Download - Vi khuan Bacillus cereus

1

BÁO CÁO TIỂU LUẬN:

VI KHUẨN BACILLUS CEREUS

1

2

NỘI DUNG

1. Mở đầu - Giới thiệu Bacillus cereus+ Đặc điểm Bacillus cereus

+ Tính chất sinh hóa+ Tính chất gây bệnh

2. Độc tố và cơ chế sinh độc tố+ Giới thiệu chung về độc tố Ba.cereus

+ Cơ chế gây bệnh

3. Các phương pháp xác định+ Phương pháp truyền thống

+ Phương pháp hiện đại

2

3

GIỚI THIỆU BAC. CEREUS

Trực khuẩn Gram dương

Thuộc giới bacteria

Ngành (phylum) firmicutes

Lớp (class) bacilli

Bộ (order) Bacillales

Họ (family) Bacillaceaem

Chi (genius) Bacillus

Loài (species) Cereus 3

4

Trong chi này, ngoài loài cereus, còn có một số loài khác

như:

• Bacillus coagulans

• Bacillus subtilis

• Bacillus thuringiensis

• Bacillus natto

• Paenibacillus larvae4


5

Được phát hiện đầu tiên

trong một ca nhiễm độc

thực phẩm vào năm 1955

Bacillus cereus là loài vi

khuẩn hiếu khí

Bào tử dạng hình ovan

có khả năng sinh nha bào Bacillus cereus trên kính hiển vi

5

GIỚI THIỆU B. CEREUS

6

Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp. mycoides. Gram stain

6


7

Bacillus cereus Infections Leifson flagella stain. B cereus food poisoning is often associated with contaminated rice

containing heat-resistant B cereus spores.

7


8

ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS

Trực khuẩn Gr+

Tạo nội bào tử

Kích thước 0.5-1.5 x 2-4 μm

Không tạo giáp mô, không có

khả năng di động

Nhiệt độ tối thích: 35-400C

pH tối thích: 4.5-9.38

Mô hình cấu tạo B.cereus

9

Trên MT NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn

nheo, xù xì

Trên MT BA tạo dung huyết rộng

Trên MT MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm

hồng chung quanh có vòng sáng

Trên MT Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to

hồng chung quanh có vòng sáng …9

ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS

10

TÍNH CHẤT SINH HÓA B.CEREUS

Trên môi trường đường: lên

men glucose trong điều kiện

hiếu khí và kị khí, không lên

men mantose

Khử nitrat thành nitrit

Phân giải Tyroxin

Catalase (+), Citrate (+) 10

11

TÍNH CHẤT GÂY ĐỘC

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên,

nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu,

thường gây ngộ độc thực phẩm

11

12

ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS

Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm

do vk bac.cereus là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ

xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại

bệnh viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ

và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định

B. cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã phát triển mẫu

phân lập đến nồng độ khoảng 4x106 ml-1 và cho vào 200ml

cocktail. Sau khi uống13h, ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra

nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. 12

13

Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoed toxin): Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.

Độc tố gây nôn mửa emetic toxin: Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn

Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt.

13

ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS

14

TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC

Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ

gây độc.

Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải

thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ.

Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn

hâm nóng trên 800 C trước khi ăn

14

15

So sánh độc tố type 1 và type 2

Đặc tính Type 1 Type 2

Bền với nhiệt

45oC/30 phút 120oC/90 phút

pH ổn định pH 4-11 ổn định pH 2-11

Tính nhạy Nhạy với enzyme protease và trypsin

Kháng pepsin và trypsin

15

TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC

16

CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ

Độc tố EmeticBảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu

chứng gây nôn mửa do B. Cereus

Tính chất/ Hoạt động Mô tảLiều nhiễm độc sl B.cereus: 105 - 108 tb/g

thực phẩm Khối lượng độc tố 12 - 32 μg/kg

Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 – 300C)Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5hKhoảng thời gian mang bệnh 6 - 24hTriệu chứng Buồn nôn, nôn mửaLoại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở 16

17

CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐEmetic Syndrome

Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus

Tên của độc tố Cereulide Cấu trúc của độ Chuỗi pp [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa Sinh kháng thể Không (none) Hoạt động sinh học trên người Gây nôn Cơ quan nhận cảm 5-HT3 Cytotoxic No Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 1210C Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không Việc sản sinh ra độc tố như thế nào (not known, but probably

enzymatically)

18

Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố dựa trên sự bất thường của depsipeptide từ 13C liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của 13C là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40% 13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide.

18


19

Diarrheal Syndrome

- Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người sau khi ăn thịt

hầm với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105. Lần đầu

tiên bùng phát (1992), 17 – 24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân

phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu nặng ở 3 bệnh nhân này

khá muộn (>24h). Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995.

- Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra

trong suốt quá trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành

độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc về lý thuyết

mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là

điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng B.cereus tồn tại

trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường

ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và

enzyme proteolytic của tá tràng.19


20

Diarrheal Syndrome

Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus

Đặc tínhLiều gây nhiễm 105/g hoặc

/mlĐộc tố được sản sinh ra Trong ruột non

Loại độc tố ProteinThời kỳ ủ bệnh 8 – 16h

Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24hTriệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi

tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn20


21

Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát.

21


22

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH- Các phương pháp truyền thống: Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp MPN

- Các phương pháp hiện đại: Phương pháp RPLA Phương pháp ELISA Phương pháp PCR

22

23

PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

23

24

Ưu & nhược điểm

- Ưu điểm: Không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền

- Nhược điểm: Độ nhạy không cao Yêu cầu kỹ năng thao tác Tốn nhiều hóa chất Thời gian phân tích lâu Tốn nhiều nhân công

24

25

Các đặc tính của Bacillus nhóm 1

Đặc tính

Loài

B.cereus B.thuringiensis B.mycoides B.anthracis B.megaterium

Gram +(a) + + + +

Catalase + + + + +

Di động +/-(b) +/- -(c) - +/-

Khử nitrate + + + + -(d)

Phân hủy tyrosine + + +/- -(d) +/-

Kháng lysozyme + + + + -

Phản ứng với lòng đỏ trứng + + + + -

Lên men glucose + + + + -

Phản ứng VP + + + + -

Sinh acid từ manitol - - - - +

Tan máu (cừu) + + + -(d) -25

26

Phương pháp truyền thống

Phương pháp đếm khuẩn lạc

Mẫu

Đồng nhất mẫu

Phân lập

Khẳng định

Đếm số khuẩn lạc điển hình

Test sinh hóaNhuộm Gram26

27

Cách tính kết quả:

Mật độ (CFU/ml)=AixDi/V

Ai:số khuẩn lạc trung bình/đĩa

Di: độ pha loãng

V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

28

Phương pháp truyên thống

Phương pháp MPN

Mẫu pha loãng vào peptone đệm

9 ống môi trường TSP

Nhuộm Gram, thử sinh hóa

Chọn ống đục cấy sang MYP ủ 30oC/24-48h

Chọn khóm hồng có vòng sáng

TSA thạch nghiêng

Tra bảng MPN

28

29

Các thử nghiệm phân biệt các loài Bacillus nhóm 1

Thử nghiệm tính di động: hầu hết các chủng B.cereus;

B.thuringgiensis là di động, B.anthracis, B.mycoides không di động

Sự hình thành rễ giả: B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, B.mycoides

tạo cấu trúc rễ giả

Thử nghiệm làm tan máu: B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan

máu hoàn toàn (β) 2-4µm, B.thuringiensis và B.mycoides cũng làm tan

máu, B.anthracis thường không làm tan máu trong 24h

Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể:B.thuringiensis tạo tinh thể độc tố,

B.cereus và các Bacillus khác không tạo tinh thể độc tố29

30

Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm , Bộ y tế 4/1998

Nhóm thực phẩm

Gới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm)

B.cereus

Nhóm thịtThịt tươi, thịt đông, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biếnSản phẩm chế biến từ thịt: thịt hun khói, patê, xúc xích

102

10

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ:Cần xử lý nhiệt trước khi dùng: bột, miến, mì sợiDùng trực tiếp không xử lý nhiệt: bánh bột

102

10

Nhóm thức ăn khô và chứa dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc biệtPhải xử lý nhiệt trước khi sử dụngDùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt

10

10

31

MỘT SỐ HÌNH ẢNH

B.Cereus trên kính hiển vi điện tửKhuẩn lạc B.cereus trên

môi trường thạch máu cừu

31

32

B.Cereus không tạo cấu trúc rễ giả B.mycoides tạo cấu trúc rễ giả

32

33

Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường Mossel

Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP

33

34

PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

BCET – RPLA (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex

Agglutination )

BDE - ELISA (Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual

ImmunoAssay )

PCR

34

35

PHƯƠNG PHÁP BCET – RPLA

Nguyên tắc:

Phương pháp LA (latex agglutination)

Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex

Agglutination)

35

36

PHƯƠNG PHÁP AGGLUTINATION

Kháng nguyên dạng hạtKháng thể

36

37

PHƯƠNG PHÁP RPLA : Bộ KIT BCET – RPLA (OXOID TEST KIT)

Hạt latex (polystyrene 0.81 µm) gắn kháng thể đăc hiệu IgG (thỏ) kháng nguyên

Kháng nguyên hoà tan Hạt latex tụ lại

37

3838

Bộ Kit BCET – RPLA (Oxoid test kit)12

39

PHƯƠNG PHÁP ELISA-VIA Nguyên tắc phương pháp Elisa sandwich:

39

4141

Bộ BDE - Tecra kit test

4242

Kết quả:

4343

Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó,… ).

PHƯƠNG PHÁP PCR

44

B.cereus PCR kit test (Takara): xét nghiệm 2 loại gen CRS (cereulide – emetic toxin) của B.cereus LE (lecithinase ezyme gen) của các loài Bacillus

44

Chu kì bắt đầu 94oC / 30s

55oC/ 30s

Chạy điện di

72oC / 30s

Chuẩn bị mẫu

Phản ứng PCR lặp lại 40 lần

Phương pháp PCR

4545

Kết quả:

1) Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp

2) Lecithinase (LE) gene: 227bp

3) Internal Control (I.C.): 106 bp

46

Detection Real Time qPCR Kit

primerbuffer

SYBR Green

DNA

dNTPs

Tag

47

o Ưu điểm: dễ sử dụng, nhạy, hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình

nhân bản DNA đang diễn ra

o Nhược điểm: do SYBR liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép nào

trong phản ứng nên dẫn đến kết quả cao hơn so với nồng độ đích.

Phương pháp Real Time qPCR

4848

Duỗi xoắn DNA 94oC / 30s

Gắn mồi 58oC/ 45s/30 lần

Chạy điện di

Kéo dài 72oC / 1ph

Chuẩn bị mẫu

Phản ứng PCR


Gắn mồi 65-55oC/ 45s/30 lần

Chạy điện di

Kéo dài 72oC / 45s

Chuẩn bị mẫu

Phản ứng PCR

Gen HblA Gen BceT Gen entFM


Gắn mồi 52oC/ 45s/30 lần

Chạy điện di

Kéo dài 72oC /1ph

Chuẩn bị mẫu

Phản ứng PCR

49

PHƯƠNG PHÁP PCR

Multiplex PCR:

Hỗn hợp PCR có nhiều cặp mồi

Phương pháp phát hiện nhanh nhiều đoạn gen trong

cùng một phản ứng

Ưu điểm: Giảm thời gian phân tích mẫu

49

50

BCET-RBLA test

kit

Tecra BDE test kit

( ELISA - VIA)

PCR

50

5555

B. cereus group – Bal gen – PCR test . Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: B. cereus NCIM 2106, Lane 2: B. subtilis NCIM 2545, Lane 3: Salmonella Dublin ATCC 15480, Lane 4: E. coli MCIM 2068, Lanes 5-10: B. cereus isolates, Lane 11: Staphylococcus aureus NCIM 2079, Lanes 12-15: B. cereus isolates.

56

NHẬN XÉT:

ELISA-BDE cho kết quả dương tính với các dòng B.cereus có độc tố NHE (Omnii & Nduhiu, 2005;

Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ) với độ nhạy 1ng/ml dịch thực phẩm bị nhiễm.

BCET – RPLA cho kết quả dương tính với dòng có độc tố HBL, chạy PCR kiểm tra có sự hiện diện

của gen hblA (Sanjoy Das et al.,2007;Mantynen & Lindstrom, 1998,..), có độ nhạy cao với protein

L2/HBL (Douglas J.Beecher et al.,1994), 2ng/ml

81% dòng B.cereus sinh độc tố NHE, 53% dòng sinh độc tố HBL, 18% dòng cho cả 2 loại độc tố này

trên tổng 96 loài (Omnii & Nduhiu, 2005)

65% cho kết quả dương tính với Tecra test, 51% với BCET-RPLA test (Beattie & Williams, 1998).

Primer BalF/BalR khuyếch đại đoạn gen 533bp đặc hiệu cho nhóm B.cereus (Sanjoy Das et al.,2007)

56

57

Độc TốThành phần

độc tốProtein Gen mã hoá Phương pháp phát hiện

Diarrhoel enterotoxins

Hemolytic enterotoxin

(HBL)

L2 hblC BCET-RPLA test kit

PCR

L1 hblD(B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination -

Oxoid test kit)

B hblA phát hiện protein L2/HBL

Nonhemolytic enterotoxin

(NHE)

NheA nheA Tecra BDE ( ELISA - VIA)

NheB nheBBacillus Diarrheal Enterotoxin

visual immunoassay - Tecra kit test)

NheC nheCphát hiện protein NheA 45kDa

/ NHEEnterotoxin T bceT

Cytoxin KcytK-1 cytK-1

cytK-2 cytK-2

Enterotoxin FM entFM entFM

Emetic toxin (Cereulide)

Cereulide Ces ( CRS)Sperm motility test (Swensson

et al.,2005;…) 57

Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó,… ).

58

KẾT LUẬN

B.cereus có 2 loại độc tố:

Diarrhoeal enterotoxin,thời gian ủ bệnh dài 8-16h, gây ngộ độc tương tự loài

Clostridium perfringens, bất họat ở 56oC/30phút, sống ở pH 4-11.

Emetic toxin (cereulide), thời gian ủ bệnh ngắn 1-6h , gây ngộ độc tương tự

loài Staphylococcus, bất họat ở 120oC/90ph, sống ở pH 2-11.

Phương pháp miễn dịch :

ELISA-BDE dương tính với độc tố NHE

BCET-RPLA dương tính với độc tố HBL

B.cereus phát triển ở 35-40oC. Các thực phẩm sau khi nấu chín để nguội dễ bị

nhiễm b.cereus, cần bảo quản thực phẩm trên 60oC.

Diarrhoel enterotoxins

Download - Vi khuan Bacillus cereus

Top Related