du génotype aux phénotypesperso.crans.org/epalle/m1/bio/biologie/genotype.pdf · 2014-04-01 ·...
TRANSCRIPT
Du génotype aux phénotypes
2013-2014M1 Phytem – ENS Cachan
Introduction
Les pois de Mendel (1866)Introduction
Pois lisse Pois ridé
Parents
F1
F2
Un croisement de deux lignées pures différant par un caractère
donne une F1 homogène.
Dans la descendance d’un croisement de deux F1, les caractères parentaux réapparaissent avec une proportion de 3 à 1
P. sativum
Le caractère qui se manifeste est dominant sur celui exclu.
x
Introduction
Les pois de Mendel (1866)Introduction
Pois lisse Pois ridé
Parents
F1
F2
A/A a/a
A/a
A a
x
A
A/A a/aA/a A/aX
X/x Génotype
Phénotype
Introduction
Théorie chromosomique de l’héréditéIntroduction
Morgan : Couleur des yeux de D. melanogaster
Sutton (1910) : Définition des groupes de liaison et des premières cartes génétiques
1.1 La découverte de l’ADN
Introduction Expérience de Griffiths
S. pneumoniae
S (lisse) R (rugueux)
+ +
I- Relation génotype-phénotype
Infectieux Non infectieux
1.1 La découverte de l’ADN
Introduction Expérience de Griffiths
S (lisse) mort R (rugueux)
+ +
S (lisse) mort
+
Principe transformant
I- Relation génotype-phénotype
1.1 La découverte de l’ADN
Introduction Travaux d’Avery, Mc Leod et Mc Carthy
R (rugueux)
Traitement avec+
Principe transformant = ADN
S (lisse) mort
+
Protéases RNases DNases
I- Relation génotype-phénotype
1.1 La découverte de l’ADN
Introduction Expérience de Griffiths
ADN Phénotype
(Caractère)
???
I- Relation génotype-phénotype
1.2 La structure de l’ADN
Introduction Structure de l’ADN
Crick, Watson et Wilkins
• Composition chimique de l’ADN
• Mesures de Chargaff
A - T
C - G
- Rapport (A+T)/(C+G) est constant pour une espèce donnée ... Mais variable entre espèces
- Rapport A/T = 1 et C/G =1 quelque soit les espèces
- Nombre de (A+G) = nombre de (C+T)
4 bases azotées : A, T, G, C
Structure de l’ATP
I- Relation génotype-phénotype
1.2 La structure de l’ADN
Introduction Structure de l’ADN
Crick, Watson et Wilkins
• Microscopie électronique
Diamètre : 2 nm
R. Franklin
Figure en croix caractéristique des structures en hélice
Suggérant deux chaînes de désoxyribose phosphate
• Clichés de diffraction aux rayons X
I- Relation génotype-phénotype
1.2 La structure de l’ADN
Introduction Structure de l’ADN
Crick, Watson et Wilkins
Introduction
- Hélice à double brins antiparallèles
- Appariement des bases par liaisons hydrogènes : A-T et G-C
- Agencement aléatoire des bases
- 10 bases par pas d’hélice et 0,34 nm entre 2 paires de bases
0,34 nm
Grand sillon
Petit sillon
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Relation gène - fonction
Beadle et Tatum
N. crassa
Sauvage Mutants
Milieu minimum + ArgMilieu minimum
Mutant A
Mutant B
Mutant C
Mutagenèse (UV, RX, ...)
....
Expérience :
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Relation gène - fonction
Beadle et Tatum
Résultats :
Souche Milieu minimum (MM)
MM + ornithine
MM + citrulline
MM + arginine
Sauvage + + + +
A - - - +
B - - + +
C - + + +
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Relation gène - fonction
Beadle et Tatum
Modèle :
Précurseur ArgX Y
Enz C Enz B Enz A
Gène C Gène B Gène A
1 gène = 1 enzyme
Y = citrulline
X = ornithine
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Relation gène - polypeptide
Yanofsky
Colinéarité entre mutation sur l’ADN et acide aminé modifié
Gène
Protéine
1 gène = 1 polypeptide
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Le code génétique
Niremberg
Modèle :
Chaque acide aminé est codé par un triplet de nucléotides
Gène
Protéine
1 codon = 1 acide aminé
- Le code génétique est universel
- Le code génétique est redondant
I- Relation génotype-phénotype
1.3 Du gène à la protéine
Introduction Le code génétiqueI- Relation génotype-phénotype
I – La relation génotype - phénotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
I- Relation génotype-phénotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La transcription
Promoteur Gène
ARN pol
TerADN
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La transcription
Gène TerTATACis
ARN pol
ADN
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La transcription
Gène TerTATACis
ARN pol
ARN
ADN
A AGC T
T TCG A
T TCG A
GG
C C
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
3’
5’
3’5’
3’
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La transcription
Gène TerTATACis
ARN pol
ARN
ADN
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La régulation de la transcription
Gène TerTATACis
ARN pol
ADN
ARNpo l : machinerie de transcription
Facteurs de transcription : activation spécifique de la transcription de certains gènes
FT
Quels gènes sont transcrits ?
(1)
(100-1000 …)
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction La régulation de la transcription
Gène TerTATACis
ARN pol
ADN
ARNpo l
Facteurs de transcription
FT
Quels gènes sont transcrits ?I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose
Métabolisme du glucoseMétabolisme du lactose
lactose glucose
lacY
ATP
lactose Glucose-6-P
Galactose + glucose
Allolactose
ADP
Glucose-6-P
AMPc
Voie métabolique
Voie m
étaboliqueE E
β-galactosidase
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose
LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE
LACI
LACILACILACI
LACI
CAP
• En présence de lactose dans le milieu (sans glucose)
+1+1
PromoteurPromoteur
AMPc
Allolactose
β-galactosidase Perméase Transacétylase
ARN pol
Transcription FORTE
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose
LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE
LACI
LACILACILACI
LACI
CAP
• Sans lactose dans le milieu (mais avec du glucose)
+1+1
PromoteurPromoteur
LACILACILACI
LACI
ARN pol
Transcription TRES FAIBLE
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose
LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE
LACI
LACILACILACI
LACI
CAP
• En présence de lactose dans le milieu (avec glucose)
+1+1
PromoteurPromoteur
Allolactose
β-galactosidase Perméase Transacétylase
ARN pol
Transcription FAIBLE
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose
Bilan
Glucose
Lactose
Glucose +
Lactose
CAPActivité de
transcriptionCRELac I Opérateur
Lac I
Lac I-Allo
Lac I-Allo
CAP
CAP-AMPc
CAP
Non occupé
Non occupé
Non occupé
Non occupé
Occupé
Occupé FORTE
Faible
basale
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne
Structure d’un nucléosome
Structure en collier de perle
+
Octamère histones
ADN
Nucléosome
=
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne
Régulation de la transcription par des facteurs de remodelage de la chromatine
Complexe activateur
(HAT)
Complexe répresseur
(HDAC)
Transcription
Pas de transcription
Chromatine décompactée
Chromatine compactée
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.1 La transcription et sa régulation
Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne
Régulation de la transcription par des facteurs de remodelage de la chromatine
Complexe activateur
(HAT)Transcription
FT
HAT
Chromatine décompactée
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
ARN polFT
HAT
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.2 La maturation des ARNm
Introduction Cas particulier – l’épissage
TerADN TATACis E1 E2 E3 E4I1 I2 i3
Gène
E1 E2 E3 E4I1 I2 I3ARNm AAAAAAA
E1 E2 E3 E4
Transcription
Epissage
Uniquement chez les eucaryotes
E : exon
I : intron
= Excision des introns
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.2 La maturation des ARNm
Introduction Cas particulier – l’épissage
TerADN TATACis E1 E2 E3 E4I1 I2 i3
Gène
E1 E2 E3 E4I1 I2 I3ARNm AAAAAAA
E1 E2 E3 E4
Transcription
Epissage
E1 E2 E4
E1 E3 E4
OU
OUEpissage alternatif
= Excision des introns …
… variable selon les cellules
Cellule A
Cellule B
Cellule C
Uniquement chez les eucaryotes
E : exon
I : intron
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Sortir du noyau chez les eucaryotes
Cellules procaryotes Cellules eucaryotes
Cytosol
Cytosol
Noyau
TRANSCRIPTION
TRADUCTION
EXPORT
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.3 La traduction
Introduction La traduction
AAAAAAAUG
+1
AAAAAAAUG
+1
Ribosome
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.3 La traduction
Introduction La traduction
AAAAAAAUG
+1
A C G U G G A C AG C U
ARNt
polypeptide
Ribosome
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.3 La traduction
Introduction La traduction
AAAAAAAUG
+1
A C G U G G A C AG C U
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
polypeptide
Ribosome
2.3 La traduction
Introduction La traduction
AAAAAAAUG
+1
A C G U G G A C AG C U
stop
stop
RF1
RF3
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
Maturation
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
ARNr, ARNt
2.4 La maturation des protéines
Introduction La structure des protéines
Primaire Secondaire Tertiaire Quaternaire
• Comment les protéines acquièrent-elles leur structu re tridimensionnelle ?
Structure tridimensionnelleBranden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.4 La maturation des protéines
Introduction
I- Relation génotype-phénotype
Interactions entre acides aminés
II- Phénotype = expression du génotype
Liaisons H. Interactions ioniques Ponts disulfures
Liaisons faibles Liaisons covalentes
Ox
Red
Stryer, 6e éd
O
H
O
O O
C
NH3+
-
2.4 La maturation des protéines
Introduction Structure secondaire des protéines
• Hélice α • Brin β
- Liaison H. entre C=O et NH des résidus n et n+4
- Structure stable pour une hélice droite
3,6 résidus par tour
- Les chaînes latérales projettent vers l’extérieur
- Impliqués dans la formation de feuillets β
Distance 0,15nm
Branden & Tooze, 1999
Branden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.4 La maturation des protéines
Introduction
Antarctique
Structure tertiaire des protéines
• Motifs structuraux : Les feuillets β
Feuillet β parallèle Feuillet β antiparallèle
- Liaison H. entre C=O et NH des résidus qui se font face
Branden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.4 La maturation des protéines
Introduction Structures tertiaire et quaternaire
• Structure de la protéine Cro
- 3 hélices α
- 3 brins β
Motif HBH
Organisation en dimère grâce au brin 3
Structure monomérique de Cro
Dimère de Cro
Branden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.4 La maturation des protéines
Introduction Adressage des protéinesI- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
SRP
SRP
SRP
Cytosol
Lumière du réticulum
Membrane
Adressage des protéines au réticulum endoplasmique
Séq. signal
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
Maturation Repliement, structure II, III, IV
Adressage
ARNr, ARNt
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.5 Relation structure – fonction des protéines
Introduction La structure des protéines
Primaire Secondaire Tertiaire Quaternaire
Structure tridimensionnelleBranden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
Fonction
?Quelle est la relation entre leur structure tridimensionnelle et leur fonction ?
2.5 Relation structure – fonction des protéines
Introduction La structure primaire dicte t’elle la structure tridimensionnelle ?
Expérience d’Anfinsen
Antarctique
RNase A purifiée active
RNase A inactive
RNase A active
Urée + β-mercaptoéthanol
Dialyse lente pour éliminer urée + β-mercaptoéthanol
- Le repliement de la RNase A est spontané- Les informations nécessaires à son repliement sont contenues dans sa séquence primaire
Stryer, 6e éd
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.5 Relation structure – fonction des protéines
Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN
• Modèle d’interaction entre Cro et l’ADN
Cette organisation en dimère place les deux motif H BH à une distance de 3,4 nm correspondant exactement à un tour d’héli ce de l’ADN
Branden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.5 Relation structure – fonction des protéines
Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN
• Interaction non spécifique Cro et l’ADN
Entre le squelette sucre-phosphate et la liaison peptidique de la protéine
Permet par ajustement conformationnel de positionne r l’hélice de reconnaissance correctement dans le gra nd sillon
Branden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
2.5 Relation structure – fonction des protéines
Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN
• Interaction spécifique Cro et l’ADN
Entre les chaînes latérales des acides aminés et les bases de l’ADN
Les deux hélices 3 étant orientées en sens inverses,
la séquence d’ADN reconnue est palindromique et espacée
d’environ 10 pb.
T-G-T-T-X6-A-A-C-ABranden & Tooze, 1999
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction Bilan
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
Maturation Repliement, structure II, III, IV
Adressage
ARNr, ARNt
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction L’importance de l’environnement
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
Maturation Repliement, structure II, III, IV
Adressage
Environnement
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
ARNr, ARNt
II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype
Introduction L’importance de l’environnementI- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
Si trop de glucose dans le sang
Cellule du foie
glucagon
PKA
GlycogèneGlyS
+
P
glucose
GlyP P
active
peu active
Stockage
AdC
3.1 Connaître le génotype d’un individu
Introduction Allèles, mutations et conséquencesI- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
Pois lisse
A/a
Fleur
Fruits
ATGGCGCTACGCATT
ATGGCACTACGCATT
Lisse ou ridé ?
ou
diploïde
- DPI- Empreintes génétiques- Sélection génétique
Connaitre la séquence des gènes mais pourquoi ?
3.1 Connaître le génotype d’un individu
Introduction La PCR
ADN db
ADN sb
ADN sb Amorce
Dénaturation (95°C)
Hybridation (55-60°C)
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
ADN dbPolymérisation (72°C)5’
3’5’
3’
ADN polymérase thermostable
Dénaturation
Hybridation
Polymérisation
ADNpol
3.1 Connaître le génotype d’un individu
Le pyroséquençageIntroduction
Ajout NTP
- ADNn + NTP ���� ADNn+1 + NMP + PPi
+ cocktail enzymatique
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
Si p
as d
e N
dan
s la
séq
uenc
eS
i N d
ans
la
séqu
ence
- PPi + X ���� Lumière
Dégradation NTP
N = A ou C ou G ou T
- Lumière : captée par une caméra
ADN à séquencerN
ADNpol
3.1 Connaître le génotype d’un individu
Le pyroséquençageIntroduction
Cycle I Run A
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
A T G G C G C T A C G C A
Cycle II
Cycle III
Run C
Run G
Run T
Run A
Run C
Run G
Run T
Run A
Run C
Run G
Run T
Lum
ière
ém
ise
Lum
ière
ém
ise
Lum
ière
ém
ise
A
T
GG
C
G
3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée
La transcriptomique : Les puces à ADN Introduction
Sondes spécifiques (oligonucléotides, ...) de chaque gène
Support (nylon, verre-silicium, ...)
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
Oligonucléotide
3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée
La transcriptomique : Les puces à ADN Introduction
Echantillon 1 Echantillon 2
Extraction des ARN
Synthèse ADNc et marquage fluorescent
Mélange
Hybridation compétitive sur une puce
Lecture (LASER)
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
50% 50%
0 100
100 050
50
Lavage
2. Elimination des « résidus » d’ADN
3. Réaction de TRANSCRIPTION INVERSE
4. Inactivation de l’enzyme
AAAAAAAAAA5’ 3’TTTTTTTT
ARNm
5’
Amorce OligoT
RT
dNTP
ADNc
3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée
Synthèse des ADNc : La transcription inverse
1. Extraction des ARNm
Introduction
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée
La protéomique : L’électrophorèse bidimensionnelleIntroduction
Gel à forte porosité + ampholytes formant un gradient de pHi
Les ampholytes (espèces amphotères synthétiques) migrent jusqu’à leur pHi
Séparation selon la masse moléculaire
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
-
+
-
+
Séparation selon pHi
Séparation selon poids
moléculaire
1ère dimension : électrofocalisation
2ème dimension : gel dénaturant Révélation
Détection de spots de taille proportionnelle au contenu en protéines
3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée
La protéomique : L’électrophorèse bidimensionnelleIntroduction
Echantillon 1 Echantillon 2
Extraction des protéines
Electrophorèse bidimensionnelle
Comparaison
Identification
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
III- Quelques méthodes d’étude
?
Qualitative et quantitative
Séquençage par spectrométrie de masse
Conclusion
Introduction
ADN
ARNm
Protéine
Génotype
Phénotype
Transcription
Traduction
Expression
Maturation
FT cis/trans
Modification chromatine
Epissage (alternatif)
Maturation Repliement, structure II, III, IV
Adressage
Environnement
I- Relation génotype-phénotype
II- Phénotype = expression du génotype
ARNr, ARNt
Séquençage
Observable, mesurable
Puce à ADN
Electrophorèse 2D
III- Quelques méthodes d’étude