Download - Wang et al 2003
NO é a molécula sinalizadora mais difundida encontrada na
retina :
› Influência fisiológica - mais claramente pelo mecanismo de
sinalização onde NO ativa a guanilato ciclase solúvel (GCs) para
promover a síntese de GMPc.
Estimulação da retina pela luz estimula liberação de NO (Neal
et al., 1998);
› Fotorreceptores: (Savchenko et al., 1997)
canais iônicos controlados por voltagem no bastonete;
canais ligados a nucleotídeos cíclicos em cones e bastonetes.
› Bipolares: (Mills & Massey, 995)
modula níveis de GMPc;
reduz o acoplamento entre amácrinas AII e bipolares dos cones.
INTRODUÇÃO
Ganglionares: › Doador de NO: modula a condutância dos canais de GMPc
(Ahmad et al., 1994; Kawa & Sterling 2002);
› NO: pode modula a atividade retiniana (Goldstein et al., 1996;
Maynard et al., 1995);
› Como NO afeta a resposta de células ganglionares
individualmente?
E se houver adaptação ao escuro?
Existe preferência por alguma classe de ganglionar?
A resposta à luz é mediada por alguma das vias ligadas ao
bastonete?
INTRODUÇÃO
Eletrofisiologia:
› Preparação da retina de furão:
Patch-clamp:
P35-P55;
Enucleação dos olhos : oxigenados a 37ºC – 12min;
Dissecação da retina: mantida em EMEM (95% de O2 – 5% CO2);
Separação de parte da retina
Registros eram feitos por 30-120min;
Eletrodo era preenchido (mM): 140 KCl, 10 HEPES, 0,5 EGTA, 0,5% lucifer
yellow.
› Estimulo luminoso:
LEDs controlados por computador: 463, 569 e 651 nm
Ativação dos fotorreceptores.
MATERIAIS E MÉTODOS
Eletrofisiologia:
› Aplicação da droga:
L-Arginina: 1 - 5 mM;
D-Arginina: 1 - 5 mM;
SNAP: 1 mM;
Estricnina: 50 µM. Dissolvidos em EMEM – administrados por gravidade.
Análise Morfológica:
› Células eram identificadas após registro (73 células).
Nikon Eclipse E600 ou Confocal Bio-Rad MRC-1024ES; Diferenciar classes de células ganglionares.
MATERIAIS E MÉTODOS
Efeitos do NO na
resposta provocada
pela luz:
› Registro de 55 células:
antes, durante e
depois;
› 47 de 55 foram
afetadas por l-
arginina;
› Resposta on: 29 de 37
RESULTADOS Trasiente Sustentada
RESULTADOS Efeito das concentrações de L-arginina:
Res
post
a on
› Diferenças nas inibições das respostas on e off.
RESULTADOS
› 4 on: ↓ resposta (19,2-53,4%);
› e 3 off: 2 bloqueadas e 1
reduzida (38,5%).
› SNAP tem efeito semelhante
ao da L-arginina.
Efeito do SNAP:
› 4
ON OFF
NO em Diferentes Classes
Morfológicas:
› Alfa: 75% (6 em 8);
› Beta: 88,5% (23 em 26);
› Gama: 75% (9 em 12).
RESULTADOS
Influência de L-arginina ou SNAP no Potencial de
Repouso:
› Pot. Repouso: -57,4±4,6 mV;
› Após aplicação da droga: 61 de 73 céls.
12 de 73: hiperpolarizaram (2-5 mV);
Efeitos do NO:
› Podem influenciar respostas visuais – excitabilidade da
membrana – efeitos do NO nas respostas provocadas pelas
correntes;
RESULTADOS
Efeitos do NO nas respostas provocadas pelas
correntes:
› 30 céls. ganglionares: 10 passos de 10-180 pA
19 on: 14 de 19 - ↓ respostas L-arginina (18,4-58,5%)
5 off: todas afetadas – 4 bloqueadas e 1↓ 36,7%.
6 on-off: on reduzida em 5, off bloqueadas em 4.
Mas não há uma relação clara entre os efeitos do NO nas repostas
provocadas pela luz e nas repostas provocadas pela corrente:
Sub-grupo com excitabilidade de membrana sensível ao NO.
RESULTADOS
Avaliação da adaptação ao escuro (resposta off):
› Mediada por duas vias
Bastonete > bipolar de bastonete > A II > bipolar do cone off >
ganglionares off (APB-sensível)
Sinapses glicinérgicas;
APB: bloqueia - Hiperpolarização da bipolar ligada ao bastonete – não ocorre
liberação de glutamato;
Bastonete > bipolar de cone off > ganglionares off (APB-resistente)
Bastonete – cone (gap junctions) – bipolar do cone.
Podem influenciar na modulação pré-sináptica da resposta off de
céls. Ganglionares.
RESULTADOS
Qual das vias está envolvida no bloqueio das respostas
off?
› Avaliação da resposta pré-sináptica:
SNAP: doador de NO;
Estricnina: bloqueia receptor glicinérgico;
APB: bloqueia receptor glutamatérgico.
RESULTADOS
NO:
› Modula as três classes de ganglionares (alfa, beta e gama);
› “Amortece” resposta visuais à estímulos em flashes;
› Via off é mais sensível;
Evidência direta: influencia na resposta das céls.
ganglionares, individualmente;
Afeta a transferência da informação retina-níveis
superiores do sistema visual;
Não atribuído à toxicidade: respostas on e off são
diferentes;
DISCUSSÃO
Possíveis sítios de ação para a modulação do NO nas
respostas visuais:
› Doadores de NO ↑GMPc em céls da retina:
Múltiplos sítios de ação podem contribuir para efeitos do NO;
› Pequena proporção de neurônios: NO afeta propriedades
intrínsecas da membrana - Descargas provocadas por corrente;
› Pouco provável que respostas on e off diferentes sejam
refletidas pela ação dos fotorreceptores
Primeira influência do NO – céls. ganglionares (pré-sináptico);
DISCUSSÃO
APB-sensível x APB-resistente: A redução da resposta off
› APB-sensível (Müller et al., 1988): hiperpolarização de bipolar de
bastonete
Estricnina: inibe sinapses glicinérgicas (sinapses com ganglionares
off).
› APB-resistente (Hack et al. 1999; Soucy et al. 1998):
4 em 11: atividade da via APB-resistente – funcional na adaptação
ao escuro (mesópicas e escotópicas);
› NO inibe liberação de glicina:
Sinapses glicinérgicas: mecanismos pelo qual bloqueia as respostas
das células ganglionares off.
+ outros sítios de ação
DISCUSSÃO
Redução da resposta on:
› Não tentaram estabelecer os sítios de ação do NO nas respostas
das ganglionares on;
› Literatura:
NO reduz o acoplamento:
de gap junctions na retina (DeVries & Schwartz 1989; Miyachi et al., 1990);
de AII com bipolar de cone on (Mills & Massey, 1995);
NO: Canais ligados a GMPc em bipolares on (Nawy & Jahr,1990,
1991; Shiells & Falk, 1990)
Aumento da resposta a luz em bipolares on!!!
Não há uma regra – diminuição das respostas à luz nas céls.
ganglionares on.
DISCUSSÃO
O NO possui um poderoso efeito na retina, principalmente às
relacionadas com a respostas off à estímulos luminosos
› 86% das respostas off sofreram alteração – maior parte foi bloqueada;
Complementar:
› NGL: bloqueio da NOS reduz as respostas visuais de todas céls X e Y
(Cudeiro et al., 1994) – L-arginina não possui efeito na resposta visual;
› Córtex: manipulações no sistema NO produz reduções/aumentos na
reposta visual (Cudeiro et al., 1997).
CONCLUSÃO
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