(d)persiapan bahan eksplan

PERSIAPAN, PEMILIHAN DAN STERILISASI EKSPLAN

A. Tujuan Pembelajaran Umum (TPU).

Setelah selesai berlatih, peserta memahami persiapan, pemilihan dan sterilisasi

eksplan.

B. Pokok Bahasan :

1. Pengertian eksplan dan beberapa golongan eksplan menurut jaringan yang akan

dibiakkan.

2. Kondisi atau syarat/pertimbangan pemilihan bahan eksplan

3. Perlakuan bahan eksplan

4. Perkembangan eksplan menjadi plantlet.

C. Tujuan Pembelajaran Khusus (TPK).

Setelah selesai berlatih, peserta dapat :

1. Menjelaskan pengertian eksplan dan beberapa golongan eksplan menurut jaringan

yang akan dibiakkan dengan benar.

2. Menjelaskan kondisi atau syarat/pertimbangan pemilihan bahan eksplan dengan

benar.

3. Melaksanakan perlakuan terhadap bahan eksplan dengan benar.

4. Menjelaskan perkembangan eksplan menjadi plantlet dengan benar.

5. Menjelaskan tata cara sterilisasi eksplan yang baik dan benar.

6. Menjelaskan konsep dasar pengenceran (penurunan konsentrasi) bahan-bahan

sterilisasi eksplan.

INFORMASI :

Informasi 1. Pengertian Eksplan dan Beberapa Golongan Eksplan

Menurut Jaringan yang Akan Dibiakan.

Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Jika semua faktor yang

mempengaruhi keberhasilan dalam teknologi kultur jaringan berjalan dengan baik,

maka dari satu eksplan akan diperoleh ribuan tanaman. Tentu saja, akan lebih baik jika

kita memulai dengan beberapa eksplan untuk menghindari kehilangan eksplan sebagai

akibat dari kontaminasi, perlakuan pada eksplan saat sterilisasi misalnya penggunaan Bahan Ajar/Persiapan dan Sterilisasi/AJ&AR/2011

1

anti kontaminan yang berlebihan seperti Na-Hipoklorit (merek dagang: Bayclin, Clorox

dsb. dengan bahan aktif Na-CLO) atau disebabkan karena keadaan eksplan yang sudah

berpotensi untuk mengakibatkan kontaminasi.

Ukuran eksplan berkisar antara ukuran yang mikroskopis mulai 0,1 mm sampai

dengan ukuran yang cukup besar yang dapat mencapai 1 sampai 3 cm. Eksplan pada

prinsipnya dapat berasal dari semua jaringan. Eksplan dapat digolongkan menurut asal

eksplan jaringan yang akan dibiakan, yaitu :

1. Bagian tanaman yang terletak antara ujung tanaman seperti pucuk tanaman atau

ujung akar, jaringan ini mempunyai ciri cepat dalam tingkat sel, sel-selnya mudah

membelah atau meristematis dan ukurannya sangat kecil, diperlukan alat bantu

berupa mikroskop Tipe Meristem.

2. Pucuk

3. Batang

4. Antera

5. Bunga

6. Daun

7. Embrio

8. Hipokotil

9. Benih

10. Bibit

11. Akar

12. Bakal bunga

Informasi 2. Kondisi atau Syarat/Pertimbangan Pemilihan Bahan

Eksplan.

Penggunaan bahan eksplan sebagai bahan awal untuk dimulainya kultur

jaringan sangat dipengaruhi banyak faktor, termasuk di antaranya eksplan dapat diambil

dari tanaman yang tumbuh dari lingkungan yang berbeda, usia tanaman yang berbeda.

Kondisi optimal eksplan sulit untuk diperkirakan. Meskipun faktor-faktor tersebut

sudah diketahui, tetapi tidak dapat memberikan jaminan keberhasilan suatu petunjuk

atau suatu prosedur penggunaan eksplan. Selain itu, faktor genotipe tanaman, morfologi

eksplan, asal tanaman (dari rumah kaca atau lapangan) sangat menentukan keberhasilan

penggunaan eksplan.

Bahan Ajar/Persiapan dan Sterilisasi/AJ&AR/2011 2

Tahap yang paling sulit dalam persiapan eksplan adalah mempersiapkan

eksplan yang bersih. Petunjuk di bawah ini akan memudahkan pekerjaan, bagaimana

memperoleh eksplan yang bersih:

- Gunakan tunas yang baru tumbuh dari suatu tanaman karena tunas yang baru tumbuh

lebih bersih dibandingkan tunas yang berumur tua, dan mudah untuk dibersihkan.

- Tanaman dalam rumah kaca, tunas-tunas yang mengalami dormansi sering lebih

bersih dibandingkan dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang tumbuh di lahan

terbuka.

- Plastik yang ditutupkan pada tunas yang akan tumbuh pada beberapa hari berikutnya

akan diperoleh tunas yang lebih bersih, tetapi dalam kondisi demikian tunas yang

terbentuk seringkali terbakar akibat terlalu tingginya suhu dan kelembaban di dalam

plastik. Untuk menghindarinya dapat digunakan naungan untuk mengurangi

intensitas cahaya yang masuk.

- Ukuran eksplan yang kecil lebih bersih dibandingkan yang berukuran besar.

- Penggunaan bahan untuk sterilisasi eksplan sebaiknya dimulai dari konsentrasi

rendah untuk meningkatkan efektifitas sterilisasi. Sebaiknya dengan menggunakan

konsentrasi Na-Hipoklorit yang tinggi akan menyebabkan matinya eksplan, berapa

konsentrasi yang tepat sangat tergantung dari penggunaan eksplan dan bahan

sterilisasi yang digunakan dan lama waktu penggunaan bahan sterilisasi.

Informasi 3. Perlakuan Bahan Eksplan.

Hal yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan eksplan yang bersih,

digunakan beberapa eksplan untuk dikombinasikan dengan beberapa perlakuan

prosedur sterilisasi untuk mengurangi risiko terjadinya kontaminasi.

Eksplan dapat disterilisasi dengan menggunakan pemutih dari berbagai merk

dagang seperti bayclin, clorox dan lain-lain. Kandungan bahan aktifnya berupa Natrium

Hipoklorit sebesar 5,25%. Penggunaan bahan ini dapat pula dikombinasikan urutannya

dengan bahan lain seperti sabun, aquades steril, dan fungisida.

Untuk membuat 100 ml pemutih dengan konsentrasi tertentu dapat dilakukan

dengan cara :

1/2 campurkan 50 ml pemutih dengan 50 ml air




1/100 campurkan 10 ml dari 1/10 pemutih dengan 90 ml air

Cara perhitungan yang sama dapat dilakukan untuk bahan sterilisasi lain dengan

konsentrasi tertentu. Beberapa bahan sterilisasi dan konsentrasi lain yang sering

dipergunakan adalah sebagai berikut:

- Alkohol atau isopropyl alcohol 70%

- Kalsium Hipoklorit 0,8%

- Hidrogen peroksida (H2O2) 0,1%

- Mercuri Klorida 0,1%

- Sabun cair 5-10 menit pembilasan berkali-kali di bawah air mengalir

Satu contoh yang sering dipergunakan untuk sterilisasi eksplan adalah sebagai

berikut:

1) Masukkan eksplan pada gelas Beaker di atas magnetic stirer selama 10 menit dalam

1/100 pemutih yang telah ditambahkan 10 tetes sabun cair untuk setiap 100 ml

larutan sterilisasi.

2) Bilas dengan aquadest

3) Rendam dalam larutan alkohol 70% selama 10 detik

4) Bilas dengan aquadest

5) Masukan ke dalam 1/10 pemutih di atas magnetic stirer selama 15 menit. Untuk

membantu penetrasi bahan sterilisasi dapat digunakan pompa vacuum.

6) Pada tahap selanjutnya sterilisasi dapat dilakukan di dalam LAF (Laminar Air

Flow) dan bilas eksplan dengan aquadest.

7) Bilas dengan aquadest steril selama 5 menit.

8) Jika perlu bilas dengan menggunakan antioksidan, misalnya Vitamin C.

9) Keringkan di atas kertas saring steril

10) Tempatkan pada medium kultur.

Penggunaan Meristem

Penggunaan meristem merupakan eksplan yang paling banyak digunakan

meskipun diperlukan mikroskop untuk mengambil eksplan yang bersifat meristematis

(sel-sel aktif membelah) di antara dua daun primordia. Meristem sering digunakan

untuk memperoleh planlet (tanaman kecil hasil kultur jaringan) yang bebas virus.

Secara teoritis pertumbuhan meristematis jaringan meristem lebih cepat dibandingkan

dengan pertumbuhan virus pada sel-sel meristem yang baru tumbuh, sehingga semakin


kecil jaringan meristem yang dipergunakan akan memperbesar kemungkinan

diperolehnya planlet bebas virus.

Penggunaan meristem pada tanaman stroberi sangat umum dilakukan

dibandingkan dengan tanaman lainnya, untuk memperoleh planlet. Sebagai contoh

pengambilan eksplan meristem dapat digambarkan sebagai berikut:

Pengambilan meristem dimulai dengan memotong 2-5 cm runner (anakan pada

tanaman stroberi) dengan sedikit daun. Meristem terdapat di antara dua daun primordia

di dalam bakal tunas. Oleh karena itu sterilisasi permukaan lebih mudah dengan

menggunakan bahan sterilisasi dan prosedur lebih sederhana dibandingkan dengan jika

menggunakan eksplan lain, dibandingkan dengan tanaman lain. Masukan eksplan (2-3

cm panjangnya) dan kocok atau putar di atas magnetic stirer yang telah dimasukkan

1/10 pemutih kemudian diikuti dengan pembilasan dengan aquades steril selama 2-5

menit. Kemudian bawa eksplan dalam gelas beaker tadi ke dalam Laminar Air Flow

(LAF). Tempatkan petridish di bawah mikroskop, dengan perbesaran sedang (40 kali).

Masukan kertas saring yang telah diberi aquadest steril, kemudian letakan tunas dari

runner tadi ke dalam petridish. Buka daun yang menutupi meristem dengan

menggunakan scalpel no 6. Pisahkan daun yang menutupi meristem. Pada pembuangan

daun jumlah tertentu akan terlihat batang tunas. Pada saat ini batang tunas dapat

dipotong. Jika ragu-ragu dapat dibiarkan terlebih dahulu sampai hampir semua daun

yang menutupi meristem dibuang. Pada saat mendekati meristem, ditandai dengan

tersisanya dua sampai tiga daun primordia. Jaringan berwarna lebih muda dibandingkan

dengan daun-daun sebelumnya. Pada tahap terakhir diperlukan ke hati-hatian untuk

mengambil meristem. Penggunaan ujung scalpel dan dibantu dengan kelembaban

meristem dapat menempel ke ujung scalpel untuk kemudian di tempatkan pada media

kultur.

Informasi 4. Perkembangan eksplan menjadi plantlet.

Perkembangan eksplan menjadi planlet dalam teknologi kultur jaringan dapat

dibagi menjadi tiga tahap. Pada tahap pertama adalah persiapan eksplan dan sterilisasi

eksplan sampai pada tahap eksplan ditempatkan dalam media. Pada tahap kedua eksplan

mulai tumbuh dan berkembang ditandai dengan tumbuhnya organ-organ seperti tunas,

akar, dalam jumlah tertentu. Pada tahap ini tunas-tunas yang tumbuh dapat dikulturkan

kembali untuk memperoleh eksplan awal dalam jumlah lebih besar. Media dapat


diarahkan untuk memperoleh jumlah tunas yang optimal. Pada tahap tiga, merupakan

tahap stabilitas dan persiapan awal aklimatisasi termasuk proses perakaran dari tunas-

tunas yang belum tumbuh akarnya. Pada tahap empat adalah tahap aklimatisasi, yaitu

proses pemindahan planlet dari medium yang kaya akan nutrisi ke media tanah, di mana

planlet harus mulai hidup mandiri dengan sumber hidup dari hasil fotosintesis sendiri,

kadang-kadang ditemukan pertumbuhan akar lebih baik pada tahap ini, sehingga

diperoleh planlet dengan akar yang lebih kokoh. Tahapan di atas merupakan usulan

yang dikemukakan oleh Murashige dan Skoog (1992). Namun perkembangan yang

sama pada teknologi kultur jaringan kemudian Deberg (1992) menambahkan tahap 0

(nol) pada tahapan di atas. Secara rinci tahapan perkembangan eksplan menjadi planlet

adalah sebagai berikut:

Tahap 0. Tahap Persiapan; Persiapan dan seleksi tanaman donor

Kualitas eksplan dan respon eksplan dipengaruhi oleh fisiologi dan kebersihan tanaman

donor.

Pembersihan tanaman donor dari pathogen

Stok tanaman yang bebas pathogen dipelihara pada kondisi yang bersih

Pertumbuhan dapat dipacu dengan pemupukan, tetapi tidak melebihi batas

Tanaman donor dapat diberi pra perlakuan dengan cara tertentu (pestisida,

insektisida, dsb.)

Tahap 1. Stabilisasi Eksplan

- Sterilisasi permukaan. Menghindari semua mikroorganisme penyebab

kontaminasi tetapi tidak mematikan eksplan

- Pengambilan atau isolasi pucuk dalam keadaan steril

- Media harus mengandung semua komponen yang dibutuhkan, sehingga eksplan

dapat tumbuh normal.

o Pencoklatan media: hasil oksidasi senyawa phenol dari luka eksplan akibat

pemotongan, terjadi pada eksplan tanaman berkayu. Hal ini dapat dicegah

dengan penambahan anti oksidan atau memindahkan eksplan ke medium baru

(sub kultur).

o Media yang digunakan dapat media standar, misalnya Murashige dan Skoog

(MS), media yang lebih kompleks dapat digunakan jika eksplan yang

digunakan berukuran kecil.

o Media dapat berupa padat atau semi padat dengan kelebihan berbeda.


- Kondisi lingkungan

Cahaya

Suhu

Kelembaban relatif

- Stabilitas kultur

Tahap 2. Multiplikasi Proliferasi Tunas Aksilar

- Produksi tunas aksilar secara berulang

- Dirangsang menggunakan sitokinin dengan konsentrasi auksin yang rendah atau

tanpa auksin

- Panen tunas dengan dikulturkan pada media baru

- Jumlah subkultur bervariasi tergantung spesies dan kultivar.

Tahap 3. Perakaran

Merangsang tumbuhnya akar

Untuk perakaran dipergunakan auksin

Keuntungan perakaran setelah tahap in vitro

Mengurangi biaya lebih baik dalam struktur dan fisiologi

Tahap 4. Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah proses pemindahan dari in vitro ke in vivo (keadaan sebenarnya)

- Merupakan proses yang relatif lambat, dapat mencapai beberapa minggu

- Perlu dikondisikan dari kelembaban tinggi ke kelembaban rendah (98-99%

sampai 20-60%)

- Dari kondisi bersih ke kondisi di mana terdapat hama dan penyakit.


PRAKTEK STERILISASI EKSPLAN

A. Salah satu contoh sterilisasi eksplan pada tanaman pisang (bahan eksplan

adalah bonggol + tunas) :

Bahan:

Air bersih (mengalir)

Twin 20

Bakterisida (Agrept)

Fungisida (Benstar)

Bayclin 30%

Alkohol 70%

Betadine

Alat:

Beaker Glass

Pinset

Pisau

Scalpel+Blade

Cara Kerja:

1. Cuci eksplan dengan air mengalir sambil dipotong dan dikelupas sampai

ukuran menjadi kecil (sekitar 3 - 5 cm tergantung ukuran awal eskplan),

2. Rendam dengan detergent 1-2 sendok makan dalam 1000 ml air biasa,

kocok selama 10 menit, bilas 3 kali dengan air biasa,

3. Rendam eksplan dengan Twin 20 sebanyak 3 ml dalam 100 ml akuades

selama 20 menit, bilas 3 kali dengan akuades,

4. Rendam eksplan dengan bakterisida 2 gr/L selama 1 jam, bilas 3 kali

dengan akuades,

5. Rendam eksplan dengan fungisida 2 gr/L selama 1 jam, bilas 3 kali dengan

akuades,

6. Rendam eksplan dengan bayclin 30% selama 30 menit, bilas 3 kali dengan

akuades,


7. Rendam eksplan dengan bayclin 20% selama 20 menit, bilas 3 kali dengan

akuades,

8. Rendam eksplan dengan alkohol 70% selama 1 menit, bilas 3 kali dengan

akuades, (Sterilisasi bagian ini dilakukan di dalam LAFC)

9. Kelupas kembali eksplan sampai kecil (sekitar 1 – 2 cm tergantung ukuran

awal eksplan), (Sterilisasi bagian ini dilakukan di dalam LAFC)

10. Pindahkan eksplan ke beaker glass baru,

11. Rendam eksplan dengan betadin secukupnya tanpa air selama 15 menit,

bilas 3 - 5 kali dengan akuades,

12. Eksplan siap ditanam dalam media kultur.

B. Salah satu contoh perhitungan pengenceran bahan sterilisasi eksplan :

Contoh Kasus:

1. Jika tersedia alkohol 95% sebanyak 1 liter, dan akan diencerkan atau

diturunkan konsentrasinya menjadi 70%, berapa ml volume aquadest yang

harus ditambahkan?

Jawab:

95% x 1 liter (1000 ml) 70%

95.000 ml 70

1.357,14

1.357,14 – 1000 ml

357,14

Jadi, aquadest yang harus ditambahkan sebanyak 357,14 ml.

2. Jika tersedia clorox atau bayclin 50% sebanyak 0,5 liter, dan akan dibuat

clorox atau bayclin 20%, berapa ml volume aquadest yang harus

ditambahkan?

Jawab :

50% x 0,5 liter (500 ml) 20%

25.000 ml 20

1.250 ml


1.250 ml – 500 ml

750 ml

Jadi, aquadest yang harus ditambahkan sebanyak 750 ml.

Daftar Pustaka

Arinto Nugroho dan Heru Sugito, 2005. Pedoman Pelaksanaan Teknik Kultur Jaringan. Penerbit Penebar Swadaya. Jakarta.

Murdaningsih H.K dan Suseno Amien, 2006. Pengambilan Eksplan dalam Teknologi Kultur Jaringan. UNPAD Bandung

Livy Winata Gunawan, 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor (IPB)


(d)persiapan bahan eksplan

Documents