dpni sur plateforme ion torrent - eaclf• recrutement partagé de cas de t21 et d’euploïdies...
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DPNI sur Plateforme Ion TorrentN. Chatron Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle Hospices Civils de Lyon
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Principe technologique
1. Préparation de la banque • Ligation (barcoding) + end repair
!!!!!
!• 10 cycles PCR + purification de PCR Etape semi-automatisée à Lyon, automatisable à plus grande
échelle.
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Amorces « universelles »
Barcode
Séquence d’intérêt
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Principe technologique
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Principe technologique3. Enrichissement
2. Amplification clonale !!
3. !!!!
4. Chargement de la puce
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Principe technologique3. Enrichissement
2. Amplification clonale !!
3. !!!!
4. Chargement de la puce
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Principe technologique3. Enrichissement
Etapes 2, 3 et 4 automatisées sur IonChef (2 puces)
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Principe technologique5. Séquençage : technologie semi-conducteur
!!!!!!!
!L’incorporation d’un dNTP entraîne la libération d’un
proton. Le signal à interpréter est une différence de potentiel
électrique. Capacité de la puce Proton P1 ≈ 80M de reads Echantillons multiplexés par 5 pour le moment (WG : 0,6 -
0,8x)
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Etape Temps total (h) Hands-on (h)
Extraction ADN 2 1
Préparation library 4,5 2,5
Quantification Bionalyzer 1 0,5
Ion Chef 12 0,5
Proton 7 2
TOTAL 26,5 6,5
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Temps technique : pour 2 puces
Etape Temps total (h) Hands-on (h)
Extraction ADN 2 1
Préparation library 4,5 2,5
Quantification Bionalyzer 1 0,5
Ion Chef 12 0,5
Proton 7 2
TOTAL 26,5 6,5
7
Temps technique : pour 2 puces
Avantages : + Coût + Disponibilité + Rapidité de séquençage + Flexibilité + Débit modéré avec la P1 + Reads longs
Inconvénients : + Coût + Débit modéré avec la P1 + Erreurs de séquençage
Workflow : TaT = 3j• Prélèvements sur tube STRECK • Préparation plasma • Extraction d’1mL d’ADN plasmatique
Qiagen circulating DNA • Vérification de la présence d’ADN par dosage Qubit
ADN = 1ng/µL • Préparation de banques barcodées (ADN déjà fragmentés) :
Library Builder + 10 cycles PCR + purif manuelle !• Quantification + normalisation Bioanalyzer !• Ion Chef • Proton : objectif 10M de reads par patiente !• Analyse bioinformatique 8
Bat
ch d
e 10
éch
anti
llons
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Principe technologique
9
Principe technologique
Analyse bioinformatique
Analyse bioinformatique• Différents algorithmes publiés, initialement développés pour
des données Illumina • TorrentSuite : BAM « filter duplicates » • Tests en cours de Wisecondor (WIthin-SamplE COpy Number
aberration DetectOR)
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- Fragmentation du génome en bin - Nécessite un set de référence pour établir une
liste de bin « jumeaux » (avec correction GC) !
- Echantillon à tester - Z-score par bin - Z-score de stouffer - Réponse binaire sur aneuploidies
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Etat des lieux : littérature
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Oct 2014
Puce PGM 318 ; N=13
Janv. 2013
Etat des lieux : littérature
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Oct 2014
Puce PGM 318 ; N=13
Janv. 2013
Etat des lieux : littérature
• Puce Proton P1
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Oct 2014
Puce PGM 318 ; N=13
Janv. 2013
Etat des lieux : littérature
• Puce Proton P1• N = 155• 10 échantillons par puce
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Oct 2014
Puce PGM 318 ; N=13
Janv. 2013
Juillet 2014• Earlier this month, the China Food and Drug
Administration said it approved two next-generation sequencing-based diagnostic products developed by BGI : BGISEQ-100 and BGISEQ-1000. !
• The BGISEQ-100 system is based on Ion Torrent semiconductor sequencing. Although the instrument is similar to and uses the same chemistry as the Proton, it is manufactured by BGI, not Thermo Fisher, according to a Thermo Fisher spokesperson.
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Collaboration nationale : Consortium H+• Recrutement partagé de cas de T21 et
d’euploïdies pour atteindre une puissance statistique suffisante, prélèvements réalisés en parallèle d’un test invasif
!• Objectif : ▫ 500 patientes testées dont 50 T21 ▫ Uniformisation de l’ensemble du protocole ▫ Transfert diagnostique ▫ Valorisation scientifique !
!• Bilan janvier 2015 : ▫ 240 échantillons testés ▫ Se = Sp = 1 14
Collaboration nationale : Consortium H+• Recrutement partagé de cas de T21 et
d’euploïdies pour atteindre une puissance statistique suffisante, prélèvements réalisés en parallèle d’un test invasif
!• Objectif : ▫ 500 patientes testées dont 50 T21 ▫ Uniformisation de l’ensemble du protocole ▫ Transfert diagnostique ▫ Valorisation scientifique !
!• Bilan janvier 2015 : ▫ 240 échantillons testés ▫ Se = Sp = 1 14
Merci de votre attention