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Développement de marqueurs spécifiques de contamination fécale :
• Anne-Marie Pourcher
Développement de marqueurs spécifiques de contamination fécale : application aux profils de baignade
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A-M. Pourcher1, E. Jardé 2, M-P. Caprais3, A. Jaffrezic4, N. Wery5,
Projet "Traceurs de contamination fécale "
6 laboratoiresA-M. Pourcher1, E. Jardé 2, M-P. Caprais3, A. Jaffrezic4, N. Wery5, A. Jadas-Hécart6, P-Y. Communal6, R. Marti1, S. Mieszkin3, M. Derrien2, O. Solecki1, L. Jeanneau2, M. Gourmelon3
1 Cemagref - Rennes
2 CNRS Géosciences - Rennes
3 Ifremer - Plouzané3 Ifremer - Plouzané
4 INRA Agrocampus – Rennes
5 INRA LBE – Narbonne
6 Université – LEESA- Angers
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effluents et boues issus des stations d'épuration
rejets des habitations non connectées aux réseaux
Source : Cemagrefbiodiversite.wallonie.be/.../pointnoir.htm
déjections d’animauxd’élevages
Source :INRA
Contamination ponctuelle ou diffuse
Directive européenne 2006/7/CE sur la qualité des eaux de baignade Elaboration de profils de baignade (mise en œuvre : mars 2011) ���� identifier les sources de pollutions fécales susceptibles de contaminer les zones de baignade.
Contamination ponctuelle ou diffuse
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effluents et boues issus des stations d'épuration
rejets des habitations non connectées aux réseaux
Source : Cemagrefbiodiversite.wallonie.be/.../pointnoir.htm
déjections d’animauxd’élevages
Source :INRA
Contamination ponctuelle ou diffuse
Directive européenne 2006/7/CE sur la qualité des eaux de baignade Elaboration de profils de baignade (mise en œuvre : mars 2011) ���� identifier les sources de pollutions fécales susceptibles de contaminer les zones de baignade.
Contamination ponctuelle ou diffuse
Quelles méthodes pour identifier l’origine de la pollution (humaine / animale) ?
www.charente.pref.gouv.fr
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☺☺☺☺☺☺☺☺
2 indicateurs de contamination fécale
���� méthodes normalisées de détection de pollution fécale
☺☺☺☺☺☺☺☺ origine fécale
E. coli Entérocoques intestinaux
www.ebiologie.fr/upload/Gallery/e_coli-dk.jpg www.cst.cmich.edu/users/alm1ew/enterococci.jpg
���� impossible de différencier humain/ animal
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Depuis ≈ 10 ans � méthodes “Faecal source tracking”
Regroupent des méthodes biologiques et chimiques pour identifier les principales sources de contamination fécale dans les eaux de surface
Source : INRAwww.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html
ian.umces.edu/imagelibrary
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Depuis ≈ 10 ans � méthodes “Faecal source tracking”
Regroupent des méthodes biologiques et chimiques pour identifier les principales sources de contamination fécale dans les eaux de surface
Objectifs du projet “Traces” :
Source : INRAwww.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html
ian.umces.edu/imagelibrary
Objectifs du projet “Traces” :
Développer et valider des outils existants et de nouveaux outils analytiques fondés sur l’identification de marqueurs permettant de déterminer l’origine humaine ou animale de la pollution fécale
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Différents outils � microbiologiques :
- séquences d’ADN bactérien : flore dominante du tube digestif
microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacter...
- Phages F-RNA spécifiqueswww.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html
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� microbiologiques :
- séquences d’ADN bactérien : flore dominante du tube digestif
microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacter...
Différents outils
� chimiques :
- molécules spécifiques des effluents urbains
- Phages F-RNA spécifiqueswww.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html
caféine
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� microbiologiques :
- séquences d’ADN bactérien : flore dominante du tube digestif
microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacter...
Différents outils
� chimiques : � chimiques :
- molécules spécifiques des effluents urbains
- Phages F-RNA spécifiqueswww.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html
caféine
- empreintes moléculaires des stérols et stanolsCoprostanol
24-ethylcoprostanol
-
Cop
rost
anol
Epi
-Cop
rost
anol
Cop
rost
anon
e
Cho
lest
erol
Cho
lest
anol
Eth
yl-C
opro
stan
olC
ampe
stan
ol
Sito
stan
olS
itost
erol
Exemples de profils de stérols et de stanols
Lisier de porc
Source : INRA
Fumier de bovin
www.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html
Sito
ster
olS
itost
anol
Cho
lest
erol
Cho
lest
anol
Cam
pest
anol
Cam
pest
erol
R1 (%) : coprostanol
(coprostanol+24-ethylcoprostanol)
R2 : sitostanolcoprostanol
2 ratios de stéroides :
-
� microbiologiques :
- séquences d’ADN bactérien : flore dominante du tube digestif
microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacter...
Différents outils
� chimiques : � chimiques :
- molécules spécifiques des effluents urbains
- Phages F-RNA spécifiqueswww.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html
caféine
- caractérisation de la matière organique
- empreintes moléculaires des stérols et stanolsCoprostanol
24-ethylcoprostanol
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typical fluorescence EEM425
Exc
itatio
n W
avel
engt
h
La matrice EEM est divisée en 2 régions fluorescentes
Caractérisation de la matière organique
300 500Emission Wavelength (nm)
250
Fulvic matterMostly from natural organic matterTryptophan- intensity
Humic-like mostly from natural organic matter
Exc
itatio
n W
avel
engt
h (n
m)
régions fluorescentes (biochimique et géochimique) elles mêmes subdivisées en différentes zones
2 ratios :
biochimique/géochimique : bio-géo
Geochemical Fluorescence Index : GFI
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Marqueurs bactériens et viraux
hôte marqueurs publications
Pig-2-Bac
(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009
(Bacteroidales)Lactobacillus amylovorus Marti et al., 2010
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Marqueurs bactériens et viraux
hôte marqueurs publications
Pig-2-Bac
(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009
(Bacteroidales)Lactobacillus amylovorus Marti et al., 2010
Rum-2-Bac
(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009
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Marqueurs bactériens et viraux
hôte marqueurs publications
Pig-2-Bac
(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009
(Bacteroidales)Lactobacillus amylovorus Marti et al., 2010
Rum-2-Bac
(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009
HF183 (Bacteroidales)
Bifidobacterium adolescentis
Seurinck et al., 2005
Gourmelon et al., 2010Bifidobacterium adolescentis
bactériophages F-RNA spécifiques (groupes II et III)
Gourmelon et al., 2010
Gourmelon et al., 2010
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hôte marqueurs publications
Marqueurs chimiques
Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007
Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007
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hôte marqueurs publications
Marqueurs chimiques
Ratios de fluorescence bio-géo et GFI Bilal et al., 2010
Ratios de fluorescence bio-géo et GFI Bilal et al., 2010
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hôte marqueurs publications
Marqueurs chimiques
Ratios de fluorescence bio-géo et GFI Bilal et al., 2010
Ratios de fluorescence bio-géo et GFI Bilal et al., 2010
Caféine, benzophénoneTCEP tri(2-chloroethyl)phosphate) Gourmelon et al., 2010
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33 échantillons4 effluents de stations d’épuration
3 eaux de ruissellement après épandage de fumier de bovin
23 eaux de rivières
3 eaux de ruissellement après épandage de lisier de porc
Materiel et méthodes
23 eaux de rivières
-
33 échantillons4 effluents de stations d’épuration
3 eaux de ruissellement après épandage de fumier de bovin
23 eaux de rivières
3 eaux de ruissellement après épandage de lisier de porc
Materiel et méthodes
23 eaux de rivières
2 zones de baignade (eau douce et eau de mer)7 points en amont des deux zones de baignade
-
33 échantillons4 effluents de stations d’épuration
3 eaux de ruissellement après épandage de fumier de bovin
23 eaux de rivières
3 eaux de ruissellement après épandage de lisier de porc
Materiel et méthodes
23 eaux de rivières
3 marqueurs chimiques
14 marqueurs
2 zones de baignade (eau douce et eau de mer)7 points en amont des deux zones de baignade
3 marqueurs chimiques
2 ratios de fluorescence
2 ratios de stanols
2 groupes de phages F-RNA
5 marqueurs bactériens
Analyse des Correspondances Multiples
Classification Ascendante Hiérarchique
-
WW4
WW3
WW1
WW2
P3
P2 P11
1,5
Eaux contaminées
Application des outils à 33 échantillons d’eaux
WW3
R5
R1
R15
R12 R6 R8
R20
R19R16
R11
R18R17
R14R13
C3C2
C1
B3
B2
B1
-0,5
0
0,5
F2
(23,
40 %
)
Eaux contaminées par du lisier de porc
Eaux usées urbainesEaux contaminées par des déjections bovines
??
R3
R4R2
R9
R7 R10
-1-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5
F1 (46,22 %)
Analyse des correspondances multiples
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6Sim
ilarit
é
R19
R16
R15
R20
R14
R13
R11
R18
R17C1
B3
B2
C3
C2
B1
P2
P1
P3
R6
R8
R7
R10R9
R4
R2
R3
R5
R1
WW
3
WW
2
WW
1
WW
4
R12
0,6
0,7
0,8
0,9
Sim
ilarit
é
R1< 50E. coli >1000 E. coli >1000
bio geo > 0,17
R12
WW
4
WW
1
WW
2
WW
3
R1
R5
R3
R2
R4
R9
R10 R
7
R8
R6
P3
P1
P2
B1
C2
C3
B2
B3
C1
R17
R18
R11
R13
R14
R20
R15
R16
R19
E. coli >1000/ 100 mL
R1 > 60 R1< 50R2 > 1
Rum-2-Bac > 105B. adolescentis 104 à 105
bio geo > 0,17 GFI > 1,2
Pig-2-Bac > 105L. amylovorus >107
R1 > 60 bio geo > 0,17 et GFI < 0,9
B. adolescentis > 105
HF 183 >105Phages FRNA II et III
Caféine ≥≥≥≥ 0,3Benzophenone ≥≥≥≥ 0,2TCEP 0,08 à 0,5
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6Sim
ilarit
é
R19
R16
R15
R20
R14
R13
R11
R18
R17C1
B3
B2
C3
C2
B1
P2
P1
P3
R6
R8
R7
R10R9
R4
R2
R3
R5
R1
WW
3
WW
2
WW
1
WW
4
R12
0,6
0,7
0,8
0,9
Sim
ilarit
é
E. coli < 500 / 100 mLmarqueurs bactériens non détectés
caféine < 0,1 µg/L
?
R12
WW
4
WW
1
WW
2
WW
3
R1
R5
R3
R2
R4
R9
R10 R
7
R8
R6
P3
P1
P2
B1
C2
C3
B2
B3
C1
R17
R18
R11
R13
R14
R20
R15
R16
R19
marqueurs bactériens non détectéscaféine < 0,1 µg/L
ratios non spécifiques
Origine ?
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6Sim
ilarit
é
R19
R16
R15
R20
R14
R13
R11
R18
R17C1
B3
B2
C3
C2
B1
P2
P1
P3
R6
R8
R7
R10R9
R4
R2
R3
R5
R1
WW
3
WW
2
WW
1
WW
4
R12
0,6
0,7
0,8
0,9
Sim
ilarit
é
E. coli >1000
R1 < 50
?
R12
WW
4
WW
1
WW
2
WW
3
R1
R5
R3
R2
R4
R9
R10 R
7
R8
R6
P3
P1
P2
B1
C2
C3
B2
B3
C1
R17
R18
R11
R13
R14
R20
R15
R16
R19
R1 < 50Rum-2-Bac > 105
Caféine > 0,1Benzophenone > 0,1TCEP 0,05 à 0,1
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6Sim
ilarit
é
R19
R16
R15
R20
R14
R13
R11
R18
R17C1
B3
B2
C3
C2
B1
P2
P1
P3
R6
R8
R7
R10R9
R4
R2
R3
R5
R1
WW
3
WW
2
WW
1
WW
4
R12
0,6
0,7
0,8
0,9
Sim
ilarit
é
?
HF 183 104E. coli >1000
R12
WW
4
WW
1
WW
2
WW
3
R1
R5
R3
R2
R4
R9
R10 R
7
R8
R6
P3
P1
P2
B1
C2
C3
B2
B3
C1
R17
R18
R11
R13
R14
R20
R15
R16
R19
HF 183 104Rum-2-Bac >105
Phages II et III : 100%
Caféine 0,05 à 0,17+/-Benzophenone +/- TCEP
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6Sim
ilarit
é
R19
R16
R15
R20
R14
R13
R11
R18
R17C1
B3
B2
C3
C2
B1
P2
P1
P3
R6
R8
R7
R10R9
R4
R2
R3
R5
R1
WW
3
WW
2
WW
1
WW
4
R12
0,6
0,7
0,8
0,9
Sim
ilarit
é
E. coli > UFC 1000 / 100 mL E. coli < UFC 500 / 100 mL
?
R12
WW
4
WW
1
WW
2
WW
3
R1
R5
R3
R2
R4
R9
R10 R
7
R8
R6
P3
P1
P2
B1
C2
C3
B2
B3
C1
R17
R18
R11
R13
R14
R20
R15
R16
R19
E. coli > UFC 1000 / 100 mL E. coli < UFC 500 / 100 mL
marqueurs indiquent 1 ou plusieurs origines
Origine non déterminée
Directive (2006/7/EC) eaux de bonne qualité : 1000 E. coli / 100 mL en eau douce500 E. coli / 100 mL en eau de mer
-
Application des outils à deux zones de baignades
Zone de baignade
p 0
p 1p 2p 3
d 2
d 3t 1
d 5
e 1
d 3
e2
1 km
Zone de baignade p 1p 3
p4p 5p 6
p 7
Zone de baignade
5 km
em
Eau de mer : bassin versant du PenerfEau douce: le Loir
e2L1
-
rejet step
-
D2
rejet IAA*
1,9 103
Eau de mer : bassin versant du Penerf
rejet step
E. coli 100/ mL
E1D5
D4
D3D2
L13,2 103
E2
1,4 1051,4 103
6,1 103
8,4 102
1,9 10
5,9 102
Caractéristiques :zones de pâturages
épandages de lisiers de porc
rejet step
rejet IAA*
Em
L1
2 km
-
L1E1
D5
D4
0
0,5
1F2
(3,7
3 %
) ?E1
D5D4
D3D2
L1
2 km
E2
rejet step
Eau de mer : bassin versant du Penerf
E2
D3
D2
-1
-0,5
-1,5 -0,5 0,5 1,5 2,5F1 (92,76 %)
F2 (3
,73
%)
E. coli R1 R2 Bio/géo GFI caféine TCEPPhages humains HF183 B. ado L. amy Rum-2
D2
Origine supposée de la pollution:
humaine
bovine
porcine
2 km
D2 810 31 4,1 0,18 1,1 0,07 0,04 0 0 0 0 0D3 840 43 2,5 0,15 1,1 0,05 0 0 0 0 D 0D4 2,2 103 52 2,1 0,14 1,1 0,18 0 0 0 0 0 0D5 1,4 103 57 1,7 0,14 1,1 0,22 0 0 0 0 0 DE1 1,4 105 88 0,1 0,23 0,9 12,4 0,29 4,3 103 7,3 105 1,2 104 200 0E2 3,2 103 61 1,0 0,11 1,0 0,08 0,05 0 0 0 0 0L1 590 55 2,6 0,11 1,1 0 0 0 0 0 0 0
-
Conclusion (1/3)
Caractéristiques et limites de la boîte à outils
Marqueurs bactériens et viraux
Très spécifiques, excepté B. adolescentis
Non détectés E. coli
-
Conclusion (2/3)
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
Marqueurs chimiques
Caractéristiques et limites de la boîte à outils
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
-
Conclusion (2/3)
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
Marqueurs chimiques
Caractéristiques et limites de la boîte à outils
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
Ratios des stanols et de fluorescence
Difficilement interprétables en cas de pollutions mixtes
Interprétables lorsque qu’une pollution est dominante(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)
-
Conclusion (2/3)
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
Marqueurs chimiques
Caractéristiques et limites de la boîte à outils
Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine
Ratios des stanols et de fluorescence
Difficilement interprétables en cas de pollutions mixtes
Interprétables lorsque qu’une pollution est dominante(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)
Étude d’un bassin versant sur une année���� Continuer l’acquisition de données pour valider les marqueurs
-
Bacteroidales Pig-2-Bac Bacteroidales HF183,
Conclusion (3/3)
Caractérisation de 3 types de pollution à l’aide de la boîte à outils (E. coli> 1000 / 100 mL)
Bacteroidales Pig-2-Bac Lactobacillus amylovorus
Bio/géo>0.17 et GFI>1.2
Bacteroidales Rum-2-Bac
R11Bio/géo>0.17 et GFI>1.2
Bacteroidales HF183,Phages F-RNA II etIICaféine >0,1 TCEP, benzophenone
R1>65 % et R20.17 et GFI
-
Merci de votre attention