnicos Toxicidad iToxicidad ióónica.nica.
�� Cambio en la expresiCambio en la expresióón de fitohormonas.n de fitohormonas.
�� Alterada por inoculantes.Alterada por inoculantes.
Azcon-Bieto y Talon, 2000
IMPORTANCIA MANGLARES.IMPORTANCIA MANGLARES.
�� Servicios ambientales.Servicios ambientales.
�� Altamente productivos.Altamente productivos.
�� Exportadores de materia Exportadores de materia orgorgáánica.nica.
�� HHáábitat de reproduccibitat de reproduccióón y n y desarrollo.desarrollo.
�� Estabilizador de suelos.Estabilizador de suelos.
La contribuciLa contribucióón den delas bacteriaslas bacteriasa las pesquera las pesquerííasas
HOLGUIN et al., 1999.
CIENCIA Y DESARROLLO
SituaciSituacióón de manglares.n de manglares.� 379.349 ha de manglar (2003).ha de manglar (2003).�� Estado crEstado críítico.tico.�� ReducciReduccióón de su cobertura:n de su cobertura:
7.965 ha/ha/ anuales (17 aanuales (17 añños).os).Zonas hipersalinas.Zonas hipersalinas.
*1. Álvarez-León, R. 2003.
�� Oferta ambiental de los bienes y Oferta ambiental de los bienes y servicios.servicios.
�� La abundancia y diversidad de La abundancia y diversidad de recursos pesqueros.recursos pesqueros.
�� La calidad, desarrollo y La calidad, desarrollo y productividad de los bosques.productividad de los bosques.
Mecanismos de AcciMecanismos de Accióónnen la promocien la promocióón de crecimiento vegetal*n de crecimiento vegetal*
1) La fijaci1) La fijacióón bioln biolóógica del nitrgica del nitróógeno.geno.
2) Solubilizaci2) Solubilizacióón de diferentes minerales (fosfatos).n de diferentes minerales (fosfatos).
3) Producci3) Produccióón de reguladores de crecimiento (auxinas, n de reguladores de crecimiento (auxinas, citoquininas, giberelinas y actividad ACC deaminasa).citoquininas, giberelinas y actividad ACC deaminasa).
4) Aumento de actividad de otras simbiosis (4) Aumento de actividad de otras simbiosis (RhizobiumRhizobium sp sp y y micorrizas).micorrizas).
5) Hip5) Hipóótesis aditiva, la intervencitesis aditiva, la intervencióón de varios mecanismos.n de varios mecanismos.
* * (( Vessey, 2004)Vessey, 2004)
Bacterias promotoras de crecimiento Bacterias promotoras de crecimiento vegetal.vegetal.
� Reducen agroquímico.
� Producción económica.
� Restauración de ecosistemas.
� Mitigar el efecto del estrés salino1,2
1. Mayak et al., 2004 2. Bashan et al., 2000* Kennedy et al., 2004
�� En los seres vivos: macronutriente.En los seres vivos: macronutriente.
�� En el Suelo: En el Suelo: Deficientes en N.Deficientes en N.NitrNitróógeno Orggeno Orgáánico.nico.N0N033
--= Desnitrificaci= Desnitrificacióón y Lixiviacin y Lixiviacióón.n.NHNH44
++= = VolatilizaciVolatilizacióón, nitrificacin, nitrificacióón y n y retenciretencióón en arcillas.n en arcillas.
�� En la AtmEn la Atmóósfera: En abundancia (78%). sfera: En abundancia (78%). NN22 estableestable
FIJACIFIJACIÓÓN DEL NITRN DEL NITRÓÓGENOGENO..
BIOLBIOLÓÓGICA. GICA. �� T. AmbienteT. Ambiente�� EconEconóómica.mica.�� No contaminante.No contaminante.
COMERCIALCOMERCIAL..�� 500500°°CC�� Costosa.Costosa.�� EutroficaciEutroficacióón.n.
NN2 2 2 NH2 NH33
AcetilenoAcetileno EtilenoEtilenonitrogenasa
FijaciFijacióón de fosfatos en el suelon de fosfatos en el suelo
¡ En 60 a 80 años se acabaría la reserva de fósforo mineral !
Suelos Suelos áácidoscidos Suelos alcalinosSuelos alcalinosFe, AlFe, Al Ca, MgCa, Mg
algunos manglares
colombianos
Vessey, 2004 Valero, 2002
Reguladores de crecimiento vegetal (PGR)Reguladores de crecimiento vegetal (PGR)
Antecedentes.Antecedentes.� Holguín et al., 2001 (Microcoleus)
A. germinansLa concentración total de nitrógeno en plántulas inoculadas aumento.
� (Bashan et al., 2000). Salicornia(planta halófita).
Vibrio y Phylobacterium (diazótrofos).
Crecimiento de un 44 a 102% 500% contenidos de N 94% el de ácidos grasos.
� Ravikumar et al., 2004
3 sp de Azotobacter. Manglar
� Bajo condiciones salinas de 30 g/l de NaCl.
� Alto crecimiento.
� Fijación de nitrógeno.
� Producción de auxinas.
� Rhizophora mangle =Biomasa de raíces (98.2%)Biomasa de vástago (30%), Longitud de raíz (48.45%)Área foliar (277.86%)Niveles de clorofila (151%) y Carotenoides (158%).
� Bacilio et al., (2004) Azospirillum plántulas de maíz
estrés salino.Incremento: La altura,
Peso seco de las raíces y hojas.
Bacilio et al., (2004)
Mayak et al., (2004).
Bacterias Tomate ambientes salinos. Estrés salino.
Actividad ACC deaminasa.Incrementaron los parámetros de crecimiento.
EstrEstréés por Inundacis por Inundacióón.n.
Grichko and Glick 2001
METODOLOGIAMETODOLOGIA..
1.Muestreo
5. Caracterización4. Reducción de
Acetileno
3. Purificación Morfotipos
2. Procesamiento
6. Efecto de Inoculación
1. Muestreo y Procesamiento1. Muestreo y Procesamiento
10 Plántulas por especie
Cinco muestras integradas por
especie
2 muestreos
1. Enriquecimiento en Nfb
Diluciones
2. Siembra en placa (AN, Nfb)
ReducciReduccióón n deldel Acetileno.Acetileno.( Lozano, 1998)
Acetileno
ARA
ACTIVIDAD NITROGENASAACTIVIDAD NITROGENASA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
G10M17G9,2M9,8G9,7G12 M4G13M 9,1 M2 M1 G5
M18M19G11 M9
Morfotipos
Act
ivid
ad N
itrog
enas
a (n
mol
etile
no/fr
asco
/hor
a)
AIA
Crecimiento
Estrés salino
Cucumis meloL. esculentum
R. mangleR. mangle
A. germinans
ManglarN2
Cepa G10
Vanegas, 2004 Galindo, 2005
Bioensayo en TomateBioensayo en Tomate
EFECTO DE INOCULACEFECTO DE INOCULACÍÍONON
�� PlPláántulas de tomate.ntulas de tomate.
�� Bajo dos concentraciones de Bajo dos concentraciones de salinidad y de nitratos.salinidad y de nitratos.
�� Longitud y biomasa de raLongitud y biomasa de raííces y ces y vváástago, stago, áárea foliar.rea foliar.
�� ANOVA y prueba de DuncanANOVA y prueba de Duncan
Tratamientos.Tratamientos.
Soluciones Nutritivas
Relación entre aniones.NO3
- = (H2PO4- + SO4
-)CE (dSm -1) pH
1. Salinidad A Nitratos B
46,0 : 54,0 4,8 5.8
2. Salinidad A Nitratos A
72,7 : 27,3 4,8 5.8
3. Salinidad B Nitratos B
46,0 : 54,0 2,27 5.8
4. Salinidad B Nitratos A
72,7 : 27,3 2,27 5.8
BIOMASA SECABIOMASA SECA
b b
b b
b
b
a
b
0
50
100
150
200
250
300
350
Bio
mas
a se
ca (
mg)
I N I N I N I N
SA NB SA NA SB NB SB NA
Tot.
Raíc.
Vast.
ÁÁrea Foliar (cmrea Foliar (cm22))
b b
bb
b
b
a
b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
I N I N I N I N
SA NB SA NA SB NB SB NA
Efecto de InoculaciEfecto de Inoculacióónn
SBNA
SANB
SBNB
Aislamiento de MSFAislamiento de MSF
lavadoSRS (1963)
Ca3(PO4)2
Enriquecimiento
7 días
110 rpm
T = 37 ºC
Siembra en placa en SRS sólido (0.1 mL x 3)
Aislamiento
AislamientosAislamientos
Debaryomyces hansenii
Aspergillus niger
9 aislamientos bacterianos solubilizadoras de fosfatos… Aquaspirillum, Aeromicrobium.
EvaluaciEvaluacióón de actividad n de actividad solubilizadora de fosfatossolubilizadora de fosfatos
Pre-inóculo:
SRS líquido
SRS líquido
Medición de fosfato soluble en el medio: reacción colorimétrica detectable con espectofotómetro
pH??? # células o biomasa
SolubilizaciSolubilizacióón de fosfato inorgn de fosfato inorgáániconico
ef
b cc c c c c d
e
efef
f f
fg
g
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450B
lanco
SA
8(1
)
SR
1
HSF2
B1
BA
10
BA
13
SR
2(1
)
SA
7
B2
HSF11
SA
4(2
)
BA
9
BA
12
HSF10
SA
4(3
)
BR
4
HSF9
Aislamiento
Fosf
ato
solu
bli
zado (m
g*L-1
)
3
4
5
6
7
pH
ComparaciComparacióón de valores medios n de valores medios de solubilizacide solubilizacióón en diferentes n en diferentes
manglares.manglares.
�� MenoresMenores : : San AndrSan Andrééss(190 mg*L(190 mg*L--11*24h*24h--11))
�� IntermediosIntermedios : : BarBarúú(226 mg*L(226 mg*L--11*24h*24h--11) )
�� MayoresMayores : : MMééxicoxico(460 mg*L(460 mg*L--11*24h*24h--11))VVáázquez zquez et al., et al., 2000)2000)
Factores que pueden explicar esto: estado de Factores que pueden explicar esto: estado de conservaciconservacióón, cantidad de reserva de fn, cantidad de reserva de fóósforo sforo inorginorgáánico, aportes externos de fnico, aportes externos de fóósforosforo
Ensayos con plEnsayos con pláántulas de manglentulas de mangle
A partir de propágulos bajo invernadero:
Sí se obtuvo respuesta
En transplante y en plántulas ya establecidas: No se obtuvo respuesta
Ensayos con propEnsayos con propáágulos de gulos de A. A. germinansgerminans
�� Inoculantes pueden agilizar procesos de Inoculantes pueden agilizar procesos de reforestacireforestacióón cuando se utilicen pln cuando se utilicen pláántulas bajo ntulas bajo condiciones de vivero.condiciones de vivero.
Crecimiento en patilla Crecimiento en patilla
BB
B BC
D D DA
E'D'D'
C'
A'
B'
A'
B'
A'
D''D''D''
BC''
B''
C''
C''
A''
B''
D'''D'''
D'''
C'''
B'''B'''B'''
A'''
0
20
40
60
80
100
120
140C
8
A. B
rasi
lens
e C
d
* V
ibrio
6hc
Par
acoc
occu
s 4b
c
* V
ibrio
1hc
Aer
omon
as 7
yc
Pse
udom
onas
6a
Vib
rio 1
mbc
Bla
nco
med
io
Cepa
[AIA
] µg*
mL-1
12 h24 h48 h72 h
A'''
ProducciProduccióón de AIAn de AIA
ConclusionesConclusiones
�� Alta actividad biofertilizante de Alta actividad biofertilizante de microorganismos asociados a manglar.microorganismos asociados a manglar.
�� Bacterias Fijadoras de nitrBacterias Fijadoras de nitróógenogeno�� Solubilizadoras de fosfatoSolubilizadoras de fosfato
�� Potencialidad para reforestaciPotencialidad para reforestacióón e n e inoculantes de plantas de interinoculantes de plantas de interéés s comercial.comercial.
�� Mitigadoras de estrMitigadoras de estréés salino.s salino.
�� Ensayos a nivel de campo.Ensayos a nivel de campo.
�� EvaluaciEvaluacióón en otras especies comerciales.n en otras especies comerciales.
�� FormulaciFormulacióón del inoculante.n del inoculante.
�� Evaluar colonizaciEvaluar colonizacióón.n.
�� Potencializar la actividad microbiana.Potencializar la actividad microbiana.
Perspectivas y preguntas.Perspectivas y preguntas.
Agradecimientos.Agradecimientos.
Colciencias por el Apoyo a Doctorados Nacionales.Colciencias por el Apoyo a Doctorados Nacionales.
INVEMAR por su invitarnos a Primer Taller de INVEMAR por su invitarnos a Primer Taller de BiotecnologBiotecnologíía Marina.a Marina.
BIBLIOGRAFBIBLIOGRAFÍÍAA�� Bacilio M., H. RodrBacilio M., H. Rodrííguez, M. Moreno, J. Hernguez, M. Moreno, J. Hernáández, y Y. Bashan (ndez, y Y. Bashan (20042004). ).
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�� Vanegas, J. Vanegas, J. 20042004. . DeterminaciDeterminacióón de la actividad fijadora de nitrn de la actividad fijadora de nitróógeno de geno de diazdiazóótrofos asociados a pltrofos asociados a pláántulas de ntulas de Rhizophora mangle Rhizophora mangle y y Avicennia Avicennia germinans germinans en manglares del caribe colombiano. Tesis de pregrado. en manglares del caribe colombiano. Tesis de pregrado. Facultad de Ciencias. Departamento de BiologFacultad de Ciencias. Departamento de Biologíía. Universidad Nacional de a. Universidad Nacional de Colombia.Colombia.
Javier Van
egas G
uerrero