Olivier Plantard
UMR INRA-Oniris « BioEpAR »"Biologie, Epidémiologie et Analyse de Risque en santé animale”
Variabilité génétique des tiques :apports pour la lutte anti-vectorielle
et la compréhension de l'épidémiologie des maladies à tiques
Rennes, 25/02/2014
Olivier Plantard
UMR INRA-Oniris « BioEpAR »"Biologie, Epidémiologie et Analyse de Risque en santé animale”
Variabilité génétique des tiques :apports pour la lutte anti-vectorielle
et la compréhension de l'épidémiologie des maladies à tiques
Rennes, 25/02/2014
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Définition :Vecteur = arthropode hématophage qui assure la trans mission biologique
(ou mécanique) active d’un agent infectieux d’un vertébré à un autre vertébré
Vecteur
HôteAgent pathogène
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Malaria : 1,2 millions de morts par an
http://vigilance-moustiques.com/10-ans-de-progression-du-moustique-tigre-en-france/
Source : OMS
Classification phylogénétique du vivant. Lecointre & Le Guyader 2001
Arachnides :Acariens :
Tiques
Hexapodes : Insectes
Hématophagie aussi chez des chélicérates
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Ixodes ricinusIxodes scapularis
Rosa et al. 2005
Borrelia burgdorferi
« Lyme disease should be recognized as a virulent epidemic that is at least six times more common than HIV/AIDS. »
La principale maladie humaine transmise par les tiques : la maladie de Lyme
Janvier 2014
Borrelia spielmanii associée au lérot
Borrelia lusitaniae associée aux lézards
associations préférentielles entre espèces de Borrelia et espèces de vertébrés-hôtes
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Borrelia burgdorferi : agent responsable d’une maladie décrite seulement en 1982mais le plus vieil agent pathogène connu associé à l’homme
© L. Malandrin
Babesia divergens
Un exemple de maladie animale transmise par les tiques : la piroplasmose bovine
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Niveau d’expression de différents gènes chezdes tiques non-infectées / tiques infectées par B. burgdorferi
Le niveau de transcription de certains gènes de tiques est manipulé par les bactéries Borrelia
Tick housekeeping gene
Bacteria housekeeping gene
Tick salivary gland gene
Tick salivary gland gene
Hovius et al. 2007Ramamoorhy et al. 2005
larve
oeuf
femelle
mâle
nymphe
2ème
Cycle de vie à 3 stades et 3 repas sanguins sur 3 hôtes différents
Cycle durant 2 à 4 ans;dont seulement 5% sur un hôte
Bactéries intracellulaires trouvées dans les tiques
Wolbachia
Collaboration avec
Claudio Bandi et Davide Sassera
Ixodiphagus hookeri
Midichloria mitochondrii
La présence de Wolbachia dans
Ixodes ricinus est liée à celle
d’un parasitoïde
Quelles conséquences de la présence de Midichloria sur la
fitness des tiques ?
présente dans 100% des femelles
d’I. ricinus sauvages
Plantard et al. 2012
2) Pour une meilleure compréhension de l’épidémiologie des maladies transmises par les tiques
- Connaissance des flux de gènes entre populations de tiques permettant d’estimer leur dispersion
Objectifs
1) Pour développer des méthodes de contrôle efficaces et durables contre ces vecteurs
Etude de la variabilité génétique des tiques à l’échelle inter- et intra-spécifique
23 /45
- Connaissance de la variabilité des gènes de tiques (interactions avec les hôtes, les pathogènes…)
vaccins anti-tiques acaricides
Séquençage de 6 gènes :• 4 gènes « de ménage » : ¤ 2 gènes mitochondriaux : 16S (444 bp) – COI (1318 bp)
¤ 2 gènes nucléaires : 18S (1770 bp) - EF1-α (1001-1814 bp)• 2 gènes potentiellement impliqués dans la transmission de pathogènes :
Trospa (695 bp) - Defensin-2 (960 bp)Alignement de 6200-6800 bp
Local scale: Gâvre Forest [10 ha]
Regional scale [343 km]
Eurasian scale [827 km]
Western Palearctic scale [1014 km] (Eurasia +north-Africa)
+++
Phylogéographie d’ Ixodes ricinus
� Décrire la variabilité génétique de l’espèce (aire de répartition)� Existe-t-il un patron sud-nord de diversité traduisant l’existence d’un refuge glaciaire ?
24 /45
Noureddine et al. 2011
Neighbour-Joining, MCL
9/12
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
Local scale Regional scale Distribution areascale with N-A
populations
Diversité nucléotidique(π de Nei)
Phylogéographie d’ Ixodes ricinus
TrospA gene
Noureddine et al. 2011
Neighbour-Joining, MCL
10/12
Noureddine et al. 2011
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
Local scale Regional scale Distribution areascale with N-A
populations
Afrique du nord
Diversité nucléotidique(π de Nei)
Phylogéographie d’ Ixodes ricinus
TrospA geneNoureddine et al. 2011
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�Absence de structuration entre populations eurasiatiques :
Fort flux de gènes entre ces populations (rôle des oiseaux migrateurs ? des échanges commerciaux d’animaux ?...)
� Forte divergence génétique entre Eurasie/ Afrique du nord :
Différenciation génétique ancienne dans des populations relictuelles (montagnes…) ?
Phylogéographie d’ Ixodes ricinus
Conclusion
� Echantillonnage de populations de tiques de part et d’autre de barrière à la dispersion des
mammifères (grands fleuves)
20 km
Capacité de dispersion des hôtes :
< <
� Génotypage de 31 individus par population avec 6 marqueurs microsatellites
? ?� Rôle des fleuves comme barrières potentielles
aux flux de gènes entre populations de tiques
Contributions relatives des hôtes dans la dispersion des tiques :
larva
eggs
female
male
nymphe
1st blood meal
3rd
blood meal
2nd blood meal
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale
Echantillonnage de populations de tiques par collecte « au drapeau » (printemps- été 2008) :
4 transects de 4 populations
Génotypage de 31 individus (nymphes) par population avec 6 marqueurs microsatellites (6000allèles
Loire
GaronneRhône
Rhin
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale
Différenciation génétique entre 2 populations (Fst):
>
• Si la dispersion des tiques par les oiseaux est négligeable(ce sont les mammifères qui dispersent les tiques) :
FstFst
Fst
20 km
• Si la dispersion des tiques par les oiseaux est importante :
=FstFst
Fst
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale
31
Conclusion
20 km� Les fleuves ne jouent pas un rôle de barrières
aux flux de gènes entre populations de tiques
� Les oiseaux jouent un rôle majeur dans la dispersion des tiquesà l’échelle régionale :
<
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale
Les tiques et leurs hôtes ne vivent pasdans un environnement homogène
Outil de Simulation Cartographique à l’échelle du paysage Agricole du Risque acarologique
Agrobiosphère
� Il est nécessaire de prendre en comptel’hétérogénéité à l’echelle du paysage
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Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage
Laboratoire porteur du projet
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� Habitats
� Densité de tiques
� Génotype de tiques
� Densité et mouvements des hôtes
� Prévalence de pathogènes dans les tiques(Borrelia, Anaplasma, Babesia)
� Hôtes utilisés par les tiques (repas sanguins)
Pour mesurer les flux de gènes à une échelle aussi fine, il faut des marqueurs génétiques résolutifs
3 sets de loci microsatellites (6, 17, 9) ont été développés mais ils présentent des difficultés de détermination des génotypes et montrent des patrons non-mendéliens de transmission des allèles
� Développement d’un nouveau type de marqueurs : les Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
� Pyroséquençage d’une partie réduite du génome (Reduced Representation Libraries)
• Pas de génome de référence disponible ("traces" d’ I. scapularis mais pas d’assemblage)• Génome de grande taille (2.1 Gb)
Isolement et mise au point de marqueurs SNPs à partir du génome d’Ixodes ricinus
Alshuler et al, 1998
34
Elsa Quillery
� Sélection de 1765 SNPs
Découpage des reads en k-mers
Analyse des graphes de De Bruijn pour repérer les SNPs
Filtrage des SNPs à partir de critères de qualité, profondeur de séquençage…
� Amorces dessinées pour 384 loci
� 1 400 000 reads
Taille moyenne des reads = 530 bp
En l’absence de génome de référence, utilisation d’une suite originale de logiciels, en collaboration avec des bioinformaticiens de l’INRIA (Rennes; Pierre Peterlongo et Olivier Quenez) : DiscoSNP (Uricaru et al. soumis)
Génotypage haut débit par la technologie Fluidigm
Volume : nanolitre (10-9L)
Puce de 96 x 96 = 9 216 réactions PCR
Quillery et al. 2013
Validation des marqueurs SNPs par génotypage
� 368/384 (96%) des loci ont montré la présence des deux allèles
- Préamplification de l’ADN de nymphes individuelles par « Whole Genome Amplification »
Echantillonnage de 3000 tiques par la « méthode du drap » dans 900 localités géoréférencées
Génotypage de 480 tiques par 384 loci
Quillery et al. in prep
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Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage
Quillery et al. in prep
� Absence d’isolement par la distance
v v
12
3
1 32
% d’assignation du génomeà chaque entité génétique
� Absence de structuration génétique à l’échelle du paysage
Fst / 1-Fst entre paire d’individus
Sélection de 371 individus , 128 SNPs
Assignation bayesienne (STRUCTURE; k=9)
Distance (m)
371 individus
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage
38
Conclusion
Absence de différenciation génétique et d’isolement par la distance à l ’échelle du paysage.
Hypothèses avancées :
- Taille importante des populations (150 nymphes / 10 m2) qui limite l’effet de la dérive génétique
Platt et al. PLOS Genetics 2010
« No natural breaks correspondingto classical notion of populations »
- Mouvements importants des hôtes à l’échelle du paysage (chevreuils, oiseaux…) occasionnant des flux de gènes entre populations de tiques
- Modification trop récente de la structure du paysage pour la mise en place d’une différentiation génétique
Arabidopsis thaliana149 SNPs
Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage
Carte génétique Ixodes scapularis
Ullmann et al. Exp & Applied Acarol 2002 Ins Mol Biol 2003
Carte génétique Ixodes ricinus
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Perspectives
� Permettre la localisation de gènes sur les groupes de liaison
� Identifier des marqueurs liés aux chromosomes sexuels (XX/XY)
Int. J. for Parasitology 2007
N50= 2941 nucléotides
Trends in parasitology 2005
Le séquençage d’Ixodes scapularis : un projet débuté en 2004
40
360 000 scaffolds !!!
1 million de copies de l’élément Is6 (96 bp) soit 5% du génome
Objectifs :
- Identification de gènes de tiques impliqués dans des traits d’histoire de vie d’intérêt en épidémiologie des maladies vectorielles ou pour la lutte anti-vectorielle (vection d’agents pathogènes, interaction avec les hôtes, les symbiotes, dynamique des populations…)
- Génomique des populations (nombreux marqueurs distribués sur l’ensemble du génome; GenScan)
- Analyse de la variabilité populationnelle de gènes sous-sélection
- Comparaison du transcriptome entre espèces du genre Ixodes (taux d’évolution des gènes)
5,000 Insect and Other Arthropod Genome Initiative
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Projet Génomique Ixodes ricinus
(en collaboration avec Claude Rispe et des laboratoires partenaires français et européens)
- Séquençage complet du génome
Perspectives